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Farbstoffzubereitungen zum Färben von Blutpräparaten und Verfahren
zu ihrer Herstellung Die Erfindung bezieht sich auf Farbstoffzubereitungen, die
in der medizinischen Diagnostik zum Färben von Blutpräparaten, insbesondere von
Blutausstrichen, eingesetzt werden sollen.
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Es ist bekannt, zum Färben von Blutpräparaten verschiedene Farbstofflösungen
zu verwenden* z. Bo Eosin-Methylenblaulösungen nach Leishmann, Wright9 May-Grünwald
und Jenner, Azur-Eosin-Methylenblau-@ösung nach Giemsa, Hämatoxylin-Lösung nach
Harris oder Orange G- und Eosin-Lichtgrün-Bismarckbraun-Lösungen nach Papanicolaou.
Einzelheiten über dies bekannten Färbemethoden sind in der einschlägigen Literatur
vielfältig beschrieben0 Verwiesen sei in diesem Zusammenhang auf "Medizinisch-chemische
Untersuchungsmethoden", herausgegeben von der Eo Merck AG, 10. Auflage9 1962, Seiten
2 - 9, Verlag Chemie, Weinheim, sowie auf das Handbuch von Bn Romeis "Mikroskopische
Technik", 15. Auflage, München 1948, Seiten 316 bis 329.
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Nach "The British Medial Journal", 1901/IÏ9 Seite 757p besteht die
Eosin-Methylenblau-Farbstoff-Mischung aus 1,0 g Methylenblau und 0,1 g Eosin; nach
Bo Romeis "Mikroskopische Technik", lOcO9Selte 317, ist die Eosin-Methylenblau-Farbstoff-Mischung
nach May-Grünwald aus je 1,0 g Methylenblau und 1,0 g Eosin zusammengesetzt. Letztere
unterscheidet sich nur unwesentlich von den Eosin-Methylenblau-Farbstoff-Mischungen
nach Wright und Jenner. In"Ullmanns Encyklopädie der technischen Chemie", 3. Auflage,
120 Band, Seite 467 (1960), besteht die Azur-Eosin-Methylenblau-Farbstoffmischung
aus 50 ing Azur-A-Eosinat, 250 mg Azur-B-Eosinat und 200 mg Methylenblau-
-Eosinat.
Verschiedene Eosin-Lichtgrün-Bismarckbraun-Gemische nach Papanicolaou sind in "Science",
Band 95, Seite 438 (1942) beschrieben; so besteht beispielsweise die Mischung EA
36 (bzw. BA 25) aus 225 lag (bzw. 220 mg) Eosin, 225 mg (bzw.
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220 mg) Lichtgrün und aus 50 mg (bzw. 60 mg) Bismarckbraun.
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Die Pärbemethode nach Leishman beruht beispielsweise darauf, da# ein
lufttrochener Blutausstrich lit etwa 0,5 ml der gesättigten methanolischen Farbstofflösung
nach Leishman bedeckt wird. Das angefärbte Blutpräparat nimmt einen hellroten Farbton
an. Die Farbstofflösung nach Leishman wird zubereitet, inden man 0,12 g Eosin-Methylenblau
nach Leishman init einer kleinen Menge Methanol vorlöst, dann mit Methanol auf 100
ml aufföllt, eine Stunde rUbrt und 5 Tage stehenlä#t. Erst nach dem Filtrieren erhält
man schlie# lich die gebrauchsfertige Lösung. Ähnliches gilt für die Herstellung
der übrigen bekannten Farbstofflösungen zum Färben von Blutpräparaten. Die Verfahrensweise
dieser Testmethoden ist insofern von gro#em Nachteil, als man zunächst immer aüf
umständlichen und zeitraubedem Wege die Farbstofflösungen herstellen mu#.
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Zum Teil sind die Testfarbstoff-Gemische, insbesondere z. B.
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Eosin-Methylenblau nach Leishman, in den Ublioherweise verwendeter
Lösungsmitteln, insbesondere Methanol, nur schwer löslich.
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Infolgedessen werden diese Farbstoffe bisher nur als Parbpulver, nicht
aber in Form von Lösungen, dem Verbraucher zur Verfögung gestellt. Besonders nachteilig
ist das Einwägen der kleinen Menge des jeweiligen Farbstoffpulvers und das ansohließende
langwierige Vorlösen, Lösen und Filtrieren.
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Darüberhinaus bringt aber auch die Herstellung der eigentlichen Farbstoffpulver
erhebliche verfahrenstechnische Schwierigkeiten mit sich. So ist insbesondere die
Herstellung der trockenen Farbstoffpulver aus den bei der Fabrikation lösungsmittelhaltig
schleuderfeucht anfallenden Farbstoffmassen wegen der dabei auftretenden Staubbildung
und wegen der Verglimmungsgefahr des feinverteilten
Farbstoffes
beim Trocknungsprozeß mit erheblichen Nach teilen verbunden. Die feinverteilten
Farbstoffe neigen wegen ihrer pyrophoren Eigenschaften während der Trocknung manchmal
schon bei Temperaturen zwischen 25 und 500C zur Selbstentzündung bei der Ueblichen
Anwesenheit von Luftsauerstoff, wodurch neben den damit verbundenen Gefahren auch
der wirksame Parbstoffgehalt abnimmt und methanolunlösliche 3estandteile gebildet
werden, die eine Filtration und spätere Neueinstellung der Lösung erforderlich machen,
Auch backen die sehr kleinen Pigmentteilchen beim Trocknen häufig zusammen und bilden
harte Brocken von beträchtlicher mechanischer Festigkeit, die mit den üblichen Zerkleinerungsvorrichtungen
nicht mebr tn Produkte mit der ursprünglichen Feinheit und Löslichkeit umgewandelt
werden können, Es wurde nun gefunden, daß man diese, sowohl mit der Herstellung
der Farbstoffpulver als auch der Farbstofflösungen verbundenen Flachteile vermeiden
kann, wenn man die zum Färben von Blutpräparaten verwendeten, von der Herstellung
her noch lösungsmittelhaltigen, schleuderfeuchten Farbstoffe in Polyäthylenglykole
einarbeite. Man umgeht auf diese Weise die Herstellung der trockenen Farbstoffpulver.
Außerdem ist so die Herstellung von Farbsotffpasten möglich, die eine besonders
vorteilhafte Anwen dungsform von Blutfärbepräparaten darstellen und in Tuben ver-
-packt sur Verfügung gestellt werden können9 Gegenstand der Erfindung ist somit
ein Verfahren zur Herstellung von Farbstoffpasten zum Färben von Blutpräparaten,
das darin besteht, daß ian die Farbstoffe in Polyäthylenglykol einarbeitet, Besondere
Vorteile bietet s, die von der Herstellung her nooh - sc'hleuderfeuchten, also lösungsmittelhaltigen
Farbstoffe einzusetzen. Polyäthylenglykole oder Mischungen von @ Polyäthylenglykolen
mit einem Schmelsbereich zwischen +4 und +60°C, vorzugseise zwischen +15 und +58°C,
sind dabei besonders günstig.
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Bevorzugt werden diejenigen Farbstoffe oder Farbstoffkombinationen
zu Farbstoffpasten nach der Erfindung verarbeitet, die in der Färbung von Blutpräparaten
eine wichtige Rolle spielen, z. B. Eosin-Methylenblau nach Leishman, Wright und
May-Grünwald, sowie e Azur-Eosin-Methylenblau nach Gtemsa9 Hämatoxylin nach harris
oder Orange G- und Eosin-Lichtgrün-Bismarckbraun nach Papanic @laou. Der Farbstoffgehalt.
der. Pasten. schwankt etwa zwischen 1 und 30 %.
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Gegenstand der Erfindung sind ferner die so hergestellten Farbstoffpasten.
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Die Verarbeitung der für die Färbung von Blutpräparaten gebräuchhohen
Farbstoffe zu polyäthylenglykolhaltigen Farbstoffpasten hat den entscheidenden Vorteil,
daß das gesamte Herstellungsverfahren der Farbstoffe erheblich verkürzt, vereinfacht
und verbilligt werden kann0 So lassen sich die langwierigeng nachteiligen und teuren
Trocknungsprozesse einsparen9 da die Lösungsmittelmengen, z. B. Wasser, Methanol,
Aethanol, Dioxan, die noch von den bei der Herstellung schleuderfeucht anfallenden
Farbstoffen stammen9 bei zu i der Anwesenheit von Polyäthylenglykolen die Her stellung
einwandfreier @arbstoffpasten zur Färbung von Blutpräparaten nicht stören. Der Lösungsmittelgehalt
der schleuderfeucht eingesetzten Farbstoffe oder Farbstoffe oder Farbstoffgemische
kann etwa das 0,1 bis 7-fache, bevorzugt das 1 bis 5-fache, des Farbstoffgewichtes
betragen, Selbstverständlich können aber auch, sofern das aus bestimmtsn Gründen
erwunacht ist, trockene Farbstoffe bzw. Farbstoffgemische zur Herstellung der Pasten
nach der Erfindung verwendet werden, Zur Herstellung der Farbstoffpasten nach der
Erfindung geeignete Polyäthylenglykole sind insbesondere Polyäthylenglykole mit
mittleren Molekulargewichten zwischen 400 und 6000, entsprechend einem Schmelzbereich
zwischen +4 und +60°C, besonders aber solche
Polyäthylenglykole
mit mittleren Molekulargewichten zwischen 600 und 4000 und einem zugehörigen Schmelzbereich
zwischen +15 und +58°. Aber auch dadurch Nischen verschiedener Polyäthylenglykole
mit mittleren Molekulargewichten zwischen 200 und 12000 und einem Schmelzbereich
zwischen -20 und +6000 lassen sich Produkte geeigneter Konsistenz für diesen speziellen
Verwendungszweck herstellen. Es können Polyäthylenglykolmischungen flüssiger oder
salbenartiger bis wachsartiger Konsistenz eingesetzt werden0 Solche Produkte sind
z. B. unter den geschützten Warenzeichen Polydiol#, Carbowax# und Polywachs# im
Handel. Der Gehalt der Parbstoffpasten an Polyäthylenglykolen kann zwischen 50 und
99 % schwanken.
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Als Farbstoffe oder Farbstoffkombinationen werden insbesondere Eosin-Methylenblau-Gemische
nach Leishman, Wright und May-Grünwald, Hämatoxylin nach Harris, Orange G und die
Eosin-Lichtgrün-Bismarckbraun-Gemische nach Papanicolaou, aber auch andere Eosin-Methylenblau-
und Eosin-Lichtgrün-Bismarckbraun-Mischungen und auch andere Parbstoffe, die in
der Färbung von Blutpräparaten ebenfalls eine Rolle spielen, wie Brillantkresylblau,
Asur II oder Methylenblau, verwendet. Alle diese Farbstoffe bzw. Farbstoffgemische
können nach der Erfindung pulvertrocken oder lösungsmittelhaltig (schleuderfoucht)
su Farbstoffpasten verarbeitet werden0 Der Farbstoffgehalt der Pasten liegt etwa
zwischen 1 und 30 %.
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Die Herstellung der Farbstoffpasten erfolgt in an sich Ublicher Weise,
beispielsweise durch Eintragen der trocknen, pulverförmigen oder insbesondere der
lösungsmittelhaltigen, sohleuderfeuchten Farbstoffe oder Farbstoffmischungen in
die jeweilige Polyäthylenglykolmasse, die je naoh Schmelzbereich gegebenenfalls
durch Erwärmen bis auf 50 - 100°C in eine leicht bewegliche Flüssigkeit verwandelt
wird, Man vermischt durch intensives Rühren und gibt di<
Masse
gegebenenfalls mehrmals ber Walzen. bs man eine homogene Farbpaste erhält, die in
Tuben abgepackt werden kann, Der Viskesitätsgrad der fertigen Farbstoffpasten soll
vorzugsweise so eingestellt sein, daß bei Temperaturen zwischen +10 und +3520C bei
gelindem Druck auf die Tuben die Farbstoffpaste in Porm eines Farbstranges austreten
kann.
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Aus entsprechenden Mengen der jeweiligen Farbstoffpasten können so
beispielsweise mit Methanol gebrauchsfertige Farbstofflösungen zur Färbung von Blutpräparaten
erhalten werden, wobei durch eine genormte Tubenöffnung die zeitraubende Wägung
entfällt und ledig lich eine bestimte Länge des Farbstoffstranges abgemessen werden
mu#.
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Aber auch die langwierige und umständliche Lösungsprozedur, die üblicherweise
erforderlich ist z. Bo bei der Lösung des Eosin-Nethylenblau-1?arbstoffes nach Leishman,
vereinfacht sich wesen lioh durch Verwendung der Farbstoffpasten. Denn wegen der
feinen Verteilung der Farbstoffe in den Farbstoffpasten erhält man durch bloßes
Umrühren in geeigneten Lösungsmitteln ohne Filtration sofort die gebrauchefertien
Färbelösungen. Dadurch wird daß gesamte Testverfahren für den Verbraucher entscheidend
verkürzt.
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Die polyäthylenglykolhaltigen Farbstoffpasten nach der Erfindung besitzen
zusätzlich den Vorteil, sowohl in Methanol als auch in Wasser, den wesentlichen
für Blutausstrichfärbungen benutzten Lösungsmitteln, löslich zu seine ohne daß Ausfällungen
auftreten oder olie Anfärbung der Blutpräparate beeinträchtigt we cd Besonders günstig
ist die Herstellung von Farbstoffpasten für die Färbung von Blutpräparaten unter
Verwendung von Polyäthylen glykolen außerdem dann, wenn der Farbstoff, wie So B.
der Leishman-Farbstoff, wegen zu geringer Löslichkeit in den benötigten Lösungsmitteln
dem Verbraucher nicht in Form einer konzentrierten Lösung angeboten werden kann,
Beispiel
1 Farbpaste für die Leishman-Färbung 26,4 g einer Mischung aus 3 eilen Polyäthylenglykol
600 und 1 Teil Polyäthylenglykol 4000- - die Zahlenangaben charakterisieren jeweils
das mittlere Molekulargewicht - mit einem Schmelzbereich von etwa 36 - 4200 werden
auf etwa 70°C erwärmt. In die flüssige Masse werden 3,6 g des getrockneten Leishman
Eosin-Methylenblau-Farbstoffs eingetragen. Nach gründlichem Umrühren wird die Masse
mehrmals über Farbwalzen gegeben, wobei man eine dunkelblau gefärbte, homogene Farbpaste
erhält, die in -Tuben abgepackt wird, Die Konsistenz der Farbpaste ist dann so einges-tellt,
daß bei gelindem Druck auf die Tute- die Masse in Form eines Farbstranges austreten
kann und durch Abwägen oder Abmessen einer entsprechenden Lange dieses Farbstranges
für die Herstellung der eigent-. lichen Farbstofflösung zur Verfügung steht. Zur
Herstellung einer gebrauchsfertigen Leishman Eosin-Methylenblaulösung benötigt man
1 g der Farbpaste (entsprechend 0,12 g Leishman Eosin-Methylenblau-Farbstoff), die
in 100 ml -Methanol gelöst werden. Ohne zusätzliches Filtrieren @erhält man eine
sofort brauchbare Farbstofflösung.
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Die Durchführung der Färbung erfolgt nach den Standardmethoden, wie
sie z. B. in der oben zitierten Broschüre Medizinischchemische Untersuchungsmethoden",
beschrieben sind. Das angefärbte Blutpräparat nimmt einen hellroten Farbton an.
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Beispiel 2 Farbpaste für die Leishman-Färbung Analog Beispiel 1 erhält
man aus 12,35 g eines wasserhaltigen, schleuderfeuchten Leishman-Methylenblau-Farbstoffs
mit einem Farbstoffgehalt von 6,00 g und 87,65 g einer Polyäthylenglykolmischung
aus 3 Teilen Polyäthylenglykol 600 und 1 Teil Polyäthylenglykol 4000 mit einem Schmelzbereich
von etwa 36 - 420a eine Farbstoffpaste geeigneter Konsistenz, die anschließend
in
Tuben abgepackt werden kann. 2 g dieser Farbstoffpaste enthalten 0,12 g des zur
Herstellung von 100 ml einer Leishman-Lösung erforderlichen Eosin-Methylenblau-Farbstoffs.
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Beispiel 3 Parbpaste für die Färbung nach vtright Analog Beispiel
1 werden 18,5 g eines wasserhaltigen schleuderfeuchten Eosin-Methylenblau-Farbstoffs
nach Wright mit einem Farbstoffgehalt von 7,2 g und 101,5 g einer Polyäthylenglykolmischung
aus Polyäthylenglykol 600 und Polyäthylenglykol 1000 0 zu gleichen Teilen, Schmelzbereich
etwa 29 - 32 0, gut gemischt, bis eine homogene Farbpaste von streichfähiger Konsistenz
entstanden ist. Die Farbpaste wird dann in Tuben abgefüllt. Zur Herstellung einer
gebrauchsfertigen Lösung für die Färbung nach Wright benötigt man 4,0 g Parbpaste
(entsprechend 0,24 g des Eosin-Methylenblau-Farbstoffs nach Wright), die in 100
ml Methanol gelöst werden. Man erhält ohne vorheriges Abfiltrieren eine sofort brauchbare
Farbstofflösung.
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Die. Durchführung der Färbung selbst ist in der oben zitierten Broschüre"Medizinisch-chemische
Untersuchungsmethoden", Seite 5, beschrieben.
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Beispiel 4 Parbpaste für die Giemsa-Pärbung Analog Beispiel 1 werden
38 g eines wasserhaltigen schleuderfeuchten Azur-Eosin-Methylenblau-Farbstoffs nach
Giemsa mit einem Farbstoffgehalt von 12 g und 178 g Polyäthylenglykolmischung aus
3 Teilen Polyäthylenglykol 600 und 1 Teil Polyäthylenglykol 4000, Schmelzbereich
etwa 37 - 42°C, int-ensiv gemischt.
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Die Farbstoffpaste wird anschîle#end in Tuben abgepackt. 18 g der
Farbstoffpaste enthalten 1 g ; der zur Herstellung von 100 ml einer Giemsa-Lösung
notwendigen Farbstoffmischung und werden beispielsweise mit einer Mischung aus 54
ml Glycerin und 84 ml Methanol zu einer fUr die Giemsa-Färbung gebrauchsfertigen
Farbstofflösung aufgefüllt. Die Durchführung der Färbung selbst ist in der oben
zitierten Broschüure "Medizinisch-chemische Untersuchungemethoden auf Seite 4, beschrieben.
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Beispiel 5 Farbpaste für die May-Grünwald-Färbung Analog Beispiel
1 werden 5 g trookener Eosin-Methylenblau-Farbstoff für die Färbung nach May-Grünwald
mit 20 g einer Polyäthylenglykolmischung aus gleichen Teilen Polyäthylenglykol 600
und Polyäthylenglykol 1000, Schmelzbereich ca. 29 - 320Og gut vermischt. Man erhält
eine homogene Farbstoffpaste, die in Tuben abgepackt wird.
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1 g der Farbstoffpaste enthält 0,2 g des für die Herstellung der May-Grünwald-Lösung
erforderlichen Eosin-Methylenblau-Farbstoffs und wird mit Methanol su 100 ml gebrauchefertiger
Farbstofflösung aufgefüllt. Die flurchfuhrung der Färbung selbst @@@@@der bereits
sitierten Broschüure "Medizinisch-chemische Untersuchungsmethoden" au5 Seite 4 beschrieben.