FR2523310A2 - Procede d'analyse et de determination, par sorption differentielle d'un colorant metachromatique et emission d'une lumiere fluorescente, des divers leucocytes du sang a leurs divers stades de developpement - Google Patents

Abstract

PROCEDE D'ANALYSE ET DE DETERMINATION, PAR SORPTION DIFFERENTIELLE D'UN COLORANT METACHROMATIQUE ET EMISSION D'UNE LUMIERE FLUORESCENTE, DES DIVERS LEUCOCYTES DU SANG A LEURS DIVERS STADES DE DEVELOPPEMENT. ON MET UN ECHANTILLON, OU UNE FRACTION, DE SANG SANS FIXATEURS EN CONTACT, EN MILIEU AQUEUX, AVEC L'ORANGE BASIQUE N21 OU UN ROUGE OU VIOLET BASIQUE DE LA SERIE METHINIQUE OU POLYMETHINIQUE. CHAQUE LEUCOCYTE OU ELEMENT DE LEUCOCYTE SE COLORE AINSI DE FACON METACHROMATIQUE PARTICULIERE DIFFERENTIELLE, ET L'ON NOTE LA PRESENCE OU L'ABSENCE DE COULEUR, LA FORME DU NOYAU ET LES CARACTERISTIQUES DES GRANULES EVENTUELS DU CYTOPLASME, POUR DETERMINER LE TYPE ET L'ETAT DE DEVELOPPEMENT DES DIVERS LEUCOCYTES. APPLICATION: DIFFERENCIATION ET NUMERATION DES LEUCOCYTES, NOTAMMENT CEUX DE LA SERIE MYELOIDE, POUR UNE SURVEILLANCE OU UN DIAGNOSTIC.

Description

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Comme le brevet principal et son premier Certificat d'Addition, la présente invention concerne un perfectionnement

important apporté au domaine de la cytologie et, plus particu-

lièrement, l'utilisation d'une large classe de colorants dans un procédé d'examen et d'analyse, sous le microscope, des

éléments figurés d'un sang encore vivant Ces documents anté-

rieurs concernaient l'examen en lumière naturelle ou visible.

Le brevet principal a décrit l'utilisation d'une classe de colorants métachromatiques quaternaires basiques, capables d'effectuer une coloration vitale des éléments figurés et notamment des globules blancs du sang Il a été trouvé que ces colorants colorent, dans une gamme de températures, les cinq espèces individuelles de leucocytes ou globules blancs du sang, ce qui permet la mise en oeuvre d'un procédé perfec tionné de différenciation optique de cinq espèces de leucocytes

individuelles du sang.

Le premier Certificat d'Addition concerne fondanmntale-

ment un domaine semblable de détermination, mais il se fonde sur la découverte que certaines sous-classes spécifiques des colorants, utiles en gros pour différencier, identifier et compter des leucocytes de sang humain, sont singulièrement utiles aussi pour une détermination différentielle des stades de développement de granulocytes neutrophiles et d'autres leucocytes Les inventions précitées sont mises en oeuvre en utilisant des ondes lumineuses ayant la même longueur d'onde que celle présente dans la lumière solaire ordinaire, ce que

l'on appelle parfois ici un spectre de lumière blanche.

Les documents précités permettent donc d'examiner un champ qui a été soumis à coloration vitale, l'examen étant effectué au microscope en utilisant de la lumière "blanche", qui est une forme d'énergie électromagnétique de rayonnement ayant une longueur d'onde comprise entre environ 4000 et 7700 A. Les documents précités concernaient des examens, au microscope, de l'absorption de la lumière blanche traversant un champ comportant un échantillon ayant subi une coloration vitale La présente invention concerne l'élargissement de cette technique à des émissions de lumière fluorescente La lumière

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fluorescente est liée à des émissions de lumière et elle peut

être provoquée par le flux d'une certaine forme d'énergie péné-

trant dans le corps émetteur Un spectre d'émission de fluo-

rescence provient de l'absorption d'un flux d'énergie-et d'une émission de lumière selon une fréquence caractéristique. Aux fins de la présente invention, l'émission de lumière fluorescente dans le microscope à fluorescence peut consister

en desradiations ultraviolettes, violettes et parfois bleues.

On utilise couramment la lumière de la vareur de mercure.

Cependant, une expérimentation précédente montre l'intérêt de l'utilisation, dans certains cas, d'un faisceau cohérent et unique de lumière, comme celui que l'on obtient par la technologie du rayon laser On sait que dans un appareillage de cytométrie, on a utilisé des rayons laser pour exciter des cellules simples exposées au colorant orangé d' acridine dans des dispositifs de classement de cellules ou globules Des instruments peuvent observer une seule cellule, en déterminer les formes spécifiques et mesurer l'intensité des couleurs émises par fluorescence métachromatique Cependant, l'orangé d'acridine présente de graves limitations car il dépend à la

fois du p H et de la température, L'orangé (il acridinle ne mani-

feste pas de métachromasie utile en cas d'observation par absorption de lumière En outre, le colorant tend à diffuser

et il n'est pas utile dans l'examen vital de cellules et globu-

les (encore vivants), car, par exemple il dépend de la concen-

tration Dans les procédés ici décrits, la stimulation, par la lumière d'un rayon laser, de cellules préparées pour le microscope et colorées à l'aide de l'orangé basique n' 21, par exemple, donne un moyen remarquable d'identification, de différenciation et de numération des globules sanguins et d'examen d'autres tissus capables d'élaborer, de transférer ou de conserver des globules sanguins Le faisceau laser ne

semble pas exciter ou provoquer une nouvelle qualité de chroma-

sie ou gêner la métachromasie, qui est un facteur si important

dans 1 'utilisation des colorants selon la présente invention.

Ce faisceau peut être concentré avec une grande densité d'énergie au sein d'une cellule ou d'un globule, ce qui permet

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de mieux distinguer les cellules ou globules et rend plus précises les mesures Les couleurs émises semblent ne pas

être modifiées par la forme d'énergie qui provoque la fluores-

cence des colorants sorbés selon la présente invention.

Le groupe particulier de colorants ici décrit, et tout

spécialement l'orangé basique no 21 qui est remarquable lors-

qu'on l'utilise avec un dispositif à fluorescence, comme d'ailleurs aussi lorsqu'on en examine l'absorption en lumière

blanche, permettent un progrès très important en cytologie.

Les colorants révélés à l'origine dans le brevet princi-

pal sont classés en gros comme étant des inéthines, des polymé-

thines et des colorants de la famille des cyanines En gros, les colorants de cette classe comprennent des carbocyanines, des mérocyanines, des azacyanines, des oxanols, etc. Cependant, dans cette large classe, on a trouvé que seuls des colorants en très petit nombre sont métachromatiques et utiles, notamment dans le présent domaine d'utilisation o ils doivent être aussi métachromatiques dans des conditions de fluorescence aussi bien qu'en cas d'absorption de la

lumière blanche -

Ehrlich a permis de reconnaître plus facilement des éléments biologiques par examen au microscope et en vue d'une observation photographique en utilisant des colorations (à l'aide de colorants dérivés de l'aniline) pour identifier certains globules blancs du sang Ehrlich a été le premier à noter que certains colorants sont métachromatiques, en observant que la coloration de la cellule oblige celle-ci

à prendre ou absorber une couleur différente de celle du colo-

rant ou de la couleur à laquelle on s'attendait d'après le

colorant On a observé, par exemple, que les globules baso-

philes prennent une couleur différente de celle du colorant.

Il a également été indiqué que d'autres spéciments histologi-

ques, différents des globules sanguins, se colorent en

plusieurs couleurs différentes identifiables.

Un passage en revue de l'état de la technique indique qu'il est de pratique quasi-universelle d'appliquer, avant la coloration (qui utilise d'ordinaire plusieurs colorants chimiques différents mélangés), un mode opératoire de fixation pouvant exiger jusqu'à une demi-heure de traitement avant qu'on puisse soumettre le spécimen biologique au processus

de coloration Les fixateurs sont généralement des conser-

vateurs et dénaturants qui nuisent souvent à la sensibilité de la sorption du ou des colorants Par exemple, les fixateurs comprennent le formaldéhyde, aussi bien sous forme liquide

que de vapeur, des alcools absolus (méthylique), du picrofor-

mol, etc Très souvent, les cellules vivantes ne se colorent

pas à l'aide de colorants vitaux et des fixateurs sont essen-

tiels pour la coloration des spécimens La cytochimie comprend des renseignements considérables sur les techniques mises

au point pour assurer une coloration reproductible des globu-

les sanguins De nombreux additifs essentiels sont normalement instables et se détériorent rapidement, ce qui rend difficile et parfois peu sûre l'identification des cellules Le docteur Thomas E Necheles a observé, à propos de l'analyse des leucocytes, que "ce système a subi peu ou pas de changement

en 50 ans".

Or, la coloration constitue bien un moyen pour discerner les détails qu'il serait impossible, sinon, de discerner, en soumettant à une réaction colorée des cellules et leurs

constituants colorables, que ces constituants soient métabo-

liques, fonctionnels ou pathologiques.

Les hôpitaux des Etats-Unis d'Amérique ont commencé

à dénombrer les leucocytes dès le début du 20 e siècle en uti-

lisant le dénombrement ainsi obtenu comme un indice permettant,

par exemple, de savoir si une chirurgie d'urgence est néces-

saire Dans les seuls Etats-Unis d'Amérique, on établit chaque jour plus d'un demi-million de formules leucocytaires du sang, la plupart du temps par des méthodes manuelles Il est important d'effectuer des dénombrements de l'ensemble des globules blancs, d'établir une formule leucocytaire et de

transmettre sans retard les résultats obtenus Le temps cons-

titue un facteur essentiel et l'on souhaite toujours obtenir

et transmettre plus rapidement les analyses requises.

La valeur du dénombrement des leucocytes et de l'éta-

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blissement de leurs proportions relatives ayant été établie, la demande tendant à obtenir une analyse rapide des éléments figurés du sang s'est développée de sorte qu'en commençant au voisinage de 1950 avec le travail de Mellors et de Papincolaou ( 1952), le développement des divers appareils automatisés pour l'établissement d'une forme leucocytaire a donné divers instruments en 1980 L'appareil "CYDAK" a servi

très tôt à étudier s'il était possible de réaliser une classi-

fication des globules sanguins, ce qui a souligné l'importance

des modes opératoires de coloration spécialisée, et des carac-

téristiques ont été extraites des histogrammes de la densité optique de chaque image de globule Ce mode opératoire a établi la possibilité de différencier les globules en quatre des cinq classes de leucocytes, à savoir les neutrophiles, les éosinophiles, les lymphocytes et les monocytes Younri

a publié en 1969 les résultats d'une classification automati-

sée des cinq classes de globules et Bacus a étendu en 1971

la différenciation.

On admet cependant que des systèmes de différenciation automatisée se fondent actuellement sur l'utilisation de plusieurs colorants et de systèmes de dégradation de colorants ou sur la mesure d'une fluorescence indirecte en faisant appel

à des colorants fluorescents.

Dans la coloration des éléments figurés du sang selon

l-a technique antérieure, il a été observé qu'il est de prati-

que courante d'utiliser deux ou plusieurs colorants combinés (colorants de Romanowski, Giemsa et Wright) Il est difficile

d'assurer un contrôle de la qualité lors de la mise en prati-

que de ces méthodes Elles' exigent une standardisation de

la préparation de chaque colorant faisant partie de la compo-

sition à utiliser, ainsi que du procédé de coloration des spécimens Dans le développement des appareils automatisés pouvant établir avec succès une formule leucocytaire du sang,

la reproductibilité de la coloration est encore plus impor-

tante pour permettre la vérification de l'analyse.

Mogler a indiqué en 1973 que la composition colorante

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"LARC" (utilisée dans des appareils automatisés du commerce pour l'établissement d'une formule leucocytaire) consiste en un mélange d'environ dix colorants dérivés de la thiazine, de l'éosine Y et de la 21 41, R -tribromofluorescéine (P N Marshall) Les compositions colorantes actuelles se trou-

vent le plus souvent dans des solutions alcooliques de fixa-

teurs et comportent deux ou plusieurs colorants en combinaison.

Une analyse précise de la coloration vitale des éléments figurés du sang est ainsi rendue extrêmement difficile Avec la difficulté présentée par l'oxydation réglée du bleu de méthylène, essentielle pour les colorations de Romanowski, par exemple, les problèmes de contrôle de la qualité des dix

colorants différents individuellement ajoutés pour la colora-

tion, tels qu'on les utilise en combinaison, deviennent impres-

sionnants.

Il a été admis en pratique qu'une standardisation pous-

sée et l'adoption d'un nombre limité de compositions colorantes

garantiraient une plus grande précision et une meilleure repro-

ductibilité des études cytologiques On a observé que l'utili-

sation des fixateurs entraîne une introduction grave d'arté-

facts, ce qui crée des difficultés d'interprétation et une mauvaise interprétation lors de la différenciation et de la numération des leucocytes Il a été indiqué que des ajustements du p H, des cations de métaux lourds, constituent des facteurs empêchant des tests cytochimiques de s'effectuer de la façon attendue Il a été noté que certains colorants, notamment les

colorants azoiques, font apparaître une précipitation non spé-

cifique autour des globules; d'autres modifications de dégéné-

rescence des échantillons de globules fixés du sang comprennent la formation de vacuoles, d'une structure en "feuille de trèfle" des noyaux, la distorsion des formes des globules, la présence de salissures et une gêne pour la réalisation d'une coloration parfaite On admet l'importance d'effectuer le plus rapidement possible des dénombrements différentiels sur des

cellules aussi vivantes que possible afin d'obtenir des formu-

les leucocytaires d'une utilité et d'une valeur optimales.

L'utilisation de solutions alcooliques de colorants gêne la

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coloration vitale Pour autant qu'on le sache, des compositions colorantes hydrosolubles fraîchement préparées montrent le minimum d'effet de dénaturation lors de l'examen par coloration vitale des éléments figurés du sang Tous les colorants sont plus ou moins toxiques pour les globules du sang, mais certains le sont plus que d'autres Il est important que les globules

examinés restent vivants aussi longtemps que possible La rapi-

dité de la coloration raccourcit bien évidemment le temps d'exposition, ce qui donne plus de chances d'examiner les leucocytes avant qu'ils ne perdent toute leur vitalité On

souhaite pouvoir établir par des moyens automatisés des formu-

les leucocytaires du sang obtenues en un plus petit nombre

de minutes.

Des études et un passage en revue de la manière anté-

rieure d'effectuer sous le microscope des analyses des éléments figurés du sang et un diagnostic d'une maladie ont indiqué qu'il n'est pas inhabituel pour des pathologistes de réchauffer le colorant et l'échantillon de sang jusqu'à des températures d'environ 370 C,voisines de celles du corps, avant de réaliser le contact Le docteur Sabin avait une "botte chaude" pour

garantir le réglage de la température.

Il a également été noté que certains colorants utilisés

dans l'art antérieur sont très sensibles aux températures.

La littérature indique que le violet cresylecht n'est pas utile comme colorant au-dessus de 30 C Aux fins du procédé ici décrit, on considère comme important que le colorant puisse colorer des leucocytes à des températures aussi élevées que 37 C, et l'on n'a pas observé de difficulté, avec les colorants

choisis, jusqu'à des températures d'environ 40 'C.

Le brevet principal a révélé que des colorants métachro-

matiques, en nombre relativement faible, peuvent servir à iden-

fier uneou plusieurs espèces de leucocytes L'identification

et la différenciation concernaient spécifiquement des leuco-

cytes polymorphonucléaires (neutrophiles), des éosinophiles,

des basophiles, des lymphocytes en général et des monocytes.

Il a été observé, à titre de caractéristiques communes pour.

tous les-colorants s'avérant-utiles aux fins du brevet princi-

pal, que lesdits colorants sont capables de colorer de manière métachromatique les monocytes de façon différente des autres

leucocytes du groupe ci-dessus.

Les qualités inhabituelles du colorant basique orangé 21 (CI N O 48035 et courbe spectrale n' 7, figure 7 du brevet principal) ont été observées à propos des éosinophiles, des basophiles et des monocytes, mais, en raison du faible nombre des cellules B, celles-ci sont passées relativement inaperçues initialement Il a été initialement observé dans le brevet principal qu'une différenciation optique entre des neutrophiles matures et immatures semblait possible du fait de la différence

de couleur des granules matures par rapport aux granules imma-

tl Jres, qui sont comparativement plus rouges et orangés Comme ce groupe, qui comprend des myéoloblastes, des promyélocytes, des myélocytes, des métamyélocytes et des bandes, n'est pas toujours présent dans l'ensemble des échantillons de sang ou n'est pas présent en des nombres significatifs ou importants, comme c'est souvent le cas pour des lymphocytes T (globules ou cellules T) et des lymphocytes B (ou cellules ou globules B),tous n'ont alors pas été spécifiquement identifiés comme étant colorés de manière métachromatique et différenciée par

l'orangé basique 21.

Après l'achèvement du travail qui a abouti à la demande de brevet principal, la poursuite de la recherche concernant l'utilisation de ce colorant remarquable a permis d'établir, au cours d'études semblables effectuées sur des donneurs de sang, qu'il est possible, en utilisant ce colorant cationique

basique choisi dans la classe des colorants méthiniques, poly-

métlhiniques et de la quinoléine, de distinguer de manière

reproductible, par suite d'une réponse métachromatique, cer-

tains lymphocytes Il est possible en outre d'identifier au

moins dix granulocytes bien connus et des cellules lymphocyti-

ques dont oh admet, en pratique, l'intérêt vital pour les

sciences de la santé.

En outre, cette différenciation est immédiate; elle ne nécessite pas de prétraitement biochimique complexe ou difficile des échantillons de sang De plus, on a noté que

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le colorant présente le minimum possible de toxicité.

On a effectué des mesures de microspectiophotométrie

en utilisant une ouverture assez petite pour mesurer la cou-

leur des granules des cellules granulocytiques parmi les leur cocytes soumis à une coloration vitale Aucune autre partie

de cellule, prise en compte à un certain degré dans les mesu-

res, ne s'est avérée présenter des coefficients d'extinction des couleurs des différentes espèces de leucocytes qui ont

constamment été différentes et ont souvent présenté des diffé-

rences de nuances, de valeur ou de couleur de l'ordre de 50

manomètres Ily a eu des pics reconnaissables, existant cons-

tamment pour de nombreuses cellules On sait que les diffé-

rences de l'ordre de 5 nm sont importantes dans des mesures microspectrophotométriques, si les différences sont constantes

et reproductibles.

Parmi les cellules granulocytiques immatures immédiate-

ment identifiables et distingables les unes des autres, il y a des myéloblastes et des cellules de la série myélolde,

à savoir des promyélocytes, des myélocytes et des métamyélo-

cytes On pense, et l'on admet généralement, que ce sont des

précurseurs des leucocytes polymorphonucléaires ou neutro-

philes, qui se colorent également de façon métachromatique, de manière à pouvoir être facilement et rapidement distingués, identifiés et dénombrés par les analyses de sang encore vivant

devenues possibles du fait des progrès ici décrits.

Comme décrit dans le brevet principal, on peut en même

temps distinguer des neutrophiles, de éosinophiles, des baso-

philes, des lymphocytes et des monocytes les uns des autres et de leurs précurseurs précités s'ils sont tous présents dans un échantillon spécifique de sang soumis à des analyses microspectrophotométriques. Il a, de plus, également été trouvé que ce colorant remarquable donne une forme optiquement différente de couleur ainsi qu'une densité différente de chaque couleur de granules dans des lymphocytes de type "bande" Ainsi, cette qualité de leucocytes peut aussi être remarquablement séparée, par différenciation optique, des autres cellules d'aspect immature,

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identifiées ci-dessus Il existe un tel degré d'amplitude de différences de couleurs, d'agencement et de densité de

couleur qu'un opérateur compétent peut effectuer une numéra-

tion de toutes les cellules individuellement désignées ci-

dessus, aussi bien avec des spectres de lumière blanche

(absorption) que par fluorescence (émission).

Des sources d'énergie d'émission par fluorescence sont, par exemple, des lampes à vapeur de mercure, des lampes à filaments de tungstène et à vapeur d'halogène, des lasers, des sources utilisant du deuterium, du xénon, etc. Les renseignements actuellement disponibles indiquent également qu'un équipement de numération différentielle automatique sera développé en se fondant sur des différences dues à la présence ou à l'absentée de couleur et aux formes physiques établies dans le noyau et en tenant compte de ces différences et notamment des différences relatives en nombre, dimensions, agencement ou formte et nuances, valeur et couleur et densité de couleur dues aux divers granules présents dans le cytoplasme La dualité des couleurs dans des expositions à de la lumière bimodale permet un double contrôle de

l'observation et constitue un moyen de découvrir des diffé-

rences dans la structure des cellules ou globules.

La possibilité supplémentaire de différencier des lymphocytes B, ou cellules ou globules B, par rapport à des lymphocytes T ou des cellules ou globules T, est presque incroyable mais a été également mise en évidence au cours de la recherche fondamentale effectuée jusqu'à présent Il est également possible d'identifier optiquement chacun de

ces lymphocytes importants, l'un par rapprt à l'autre, quali-

tativement et quantitativement, en utilisant le même colorant dans la même analyse de sang encore vivant sans fixateur et aussi de distinguer et de dénombrer des cellules, d'aspect immature et mature, y compris les "bandes" Des lymphocytes

T ont été observés et identifiés, par observation par fluores-

cence, dans des tissus de ganglions lymphatiques et dans d'autres tissus associés au métabolisme des globules blancs

du sang.

La découverte de la capacité, selon le premier Certi-

ficat d'Addition, de l'orangé basique N O 21 à différencier,

en plus des globules et cellules décrits dans le brevet princi-

pal, des myéloblastes et des globules sanguins de la série myélolde (ou lignée granulocytaire) ainsi que des bandes, des lymphocytes T et des lymphocytes B, étend le champ potentiel

d'utilité du colorant, de façon inattendue, au-delà de la capa-

cité admise dans le brevet principal Des fractions de fluides, associées dans des échantillons de sang encore vivant à du tissu sain ou à du tissu soupçonné d'une anomalie, comme du plasma, de la lymphe, du sérum, etc, contenant une ou plusieurs

des cellules ci-dessus, peuvent, après coloration métachromati-

que, être examinées au microscope, en utilisant le système bimodal d'énergie ici décrit ou en utilisant l'une ou l'autre source lumineuse seule, pour différencier ainsi chaque espèce de cellules indiquées cidessus, ce qui permet une numération

et une étude comparative.

Ce progrès, associé à ce qui a été décrit dans le brevet principal, constitue un progrès sans pareil en hématologie, cytologie et immunologie, et permet d'envisager et de conduire des recherches planifiées dans un domaine illimité de la santé humaine On a ainsi diminué de façon considérable et mesurable

la nécessité de faire appel à des réactifs coûteux, de consa-

crer un temps de valeur inestimable à de la recherche et l'on

a permis de rassembler des données bien plus précises.

La découverte des réponses de fluorescence, lorsqu'on

utilise un petit nombre limite de produits chimiques cationi-

ques quaternaires basiques donnant les colorants remarquables

du présent exposé,étend également, au-delà des limites actuel-

lement admises, l'horizon dans le domaine du diagnostic des maladies. En poursuivant les observations initiales réalisées tout d'abord dans le cadre du brevet principal et en utilisant un microscope Zeiss à fluorescence, il a été trouvé que la

carbocyanine K-5, un colorant de la classe des méthine-polymé-

thines,est métachromatique aussi bien par absorption de lumière blanche que par émission de fluorescence Par la suite, en

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examinant un large groupe de colorants entrant dans la classe comportant le chromophore ci-dessus et qui comprend des rouges et des violets (énumérés ci-après) ainsi que de l'orangé basique 21, il a été trouvé que tous ces colorants donnent une coloration vitale sur des monocytes, lesquels manifestent cette double réponse métachromatique ou réponse en lumière

bimodale, à l'examen sous le microscope Zeiss à fluorescence.

A la suite de l'observation selon laquelle l'orangé basique N 21 présente non seulement de la métachromasie lorsqu'il est éclairé par un spectre de lumière blanche mais aussi dans les conditions de fluorescence stimulée, des recherches ont été poursuivies et ont établi que l'orangé nasique n 21 peut être utilisé avec des sources de lumière fluorescente pour donner, dans les mêmes cellules que celles

décrites dans le premier Certificat d'Addition précité, sensi-

blement les mêmes formes géométriques et les mêmes agencements.

Cependant, les couleurs fluorescentes n'ont pas donné la même réponse de colleur que dans le cas de sources de lumière blanche, bien que les formes et agencements géométriques soient entièrement corroborés Des examens en parallèle de

la même lamelle préparée dans un grand nombre de cas concer-

nant aussi bien des leucocytes normaux que des leucocytes de patients présentant divers stades d'états maladifs, examens effectués sous lumière blanche normale, comme dans le cas

du brevet principal,et sous lumière fluorescente, correspon-

dant à la présente invention, ont produit une démonstration remarquable d'identification et de confirmation répétée des leucocytes sous lumière blanche et sous lumière fluorescente mais avec identification de couleur qui, dans un dispositif bimodal d'observation, varie de nuance, de valeur et de degré

de saturation ou pureté chromatique, et avec variation d'in-

tensité de la lumière visible, également.

Des études poursuivies en utilisant divers colorants méthiniques et polyméthiniques pour des identifications

de leucocytes ont continué à confirmer les propriétés inhabi-

tuelles de certains colorants de cette classe, particulière-

ment l'orangé basique no 21, le rouge basique N O 13, le rouge

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basique N O 36, le rouge basique n' 49, et les violets basi-

ques N 07, no 15, no 16, N 036, n'39 et N O 40 Tous les colo-

rants que l'on vient juste d'énumérer se sont avérés être métachromatiques en lumière blanche et sous émission de fluorescence et tous ont instantanément coloré des monocytes

de façon caractéristique et métachromatique dans le disposi- tif bimodal ici décrit D'autres essais ont montré que tous les colorants

précités sont très inhabituels du fait qu'ils sont également métachromatiques lorsqu'on les utilise avec certains échantillons biologiques sous lumière fluorescente

et ils présentent également de la fluorescence métachromati-

que lorsqu'on les utilise pour une coloration vitale de monocytes. Une recherche d'envergure mondiale a utilisé environ 2 000, au total, échantillons de colorants qui ont été soumis

à des essais Parmi eux, un grand nombre ne sont plus dispo-

nibles chez les fournisseurs connus.

Des études particulières de l'orangé basique n'21 mon-

trent en outre que ce colorant est vraiment remarquable parmi les nombreux colorants cités ci-dessus L'orangé basique n 21 est le seul colorant actuellement connu qui manifeste un r 8 le bimodal pour l'identification de tous les globules

biologiques du sang nommés ci-dessus Ce colorant remarqua-

ble fonctionne aussi bien lorsqu'il est éclairé en lumière

blanche que lorsqu'il est éclairé par une lumière fluores-

cente et permet une identification, par différence métachro-

matique, de chacun des leucocytes individuels suivants, y

compris les stades de développement des cellules granulocyti-

ques (ou granulocytes ou polynucléaires) neutrophiles Une coloration vitale rapide, à l'aide de solutions aqueuses de l'orangé basique N O 21, permet une différenciation optique,

une identification et une numération sous lumière fluores-

cente pour chacune des cellules suivantes, à savoir que l'on peut utiliser un champ préparé pour le microscope et des dispositifs stéréo- optiques pour examens manuels successifs

ou simultanés en lumière blanche ou sous lumière fluorescente.

* Deux types différents, mais distincts de manière caractéris-

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tique, de configurations colorées deviennent disponibles et chacun peut être vérifié par rapport à l'autre pour confirmer

une identification de neutrophiles, d'éosinophiles, de baso-

philes, de monocytes, de lymphocytes, de promyélocytes, de myélocytes, de métamyélocytes, de bandes et de cellules B aussi bien que de cellules T Le temps n'a pas encore permis

une étude exhaustive des limitations éventuelles de disposi-

tifs à grand niveau technologique, fonctionnant à l'aide

d'ordinateurs plus avancés avec possibilité de lecture simul-

tanée, sur des écrans binoculaires, d'une image de projection, en lumière blanche et en lumière fluorescente, provenant d'un

seul champ contenant l'échantillon à étudier.

On connaît des dispositifs optiques qui permettent des analyses bimodales, simultanées aussi bien que séquentielles, pour des appareils utiles pour une mesure simultanée de l'absorption et de la fluorescence (voir page 144, J.

Membrane Biology 33, 141-183 119771 C Springer-Verlag, New-

York, Inc, 1977) Ainsi, il n'est pas inconnu de soumettre un échantillon biologique coloré à une observation à l'aide

d'oculairés séparés sous le stimulus d'une source de lumière bimodale.

On sait en outre que la fluorescence seule constitue souvent une source de lumière plus facile, plus rapide, et

offrant plus de possibilités, pour stimuler une différen-

ciation à l'aide d'un microscope, mais l'on sait également que cette source de lumière peut introduire des complications d'étalonnage et de précision en raison de sa vulnérabilité à la présence et à la formation d'artéfacts Cependant, en permettant d'utiliser successivement des longueurs d'ondes

de lumière blanche et des longueurs d'ondes de lumière fluo-

rescente dans une observation comparative d'un seul échantil-

lon biologique d'essai coloré à l'aide d'un colorant qui est métachromatique non seulement en lumière blanche mais aussi en lumière fluorescente, on permet d'observer aussi bien les similitudes que les différences existant dans les constituants caractéristiques connus des leucocytes en ce qui concerne leurs granules primaires de noyaux, les granules secondaires, etc On a observé des aspects remarquables de la structure

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cellulaire des éosinophiles, qui concourent à leur différen-

ciation, leur identification et leur numération.

Les granules des éosinophiles présentent spécifiquement une forte fluorescence seulement autour de la périphérie du granule en une configuration en "chemise" ou "enveloppe".

Dans la mesure o on l'a constatée, cette configuration ou enve-

loppe de fluorescence périphérique identifie de manière remar-

quable, voire unique, les éosinophiles On ne connaît pas

jusqu'à présent de description d'un tel indice de structure

pour un globule sanguin L'observation suggère que d'autres études comparatives, effectuées sous fluorescence et avec éclairement en lumière blanche, pour des globules blancs du sang et des tissus apparentés permettront de révéler d'autres

voies de découverte et de stimuler de nouvelles études résul-

tant d'observations nouvelles et récentes de différencia-

tions apparentes de structures dont on ne soupçonnait même

pas l'existence auparavant.

Un autre exemple prometteur est une différence notée dans le degré d'intensité de la fluorescence des noyaux des

diverses cellules T (lymphocytes T) On suppose que ces diffé-

rences observées dans l'émission de lumière fluorescente donnent des indices pour l'identification de sous-groupes de cellules T, par exemple des cellules à rôle de suppression ou de destruction Si l'on admet qu'il existe une nette différence observable dans les cellules T lorsqu'on les éclaire à l'aide de deux types ou modes de lumière (éclairage bimodal ou

lumière bimodale), on ne connaît pas actuellement la signifi-

cation des différences ainsi notées.

Le très grand intérêt actuellement accordé à des études d'immunité suggère la possibilité d'un intérêt pratique et d'une application des observations bimodales rendues possibles

par les procédés d'analysé vitale ici décrits Les observa-

tions des leucocytes et de leurs stades de développement,

et la découverte et l'étude, à l'aide des observations uti-

lisant deux modes de lumière, des différences de structures de la biochimie et de la biophysique vont conduire à une compréhension plus poussée des états ordonnés et des troubles

16 2523310

ou désordres liés à la maladie.

Une étude de la structure chimique de l'orangé basique n' 21 et de celle de l'orangé basique n' 22 a été effectuée lorsque l'on a trouvé que le numéro 21 est très inhabituel et que le numéro 22 semble inutilisable aux fins visées. Les seules différences observées ont été que le radical

indolyle de chaque orangé basique ne varie que du fait du pas-

sage du groupe méthyle d'une position 2 dans l'orangé basique ne 21 à une position 1 dans l'orangé basique N 022 Le groupe méthyle est fixé comme substituant sur un carbone dans l'orangé basique né 21 et sur un azote cyclique dans l'orangé basique n* 22 La position 2 de l'orangé basique N 022 comporte un groupe phényle à la placé du qroupe réthyle fix\ r l)os; itiori 2 de la

structure cyclique de l'orangé basique n'21.

Des documents de référence de l'art antérieur indiquent

qu'il n'est pas inhabituel, dans des analyses sur des échantil-

lons encore vivants, d'utiliser, comme vérification essentielle des résultats, trois concentrations du colorant dans trois préparations de lamelles Dans le cas de l'orangé basique N O 21, les différences de couleur sont si nettes et les couleurs si exceptionnellement vives que l'on peut facilement distinguer, instantanément, avec un seul colorant et une seule lame de préparation, et avec le spectre de lumière blanche ou le spectre de lumière fluorescente, les granules primaires des

granules secondaires.

La présente invention constitue un progrès en cytologie

en proposant un seul colorant organique cationique ou quater-

naire basique, de la série des colorants méthiniques et polymé-

thiniques, qui est sorbé sélectivement de façon métachromatique par un ou plusieurs leucocytes du sang périphérique, ce qui perfectionne de façon inhabituelle l'identification et la différenciation des membres immatures et matures des divers éléments figurés de la série myéloilde ou granulocytique et des globules blancs matures, par absorption de lumière blanche et/ou sous la stimulation d'une lumière fluorescente Jusqu'à présent, il fallait utiliser des moyens cytochimiques et des colorants complexes pour différencier les globules sanguins,

2 2523310

ce qui nécessitait souvent au moins une heure de préparation fastidieuse en vue d'analyser aumicroscope, par différenciation

et numération, une seule espèce de leucocytes connus.

Dans la pratique de la présente invention, on peut maintenant colorer de façon différentielle et identifier,- précisément et facilement, à l'aide d'un seul colorant pur (auquel on peut combiner d'autres colorants pour des études spécifiques), au cours d'un simple contact aqueux avec un échantillon de sang veineux périphérique ou avec une fraction d'un tel sang, ce qui comprend des échantillons enrichis en leucocytes, chacune des espèces ou chacun des types suivants de précurseurs, de globules blancs du sang, de plaquettes, de tissus étroitement associés aux globules blancs sanguins,

etc Ces espèces comprennent des myéloblastes, des promyélo-

cytes, des myélocytes, des métamyélocytes, des bandes, des neutrophiles, des éosinophiles, des basophiles, des lymphocytes B, des lymphocytes T et des monocytes Les plaquettes peuvent également être identifiées et comptées, mais elles présentent

de la métachromasie dans leurs granules.

Lorsqu'on la soumet à des analyses vitales après traite-

ment par de l'orangé basique N O 21, chacune des espèces ci-

dessus de leucocytes est différenciée, en lumière blanche comme

en lumière fluorescente, par une réponse métachromatique inha-

bituelle des cellules ou globules au colorant et à la source

de lumière à laquelle le champ préparé est exposé.

Sous les deux types de source lumineuse (ou les sources de lumière bimodale), chacune des espèces individuelles citées peut être différenciée de ses voisines, chaque espèce peut être comptée, on peut déterminer le nombre total de chaque espèce présente, on peut étudier la morphologie de chaque espèce et l'on peut effectuer de nombreuses déterminations

d'une grande valeur pour les sciences de la santé.

Fondamentalement, chacun des globules blancs du sang précité ou des leucocytes sorbe de manière différente la lumière blanche ou fluorescente, provenant du même colorant métachromatique pur, selon la qualité du colorant, l'espèce de leucocyte et la réception du colorant par des éléments des

18 2523310

cellules spécifiques présentes dans l'échantillon, ou la frac-

tion d'échantillon, que l'on analyse.

En l'absence de fixateurs, le colorant basique utilisé selon la présente invention est sorbé de manière métachromique, de sorte que chaque classe, type ou espèce de leucocytes, de

lymphocytes ou de granulocytes reflète un spectre caractéris-

tique de lumière ou une couleur différente de chaque autre classe, type ou espèce de blastocytes, cellules myéloldes, leucocytes ou granulocytes présents dans l'échantillon La métachrosamie étonnamment vive en lumière blanche Lumme tn

-lumière fluorescente du colorant unique de la présenta inven-

tion est remarquable et même unique en son genre Chaque espèce de la série comprenant les myéloblastes, les promyélocytes,

les myélocytes, les métamyélocytes, les bandes, les neutro-

philes, les éosinophiles, les basophiles, les lymphocytes B, les lymphocytes T et les monocytes, sorbe ainsi le colorant

métachromatique unique de manière à réfléchir un spectre lumi-

neux distinctif ou une couleur de la lumière visible, et un autre spectre lumineux différent et distinct ou une couleur différente par exposition à une lumière fluorescente Il n'est pas exclu de faire appel à des combinaisons des colorants de la présente invention avec d'autres colorants de la même classe chimique, qui manifestent un comportement métachromatique semblable lorsqu'ils sont éclairés par deux types de source

de lumière (ou sources bimodales).

Le brevet principal se fonde sur la découverte d'un groupe de colorants métachromatiques remarquables pouvant servir isolément, mais souvent en combinaison, pour identifier et distinguer cinq espèces de globules blancs du sang, à savoir

les neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles, les lympho-

cytes et les monocytes, les uns par rapport aux autres, lors-

qu'ils sont présents dans un échantillon de sang humain.

La présente invention constitue un développement de la découverte de la capacité du colorant, connu sous le nom de orangé basique ne 21, lorsqu'on l'utilise seul dans un milieu aqueux en appliquant une technique d'analyse vitale du sang sur un échantillon ou une fraction sans fixateur, à

19 2523310

colorer de manière métachromatique inhabituelle et distinctive la série précédemment identifiée de globules du sang humain et des plaquettes, mais en opérant, dans le cas présent, sous

lumière fluorescente.

Cette possibilité d'identification des espèces indivi- duelles l'une par rapport à l'autre sous lumière fluorescente

reflète un remarquable ordre de différence.

L'orangé basique N O 21 est identifié par son numéro, 48 035, du Color Index, par ses structures chimiques et les

courbes spectrales, décrites et citées dans le brevet princi-

pal et le premier Certificat d'Addition.

Bien qu'on ne souhaite pas se lier par une théorie, on peut indiquer qu'il est bien connu que presque n'importe quel additif étranger a tendance à dénaturer les matières protéiniques Jusqu'à présent, l'utilisation de fixateurs dans la préparation des échantillons de sang en vue de leur coloration a constitué une pratique universelle L'expérience

a indiqué que la fixation gêne la coopération entre le méta-

chromatisme du globule et la qualité métachromatique des colo-

rants de la présente invention En appliquant une technique de "coloration vitale", c'est-à-dire en colorant à l'aide de "colorants vitaux" un échantillon sans fixateur, on évite également de former des artéfacts ennuyeux dans le champ d'examen En utilisant la technique consistant à faire appel à deux sources de lumière (lumière bimodale), on peut vérifier l'identification des cellules et globules individuelr et éliminer totalement tout risque de confusion dfl à un artéfact éventuel. Dans la pratique de la présente invention, la coloration est assez instantanée pour qu'aux températures normales du sang ( 370 C), le cytologiste ne soit pas obligé d'attendre ni de faire appel à de la cytochimie fine avant que ne se produise le développement de la couleur des globules et une différenciation spectrale des membres précédemment énumérés de la famille des leucocytes, des lymphocytes et des cellules

granulocytiques, avant de commencer ses études sous le micros-

cope, en utilisant un équipement manuel ou un équipement auto-

2523310

matisé pour la numération différentielle des leucocytes (ou

la détermination de la formule leucocytaire du sang).

Comme indiqué dans le brevet principal, voici des caté-

gories et types d'échantillons de sang sans fixateur que l'on peut utiliser: 1 du sang entier additionné d'un anticoagulant (E.D T A, citrate, héparine);

2 des suspensions de leucocytes obtenues par sédimenta-

tion,à l'aide de dextrane et/ou par gravité, d'un sang entier additionné d'un anti-coagulant;

3 Des échantillons de sang entier traités par une solu-

tion hypotonique pour lyser les globules rouges du sang, ce

qui laisse principalement les globules blancs et les plaquet-

tes; 1 S 4 des échantillons d'autres fluides corporels, comme

du fluide spinal, pleural ou ascitique, ainsi que des échantil-

lons d'un fluide d'articulation dans lesquels les globules

blancs du sang sont intéressants.

La présente invention ne propose pas spécifiquement un équipement automatisé pour l'établissement d'une formule

leucocytaire du sang en lumière blanche ou en lumière fluo-

rescente, mais dé tels systèmes et équipements ont fait, et continuent de faire, l'objet d'un examen en profondeur et

peuvent Etre près d'une commercialisation.

La conférence du Collège des Pathologistes Américains (Aspen, Colorado, août 1975) a publié une série d'articles présentés alors, dans une collection intitulée "Differential Leukocyte Counting" (Etablissement de la formule leucocytaire

du sang) Ces articles et rapports fournissent des développe-

ments, et manifestent l'intérêt porté par la technique,

concernant des machines à calculer ou ordinateurs pour l'éta-

blissement automatique d'une formule leucocytaire du sang.

On peut encore noter les brevets US-A-3 916 205 et US-A-446 604 (Kleinerman), selon lesquels on utilise certains colorants

fluorescents en des combinaisons particulières pour une diffé-

renciation automatique de certains leucocytes et autres globu-

les sanguins, en se fondant sur une réponse en lumière fluo-

21 2523310

rescente On peut en outre noter que Kleinerman se fie à une fixation des cellules et globules, ce qui est habituel dans les études de leucocytes au microscope et semble se fier à des colorants fluorescents dont on n'exige pas qu'ils soient métachromatiques, ou qui le sont, et dont on n'exige

pas une activité de fluorescence en présence des leucocytes.

L'art antérieur indique plusieurs niveaux de discrimina-

tion lors de l'établissement d'une formule leucocytaire du

sang La différenciation entre des globules polymorphonuclé-

aires et des globules "mononucléaires" a une importance fon-

damentale et principale A un niveau intermédiaire, la différenciation des polymorphes ou polynucléaires en des

neutrophiles, des éosinophiles et des basophiles, et la sépa-

ration des "mononucléaires" entre des monocytes et des lym-

phocytes, sont considérées comme possibles en principe.

Un troisième niveau apparent de difficultés implique la différenciation des neutrophiles en des formes immatures

et matures, et la division des lymphocytes en des types nor-

maux et réactifs, ce qui a été mentionné dans le brevet prin-

cipal Pour autant qu'on le sache actuellement, le présent exposé propose le seul procédé permettant de différencier simplement, à l'aide d'un seul colorant pur, les blastocytes, les leucocytes de la série myélolde ou des granulocytes,

les bandes, les leucocytes polymorphonucléaires (neitrophi-

les), les éosinophiles, les basophiles, les globules B et les globules T ainsi que les monocytes et plaquettes, le tout à l'aide d'un seul colorant et d'une seule fraction d'échantillon et d'un choix de sources lumineuses, en faisant appel à des stumuli (ou un éclairage)de lumière blanche et/ou

fluorescente.

On pense que la technique des équipements automatisés d'établissement d'une formule leucocytaire du sang se trouve

actuellement en état avancé de développement en ce qui con-

cerne l'utilisation de la lumière blanche et/ou de la lumière

fluorescente et d'un seul colorant aqueux On semble princi-

palement faire appel, pour les comptages différentiels, à un équipement manuel et à des opérations préliminaires

22 2523310

complexes On affirme que l'équipement automatisé appartient à deux groupes généraux ou classes: 1) les dispositifs de

reconnaissance des structures; et 2) les dispositifs de diffé-

renciation cytochimique Il en ressort que les méthodes de coloration de l'art antérieur servent avec plus ou moins de succès et que des opérateurs utilisant des machines peuvent suivre l'opération sur la base d'une étude ou d'une numération cellule par cellule Si les systèmes cytochimiques actuels

sont précis, ils ont encore besoin de développement de dispo-

sitifs satisfaisants d'étalonnage, et ils exigent des opéra-

teurs hautement qualifiés Il semble donc avantageux de pouvoir

observer un seul champ de microscope sous deux modes d'éclai-

rage, choisis à volonté.

Un bref examen d'ensemble des procédés de l'art anté-

rieur faisant appel à des colorants fluorescents et à des

sources de lumière fluorescente fait ressortir les points sui-

vants: ( 1) la présence d'au moins deux sources de lumière

est essentielle, ce qui comprend la lumière violette et ultra-

violette; ( 2) une troisième source de lumière semble également nécessaire; ( 3) le système semble exiger des colorations effectuées à l'aide de plusieurs colorants fluorescents pour permettre d'identifier et de différencier les types et espèces de leucocytes; ( 4) le système exige l'emploi de frottis de

sang fixés à l'alcool; ( 5) le temps nécessaire pour la colora-

tion est de l'ordre de 10 minutes; on rince durant une minute

puis l'on sèche; ( 6) il semble que l'intensité de la fluo-

rescence diminue dans lordre suivant: (a) les eosinophiles vers (b), les neutrophiles vers (c), les monocytes vers (d), les lymphocytes (l'identification des basophiles n'est pas décite dans l'art antérieur); ( 7) dans un système comportant des tubes à écoulement pour cytométrie, les globules sanguins sont fixés par du formaldéhyde et colorés par trois solutions colorantes différentes; ( 8) un comptage différentiel et une classification de la fluorescence des leucocytes décelés sont

réalisés à l'aide des taux ou rapports entre la lumière fluo-

rescente; ( 9) un des brevets cités ne décrit que l'identifi-

cation de quatre seulement des cinq types ou espèces de leuco-

23 2523310

cytes; ( 10) trois colorants fluorescents sont spécifiés il faut les combiner pour produire une composition dite de "colorant unique", et cette combinaison semble essentielle,

et pas seulement avantageuse, pour la mise en oeuvre du pro-

cédé antérieur décrit. Dans le brevet principal, on a utilisé, pour éclairer le champ du microscope, de la lumière blanche ordinaire qui est une forme d'énergie électromagnétique de rayonnement

capable de provoquer la sensation de la vision dans un rayon-

nement lumineux se situant dans une longueur d'onde comprise entre environ 4 000 et 7 000 Ancqstroms Dans le procédé du brevet principal, la partie choisie du spectre de la lumière visible traversant le milieu des leucocytes comportant le colorant est absorbée dans le champ On doit comprendre que, ici, le terme "fluorescence" concerne l'émissivité On pense que la fluorescence est dûe à l'émission d'un rayonnement électromagnétique par le milieu émetteur choisi comportant des leucocytes et du colorant et que les émissions cessent lorsque l'apport d'énergie cesse L'expérience actuellement

acquise indique que la nature de la source de l'énergie élec-

tromagnétique provoquant les émissions métachromatiques à partir des leucocytes colorés par l'orangé basique no 21 et différenciant les diverses cellules, comme décrit ici, n'est pas fondamentale Il peut s'agir d'une lampe à vapeur de mercure, telle qu'utilisée couramment dans les microscopes à fluorescence; on a trouvé satisfaisant, en variante Ju point de vue fonctionnel que l'énergie provienne d'un faisceau

sélectif et provienne par exemple d'un laser Le terme "absor-

ption" semble s'appliquer à des spectres de lumière blanche, et le terme "fluorescence" dans le cas des émissions citées

en dernier lieu.

Les procédés décrits se fondent sur une technique de "coloration vitale" La présente invention permet d'envisager un système de surveillance continue pour le diagnostic et le traitement en hôpital, notamment lorsqu'une observation des globules blancs du sang, effectuée directement sur le patient, risque d'être un objectif souhaité, ce qui entre

24 2523310

dans les possibilités des procédés bimodaux décrits ici.

Les expressions de colorant vital et colo';t ion v il ale n'excluent pas la possibilité d'une perfusion continue, à l'aide d'un circuit dérivé partant des vaisseaux sanguins d'organismes vivants, et la possibilité d'une surveillance ou d'un monitorage en continu de l'ensemble des globules blancs possible, pendant leur passage dans un tube spécialisé de dérivation en vue de l'observation et du dénombrement,

en utilisant un laser cohérent comme source d'énergie lumi-

neuse pour provoquer la fluorescence de chaque globule indivi-

duel du sang pendant son observation sous cytométrie et pendant qu'il est individuellement éclairé (ou rendu émetteur d'une lumière fluorescente) alors qu'il passe par un point

constituant le foyer du champ de grandissement du microscope.

En raison des limitations inhérentes au procédé panopti-

que de coloration d'échantillons, on a conçu, au cours des

diverses décennies passées, un certain nombre de tests cyto-

chimiques en vue de distinguer plus précisément un type de globules sanguins d'un autre En général, ces tests sont destinés à déceler l'accroissement de la quantité d'un type de substance, dans une cellule ou un globule particulier,

en comparaison d'un autre globule ou d'un autre type de subs-

tance, ou bien à déceler une ou des substances dans un orga-

nite cellulaire caractéristique d'une cellule en comparaison d'un autre organite ou d'une autre cellule Par exemple, l'activité d'estérase non spécifique est inhabituellement

élevée chez les monocytes, et cette activité semble parti-

culièrement sensible à une inhibition par du fluorure de sodium De même, l'identification des granulocytes dépend dans la plupart des cas de la mise en évidence de propriétés de lysosomes Dans ce but, la détection des activités de myéloperoxydase et d'estérases spécifiques s'est avérée utile pour des tests cytochimiques Les granules de lysosome des eosinophiles contiennent de la myéloperoxydase capable de résister à une inhibition par du cyanure de sodium, et les

granule-; des basohiles peuvent subir une coloration méta-

chromatique à l'aide de divers colorants, en raison notamment de leur teneur élevée en des substances cationiques comme l'héparine. Comme on le notera ici, le noyau des monocytes ne se

colore pas, mais l'on identifie les monocytes par différencia-

tion de la couleur du cytoplasme et des granules à l'aide d'un petit nombre d'autres colorants inhabituels décrits ici, qui sont également métachromatiques en lumière blanche comme

en lumière fluorescente.

La technique de la coloration vitale, qui utilise des globules vivants du sang et leurs affinité différentes pour une coloration vitale de ces globules et cellules par des colorants aqueux dilués, sans fixateur, évite l'apparition d'artéfacts que l'on trouve souvent dans le cas de la mise en oeuvre des fixateurs classiques En utilisant à la fois

de la lumière blanche et de la lumière fluorescente, on éli- mine sensiblement la confusion créée par des artefacts -La technique de

coloration vitale et les sources de lumière bimodale (ou de deux types de lumière) que l'on propose ici permettent de refléter la localisation du colorant dans les cellules-(par exemples les lysosomes, les structures fibrillaires, la chromatine du noyau),plus précisément que dans le cas de l'utilisation d'une seule qualité de lumière La poursuite de l'expérience acquise avec l'orangé basique n* 21

comme colorant et les perfectionnements apportés à la techno-

logie de détermination automatisée de la formule leucocytaire du sang, en utilisant des sources de lumière de concert avec la coloration vitale, sans fixateur, des leucocytes du sang

périphérique introduisent un complément supplémentaire impor-

tant dans le domaine de la cytochimie.

Il est commode, en ce point de l'exposé, de se référer

à la figure unique qui peut permettre de comprendre l'identi-

fication et la différenciation des leucocytes, que permet le progrès ici décrit On comprendra, cependant, que cette figure représente des objets tridimensionnels et doit évoquer une variation de couleur et de la florescencequ'il est difficile de représenter sur une planche de dessin plane en

noir et blanc.

Tous les globules sanguins semblent provenir de cellules

souches non différenciées et appelées cellules du mésenchyne.

Les descendants immédiats des cellules souches sont appelés

blastes, et l'on admet que les myéloblastes spécifiques engen-

drent les leucocytes différenciés et rendus identifiables et dénombrables par leurs analyses vitales, par adsorption de la lumière blanche ou émission d'une lumière fluorescente, ou les deux, simultanément ou successivement par exposition à de l'orangé basique n'21 dans un environnement aqueux sans fixateur Les myéloplastes sont identifiés ici par l'absence

de granules ou de lysosomes qui identifient de manière caracté-

ristique, par leur sorption d'un colorant métachromatique ou par fluorescence, les trois cellules descendantes dans la série ou lignée myéloide Les trois cellules descendantes, à savoir des promyélocytes, des myélocytes et des métamyélocytes, sont

chacune identifiées séparément par la coloration métachromati-

que et différentielle et par la distribution de la couleur,

comme on le décrira.

On identifie facilement les promyélocytes par les obser-

vations manuelles ou automatiques suivantes Ce sont générale-

ment les cellules ou globules ayant les plus grandes dimensions parmi les cellules de la série myéloide représentée Le noyau ovale N-1 n'est pas coloré par l'orangé basique no 21, iii par absorption ni par fluorescence, et il constitue une partie relativement grande du granulocyte total En absorption de lumière, on voit que le cytoplasme C'comporte un garnissage

étroit ou serré d'un grand nombre de granules primaires rela-

tivement petits, de couleur rouge orangé (magenta) 1, et l'on peut observer aussi la présence de quelques granules épars, 2, de couleur violette, qui sont généralement distribués dans

une large masse de granules primaires de couleur rouge orangé.

Dans les conditions d'émission d'une fluorescence, les granules primaires ou lysosomes 1 ont une fluorescence en jaune vif

et le cytoplasme présente une fluorescence en vert plus terne.

Les myélocytes possèdent également un noyau N-2 ovale, non coloré, de surface et volume légèrement moindres Le fait distinctif remarquable consiste en le net développement, dans le myélocyte, de plus gros granules secondaires 4, jaunes, formant un croissant qui s'épaissit généralement dans la cellule du myélocyte immature Deux lignes imaginaires a-a entourent et délimitent le nombre croissant de gros granules secondaires 4 jaunes des myélocytes par rapport au nombre décroissant de granules primaires 6 plus petits, de couleur rouge orangé ou magenta On peut observer que les myélocytes se distinguent des promyélocytes par le développement isolé notable de granules secondaires jaunes 4 Ces granules qui en absorption de lumière blanche sont de couleur magenta,

émettent également une fluorescence jaune vif dans des condi-

tions d'émission de fluorescence, et les plus gros granules

secondaires en cours de développement manifestent une fluores-

cence en vert pâle.

Comme dans le cas des deux cellules ci-dessus (N 1 et N 2), les métamyélocytes ont également un noyau N 3 non coloré, qui commence à présenter le développement d'une structure ou

* forme lobulaire, se distinguant de la forme ovale antérieure-

ment décrite pour la première cellule de la série myélo de.

Les granules primaires plus petits 6, de couleur rouge orangé ou magenta, forment une masse qui diminue et occupe une surface proportionnellement mineure de la surface totale du cytoplasme

C-2 observée pour cette cellule De plus gros granules secon-

daires 8, de couleur jaune, semblent déplacer une partie cen-

trale importante du noyau N-3 non coloré, antérieurement ovale, ce qui explique la modification que l'on entend décrire par le passage "d'une forme ovale à une forme lobulaire" Les configurations flwrescentes que l'on obtient sont constamment semblables et reconnaissables Les cellules secondaires ont

maintenant une dimension plus grande que dans le cas des myélo-

cytes. Des bandes se distinguent progressivement et elles ont été séparées des trois premières cellules décrites, montrant la coloration métachromatique des granules et faisant partie

de la série myéloide.

Pour autant qu'on le sache, les bandes n'ont pas été, jusqu'à présent distinguées de l'ensemble des autres leucocytes

par la métachromasie d'un colorant quelconque.

Les bandes se distinguent de tous les autres leucocytes par la présence d'un noyau N-5 de forme lobulaire, non coloré,

qui, comme la dimension globale des bandes, a nettement dimi-

nué en surface ou en volume en comparaison des leucocytes

constituant les formes antérieures dans la série myéloîde.

De plus, la forme lobulaire du noyau N-5 non coloré est

devenue plus bifurquée du fait de la poursuite de la crois-

sance du cytoplasme C-6 vers l'intérieur de ce noyau La

croissance, par augmentation du nombre des granules secon-

daires jaunes 12 dans le cytoplasme, a déplacé la quasi-

totalité des autres granules primaires 10, plus petits, de couleur rouge orangé qui ne forment plus qu'un très petit amas On note que l'amas des granules rouges 10 se situe spécifiquement dans le prolongement ou mouvement du cytoplasme

C-6 vers l'intérieur du noyau N-5 tendant à segmenter ce noyau.

De plus gros granules secondaires jaunes 12 ont réussi à "coloniser" le cytoplasme C-6, sauf ce groupe à couleur contrastée caractéristique des bandes Le point important de séparation des bandes consiste en le petit amas de granules

rouges 10 dans le cytoplasme C-6 en 10.

Il est suggéré que ce point important de différenciation des bandes par rapport à tous les autres leucocytes est

extrêmement utile pour le développement d'un équipement auto-

matisé destiné à percevoir les petits granules primaires 10, de couleur rouge orangé, entourés par un nombre largement prédominant de plus gros granules secondaires 12 de couleur jaune.

Comme dans les conditions d'absorption, dans les condi-

tions de fluorescence les bandes présentent un petit amas de granules 10 à fluorescence jaune dans des cytoplasmes C-6 dans la configuration caractéristique ci-dessus des cellules, avec présence prépondérante aussi des granules secondaires

12 à fluorescence vert pâle.

La possibilité de distinguer, identifier et de compter facilement, rapidement et certainement des bandes parmi tous les autres leucocytes à l'aide d'un seul colorant sous une

252331 O

stimulation par de l'énergie bimodale (à deux types de longueur d'ondes), comme décrit ci-dessus, va au-delà des espoirs et au-delà de toutes théories connues sur le rôle et la fonction

des bandes.

Les neutrophiles sont des globules blancs matures du

sang, et le brevet principal a indiqué qu'on peut les recon-

naitre parmi les cinq classes principales de globules blancs intéressants D'autres détails intéressants viennent d'être établis. Sur des dessins ne reproduisant pas les couleurs, les neutrophiles, les éosinophiles et les basophiles semblent tous

présenter une configuration physique relativement semblable.

Lorsqu'on utilise de l'orangé basique 21 comme seul colorant vital dans un environnement sans fixateur, on ident-ifie les neutrophiles par la présence, dans le cytoplasme C-8, de

granules secondaires 16 qui sont surtout de couleur jaune.

Le noyau N-8 n'est pas coloré et il est généralement segmenté.

Les gros granules secondaires jaunes 16 constituent la surface

ou masse majeure du cytoplasme C-8 Sous stimulation de fluo-

rescence, on identifie principalement les neutrophiles, comme ci-dessus, par la présence caractéristique du noyau N-8 trilobé (segmenté) et par la fluorescence du cytoplasme C-8 en vert terne. Lorsqu'on les observe dans des conditions d'absorption de la lumière blanche, les éosinophiles possèdent également un noyau segmenté et non coloré N-10, mais leurs gros granules secondaires 18 se différencient de ceux des neutrophiles et des basophiles par leur couleur orangée, qui constitue la

caractérisation et même la principale caractéristique du cyto-

plasme C-10.

L'excitation d'une fluorescence a révélé un développe-

ment extrêmement intéressant et caractérisant dans le cas des éosinophiles La structure générale montrant un noyau N-10 en deux sections est courante en cas d'examen par deux types de lumière (ou en lumière bimodale) Cependant, les granules secondaires présentent un contour jaune vif ou une fluorescence "d'enveloppe" autour de la périphérie des granules secondaires 3 ( O 18 que l'on n'avait pas établie jusqu'à présent Ce "marquage" remarquable, noté dans le cas des éosinophiles sous stimulation d'émission (de fluorescence) donne un moyen de vérifier les observations faites par l'examen antérieur par absorption de lumière blanche et suggère également un phénomène intéressant concernant la structure des granules secondaires eux mêmes que l'on ne connaissait pas jusqu'à présent Par observation A l'aide des deux sources d'énergie,

les structures générales sont par ailleurs confirmées.

Le noyau segmenté N-12 des basophiles n'est également pas coloré par l'orangé basique 21 dans des conditions d'absorption de lumière blanche, mais les granules secondaires

diffèrent des granules des neutrophiles 18 par la colora-

tion métachromatique des granules 20 des basophiles en un cramoisi vif présentant une faible nuance ou un faible fond bleu. L'éclairage des basophiles dans des conditions stimulant la fluorescence donne également une configuration de structure sensiblement semblable à celle observée par absorption de lumière Cependant, les granules secondaires 20 émettent une

florescence jaune citron d'un brillant inhabituel.

On note, dans la lignée de cellules indiquées, que chacun des leucocytes représentés sur la figure unique, les neutrophiles, les éosinophiles et les basophiles, provient des bandes qui en constituent le précurseur spécifique La

figure annexée n'indique pas de façon détaillée cette progres-

sion Les promyélocytes sont indiqués comme étant des précur-

seurs des monocytes.

Les lymphocytes B et les lymphocytes T ont des noyaux essentiels ovales N14 et N-16, respectivement Chacun de ces noyaux, N-14 et N-16, se colore en un jaune semblable

par absorption de lumière blanche Le cytoplasme C-14 et C-

16 reste non coloré dans chaque cas Une caractéristique du cytoplasme C16 des lymphocytes T différencie nettement les

lymphocytes T des lymphocytes B Cette caractéristique con-

siste en la présence, dans le cytoplasme C-16 des lymphocytes

T, du petit amas des granules rouges 22.

Lorsqu'on observe les mêmes échantillons que ci-dessus sous l'influence d'une lampe à vapeur de mercure comme source

lumineuse, par exemple, le petit amas de granules 22 du cyto-

plasme 16 des cellules T émet une fluorescence en jaune vif, et l'on a observé que les noyaux N-16 sont le plus souvent sensiblement non colorés, mais l'on a noté qu'ils manifestent, dans les mêmes examens, une fluorescence en vert terne La configuration est tout à fait comparable et confirmative dans les deux modes d'observations Dans les cellules B, le noyau

présente constamment une fluorescence en vert terne.

Lorsqu'on effectue des observations en utilisant les deux qualités ou modes d'énergie de stimulation, on constate qu'en cas d'absorption de lumière blanche, le noyau des cellules B a une couleur jaune et, en cas d'observation sous une lumière provoquant une émission de fluorescence, ce noyau manifeste une fluorescence en vert terne Dans les deux types d'examen avec deux modes de lumière, on n'a pas pu d'observer d'amas de granules secondaires dans le cytoplasme des cellules

B Cette configuration est décisive pour la distinction.

On a déjà noté dans le brevet principal une observation

assez remarquable selon laquelle les monocytes ont un comporte-

ment particulier, aussi bien en observation sous lumière blanche en présence de tous les colorants quaternaires basiques dont on a trouvé à l'origine l'activité métachromatique que dans le cadre des études plus récentes utilisant des énergies provoquant une émission de lumière fluorescente Les monocytes manifestent constamment un comportement métachromatique, aussi bien qu'une émission de fluorescence, non seulement en présence de l'orangé basique N O 21, mais avec plusieurs autres colorants

de la série des cyanines, du rouge basique et du violet basi-

que, antérieurement décrits ici.

Avec l'orangé basique n'21, le noyau N-18, de forme générale ovale, des monocytes ne se colore pas Cependant, le cytoplasme C-18 prend une couleur rose dans laquelle on peut discerner un nombre relativement faible de granules épars 24,de couleur cramoisie et rose, dont la nuance, la valeur

et la saturation de couleur diffèrent suffisamment de la cou-

leur "rose" du cytoplasme C-18 pour permettre une nette différenciation optique par rapport au r, y 1;îo;p ' C-18, qui

a une coloration rose généralement semblable.

Sous une stimulation de fluorescence par des ondes élec-

tromagnétiques, tous les membres indiqués de la classe des

colorants dérivés de la cyanine ou de la méthine et des colo-

rants polyméthiniques décrits ici, provoquent des émissions de fluorescence par les monocytes ainsi colorés Avec

l'orangé basique n' 21, les quelques granules 24 du cyto-

plasme C-18 ont une fluorescence en jaune vif Les violets basiques et rouges basiques cités, qui colorent par phénomène métachromatique les noyaux des monocytes, par absorption de couleur blanche, provoquent également une florescence

métachromatique en cas d'observation sous une énergie provo-

quant une émission de fluorescence.

Comme également indiqué dans le brevet principal, la découverte du groupe des colorants inhabituels qui y est

d'écrit simplifie l'identification et la numération des mono-

cytes La réaction classique de détermination d'une estérase non spécifique sensible à du fluorure, que l'on utilise en cytochimie pour identifier les monocytes,exige souvent une

heure, voire plus, pour s'achever et il faut des manipula-

tions cytochimiques très précises pour le succès de cette détermination Avec l'un quelconque des colorants décrits dans le brevet principal, on peut effectuer simplement, sans ajustements chimiques, en quelques minutes, la coloration d'une suspension, de fractions de sang entier ou de fractions séparées, et leur examen Lorsque, dans le procédé de la présente invention, en utilisant seulement l'orangé basique 21, on colore les monocytes, cette coloration est instantanée pour le cytoplasme et pour les granules présents dans le cytoplasme. Il convient de noter que les colorants métachromatiques peuvent finalement colorer les cellules à un point tel que des identifications bi-modales soient perdues Ainsi, les différences de couleurs indiquées dans le présent exposé risquent d'être perdues, ou diminuées dans une large mesure, si des analyses ne sont pas rapidement effectuées Comme une coloration pratique se produit presque immédiatement dans

presque tous les cas connus, il n'est, cependant, pas néces-

saire d'attendre pendant une période prolongée pour noter des différences maximales.

Dans l'art antérieur, l'identification et la différen-

ciation des monocytes ont été réalisées par un traitement cytochimique complexe des cellules, qui demandait beaucoup de temps et impliquait une réaction de non-présence d'estérase,

la préparation de cellules fixées, une hexazotation, un ajuste-

ment du p H et une coloration à l'aide de plusieurs colorants demandant environ 60 minutes pour réaliser ce qui peut l'être en moins d'une minute avec l'un quelconque des colorants du brevet principal, avec observation sous lumière blanche ou par fluorescence, si on le désire, par un simple contact de

l'échantillon de sang et du colorant avec un système aqueux.

Avec le colorant spécifique du présent procédé décrit ici, il y a également une coloration préférentielle et instantanée

du cytoplasme des monocytes.

On prépare,-pour l'utilisation finale proposée et aux fins de la résente invention, le colorant remarquable en cause sous forme d'une solution aqueuse filtrée à la concentration d'environ 1 % de l'orangé basique 21 pur, par exemple, dans de l'eau distillée La concentration du colorant n'est pas

particulièrement fondamentale et peut faire l'objet de varia-

tions On préfère que les solutions aqueuses soient utilisées pendant qu'elles sont fratches et qu'elles ne comportent pas

d'additifs toxiques La présence de l'un quelconque des fixa-

teurs classiques connus risque d'inhiber totalement la réaction métachromatique entre le colorant et le type spécifique ou

la classe de leucocytes.

Le terme "vital" que l'on utilise ici constitue une caractéristique et une limitation importantes Ce terme s'applique à l'échantillon de sang d'origine et à des cellules vivantes fraîchement retirées d'un organisme vivant, ou d'un organisme fraîchement sacrifié, ou de leurs équivalents Tel qu'il sert ici, ce terme entend exclure tous les "fixateurs", mais il permet l'utilisation des anti-coagulants (héparine,

E.D T A, etc) Les cellules ou globules du sang peuvent éga-

lement être retirés de la moelle des os, de l'urine et d'autres échantillons biologiques qui en contiennent, comme, par exemple, le tissu lymphatique et la rate. Voici une illustration de la pratique générale de la présente invention On prépare une solution à l % dans l'eau distillée du colorant cationique quaternaire basique choisi, on filtre tous les solides non dissous L'orangé basique 21 est extrêmement utile Si la pratique en indique la nécessité, on peut y mélanger, un ou plusieurs des colorants en cause sous forme

de solutions aqueuses s'il le faut pour un but spécifique.

Le colorant pur unique choisi et identifié ci-dessus (on peut également utiliser des combinaisons avec un ou plusieurs des colorants purs, comme décrit et illustré sur les tableaux I, II et III du brevet principal) est solubilisé pour produire une simple solution aqueuse du colorant (L'étude des diverses proportions volumétriques de la solution aqueuse du colorant, et diverses forces ou concentrations des solutions aqueuses de colorants peut donner les conditions optimales pour diverses analyses cytologiques spécifiques) Un peu d'expérimentation peut conduire à des combinaisons spécifiques ayant des avantages particuliers Cela est envisagé, mais sort

du cadre purement inventif du présent exposé.

Les échantillons de sang peuvent provenir de diverses sources, mais l'on utilise principalement des échantillons frais de sang veineux dont les érythrocytes ont été enlevés (par centrifugation, lyse hypotonique, sédimentation par gravité,

sédimentation par gradient de densité, etc), ou bien l'échan-

tillon peut être un plasma enrichi en globules blancs par des techniques physico-chimiques connues Des tissus dans lesquels des cellules ou globules sont présents, peuvent également être colorés et soumis pour étude à un stimulus par deux types de

lumière.

On préfère combiner le colorant aqueux et l'échantillon

de sang, tous deux fraîchement préparés ou obtenus, à la tempé-

rature du sang ou du corps normal (environ 360-40 'C) lorsque les analyses prévues l'indiquent On obtient généralement une coloration plus rapide et plus nette aux températures

élevées L'orangé basique 21 ne semble pas présenter de sensi-

bilité à la température. Les solutions du colorant et du sang se comportent bien lorsqu'on les combine selon un rapport volumétrique d'environ 1:4 On agite doucement le mélange durant quelques secondes et l'on examine une goutte du mélange immédiatement sous forme d'ux) Montage humide en utilisant une lamelle de verre de recouvrement, dans le champ d'un microscope optique ou dans

un équipement automatisé de comptage différencié des leuco-

cytes (ou d'établissement de la formule leucocytaire du sang), si on dispose d'un tel équipement D'autres façons de mettre en contact le colorant et les globules sanguins comprennent l'utilisation de milieux connus, comme par exemple la gélatine, des émulsions, etc, imprégnés du colorant à la concentration d'env iron 1 % du colorant Une fixation de l'échantillon gêne gravement la co-action métachromatique, inhabituelle, du ou

des colorants de la présente invention avec les leucocytes.

L'utilisation de l'orangé basique 21 permet d'examinei

en lumière blanche seule, sous lumière provoquant de la fluo-

rescence seule, ou sous les deux types de lumière, simulta-

nément, isolément ou successivement selon l'équipement dispo-

nible, et de distinguer les cellules suivantes les unes des autres, si elles sont présentes ensemble: myéloblastes,

promyélocytes, métamyélocytes, myélocytes, bandes, neutrophi-

les, éosinophiles, basophiles, lymphocytes B, lymphocytes T et monocytes L'exposé antérieur ou ci-dessus à propos de la figure annexée esquisse les moyens de différenciation pour

une numération et pour une autre étude éventuelle La techni-

que ci-dessus facilite une identification.

Les exemples présentés ici à titre illustratif aideront l'homme du métier à apprécier les possibilités des nouveaux procédés proposés Parmi lés divers avantages du ou des procédés, la numération des leucocytes (totaux) , la numération des types ou espèces de leucocytes, le diagnostic de maladies, notamment des leucémies, et la surveillance de monitorage de patients auxquels on applique divers traitements délicats, comme par exemple de la chimiothérapie, une thérapie par des rayonnements, de l'ACTH, etc, ne constituent pas les moindres avantages. On sait que l'identification et la numération d'une espèce de leucocytes, d'espèces choisies de leucocytes ou de la totalité de ces espèces de leucocytes, présentent souvent une importance fondamentale pour le diagnostic et le traitement

de maladies.

Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer la mise en pratique de l'invention et son utilité Bien entendu,

ces exemples ne sont ni exhaustifs ni limitatifs.

EXEMPLE 1

Orangé basique no 21 lEn se fondant sur la découverte initiale de la capacité inhabituelle de l'orangé basique na 21 à colorer de manière métachromatique et de façon différentielle les globules blancs du sang, on s'est procuré un nombre très important de colorants

appartenant aux séries des colorants méthiniques, polyméthini-

ques, quinoniques et/ou de la carbocyanine Sur plus de 2 000 colorants, seul l'orangé basique n' 21 s'est avéré présenter

la métachromasie inhabituelle en lumière blanche et en fluo-

rescence, comme décrit ici à titre illustratifl.

On a obtenu sur des individus normaux, dans une série

de tubes comportant de l'héparine, 50 ml de sang périphérique.

On a mélangé en double des tubes avec 10 ml d'une solu-

tion à 1 % du colorant orangé basique ne 21 dans de l'eau dis-

tillée, à environ 37 'C On n'a pas observé un effet fondamental

de la température sur ce colorant.

Lors de l'étude au microscope, on a décrit à l'origine

les éosinophiles comme ayant des granules bruns On peut main-

tenant les décrire de façon plus précise comme ayant de gros

granules de couleur orange dans le cytoplasme, en cas d'obser-

vation par absorption de lumière blanche,et comme présentant une fluorescence en jaune vif dans une enveloppe, avec un noyau lobulaire non coloré dans les deux types de lumière On a observé, dans les deux modes de lumière, que les basophiles ont une configuration géométrique semblable, mais, en cas d'observation par absorption de lumière blanche, les granules présentent dans leur masse une couleur cramoisi brillant avec une faible teinte bleue, et ces granules manifestent une fluo- rescence en jaune vif Le noyau est également lobulaire et il n'est pas coloré en cas d'examen sous les deux modes ou deux types de lumière Les monocytes se différencient nettement du fait que leur noyau ovale n'est pas coloré et qu'ils ont un cytoplasme rose contenant un petit nombre de granules cramoisis et roses En lumière fluorescente, les granules sont

jaune vif L'expression "non coloré peut comprendre des colo-

rations extrêmement pâles selon le temps qui s'est écoulé avant

l'examen de lecture de la lame.

De façon tout à fait remarquable, la coloration diffé-

rentielle des neutrophiles, tant matures qu'immatures, est plus spécifique qu'avec n'importe quel colorant ayant Jusqu' présent fait l'objet d'observations au cours des études du

présent inventeur ou citées dans l'art antérieur Dans l'obser-

vation avec absorption de lumière blanche, les neutrophiles matures sont identifiables par voie spectrale du fait du petit nombre de gros granules, de couleur surtout jaune, dans le cytoplasme et de la présence du noyau lobé non coloré Sous fluorescence, le cytoplasme présente une fluorescence en vert

terne, et les granules ne sont pas aussi visibles.

EXEMPLE 2

On a préparé des suspensions de sang humain riche en cellules T et en cellules B à partir d'échantillons de 50 ml de sang périphérique obtenus à partir d'individus normaux dans des tubes en "Vacutainer" contenant de l'héparine, par passage

de fractions, enrichies, de Ficoll-Hypaque à travers des micro-

colonnes de toile de "Nylon" On a élué les colonnes, les sus-

pensions riches en cellules T et riches en cellules B, en uti-

lisant des conditions réglées de température, avec différents

tampons choisis,en opérant comme connu dans l'art antérieur.

On a soumis des fractions de ces suspensions récupérées à des analyses immunologiques en utilisant la formation de

rosettes de cellules T pour déceler des cellules T et la détec tion d'immunoglobulines de surface pour déceler des cellules B On a

incorporé une goutte d'une solution aqueuse à I % du

colorant orangé basique 21 à 5 gouttes de la suspension recueil-

lie dans des tubes à essais séparés Chaque tube a contenu environ 2 x i 06 lymphocytes On a observé au microscope que les lymphocytes, identifiés comme étant des cellules T du fait de la formation de rosettes de cellules T, contiennent de

petits groupes ou amas de 5 à 10 granules rouges ou davantage.

En observation sous fluorescence, "es noyaux n'ont pas été colorés dans certains cas, ou ont présenté une fluorescence vert terne, et les mêmes amas de granules ont présenté une fluorescence en Jaune vif Les lymphocytes identifiés par des méthodes immunologiques comme étant des cellules B n'ont

présenté qu'un rare granule coloré en rouge dans le cyto-

plasme; la plupart des lymphocytes B ne comportaient pas de granules rouges présents dansle cytoplasme Le noyau était ovale et coloré en jaune dans les cellules T aussi bien que dans les cellules B En observation en fluorescence, les noyaux des lymphocytes B ont présenté une fluorescence vert terne,

et le cytoplasme n'a pas été affecté.

L'utilisation de l'orangé basique 21 constitue, par rapport à la méthodologie actuellement connue, un procédé nouveau et rapide pour identifier, différencier et compter les lymphocytes T et B et des cellules, par examen sous deux types ou modes de lumière ou sous stimulation seulement Les

procédés actuellement connus impliquent l'utilisation de réac-

tifs biologiques instables (cellules de moutons), exigent des techniques radio-isotopiques onéreuses et demandant beaucoup de temps, exigent la maîtrise de nombreuses variables comme la température, le p H des milieux d'incubation, etc, ce qui

ne semble plus nécessaire.

EXEMPLE 3

Une femme âgée de 48 ans, présentant un cancer de la poitrine à son état terminal, a développé de la septicémie et une forte fièvre peu avant de mourir A ce moment crucial,

sa numération de globules blancs s'est élevée à 45 000 par mm 3.

En utilisant la coloration classique de Whright, il a été éta-

bli que 6 Q % des leucocytes du sang périphérique étaient des bandes présentant un noyau caractéristique non segmenté Des échantillons de sang de la patiente ont été colorés à l'aide d'une solution aqueuse à 1 % d'orangé basique no 21, comme

colorant vital utilisé sans fixateurs.

On a identifié des bandes par la présence constante d'un petit amas de granules (primaires) se colorant en rouge parmi un plus grand nombre de granules (secondaires) plus gros O qui se sont colorés, de façon métachromatique, en jaune, ainsi que le noyau typique non segmenté Les granules primaires de

l'amas ont présenté, lors de leur éclairage par lumière provo-

quant de la fluorescence, une fluorescence en jaune.

Ainsi, il a été possible d'effectuer des opérations positives d'identification, de différenciation et de numération des formes de bandes en se fondant sur la maturation de leur cytoplasme et sur la différence de couleur entre leurs granules primaires et secondaires, en cas d'observation par

absorption de lumière blanche, et en se fondant sur la fluores-

cence en jaune de l'amas des granules primaires.

EXEMPLE 4

Un homme de 24 ans a manifesté de la fatigue et il a présenté à l'examen général une rate dilatée Les résultats de laboratoire ont montré un nombre de globules blancs du sang de 15 000 par mm 3 et environ 75 % des globules étaient des

lymphocytes atypiques Lors d'essais immunologiques supplémen-

taires, on a trouvé qu'il s'agissait de globules T Le patient a présenté un test positif de monotache, et l'on a posé un diagnostic de mononucléose infectieuse En utilisant de l'orangé basique N O 21 comme colorant vital, on a trouvé que la plupart des lymphocytes contenaient dans le cytoplasme, très près du noyau non coloré, un amas de granules se colorant de façon métachromatique en rouge Sous fluorescence, on a constaté que les mêmes granules ont présenté une fluorescence en jaune vif avec un noyau manifestant une florescence en vert terne.

EXEMPLE 5

Un homme de 75 ans a présenté des ganglions lymphatiques dilatés dans le cou et dans la région inguinale, ainsi qu'une rate dilatée Des études de laboratoire ont révélé de l'anémie, et un nombre de globules blancs du sang de 80 OOO/mm 3 Environ % de ces globules étaient des lymphocytes, et à l'examen de la moëlle des os, on a trouvé que la moëlle était remplacée

dans une large mesure par des lymphocytes d'aspect semblable.

On a posé le diagnostic de leucémie lymphocytaire chronique

Lors des essais immunologiques, on a trouvé que les lympho-

cytes étaient des globules B En examinant sous lumière blanche, en utilisant de l'orangé basique N O 21 comme colorant vital, on n'a pas vu de granules Sous fluorescence, il n'a pas été possible de voir de granules dans le cytoplasme des

lymphocytes.

EXEMPLE 6

In homme de 33 anre a présenté de la faiblesse Pt de la fat igue,

et l'on a trouvé qu'il avait une rate fortement dilatée.

L'examen de laboratoire a révélé un nombre de globules blancs du sang de 800 000 m 3 ainsi qu'une petite anémie, mais un nombre normal de plaquettes Lors d'une coloration classique de Wright du sang périhérique, on a vu tous les stades de maturation des leucocytes avec prédominance de promyélocytes,

de myélocytes et de métamyélocytes On a vu de nombreux éosi-

nophiles, basophiles et érythrocytes nucléés En se fondant

sur l'examen de la moelle des os et sur des évaluations cyto-

génétiques, on a posé le diagnostic de leucémie granulocytaire chronique. En utilisant l'orangé basique no 21 comme colorant vital

et en examinant sous lumière blanche, on a vu la différencia-

tion métachromatique attendue des leucocytes En lumière de fluorescence, les granules primaires, qui se sont colorées

par voie métachromatique en rouge, ont présenté une fluores-

cence allant d'un jaune vif au vert-jaune Des cellules qui contenaient surtout des granules secondaires (par exemple des neutrophiles) ont présenté une couleur jaune vif lors de l'examen à la lumière blanche mais une fluorescence en

252331 O

vert terne sous lumière fluorescente Des basophiles ont présenté une fluorescence en jaune vif de leurs granules, et les mêmes granules ont semblé rouge vif lors d'un examen en lumière blanche Dans les éosinophiles, les granules se sont colorées en orangé vif lors de l'examen à la lumière blanche mais, lorsqu'on a utilisé de la lumière fluorescente, les granules ont montré de la fluorescence seulement autour

de leur périphérie, en une configuration "d'enveloppe" fluo-

rescente.

EXEMPLE 7

Sur une femme de 25 ans présentant de l'asthme bronchi-

que, on a effectué une numération globulaire de routine faisant partie de son examen général Lors de l'étude den

des différents leucocytes, on a trouvé enviion 40 % d'éosino-

philes Quand on a utilisé l'orangé basique no 21 comme colo-

rant vital avec un examen en lumière blanche, on a trouvé

que les granules des éosinophiles se sont colorés en orangé.

Sous lumière fluorescente, les mêmes granules ont présenté

une fluorescence de "l'enveloppe".

EXEMPLE 8

Une femme de 62 ans, présentant un diabète sucré et un carcinome du colon à l'état terminal, a développé de

l'anémie et de la leucocytose peu avant de mourir La numéra-

tion des globules blancs du sang a indiqué-la présence de 35 000 globules/ma 3 et, lors de l'examen par coloration de

Wright, on a trouvé de nombreux myélocytes et promyelocytes.

Lorsque l'on a utilisé de l'orangé basique n'21 comme colorant vital, avec un examen en lumière blanche, les granules des

promyélocytes et myélocytes se sont colorés, par voie miéta-

chromatique, en rouge ou magenta et ils ont présenté une fluo-

rescence en jaune vif Comme on s'y attendait, ces granules ont été plus nombreux dans les promyélocytes que dans les myélocytes.

EXEMPLE 9

Chez un homme de 47 ans présentant une leucémie lympho-

blastique aiguë, la numération des globules blancs du sang

a-indiqué 10 000 globules par mm 3, contenant 80 % de lympho-

blastes leucémiques (positifs à l'essai PAS et sans réaction de désoxynucléatidyl-transférase lriniriile" En utilisant l'orangé basique N O 21 comme colorant vital, on a trouvé que

* ces lymphoblastes de leucémie ont présenté une faible colora-

tion jaune du noyau, en cas d'observation en lumière blanche,

et pas de fluorescence du noyau sous lumière fluorescente.

Les blastes leucémiques de plusieurs patients présentant de la leucémie aiguë manifestent une fluorescence nettement diminuée en comparaison de celle des leucocytes normaux Ainsi, on peut différencier des cellules normales d'avec des cellules leucémiques.

Dans la description et les exemple ci-dessus, on a

insisté sur l'importance que les progrès ici décrits peuvent avoir lorsqu'on les applique à des équipements automatisés d'établissement de la formule leucocytaire du sang On ne

connaît pas actuellement d'équipements capables de tirer avan-

tage, directement et sans modification, du procédé ici décrit avec mise en oeuvre de deux types de lumière ou avec la seule utilisation de la lumière fluorescente, ayant servi dans l'art

antérieur.

On sait, cependant, qu'il existe au moins trois éléments d'un équipement analytique se fondant sur l'émission d'une

lumière fluorescente et utilisant, dans certains cas, des colo-

rants de l'art antérieur qui, par nature, ne manifestent pas de fluorescence métachromatique On pense que ces dispositifs sont capables de déterminer les configurations de cellules éclairées par de la lumière, de déterminer les dimensions de

configurations spéciales définies ou délimitées par des diffé-

rences de couleur fluorescente, et que divers lasers de lumière cohérente servent, en totalité ou en partie, à l'identification

et à la numération des cellules ainsi différenciées Ces appa-

reillages connus dans l'art antérieur comprennent "Epic V" (Coulter), "FACS" (Becton-Dickinson) et "Cytofluorograph" (Ortho). L'homme du métier et ceux qui travaillent dans le domaine de la technologie médicale savent bien l'importance d'une détermination précise et rapide des diverses numérations et différenciations de leucocytes, ou de l'établissement d'une formule leucocytaire, à diverses fins Il a été estimé qu'aux Etats- Unis d'Amérique, on effectue chaque jour un demi-million

de déterminations des formules leucocytaires du sang, en appli-

quant dans la plupart des cas des techniques manuelles, ce qui coûte plus de 750 millions de dollars ( 5 milliards de

francs) par an.

De telles numérations, manuelles ou automatisées, exi-

gent fondamentalement que l'on puisse identifier, différencier par voie spectrale et compter les cellules, notamment pour faciliter un diagnostic en médecine Il n'est pas douteux que le progrès ci-dessus dans ces domaines fondamentaux va donner

naissance à des progrès dans le domaine d'un équipement auxi-

liaire automatisé, comme indiqué ici.

Les numérations sanguines, dont il est ici question, constituent, qu'elles soient manuelles ou automatisées, des aides très importantes, voire vitales, pour l'examen et la détermination de la nature d'une maladie On peut ainsi mieux

déceler, et donc mieux traiter, des fièvres d'origine inex-

pliquée, dues à une infection virale, ou non pyogène, à un appendice impliquant une formation de pus, à la vésicule biliaire ou aux trompes de Fallope; on peut mieux établir un pronostic pour des patients présentant diverses maladies à divers stades; des tumeurs malignes, ce qui comprend la

maladie de Hodgkins; une maladie pulmonaire; on peut surveil-

ler le traitement des patients par des stéroides du type des hormones corticosurrénales (corticothérapie), ainsi que divers genres de leucémies aiguës et chroniques; on peut établir

une différence, lors du diagnostic, entre un infarctus asepti-

que de l'os et-une ostéomyélite Un dénombrement précis des leucocytes, leur analyse et leur étude cytologique peuvent ainsi contribuer au diagnostic, au pronostic et au traitement

des états maladifs ci-dessus, ainsi que des infections bacté-

riennes et aussi contribuer à l'étude de nombreuses autres

questions médicales -

Tel qu'il sert ici, le terme "métachromatique" concerne non seulement la qualité particulière et inhabituelle des

colorants ici décrits, mais aussi la qualité des divers cons-

tituants, par exemple le noyau et le cytoplasme, de chaque type ou espèce individuels de leucocyte qui coréagissent de manière métachromatique avec quelque chose, à la manière d'une synergie, pour produire la différence de réponse spectrale

permettant les progrès ici décrits en cytochimie Essentielle-

ment, chaque type ou espèce de globules blancs du sang sorbe (ou ne sorbe pas) un seul colorant métachromatique d'une façon inhabituelle et remarquable, de sorte que chaque cellule ayant sorbé un colorant donne par réflexion et absorption un spectre lumineux individuel et différent, sous un stimulus de lumière blanche ordinaire et par émission de fluorescence Chose curieuse, les colorants ici décrits sont métachromatiques en

lumière blanche et par émission de fluorescence.

On sait bien que certains leucocytes granulaires présentent des affinités différentes pour divers colorants, c'est-à-dire que les basophiles présentent de l'affinité pour

les colorants basiques, les éosinophiles présentent de l'affi-

nité pour des colorants acides et les neutrophiles ne se colo-

rent pas intensément sous l'effet des colorants acides ou basiques L'art antérieur ne suggère cependant pas l'existence

de caractéristiques morphologiques ou d'un comportement chimi-

que permettant à l'orangé basique 21 de présenter spécfiquement

des distinctions aussi nettes que celles que l'on trouve main-

tenant entre les lymphocytes T et les lymphocytes B et permet-

tant la distinction inhabituelle des bandes sous un stimulus

de lumière à deux types ou modes, comme décrit ici.

Cela semble d'autant plus étrange lorsqu'on constate que l'orangé basique 22, dont la structure chimique ne varie que par des différences de position de deux groupes secondaires comme étudié ci-dessus, est totalement inefficace aux fins

ici visées.

L'identification, la différenciation et la numération

des monocytes ont une grande importance pour un diagnostic.

La présence d'un nombre accru de monocytes dans le sang peut indiquer l'existence d'une tuberculose active, d'une septicémie ou d'un empoisonnement du sang et des lymphomes comme dans le cas d'un diagnostic de la maladie de Ilodgkins I présence d'un nombre accru de monocytes dans le sang de personnes se relevant d'une anémie hypoplastique ou aplastique peut appeler un pronostic favorable pour le patient Des analyses rapides et précises de monocytes au microscope, par le procédé de l'invention, favorisent une application étendue d'une technique intéressante. La détection, l'identification et la numération des leucocytes polymorphonucléaires (neutrophiles) constituent des paramètres très importants, voire critiques, dans toutes les évaluations du sang Ils sont particulièrement importants dans le diagnostic d'infections aiguës comme la pneumonie ou la péritonite, au cours desquelles le nombre de neutrophiles augmente Ils sont importants aussi pour la surveillance de monitorage de patients soumis à une chimiothérapie et à une thérapie par des rayonnements Une diminution des numérations peut se produire dans le cas d'une infection écrasante, comme

manifestation de la toxicité des drogues, en cas d'hyperactivi-

té de la rate et au cours de la leucémie aiguë.

Si le -nombre absolu des neutrophiles tombe au-dessous

de 1 000 par mm 3, le risque d'infection augmente très fortement.

Le colorant spécifique de la présente invention colore instan-

tanément les granules ou lysosomes constituant une structure

caractéristique d'identification des leucocytes polymorphoru-

cléaires ou neutrophiles, à l'examen sous l'une ou l'autre des sources de lumière, ou sous les deux sources de lumière

décrites ici.

Les éosinophiles comme les basophiles sont impliqués dans des réactions allergiques Les lymphocytes sont impliqués

dans une inflammation et à un plus grand degré dans des réac-

tions immunitaires et dans des réponses à des antigènes (corps étrangers) Les éosinophiles sont instantanément identifiés par la présence des grands granules de couleur orange dans le cytoplasme et par la configuration lobulaire du noyau non coloré en cas d'examen par absorption de lumière, et par la fluorescence inhabituelle de "l'enveloppe" lorsqu'on provoque

la fluorescence de l'échantillon de sang ou de tissu colore.

La numération des éosinophiles sert à surveiller l'administration médicale de l'hormone corticotrope ACTH lors du traitement d'états cliniques Les procédés antérieurs ont introduit des artefacts donnant lieu à des confusions et àdes formes mal défiinies res;eiablan 1 t à s'y méprendre aux éosinophiles. La précision et la numération des globules sanguins diminue, dans l'art antérieur, à mesure que le temps s'écoule entre la préparation d'un échantillon de sang et l'achèvement de la numération On utilise alors essentiellement de multiples colorants Il faut souvent effectuer des colorations a l'aide de colorants acides et basiques Les colorants utilisés dans l'art antérieur tendent à se séparer par cristallisation de

leur solution au repos.

On sait que les lymphocytes, spécifiquement identifia-

bles à titre de classe, à l'aide du bleu borrel, sont liés à une inflammation et à des réactions immunitaires Leur nombre augmente dans le sang des personnes présentant de la leucémie

lymphatique chronique et de personnes ayant la coqueluche.

Leur nombre peut diminuer chez des patients soumis à une chimiothérapie et-à une radiothérapie, chez les patients

présentant un lymphome et dans le cas de divers types de défi-

ciences immunologiques héréditaires.

Les basophiles ont un cytoplasme qui contient de gros granules riches en substance cationique comme l'héparine, la sérotonine et l'histamine Ils sont impliqués, par exemple,

dans les réactions allergiques.

Le principal progrès de la présente invention réside dans la découverte d'un colorant, actuellement remarquable, qui colore de façon différentielle les lymphocytes (qui n'étaient antérieurement colorés que sous forme d'une classe par le bleu borrel) à de plus faibles températures et qui peut servir sous une seule forme pure pour une identification, aussi bien manuelle qu'automatique, et pour une étude de chaque espèce ou type indiqué, par éclairage à la lumière blanche et/ou sous un spectre fluorescent, ce qui donne deux modes

de vérification et d'examen d'un champ de microscope, compor-

tant des globules ou cellules, pour l'étude de chaque espèce indiquée. La différenciation des cellules T et des cellules B, au cours d'études effectuées selon l'art antérieur, implique des préparations et modes opératoires biochimiques plus complexes, comportant la détermination ou la mise en oeuvre de: 1) de la phosphatase acide (enzymes); 2) une estérase non spécifique; 3) des fragments d'immunoglobulines humaines (Ig G); 4) des colorants fluorescents non métachromatiques et 5) des préparations de globules rouges de sang de mouton ayant une vie utile d'environ 14 jours, ce qui constitue la base de la formation des rosettes pour l'identification des

cellules T et dépend de la température.

On trouve les lymphocytes T dans 60 à 80 % du sang péri-

phérique et dans 85 à 90 % du sang du canal thoracique On sait que ces cellules sont liées à des rejets d'allogreffes, et l'examen des cellules T et des cellules B est important en immunologie et en pathologie Les cellules B sont moins nombreuses et se trouvent à raison de 10 à 30 % dans le centre

germinatif et les cordons médulaires.

Les toxicomanes et les personnes manifestant de l'accou-

tumance à certaines drogues ou médicaments présentent une dimi-

nution importante du nombre des cellules T. Les troubles immunologiques congénitaux sont, dans leur très grande majorité, liés aux systèmes des cellules T

et des cellules B on sait également que les maladies néoplas-

tiques impliquent le système immunogénétiqueet il est admis

que ces patients présentent des anomalies des systèmes généra-

teurs des lymphocytes T et des lymphocytes B Les lymphomes d'adultes ont le plus souvent pour origine des cellules B. D'autre part, les lymphomes des enfants comportent des cellules T de marquage, que l'on pense liées au thymus, plus actif au

début de l'enfance.

La leucémie lymphorytaire chronique est une maladie apparentée aux cellules B; un leucémique présente des cellules B et ne comporte pas d'amas de cellulles T Ce bref exposé

sommaire permet de voir la grande portée et l'importance d'une

identification, d'une comparaison et d'une numération faciles

et rapides de ces cellules.

On pense que Ehrlich a 1 le; il N iieni mi tliti il;('i' ( 1397) le terme "métachromatique" pour décrire une coloration qui change de couleur apparente lors de la sorption du colorant par certaines cellules Le colorant est dit présenter de la métachromasie, et l'on a observé qu'il s'agit d'une propriété caractérisant un nombre relativement faible de colorants purs, surtout des colorants cationiques basiques comprenant des méthines, des polyméthines et des carbocyanines, qui colorent

des éléments tissulaires en une couleur différente La méta-

chromasie se définit également comme supposant l'émission,

par des substances différentes, de spectres de couleurs diffé-

rentes, lorsque ces substances sont colorées par le même

colorant La métachromasie de fluorescence est très rare.

En cytologie, des granules ou autres éléments cellulaires métachromatiques sont ceux qui prennent une couleur différente

de celle du colorant servant à les colorer.

Deux facteurs sont impliqués de manière inhérente dans

l'exposé ci-dessus de la signification des termes "métachroma-

tique" et "métachromasie" L'un est la cellule biologique

(et ses parties spécialisées),, que l'on appelle "métachromati-

que" ou "chromotrope"t et il s'agit alors d'une qualité ou d'une caractéristique de l'échantillon de cellules biologiques,

et l'autre concerne la qualité dtenlorant Très peu de colo-

rants possèdent ce qui constitue une qualité essentielle pour stimuler une ou des structures à l'intérieur d'une cellule et leur faire manifester de la métachromasie par absorption de lumière ou fluorescence Conn ( 9 e édition) indique que "des colorants purs montrant cette réaction sont très peu

nombreux" Il existe peu de rapports indiquant que le phéno-

mène a impliqué jusqu'à présent plus de deux spectres colorés distincts Dans un cas, on a signalé "une légère coloration en bleu-vert clair dunoyau, avec une métachromasie violette du cartilage" Cependant, les colorants étant normalement appliqués alors à des tissus fixés, dont la nature chimique et physique est altérée par les modes opératoires usuels de préparation à la coloration, une coopération essentielle entre les caractéristiques des structures biologiques naturelles

au sein d'un échantillon de cellules risque d'être ainsi modi-

fiée et d'être rendue non sensible à ce qui pourrait, sinon, provoquer une réaction, de sorte qu'une sorption du colorant ne se produit alors pas. On connait bien des colorants fluorescents Au cours de la fluorescence, une plus grande énergie lumineuse est émise, sur d'étroites fréquences choisies, que l'énergie absorbée dans ces fréquences choisies, bien que l'énergie totale de la lumière réfléchie ne soit pas supérieure à celle de la lumière totale absorbée On connait de la métachromasie par fluorescence (certains colorants de la ciasse comportant

comme chromophore de l'acridine peuvent présenter de la fluo-

rescence par un phénomène métachromatique) Cependant, cette qualité de métachromasie n'entre pas dans le cadre du terme "métachromasie", tel qu'on l'utilise ici Ce terme a servi dans le brevet principal, et sert ici, en accord avec le sens que l'on trouve dans l'ouvrage de Conn ( 9 e édition) et dans "Synthetic Dyes in Biology, Medicine and Chemistry" lColorants synthétiques en biologie, médecine et chimiel, de Gurr, et

dans "Rational use of Dyes in Biology" lUtilisation ration-

nelle des colorants en biologiel de Gurr, o l'on ne trouve

aucune référence à de la "métachromasie de fluorescence".

Au cours de ses études, l'inventeur a trouvé qu'un tout petit

nombre des colorants inhabituels décrits dans le brevet prin-

cipal présente une double métachromasie, et ce sont ces der-

niers colorants qui sont spécifiquement visés dans la présente invention. Les colorants méthiniques, polyméthiniques, dérivant de la quinoléine et de la carbocyanine, dans lesquels le groupe chromophore ainsi identifié forme un pont entre d'autres groupes chromophores dans la classe des cationiques, présentent le plus grand intérêt et sont extrêmement prometteurs comme classe de composés Souvent, par exemple, on trouve qu'un groupe méthine ou polyméthine forme un pont entre un

ou plusieurs chromophores portant des noyaux quinoléine.

Après la découverte, décrite dans le premier Certificat d'Addition notamment, de l'intérêt pouvant être

attaché à l'orangé basique n 21, qui est un colorant polymé-

thinique, pour la classification des globules blancs du sang, des échantillons d'autres colorants orange basiques, identifiés dans le Color Index par les numéros 22, 27, 42, 44 et 46, ont

été trouvés et soumis à des essais de métachromasie Ces colo-

rants étaient indiqués comme se situant dans la classe des polyméthines On a également essaye les oranges basiques 24,25, 26 et 28 Ces derniers n'étaient pas des polyméthines Parmi tous les orangés basiques essayés, ce qui comprend des oranges basiques du type méthine et polyméthine, seul le colorant orangé basique n 21 s'est avéré être un colorant utile aux

fins de la présente invention.

Il a été établi que le rouge basique 13 et le violet basique 16, de la classe comportant comme chromophores de la

méthine et des polyméthines, sont intéressants, par un pheno-

mène métachromatique sous deux modes d'éclairage, pour l'iden-

fication des monocytes du sang La recherche a été étendue pour couvrir les rouges et violets de méthine et de polyméthine

du Color Index, identifiés et disponibles de la même manière.

Les rouges basiques 14,15,27,37,68 et 102 se sont avérés,

après des essais, manquer de la qualité de métachromasie essen-

tielle pour colorer des monocytes et/ou d'autres leucocytes

(par absorption de lumière blanche). Cependant, les rouges basiques 36 et 49 (qui sont tous polyméthiniques),

dont on a antérieurement établi qu'ils sont utiles pour une coloration métachromatique différentielle des globules blancs du sang, peuvent également servir ici On a trouvé que les colorants violets basiques 7,15, 16,39 et 40 (qui sont tous, également, des polyméthines) peuvent servir dans le cas présent Cependant, le violet basique 14, qui n'est pas classé à titre de polyméthine dans le Color Index, n'a pas développé de métachromasie de coloration ds globules blancs du sang, lors d'un examen par absorption de lumière blanche

ou par émission.

Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'invention, de nombreuses modifications peuvent être apportées au procédé

ici décrit.

Claims (7)

REVENDICATIONS

1 Procédé d'examen et d'analyse, sous le microscope,

selon l'une quelconque des revendications 1,2 et 5 du brevet

principal, des leucocytes et lymphocytes d'un sang humain et des stades de développement de cellules granulocytiques

neutrophiles présentes dans un échantillon dans un environ-

nement aqueux sans fixateurs, procédé destiné à l'identifi-

cation, la numération et l'étude des monocytes présents dans cet échantillon, l'examen étant effectué sous l'influence d'une source d'énergie provoquant une émission de lumière fluorescente, procédé caractérisé en ce qu'on colore ledit échantillon à l'aide d'une solution aqueuse d'un colorant quaternaire organique cationique, basique, choisi parmi l'ensemble constitué par l'orangé basique n' 21, le rouge basique n'13, le rouge basique n' 36, le rouge basique N 049, le violet basique n* 7, le violet basique n'15, le violet basique n'16, le violet basique N 036, le violet basique n'39 et le violet basique n'40; on soumet l'échantillon ainsi coloré à l'action d'une énergie d'ondes pouvant stimuler la fluorescence desdites cellules exposées, la lumière émise par fluorescence constituant un moyen de différenciation des monocytes, présents dans l'échantillon, par rapport à tous

les autres globules sanguins.

2 Procédé selon la revendication 1, destiné à différen-

cier chacune des espèces de cellules individuelles présentes et caractérisé en ce qu'on colore l'échantillon à l'aide d'une

solution aqueuse d'orangé basique n' 21, on soumet l'échantil-

lon ainsi coloré à une énergie d'onde stimulant la fluorescen-

ce des cellules ainsi exposées, ce qui donne un moyen optique

pour différencier chacune des cellules présentes dans l'échan-

tillon en des espèces de cellules identifiables, par voie

optique, les unes par rapport aux autres.

3 Procédé d'examen et d'analyse selon la revendication 2, dans lequel les cellules ou globules du sang humain se trouvant dans un échantillon provenant d'un donneur comprennent une ou plusieurs des espèces ou un ou plusieurs des types suivants de cellules: myéloblastes, promyélocytes, myélocytes, métamyélocytes, bandes, neutrophiles, éosinophiles, basophiles, monocytes, lymphocytes B et lymphocytes T, le procédé étant caractérisé en ce qu'il permet d'identifier et de différencier par voie optique ces types ou espèces les uns par rapport aux autres à l'aide de la lumière émise par fluorescence. 4 Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'énergie de stimulation de l'émission de la lumière de fluorescence provient, au moins en partie, de la lumière

cohérente d'un faisceau laser.

5 Procédé d'analyse vitale,au microscope, des leucocy-

tes et lymphocytes d'un sang humain normal ou pathologique, présents dans un échantillon provenant d'un donneur, dans un environnement aqueux sans fixateurs, procédé caractérisé en ce qu'on expose ledit échantillon au colorant orangé basique no 21, on stimule la fluorescence de chaque espèce colorée présente dans ledit échantillon par l'impact d'une énergie ondulatoire et l'on différencie chacun des globules du sang les uns des autres par la présence ou l'absence d'une couleur et d'une configuration de fluorescence caractéristique du noyau et du cytoplasme,et par le nombre, la dimension,

l'agencement, la configuration et la ou les couleurs de fluo-

rescence émises par les granules présents, leurs dimensions, le nombre et l'emplacement des granules éventuellement présents

dans le cytoplasme.

-6 Procédé d'analyse vitale des leucocytes et lympho-

cytes d'un sang humain normal ou pathologique, présents dans un échantillon de sang provenant d'un donneur et comprenant un ou plusieurs des types suivants ou une ou plusieurs espèces

suivantes de cellules: myéloblastes, promyélocytes, myélocy-

tes, métamyélocytes, bandes, neutrophiles, éosinophiles,

lymphocytes, basophiles, monocytes, lymphocytes B et lympho-

cytes T, caractérisé en ce qu'on soumet à une exposition

sélective séparée, pour un examen de comparaison et une iden-

tification optique les uns des autres, l'échantillon à une absorption de lumière blanche et à une émission de lumière de fluorescence, ce qui permet de vérifier l'identification d'une espèce, parmi les cellules ou globules précités,par les configurations optiques caractéristiques de ladite espèce et par la nature différente de la lumière réfléchie ou émise par le noyau, le cytoplasme et les granules desdits globules sanguins lorsqu'on les observe en lumière blanche et avec émission d'une lumière de fluorescence.

7 Procédé d'analyse, sous le microscope, avec absorp-

tion de lumière blanche et émission de lumière de fluorescen-

ce selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on examine un échantillon de sang provenant d'un donneur normal et en l O bonne santé pour le comparer avec un second échantillon de

sang provenant d'un autre donneur et pouvant être pathologi-

que, afin de donner une information pouvant servir à un diag-

*nostic. 8 Procédé d'analyse vitale, sous le microscope, de globules de sang humain sans fixateurs, ce procédé permettant une différenciation par voie optique, une comparaison et une numération des lymphocytes T et des lymphocytes B présents dans un échantillon de sang d'un donneur, procédé caractérisé en ce qu'on colore dans un environnement aqueux

l'échantillon provenant du donneur à l'aide du colorant méta-

chromatique orangé basique n'21, on soumet cet échantillon ainsi coloré à l'action d'une source d'énergie stimulant l'émission d'une lumière de fluorescence et l'on différencie ainsi les cellules T présentes des cellules B par la mise en évidence d'un amas de granules, ayant par fluorescence une couleur jaune vif, dans le cytoplasme de cellules T qui peuvent présenter une coloration vert terne fluorescent du noyau, et les cellules B présentes dont le cytoplasme ne comporte essentiellement pas de granules fluorescents ni de couleur de fluorescence mais dont le noyau présente une

fluorescence en vert mat ou terne, ce qui permet d'identifi-

cation requise.

9 Procédé selon la revendication 8 d'analyse vitale des globules du sang humain, par examen au microscope,

procédé caractérisé en ce qu'on soumet un échantillon conte-

nant des cellules en bandes à l'action d'une source d'énergie stimulant une émission de lumière fluorescente et l'on

différencie les cellules de la bande d'autres cellules appa-

rentées du sang,par la mise en évidence d'un amas relativement petit de granules fluorescents jaune vif présents dans des parties du cytoplasme et d'un noyau sensiblement non coloré et devenu bifurqué par la croissance du cytoplasme vers le

centre dudit noyau.

Procédé d'analyse vitale, au microscope, d'un sang humain, caractérisé en ce qu'on effectue des opérations de différenciation, de numération et de comparaison, par voie

optique, de chacun des individus d'une série myéloide gianulo-

cytique comprenant, lorsqu'ils sont présents: des promyélo-

cytes, des myélocytes, des métamyélocytes, des bandes et des neutrophiles, en soumettant au moins une fraction d'échantillon de sang humain sans fixateurs à une coloration mêtachromatique

vitale par contact dans un environnement aqueux avec une solu-

tion du colorant orangé basique n' 21, ce qui permet de diffé-

rencier les promyélocytes par la présence de granules primaires ayant une fluorescence en jaune vif d'un côté du cytoplasme des myélocytes par une distribution relativement régulière de granules primaires, d'un jaune vif, dans tout le cytoplasme; des métamyélocytes par la présence d'une plus petite masse de granules primaires, à fluorescence jaune vif, dans le

croissant plus petit opposé à une saillie limpide et non colo-

rée de cytoplasme vers l'intérieur du noyau; les bandes par la présence d'un amas relativement petit de granules primaires à fluorescence jaune vif dans un champ dominant de cytoplasme

et bifurcation générale de la masse du noyau; et les neutro-

philes par la présence d'un cytoplasme moins distinct présen-

tant une fluorescence en vert profond, dans lequel les granules manifestent une fluorescence en jaune vif, chaque membre de la série cidessus ayant une surface ou volume de noyau diminuant apparemment et restant sensiblement non coloré, les trois premiers membres de la série ayant une dimension de surface,ou volume,de cellule généralement plus grande que

celle des deux derniers membres de la série.

11 Procédé selon la revendication 2, caratérisé en ce qu'on met en oeuvre le procédé de différenciation des globules sanguins à l'aide d'un dispositif automatique de numération des leucocytes capables de projeter sur le champ coloré du microscope, comprenant les cellules ou globules soumis à l'analyse, deux types d'énergie lumineuse et comportant des oculaires séparés pour observer le même champ

soumis à chaque mode ou type d'énergie lumineuse.