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Die vorliegende Erfindung betrifft die Stabilisierung von wässrigen Xanthen-Farbstofflösungen mittels antichaotroper Verbindungen, entsprechend stabilisierte Farbstofflösungen, sowie die Verwendung der entsprechenden Farbstofflösungen zum Einfärben von Zellpräparaten.
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Farbstofflösungen werden seit Langem in der Mikroskopie verwendet, um tierische oder pflanzliche Zell- und Gewebebestandteile sichtbar zu machen und eine Identifizierung und Differenzierung derartiger Gewebe zu ermöglichen.
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Farbstoffe für die Mikroskopie werden in erster Linie in der Histologie, Zytologie und Mikrobiologie eingesetzt, werden aber auch zum Analysieren von Textilfasern, Papier und anderen technischen Produkten verwendet.
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So werden beispielsweise Xanthenfarbstoffe wie z.B. Eosin, Fluorescein, Pyronin und Rhodamin in der Histologie zum Einfärben von Zellen verwendet. So wird unter anderem Eosin für die Hämatoxylin-Eosin-Färbung und Pyronin G (auch als Pyronin Y bezeichnet) für die Pappenheim-Unna-Färbung eingesetzt.
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Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung), ist ein histologisches Färbeverfahren, mit dem die verschiedenen Strukturen eines feingeweblichen Schnittes angefärbt werden können. Sie dient der Unterscheidung verschiedener Gewebestrukturen im mikroskopischen Bild anhand von zwei verschiedenen Einzelfärbungen und ist eine der am weitesten verbreiteten Routinefärbemethoden für morphologische Untersuchungen.
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Eosin ist ein synthetischer saurer Farbstoff der acidophile beziehungsweise basische (eosinophile) Strukturen rot färbt, was vor allem die Zellplasmaproteine umfasst.
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Der Farbstoff Eosin ist jedoch instabil in wässrigen Lösungen und neigt zum Ausfallen aus der Lösung. Dies führt zu einer Verschlechterung der Färbeleistung und einer Verringerung der Haltbarkeit der Färbelösung.
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Um die Stabilität von Eosin in Lösung zu erhöhen, kann anstatt einer wässrigen eine alkoholische Eosin-Lösung verwendet werden. Es werden beispielsweise Lösungen von Eosin in Ethanol oder Methanol verwendet. Darüber hinaus kann Eosin in alkoholischen Färbelösungen durch die Zugabe von Stabilisatoren stabilisiert werden.
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So beschreibt die
DE-OS 35 33 515 , dass durch den Zusatz von Dimethylammoniumsulfat die Stabilität von alkoholischen Färbelösungen erhöht werden kann.
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EP 0 313 975 A2 beschreibt die Stabilisierung von Färbelösungen durch den Zusatz von Dimethylammoniumsulfat und mindestens einem Kristallisationsinhibitor wie beispielsweise Glycerin, Polyethylenglykol und/oder Ethylenglykol.
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Die aus dem Stand der Technik bekannten Stabilisatoren haben jedoch den Nachteil, dass es sich um wenig wasserlösliche, gesundheitsgefährdende Salze wie Dimethylammoniumsulfat handelt, bzw. alkoholische Färbelösungen eingesetzt werden, die den Nachteil haben, toxisch und brennbar zu sein.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, Stabilisatoren für wässrige Xanthen-Farbstofflösungen zur Verfügung zu stellen, die nicht toxisch oder brennbar sind und die eine gute Stabilisierung des Farbstoffs in der wässrigen Lösung und somit eine lange Haltbarkeit sowie eine gleichbleibende Färbeleistung ermöglichen.
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Die Aufgabe wird durch Verwendung von antichaotropen Verbindungen zur Stabilisierung der Farbstofflösungen gelöst.
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Die erfindungsgemäßen Farbstofflösungen sind stabil und gut lagerfähig. Auch nach längerer Lagerung über einen Zeitraum von beispielsweise 2 bis 3 Monaten bei Temperaturen zwischen beispielsweise 0°C und 50°C bleiben die Farbstofflösungen stabil und es kommt zu keiner Verschlechterung der Färbeleistung. Außerdem enthalten die erfindungsgemäßen Färbelösungen keine toxischen oder brennbaren Stabilisatoren.
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Beschreibung der Figuren
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1 Zeigt eine Mikroskopieaufnahme von humanen Mundschleimhautzellen, die mittels einer frisch hergestellten erfindungsgemäßen Färbelösung eingefärbt wurden.
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2 Zeigt humane Mundschleimhautzellen, die mittels einer erfindungsgemäßen Färbelösung, die 3 Monate gelagert wurde, eingefärbt wurden.
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Die Stabilisierung der Farbstofflösungen erfolgt durch die Zugabe von wasserlöslichen antichaotropen Verbindungen als Stabilisatoren.
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Antichaotrope Verbindungen wirken als Fällungsmittel und werden beispielsweise zum Ausfällen (dem sogenannten Aussalzen) von Proteinen genutzt. Antichaotrope Verbindungen verstärken die hydrophoben Effekte in wässrigen Proteinlösungen und fördern dadurch Proteinaggregationen über hydrophobe Wechselwirkungen, was zum Ausfall von Proteinen aus der Lösung führt.
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Überraschenderweise hat sich in der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass die Verwendung von antichaotropen Verbindungen in Färbelösungen zur Stabilisierung der Farbstoffe in der Lösung führt.
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Bei antichaotropen Verbindungen im Sinne der vorliegenden Erfindung handelt es sich bevorzugt um Harnstoff und/oder antichaotrope Salze, wobei die antichaotropen Salze bevorzugt die in der Hofmeister-Reihe dargestellten antichaotropen Kationen und Anionen aufweisen. Ammoniumionen, Kaliumionen sowie Natriumionen und Magnesiumionen oder Kombinationen dieser Kationen sind besonders bevorzugte antichaotrope Kationen. Als antichaotrope Anionen werden besonders bevorzugt Sulfationen, Fluoridionen, sowie Chloridionen oder Kombinationen dieser Anionen eingesetzt.
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Als erfindungsgemäße Stabilisatoren besonders bevorzugte antichaotrope Verbindungen sind Harnstoff, Natriumchlorid, Ammoniumsulfat und/oder Natriumsulfat, insbesondere Natriumsulfat.
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Es kann eine antichaotrope Verbindung oder eine Mischung von zwei oder mehreren antichaotropen Verbindungen eingesetzt werden. Bevorzugt wird nur eine antichaotrope Verbindung eingesetzt.
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Die antichaotrope Verbindung wird bevorzugt in einer Menge von 0.01–1 Gew.%, besonders bevorzugt 0.01–0,5 Gew.%, insbesondere 0.01–0,1 Gew.%, insbesondere bevorzugt 0.02–0.08 Gew.%, insbesondere besonders bevorzugt 0.04–0.06 Gew.%, im speziellen 0,05 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung, eingesetzt.
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Als Farbstoff kann ein beliebiger wasserlöslicher Farbstoff aus der Gruppe der Xanthenfarbstoffe und/oder Derivate und/oder Salze der Xanthenfarbstoffe verwendet werden. Bevorzugt wird als Farbstoff Eosin (beispielsweise Eosin G (auch als Eosin Y bezeichnet) oder Eosin B), Fluorescein, Pyronin G (auch als Pyronin Y bezeichnet), Rhodamin (beispielsweise Rhodamin 6G, Rhodamin B, Rhodamin 123, Texas Red (Sulforhodamine 101 Säurechlorid) und Tetramethylrhodamin-methylester (TMRM+) und/oder Derivate und/oder Salze dieser Farbstoffe verwendet. Besonders bevorzugt wird Eosin G und/oder Eosin B verwendet, ganz besonders bevorzugt Eosin G.
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Es kann ein Farbstoff oder eine Mischung von zwei oder mehreren Farbstoffen eingesetzt werden. Bevorzugt wird nur ein Farbstoff eingesetzt.
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Zur Herstellung der wässrigen Farbstofflösung wird der Farbstoff in Wasser gelöst. Es kann sowohl Leitungswasser als auch destilliertes oder demineralisiertes Wasser verwendet werden. Bevorzugt wird destilliertes oder demineralisiertes Wasser verwendet.
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Der Farbstoff wird bevorzugt in einer Menge von 0,05–10 Gew.%, besonders bevorzugt 0,07–5,0 Gew.%, ganz besonders bevorzugt 0,08–2,0 Gew.%, insbesondere 0,1–1,0 Gew.%, insbesondere bevorzugt 0,2–0,5 Gew.%, insbesondere besonders bevorzugt 0,3 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung, eingesetzt.
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Durch Zugabe der erfindungsgemäßen Stabilisatoren zu den wässrigen Farbstofflösungen, werden Farbstofflösungen erhalten, die eine hohe Stabilität und Lagerfähigkeit aufweisen. Auch nach längerer Lagerung über einen Zeitraum von beispielsweise 2 bis 3 Monaten bleiben die Farbstofflösungen stabil und es kommt zu keiner Ausfällung von Eosin und keiner Verschlechterung der Färbeleistung.
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In einer bevorzugten Ausführungsform können die Farbstofflösungen durch Zusatz eines Kristallisationsinhibitors zusätzlich stabilisiert werden.
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Als Kristallisationsinhibitoren eignen sich vorzugsweise Glycerin, Polyethylenglykol, Ethylenglykol und/oder dessen aliphatische Ether, insbesondere Ethylenglykol, Glycerin und/oder Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von bis zu etwa 300, besonders bevorzugt ist Glycerin.
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Es kann ein Kristallisationsinhibitor oder eine Mischung von zwei oder mehreren Kristallisationsinhibitoren eingesetzt werden. Bevorzugt wird nur ein Kristallisationsinhibitor eingesetzt.
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Der Kristallisationsinhibitor wird vorzugsweise in einer Menge von 1–25 Gew.%, besonders bevorzugt 5–20 Gew.%, insbesondere 10–15 Gew.%, insbesondere bevorzugt 12–14 Gew.%, insbesondere besonders bevorzugt 13% Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung, eingesetzt.
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Durch Zugabe von Kristallisationsinhibitoren zu den erfindungsgemäßen Farbstofflösungen kann die Stabilität der Farbstofflösungen und damit die Haltbarkeit nochmals gesteigert werden.
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Die erfindungsgemäßen stabilisierten Färbelösungen finden Verwendung zum Anfärben von biologischem Material, vorzugsweise Zellpräparaten, in der Hämatologie, Zytologie und Histologie, insbesondere zum Anfärben von Mikroskopieproben.
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Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Eosin-Lösungen zur HE-Färbung verwendet werden.
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Das Verfahren zum Einfärben von Zellpräparaten mittels HE-Färbung erfolgt gemäß Standardprotokollen, die dem Fachmann geläufig sind. Protokolle zur HE-Färbung sind beispielsweise als Standardverfahren (SOP „standard operating procedure“) in Rüegg und Meinen, „Histopathology in Hematoxylin & Eosin stained muscle sections“, SOP_ID: MDC1A_M.1.2.004, TREAT-NMD / CURE CMD veröffentlicht.
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Die HE-Färbung wird gemäß bekannten Standardprotokollen durchgeführt, wobei bekannte Hämatoxylin-Lösungen verwendet werden. Anstelle der aus dem Stand der Technik bekannten, üblicherweise verwendeten Eosin-Lösungen, werden die erfindungsgemäßen Eosin-Farblösungen, enthaltend Eosin und antichaotrope Verbindungen, eingesetzt.
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Bei der HE-Färbung werden die Zellproben nach der Fixierung auf einem Objektträger zunächst mit Hämatoxylin gefärbt (H-Färbung). Hämatoxylin färbt alle sauren beziehungsweise basophilen Strukturen blau, insbesondere Zellkerne mit der darin enthaltenen Desoxyribonukleinsäure (DNA) und das mit Ribosomen angereicherte raue endoplasmatische Retikulum (rER).
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Nach der H-Färbung erscheinen die Zellkerne zunächst rötlichbraun aufgrund des niedrigen pH-Wertes der Färbelösung. Durch Erhöhung des pH-Wertes schlägt der Farbton in das typische Blauviolett um (Bläuen); dies wird mittels Spülen in Leitungswasser bewirkt.
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Anschließend folgt die Eosin-Färbung (E-Färbung) mit einer Eosin-Lösung. Eosin ist ein färbt alle acidophilen beziehungsweise basischen (eosinophilen) Strukturen rot, was vor allem die Zellplasmaproteine umfasst.
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Durch weitere Spülschritte über Alkohollösungen in aufsteigender Konzentration bis zu absolutem Alkohol wird das Wasser aus dem Gewebeschnitt verdrängt. Schließlich wird der entwässerte Schnitt in einem organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Xylol geklärt.
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Ein Standardprotokoll zur Durchführung der HE-Färbung umfasst beispielsweise folgende Schritte:
- (1) Fixierung der zu untersuchenden Zellen auf dem Objektträger mittels 1–2 Spraystöße eines alkoholischen Fixiersprays
- (2) Hämatoxylin-Färbung (H-Färbung) 1–2 min
- (3) Entfärbung 3 min, unter laufenden warmen Wasser
- (4) Entfärbung 2 min, unter laufenden kalten Wasser
- (5) Entfärbung 1 min, mit destilliertem Wasser
- (6) Eosin-Färbung (E-Färbung) 2–3 min
- (7) Entwässerung / Fixierung mit 70 % Ethanol
- (8) Entwässerung / Fixierung 3 min mit 90 % Ethanol
- (9) Entwässerung / Fixierung 3 min mit 96 % Ethanol
- (10) Entwässerung / Fixierung 2 mal 5 min mit 100 % Ethanol
- (11) Entwässerung / Fixierung 2 mal 10 min mit 100% Xylol
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Zur Hämatoxylin-Färbung wird saures Hämatoxylin nach Ehrlich oder saures Hämalaun nach Mayer verwendet.
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Hämalaun nach Mayer:
Die Färbelösung enthält: Hämatoxylin, Natriumjodat, Kalialaun, Chloralhydrat, Salzsäure 0,1 %ig, Ammoniaklösung, Natriumhydrogencarbonat und Zitronensäure.
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Hämatoxylin nach Ehrlich:
Die Färbelösung enthält: Hämatoxylin, Isopropanol 96%ig, Glycerin, Kalialaun, Essigsäure, Natriumjodat, Natriumhydrogencarbonat und Ammoniaklösung
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Beispiele
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Die Tabellen 1 bis 3 beschreiben die Zusammensetzung verschiedener Färbelösungen. Die Färbelösungen wurden durch Lösen, der entsprechenden Komponenten, in den angegebenen Mengen, in destilliertem Wasser hergestellt.
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Sämtliche Mengenangaben in den folgenden Beispielen und Vergleichsbeispielen sind in Gew.% angegeben, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung.
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So umfasst beispielsweise die Färbelösung gemäß Vergleichsbeispiel 1 eine Färbelösung enthaltend 0,3 Gew.% Eosin und die Färbelösung gemäß Beispiel 2 eine Färbelösung enthaltend 0,3 Gew.% Eosin, 0,1 Gew.% Ammoniumsulfat und 3,0 Gew.% Glycerin.
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Die Färbelösung gemäß Beispiel 16 umfasst eine Färbelösung enthaltend 0,3 Gew.% Eosin, 13 Gew.% Glycerin und 0,01 Gew% Ammoniumsulfat.
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Es wurden jeweils 250ml Färbelösung hergestellt, die in 500ml Labor-Schraubflaschen aus Glas (
ISO 4796) abgefüllt wurden. Die Färbelösungen wurden jeweils unter den in den Tabellen 1 bis 3 angegeben Bedingungen gelagert und zu den in den Tabellen angegebenen Zeitpunkten wurde jeweils visuell die Menge an rotem Niederschlag, gebildet durch die Absetzung von Farbstoffmolekülen, beurteilt und die Färbelösungen wurden wie folgt klassifiziert:
| +++ | sehr viel Niederschlag |
| ++ | viel Niederschlag |
| + | mäßig Niederschlag |
| (+) | wenig Niederschlag |
| ((+)) | sehr wenig Niederschlag |
| (((+))) | kaum sichtbarer Niederschlag |
| – | kein Niederschlag |
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Der Vergleich der Beispiele mit den Vergleichsbeispielen, zeigt, dass die erfindungsgemäßen Färbelösungen, enthaltend die erfindungsgemäßen Stabilisatoren, auch nach längerer Lagerung deutlich weniger Niederschlag und damit eine deutlich höhere Stabilität aufweisen.
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So zeigt beispielsweise der Vergleich der Beispiele 1 bis 3 mit den Vergleichsbeispielen 1 bis 3, dass die erfindungsgemäßen Färbelösungen, enthaltend die antichaotrope Verbindung Ammoniumsulfat als Stabilisator, deutlich weniger roten Niederschlag und damit eine deutlich besser Stabilität aufweisen als Eosin-Lösungen ohne den Zusatz von antichaotropen Verbindungen.
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Die nicht stabilisierten Färbelösungen zeigen bereits nach einer Woche, spätestens jedoch nach zwei Wochen einen deutlichen Niederschlag und verfügen nur noch über eine unzureichende Färbewirkung.
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Die erfindungsgemäßen Färbelösungen hingegen besitzen auch nach einer Lagerung von 3 Monaten bei Temperaturen zwischen 4°C und 40 °C eine konstant gute Färbewirkung.
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So wurde beispielsweise die Färbelösung gemäß Beispiel 27 als Eosin-Lösung zum Anfärben von humanen Mundschleimhautzellen mittels HE-Färbung verwendet. Die Zellen wurden mittels Bürstenbiopsie gewonnen. Die HE-Färbung der Zellen wurde gemäß folgendem Protokoll durchgeführt:
- (1) Fixierung der zu untersuchenden Zellen auf dem Objektträger mittels 1–2 Spraystößen eines alkoholischen Fixiersprays (Merckofix® Fixationsspray der Firma Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
- (2) Hämatoxylin-Färbung (H-Färbung) mittels Hämalaun nach Mayer 2 min
- (3) Entfärbung 3 min, unter laufenden warmen Wasser
- (4) Entfärbung 2 min, unter laufenden kalten Wasser
- (5) Entfärbung 1 min, mit destilliertem Wasser
- (6) Eosin-Färbung mit der Färbelösung gemäß Beispiel 27 für 3 min
- (7) Entwässerung / Fixierung mit 70 % Ethanol
- (8) Entwässerung / Fixierung 3 min mit 90 % Ethanol
- (9) Entwässerung / Fixierung 3 min mit 96 % Ethanol
- (10) Entwässerung / Fixierung 2 mal 5 min mit 100 % Ethanol
- (11) Entwässerung / Fixierung 2 mal 10 min mit 100% Xylol
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Die Anfärbung der Zellen erfolgte mit einer frisch hergestellter Färbelösung und mit einer 3 Monate gelagerten Färbelösung die unter den Bedingungen, wie sie in der Tabelle 3 für das Beispiel 27 angegeben sind, gelagert wurde, wobei die Lösung ab dem 23. Tag für den weiteren Zeitraum bis zu einer Gesamtdauer von 3 Monaten unter Raumtemperatur gelagert wurde.
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Der Vergleich der mit frischer Färbelösung angefärbten Zellen (
1) mit den mit 3 Monate gelagerter Färbelösung angefärbten Zellen (
2), zeigt, dass die erfindungsgemäße Färbelösung auch nach 3 Monaten eine gleichbleibende Färbewirkung aufweist.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- DE 3533515 A [0009]
- EP 0313975 A2 [0010]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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