DE2832491A1 - Mittel und verfahren zur anfaerbung von zellabstrichen - Google Patents
Mittel und verfahren zur anfaerbung von zellabstrichenInfo
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Description
Merck Patent Gesellschaft
mit beschränkter Haftung
Darm Stadt
mit beschränkter Haftung
Darm Stadt
Mittel und Verfahren zur Anfärbung von Zellabstrichen
Die Erfindung betrifft ein Mittel und ein Verfahren zur Anfärbung von Zellabstrichen. Als Standardmethode hierfür
wird seit Jahrzehnten in der gynäkologischen Zytodiagnostik
zur Früherkennung von Genitalkrebs bei Frauen die Färbung nach Papanicolaou eingesetzt. Das Prinzip dieser Färbung
besteht darin, daß Vaginal-, Portio- und Zervikalabstriche sowie Uterussedimentausstriche, die Einzelzellen oder ZeIlverbände
enthalten, mit mehreren Farbstofflösungen angefärbt werden. Anhand der Zellmorphologie können Krebszellen
oder Vorstufen derselben erkannt werden.
Die Nachteile dieser Färbemethode bestehen darin, daß sie sehr zeitaufwendig ist und die Auswertung eine langjährige
Erfahrung voraussetzt. Die Papanicolaou-Färbung läuft einschließlich
der Präparate-Eindeckung über 23 - 25 Arbeitsstufen; der Zeitaufwand beträgt dabei etwa 30 - 45 Minuten.
Der eigentliche Färbevorgang läuft in mehr als 10 Stufen ab (3 Färbelösungen, Spülungen in Wasser,, Alkohol, Säure
und Base). Nach dieser Technik wird die Papanicolaou-Färbung seit über 30 Jahren vor allem in zytologischen
Speziallaboratorien durchgeführt. Es zeigten sich jedoch schon immer Bestrebungen, die zeitaufwendige Färbung zu
vereinfachen und zeitlich zu verkürzen, um sie auf die Belange der niedergelassenen Gynäkologen auszurichten.
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Eine Vielzahl von Modifikationen und Schnellfärbetechniken
der Papanicolaou-Färbung wurden im Laufe der Zeit entwickelt, die jedoch alle nur eine gewisse nationale Bedeutung
erlangten. Auch Papanicolaou war sich schon der Nachteile seiner Färbemethode bewußt. Er beschrieb deshalb in
J.Lab.Clin.Med. 1941, Seite 1200, eine Färbelösung, bestehend' aus Anilinblau, Orange G, Fuchsin, Eosin, Molybdato-
und Wolframatophosphorsäure, die schon in 3 Minuten eine für viele Fälle brauchbare Färbung liefern sollte;
allerdings seien die Kerne ohne Verwendung von Hämatoxylin nicht so gut gefärbt und zytologische Einzelheiten seien
nicht so gut erkennbar. Ähnliches berichtete Papanicolaou auch von seinen Lösungen EA 36 bzw. EA 25, die aus Lichtgrün, Bismarckbraun, Eosin, Wolframatophosphorsäure und
Lithiumcarbonat bestanden (Science 9_5_, 2469 (1942)). In
Ann.Biol. Clin. 12_, 187 (1954) wird die Färbung nach Papanicolaou
mit 7 anderen Methoden verglichen, mit dem Ergebnis, daß Einmalfärbungen zwar sehr gut das Zytoplasma
anfärben, nicht aber die Struktur des Kerns zum Ausdruck bringen können. In jedem Fall sei mindestens die zusätzliche
Färbung mit Hämatoxylin notwendig.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Mittel und ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem
es möglich ist, mit Hilfe einer einzigen Färbung Bilder zu erhalten, die den Färbungen nach Papanicolaou entsprechen
und zwar sowohl in der Feinstruktur als auch im Farbcharakter. Erfindungsgemäß wurde diese Aufgabe
durch eine spezielle Farbstoffkombination gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel zur Anfärbung von •3o Zellabstrichen, das Hämatein, einen Triphenylmethanfarbstoff
und einen Fluoresceinfarbstoff enthält. Vorzugsweise enthält die Farbstoffkombination Hämatein, Lichtgrün und Eosin.
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Die bevorzugte Farbstoffkombination besteht aus einer Lösung, die 0,01 - 0,5 Gew.-% Hämatein, 0,01 - 0,5 Gew.-%
Lichtgrün und 0,05 - 1 Gew.-% Eosin enthält.
Ferner umfaßt der Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Anfärbung von Zellabstrichen, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man den fixierten Ausstrich nach Behandlung mit einer Metallsalzlösung mit einer Farbstoffkombination,
enthaltend Hämatein, einen Triphenylmethanfarbstoff und einen Fluoresceinfarbstoff, in Berührung bringt.
überraschenderweise hat sich gezeigt, daß mit Hilfe der
speziellen Farbstoffkombination in einer einzigen Färbung mikroskopische Bilder erhalten werden, die den Färbungen
nach Papanicolaou für zytodiagnostische Zwecke vollständig entsprechen.
Die erfindungsgemäße Farbstoffkombination läßt sich als Lösung für die Färbung einsetzen. Da Lösungen in der Regel
nicht unbegrenzt haltbar sind und bei mehrfacher Anwendung ihre Zusammensetzung ändern können, z. B. durch teilweises
Verdampfen des Lösungsmittels oder durch Kristallisation eines Bestandteils, :ist es vorteilhaft, diese Lösungen
auf einen Träger aufzubringen und das Lösungsmittel zu verdampfen. Der dann auf dem Träger verbleibende dünne
Farbfilm ist für eine Färbung ausreichend. Geeignete Trägermaterialien sind z.. B. Glas, Kunststoffolien oder auch
saugfähige Träger, wie Papier oder Glasfaserpapier.
Kommt das erfindungsgemäße Mittel in Form einer Folie zur
Anwendung, so werden dadurch eine Reihe weiterer Vorteile erzielt, wie der Wegfall der Färbebank, eine einfachere
Handhabung, die die Ausführung durch eine Hilfskraft ermöglicht; die Gefahr der Verunreinigung des Labors durch
Farbstofflösungen wird vermieden, der Stellplatz für Farbstoff
lösungen entfällt.
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Das erfindungsgemäße Färbeverfahren wird z. B. in der
Weise durchgeführt, daß inan zunächst einen mit Alkohol/ Äther fixierten Ausstrich für 3 Minuten in eine Metallsalzlösung
stellt. Auf den noch feuchten Ausstrich legt man die Folie, die mit der Farbstoffkombination beschichtet
ist und läßt 5-Minuten einwirken. Anschließend entfernt man die Folie, spült mit Alkohol und deckt in
üblicher Weise ein.
Die Ausstriche werden sofort fixiert, entweder durch Besprühen mit im Handel befindlichen Fixiermitteln oder
durch Einstellen in Äthanol/Äther. Für die Zellkernfärbung ist es wesentlich, daß der Ausstrich mit Metallsalzlösungen
gebeizt wird. Als Metallsalze finden vorzugsweise Aluminiumverbindungen Anwendung , aber auch Eisen-, Wismutund
Kupfersalze können eingesetzt werden. Vorzugsweise werden der Metallsalzlösung Komplexierungsmittel zugesetzt,
wie Zitronensäure, Weinsäure, Gluconsäure, Äthylendiamintetraessigsäure oder die entsprechenden
Salze. Dadurch werden Niederschlagsbildungen in Grenzen gehalten. Geeignete Metallsalzkonzentrationen liegen
bei etwa 0,1 - 5 Gew.-%. Bei niedrigeren Konzentrationen
wird der Kern praktisch nicht stärker gefärbt als das
Plasma, bei höheren Salzkonzentrationen muß mit Farbniederschlägen
im Plasma gerechnet werden.
Mit der erfindungsgemäßen Farbstoffkombination aus Häriiatein,
einem Triphenylmethanfarbstöff und einem Fluoresceinfarbstoff,
werden Farbbilder erhalten, die der Färbung nach Papanicolaou genau entsprechen, sofern die
Farbstoffe im angegebenen Konzentrationsbereich eingesetzt
werden. Leichte Farbverschiebungen können eintreten, wenn die Verhältnisse der Farbstoffe zueinander verändert werden
oder wenn anstelle des bevorzugten Fluorescein-Farbstoffs
Eosin z. B. Phloxin oder Erythrosin bzw. anstelle des Triphenylmethan-Farbstoffs Lichtgrün z. B. Patentblau
zur Färbung eingesetzt werden.
Il
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0752
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Herstellung der Lösungen
1. Metallsalzlösung
0,5 g Aluminiumchlorid und 0,5 g Natriumeitrat in 100 ml Wasser
2. Färbelösung
Es werden die folgenden 3 Lösungen hergestellt: a) 1,20 g Hämatein in 300 ml Äthanol
b) 0,69 g Lichtgrün in 20 ml Wasser und 100 ml Äthanol
c) 2,88 g Eosin in 30 ml Wasser und 100 ml Äthanol
Diese Lösungen werden filtriert und in folgenden Mengen zur eigentlichen Färbelösung vereinigt:
30 ml der Lösung a)
12 ml der Lösung b)
13 ml der Lösung c)
Herstellung einer Farbfolie
Die nach Beispiel A 2.hergestellte Farblösung wird gleichmäßig
auf ein 55 mm breites und 1000 mm langes Folienband aus glasklarem Polyvinylchlorid (Dicke 0,15 mm) aufgebracht,
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ζ. B. durch Auftragen mit einem Schwamm, Aufsprühen oder Aufdrucken. Nach dem Verdunsten des Lösungsmittels wird
das Folienband in 24 mm breite Streifen geschnitten und ist dann für die Färbung verwendbar.
5 Beispiel C Färbeverfahren
Ein Vaginal-, Zervikal- oder Uterusausstrich wird sofort fixiert, indem der Objektträger für etwa 10 - 15 Minuten
in eine Lösung aus Äthanol/Äther 1 : 1 eingestellt wird.
Die Fixierung des Ausstrichs kann auch durch Besprühen
mit einem Fixationsspray erfolgen. Der so fixierte Abstrich wird für etwa 3 Minuten in die unter Beispiel A 1.
beschriebene Metallsalzlösung getaucht. Auf den noch feuchten Ausstrich wird die Farbfolie gelegt. Nach 5 Minuten
wird die Folie entfernt, der Ausstrich wird mit Alkohol gespült und in tiblicherjiieise eingedeckt. .
Beispiel D Auswertung
Die Zellbestandteile des mit der Färbelösung nach Beispiel A 2. behandelten Ausstrichs sind im mikroskopischen
Bild wie folgt angefärbt:
Basophiles Zytoplasma Azidophiles Zytoplasma ·
Erythrozyten 25 verhorntes Plasma Zellkerne
blaugrün rosa rot rosa bis orange blau bis dunkelviolett
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Claims (5)
1. Mittel zur Anfärbung von Zellabstrichen,· enthaltend Hämatein, einen Triphenylmethanfarbstoff und einen
Fluoresceinfarbstoff.
2. Mittel nach Anspruch 1, enthaltend die Farbstoffkombination
Hämatein, Lichtgrün und Eosin.
3. Mittel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Farbstoffkombination aus einer Lösung enthaltend 0,01 - 0., 5 Gew„-% Hämatein, 0,01 0,5
Gew.-% Lichtgrün und 0,05 - 1 Gew.-% Eosin besteht-,
4. Mittel nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß die Farbstoffkombination als getrockneter homogener Film auf einem Träger vorliegt.·
5. Verfahren zur Anfärbting von Zellabstrichen, dadurch
gekennzeichnet, daß man den fixierten Ausstrich nach Behandlung mit einer Metallsalzlösung mit einer
Farbstoffkombination, enthaltend Hämatein, einen Triphenylmebhanfarbstoff und einen Fluoresceinfarbstoff,
in Berührung bringt.
6· Verwendung des Mittels nach den Ansprüchen 1 bis 4
zur Zytodiagnostik.
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