FI92076B - Lymfosyyttien tunnusmerkillinen potentiaalille herkkien aineiden sitominen - Google Patents
Lymfosyyttien tunnusmerkillinen potentiaalille herkkien aineiden sitominen Download PDFInfo
- Publication number
- FI92076B FI92076B FI883489A FI883489A FI92076B FI 92076 B FI92076 B FI 92076B FI 883489 A FI883489 A FI 883489A FI 883489 A FI883489 A FI 883489A FI 92076 B FI92076 B FI 92076B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- lymphocytes
- intensity
- pulses
- malignancy
- mps
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Radar Systems Or Details Thereof (AREA)
- Measurement Of Radiation (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
92076
Lymfosyyttien tunnusmerkillinen potentiaalille herkkien aineiden sitominen
Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee lymfosyyttien tunnusmerkillistä membraanipotentiaalille herkkien aineiden sitomista ja vielä erityisemmin kehossa olevan pahanlaatuisuuden havaitsemiseen tarkoitettua menetelmää, jossa käytetään hyväksi lymfosyyttien tunnusmerkillistä potentiaalille herk-10 kien aineiden sitomista.
Keksinnön tausta
Viime vuosina on esiintynyt lisääntynyttä kiinnostusta biologisten koettimien, kuten esimerkiksi membraanipotentiaalille herkkien väriaineiden käyttöön tarkoituk-15 sena määrittää elävien solujen ja/tai muiden soluisten rakenteiden membraanipotentiaalin muutoksia elävien solujen sähköfysiologisissa ja biofysikaalisissa tutkimuksissa. Tällaisia aineita on esimerkiksi käytetty kalmarin jättiläisaksonisolujen, Cohen LPB ym. J. Membrane Biol.
20 19,1 (1974), punaisten verisolujen, Hoffman, J. R. ja La ris, P. C., Physiol. Lond. 239, 519 (1974), ja sammakon sydämen lihaskudoksen, Morad, M. ja Selema, G., J. Physiol. Lond. 292-267 (1972), membraanipotentiaalin tutkimiseen.
25 Tätä samaa linjaa seuraten on verisolujen tutkimus > · johtamassa ihmisten ja eläinten kehojen sairaustilojen havaitsemiseen tarkoitettuihin menetelmiin. Me olemme esimerkiksi kehittäneet menetelmän syövän sekä muiden antigeenejä tuottavien sairauksien ja kehän tilojen varhaista 30 toteamista varten, jossa menetelmässä sytoplasmisen matriisin rakenteisuudessa (structuredness of cytoplasmic matrix) (SCM) tapahtuvien muutosten tutkimiseksi käytetään solunsisäisen fluoreseiinin fluoresenssin polarisaation mittauksia elävissä soluissa. SCM sisältää monenlaisia 35 solun rakenteita, kuten esimerkiksi mitokondrioita, solu- 2 92076 membraaneja, solunestettä, lysosomeja, ribosomeja, tumia ja vastaavanlaisia rakenteita. Menetelmästämme, jota kirjallisuudessa kutsutaan "SCM-testiksi", sekä käytetystä tekniikasta on tehty yhteenveto L. Cercekin ja B. Cercekin 5 julkaisussa "Application of the Phenomenon of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matric (SCM) in the Diagnosis of Malignant Disorders: A Review", Europ. J.
Cancer, Vol. 13, 903-915 (1977). Tekniikkaamme käyttäen on syövän sekä muuntyyppisten sairauksien ja kehon tilojen 10 varhainen diagnoosi helposti toteutettavissa mittaamalla perifeerisen veren lymfosyyttien tietyn tiheydeltään tarkoin määrätyn alapopulaation tunnusmerkilliset vasteet esimerkiksi fytohemagglutiniini-mitogeeniin ja syöpään assosioituneisiin antigeeneihin. Solunsisäisen fluoreseii-15 nin fluoresenssin polarisaation muutoksia käytetään indikoimaan lymfosyyttien tunnusmerkillisiä vasteita.
Yllä kuvattu menetelmä vaatii kuitenkin hyvin korkeasti koulutetun henkilökunnan ja äärimmäisen varovaisen tekniikan SCM-reagoivien (SCM-responding) lymfosyyttien 20 alapopulaation erottamiseksi ja eristämiseksi verinäyt teestä sekä fluoresenssimittausten tekemiseksi. Lisäksi SCM-testitekniikka vaatii mikroanalyyttistä täsmällisyyttä solunsisäisen fluoresenssin polarisaation mittauksissa, ”·' sekä suurta laitteiden herkkyyttä ja stabiilisuutta. Huono 25 tekniikka ja metabolisessa tilassa tapahtuville häiriöille herkkien lymfosyyttien taitamaton käsittely saattavat johtaa toistokelvottomiin ja täysin virheellisiin testituloksiin.
Niinpä olisikin hyvin toivottavaa saada käyttöön ·] 30 syövän havaitsemiseen tarkoitettu seulontatekniikka, joka on yksinkertaisempi ja vähemmän kallis käyttää ja joka voidaan luotettavasti panna täytäntöön alemman tasoisella teknisellä taitavuudella käyttäen helposti saatavilla olevaa laitteistoa ja saattamalla siten tällaisen seulonta-35 tekniikan metodologia käyttökelpoiseksi kliinisten labo- 3 92076 ratorioiden rutiinikäytössä ja jopa lääkärin vastaanotto-huoneessa .
yhteenveto keksinnöstä Tämä keksintö antaa käyttöön menetelmän, jolla seu-5 lotaan verinäytteitä tutkittavassa kehossa esiintyvän pahanlaatuisuuden paljastamiseksi käyttämällä testitulosten ilmaisemiseen ja rekisteröintiin kaupallisesti saatavilla olevaa laitteistoa. Keksinnön metodologia perustuu tietyn lymfosyyttien alapopulaation tunnusmerkilliseen membraa-10 nipotentiaalille herkän aineen sisäänkuljetuksen (uptake), joka on erilainen riippuen siitä, koetteleeko luovuttaja-kehoa pahanlaatuisuus vai ei. Vaikka tässä määritelty metodologia vielä vaatiikin jonkinasteista taitavuutta oikean tiheydeltään tarkoin määrätyn lymfosyyttien alapopu-15 laation eristyksessä, on se vähemmän vaativa ja ammattiin koulutetun toimesta helpommin toteutettavissa. Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään virtaussytometrian tekniikoita ja laitteistoa, jotka tunnetaan hyvin ja joita on helposti saatavillla, ja lymfosyyttien käsittely on 20 vähemmän ratkaisevaa kuin aiemmin kuvatussa SCM-testissä. Tämä menetelmä on erityisen sopiva käytettäväksi rutiininomaisena syövän seulontamenetelmänä, jota voidaan käyttää yhdessä aiemmin mainitun SCM-testin kanssa, jolla pystytään pahanlaatuisuuden hyvin varhaiseen ja spesifiseen .. 25 diagnoosiin.
Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä elävien lymfosyyttien suspensio yhdistetään sellaisen liuoksen kanssa, joka sisältää membraanipotentiaalille herkkää fluoresoivaa ainetta. Tällaisia aineita, joita tavaksi tulleesti 30 kutsutaan membraanipotentiaalille herkiksi fluoresoiviksi • väreiksi, kutsutaan alempana "MPS-väreiksi". Lymfosyyttien suspension ja MPS-värin välistä yhteyttä pidetään yllä riittävän kauan, jotta sallitaan lymfosyyttien leimautuminen MPS-väriaineella.
35 Edellä kuvatun leimaustoimenpiteen jälkeen nyt lei- 4 92076 matut lymfosyytit johdetaan yksittäisinä soluina kohdistetun heräte-energian lähteen läpi, jotta mikä tahansa MPS-väriaine, jolla lymfosyytit on leimattu, saadaan fluoresoimaan. Kustakin solusta lähtevä fluoresenssiemissio 5 taltioidaan pulssina ja kunkin intensiteetin pulssien lukumäärä säilytetään. Käyrä, jossa pulssien lukumäärän jakautuminen esitetään leimatuista lymfosyyteistä lähtevän fluoresenssiemission pulssien intensiteetin funktiona, on bimodaalinen käyrä, eli käyrä sisältää kaksi huippua. Käy-10 rän ensimmäinen huippu sisältää alhaisen fluoresenssi-intensiteetin pulssit ja toinen huippu sisältää korkean fluoresenssi-intensiteetin pulssit. Kullekin testatulle näytteelle laskettu alhaisen fluoresenssin pulssin kokonaismäärän suhde korkean fluoresenssin pulsseihin tuottaa 15 tekijän, jonka mukaan syövästä kärsivän luovuttajan lymfosyytit on erotettavissa sellaisista lymfosyyteistä, jotka ovat peräisin luovuttajasta, jolla syöpää ei ole kestettävänä. Tämän tekijän, jota tässä kutsutaan alfa-tekijäksi, on havaittu olevan pienempi kuin 2,6 sellaisille 20 lymfosyyttisuspensioille, jotka ovat peräisin pahanlaatuisuuden vaivaamista luovuttajista. Toisaalta 2,6:tta suuremmat alfa-tekijät ovat yhteydessä sellaisiin lymfosyyt-tinäytteisiin, jotka ovat peräisin luovuttajista, joita pahanlaatuisuus ei koettele. Tällä perusteella tämän kek-25 sinnön mukainen menetelmä antaa käyttöön syövän olemassaolon havaitsemiseen tarkoitetun seulontatestin, joka on suhteellisen yksinkertainen, taloudellinen ja jonka täytäntöön paneminen vaatii vain tavanomaisen tasoista ammattitaitoa.
30 Piirrosten lyhyt kuvaus
Keksintö on täydellisemmin ymmärrettävissä keksinnön yksityiskohtaisesta kuvatuksesta luettuna yhdessä kuvioiden kanssa, joissa kuvioissa: kuvio 1 on tyypillinen fluoresenssiemissioiden puls-35 sijakautumaa kuvaava käyrä fluoresenssiemissioiden ollessa 5 92076 lähtöisin tyypillisestä sellaisesta lymfosyyttinäytettä, joka on peräisin luovauttajasta, jolla ei ole pahanlaatuisuutta kestettävänä; ja kuvio 2 on tyypillinen sellaisten lymfosyyttien 5 fluoresenssiemissioiden pulssijakautumaa kuvaava käyrä, jotka lymfosyytit ovat peräisin pahanlaatuisuudesta kärsivästä luovuttajasta.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvas Tämän keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävät 10 solut ovat lymfosyytteja, jotka on erotettu tutkittavasta kehosta otetusta verinäytteestä. Vaikka asiaa ei tällä hetkellä täysin ymmäretä, uskotaan, että lymfosyytit, jotka ovat T-solutyyppiä, ovat osallisina pahanlaatuisuuteen assosioituneiden antigeenien tunnistuksessa. Tietyt lym-15 fosyytit, SCM-reagoiviksi lymfosyyteiksi kutsutut, jotka ovat peräisin syövästä kärsivistä luovuttajista, ovat tulleet in vivo esiherkistetyiksi (prime) tunnistamaan pahanlaatuisuuteen liittyneitä antigeenejä, sellaisia kuin kas-vainsolut muodostavat, ja tämän mukaisesti niillä on ha-20 vaittu olevan erilainen vaste MPS-väreihin kuin sellaisilla lymfosyyteillä, jotka ovat peräisin luovuttajista, joilla pahanlaatuisuutta ei ole kestettävänä.
Tässä keksinnössä käyttökelpoiset lymfosyytit ovat verinäytteestä kätevimmin eristettävissä sentrifugoimalla . 25 verinäytettä tiheysgradienttiliuoksen, sellaisen kuin Fi- t coll 400-liuoksen (Pharmacia A B) ja Triosil 440-liuoksen (Nyegaard & Co.) seoksen, päällä. Verisolut, joilla on pienempi tiheys kuin gradienttiliuoksella, kelluvat gra-dienttiliuoksen pinnalla, ja ne voidaan erottaa soluista, 30 joiden tiheydet ovat suurempia kuin gradienttlliuoksen. Tällainen veren komponenttien erotteluun tarkoitettu me-netelmä, sellainen kuin esimerkiksi R. Harrisin ja E. Uka-ejiofon julkaisema tekniikka, Lancet, Voi. 2, 327 (1969), tunnetaan alalla hyvin. Modifioimalla gradienttiliuos 35 erottelutiheyteen 1,08 grammaa /cm3 25°C:ssa ja osmolaali- 6 92076 suuteen 0,320 Osm/kg, kelluvat SCM-reagoivat lymfosyytit verinäytteen sentrifugoinnin jälkeen gradienttiliuoksen pinnalla ja ne ovat helposti erotettavissa imemällä välittömästi plasman ja gradienttiliuoksen rajapinnan yläpuo-5 lella oleva solukerros talteen, kuten menetelmän ovat kuvanneet L. Cercek ja B. Cercek, Br. J. Cancer, Voi. 28, 163 (1978).
Gradienttiliuoksesta erottamisen jälkeen solut pestään, edullisesti kahdesti, säilytysaineita sisältämättö-10 mällä injektioihin tarkoitetulla natriumkloridiliuoksella ja sitten, edullisesti kahdesti, täydellisellä Dulbeccon fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (complete Dul-becco's phosphate buffered saline) (PBS). Pesun jälkeen solut suspendoidaan PBS:ään käytettäväksi tämän keksinnön 15 mukaisessa testimenetelmässsä. Solujen pitoisuus suspensiossa ei ole ratkaiseva, joskin suspensiossa täytyy olla riittävä määrä soluja, jotta fluoresenssi-intensiteetin jakautumiskäyrä voidaan jäljempänä yksityiskohtaisemmin kuvatulla tavalla tehdä. Hyviä tuloksia on saatu keksinnön 20 edullisen toteutusmuodon mukaisesti käyttämällä lymfosyyt-tisuspension pitoisuuksia, jotka ovat suuruusluokkaa 106 solua ml:ssa.
MPS-värit ovat aineita, jotka sisältävät fluorokro-min ja jotka kykenevät sitoutumaan solumembraaniin tai . 25 läpäisemään sen. Tarkka mekanismi, jonka mukaisesti MPS- värit toimivat, ei ole selvillä, joskin useita malleja on esitetty, Sims ym., Biochemistry 13, 3315 (1974).
Tässä keksinnössä käytettäväksi sopivat MPS-väriai-neet valikoidaan ryhmästä, joka koostuu syaniiniväreistä, 30 merosyaniiniväreistä ja oksonoliväreistä. Merosyaniinivä-reihin kuuluvat merosyaniinioksatsoloni ja merosyanaiini-rodaniini. Laajimman tutkitun ja edullisen väriryhmän muodostavat syaniinivärit, joita ovat valmistaneet ja tutkineet Sims ym., Biochemistry 13, 3315 (1974). Tässä julkai-35 sussa tuktittiin noin 29 väriä kiinnittäen huomiota sii- 7 92076 hen, mikä on membraanipotentiaaleissa tapahtuvien muutosten vaikutus väriin. Kaupallisesti saatavilla oleva sya-niiniväri, jolla tässä keksinnössä on saatu hyviä tuloksia, on 3,3'-diheksyylioksakarbosyaniini. Sen yleisen ta-5 van mukaisesti, joka ilmaistiin Simsin ym:iden julkaisussa, tämä väri identifioidaan pikakirjoitusmerkitsemista-vallaan, diO-C6.(3) . Tässä keksinnössä MPS-väriä käytetään värin PBS:ään tehtynä laimeana liuoksena. Liuoksessa MPS-värin konsentraatio vaihtelee välillä noin 2 x 10"6 - 5 x 10 10'6 ja on edullisesti noin 3 x 10'6 grammaa ml:ssa. Koska monet MPS-väriaineista ovat vain heikonlaisesti fosfaatilla puskuroituun suolaliuokseen liukenevia, on edullista tehdä MPS-väriaineesta ensin konsentroidumpi liuos etyylialkoholiin ja laimentaa sitten konsentroitu alkoholi-15 liuos haluttuun konsentraatioon PBSiällä.
Kun lymfosyyttisuspensio on tehty edellä kuvatulla tavalla, lymfosyytit leimataan MPS-väriaineella. Leimaus-toimenpide tehdään kätevimmin sekoittamalla keskenään samansuuruiset osat lymfosyyttiliuosta ja MPS-aineen laimeaa 20 liuosta, ja lymfosyyttisuspensioväriliuos-seosta pidetään yllä, jatkuvasti hellävaraisesti sekoittaen, sopiva aika tarkoituksessa sallia lymfosyyttien leimautuminen MPS-vä-riaineella. Noin 10 minuutin kontaktiaika on normaalisti riittävä lymfosyyttien leimautumisen aikaansaamiseksi, . 25 joskin kontaktia voidaan pitää yllä niinkin kauan kuin 1 tunti ilman, että aiheutetaan lymfosyyttien vahingoittumista. Olemme havainneet, että parhaat tulokset saadaan pitämällä lymfosyyttisuspensio/väriliuos-seoksen lämpötila leimaustoimenpiteen aikana huoneenlämpötilassa (20°C-30 23° C).
Solususpension ja MPS-väriliuoksen välisen kontaktin jälkeen solut johdetaan kohdistetun fluoresenssin heräte-energian lähteen läpi, joka heräte-energian lähde saa MPS väriaineen fluoresoimaan. Tämä suoritetaan fluoresenssin 35 aktivoimassa solulajittelijassa (fluorescence activated 8 92076 cell sorter), johon leimatut lymfosyytit on ruiskutettu vaippanesteeseen, joka virtaa läpimitaltaan pienen putken läpi riittävällä nopeudella saamaan aikaan lymfosyyttien laminaarisen, samankeskisen virtauksen vaippanesteessä.
5 Tällä tavoin yksittäiset lymfosyytit erotetaan toisistaan yksittäisten solujen virran muodostamiseksi vaippanesteeseen. Kodistettu heräte-energian lähde on lasersäde ja säteen annetaan tunkeutua liikkuvaan nestevirtaan suurin piirtein kohtisuorasti virtauksen suuntaa vastaan. Tällä 10 tavalla lasersäde osuu jokaiseen yksittäiseen lymfosyyttiin tämän kulkiessa ohi. Sopivat fotosähköiset ilmaisu-laitteet sijaitsevat myötävirtaan siitä kohdasta, jossa lasersäde osuu lymfosyytteihin, ja kunkin lymfosyytin fluoresenssi-intensiteetti ilmaistaan pulssina lymfosyytin 15 ohittaessa fotosähköisen ilmaisulaitteen. Pulssin intensiteetti johdetaan edelleen pulssilaskuriin, jossa kyseistä pulssia vastaava laskutapahtuma talletetaan kanavalle, joka on erotettu muista kanavista tätä nimenomaista pulssi-intensiteettiä varten. Tällä tavoin kunkin pulssi-in-20 tensiteetin pulssien lukumäärä säilytetään käytettäväksi jakautumakäyrän luomisessa.
Kuten kuvioissa 1 ja 2 on kuvattu, muodostaa jokaisen näytteen tulosaineisto bimodaalisen käyrän, kun käyrä piirretään siten, että abskissana on pulssin korkeus (vas-; 25 täten fluoresenssi-intensiteettiä) ja oordinaattana on kyseistä pulssin korkeutta vastaavien laskutapahtumien lukumäärä. Jakautumakäyrän ensimmäinen huippu (vasen huippu) edustaa alhaisen intensiteetin lymfosyyttejä, kun taas jakautumakäyrän toinen huippu (oikeanpuoleinen huippu) 30 edustaa korkean intensiteetin lymfosyyttejä. Olemme yllät-’ täen havainneet, että vasemmanpuoleisessa huipussa olevien solujen lukumäärän suhde oikeanpuoleisessa huipussa olevien solujen lukumäärään (alfa-suhde) on suorassa yhteydessä pahanlaatuisuuden esiintymiseen sen luovuttajan ke-35 hossa tai pahanlaatuisuuden puuttumiseen sen luovuttajan 9 92076 kehosta, josta lymfosyytit oli eristetty. Kuviossa 1 kuvattu käyrä esimerkiksi edustaa sellaisten lymfosyyttien jakautumakäyrää, jotka on eristetty luovauttajasta, joka ei kärsi pahanlaatuisuudesta. Nähdään, että alhaisen in-5 tensiteetin pulsseja edustava vasen huippu on huomattavasti suurempi kuin korkean intensiteetin pulsseja edustava oikea huippu. Sellaisissa fluoresenssiemissioiden jakau-tumakäyrien tapauksissa - jollaista kuvio 1 edustaa, joissa leimatut solut ovat peräisen luovuttajista, joita syöpä 10 ei vaivaa, on oikean huipun suhde vasempaan huippuun suurempi kuin 2,6.
Kuvio 2 edustaa toisaalta tyypillistä jakautumakäyrää sellaisille lymfosyyteille, jotka on eristetty luovuttajasta, jolla on pitävästi diagnostisoitu olevan pa-15 hanlaatuisuutta. Tässä tapauksessa korkean intensiteetin pulssien ja alhaisen intensiteetin pulssien lukumäärien välinen ero ei ole niin suuri kuin kuviossa 1, ja vasemman huipun suhde oikeaan huippuun on pienempi kuin 2,6.
Syytä pahanlaatuisuuksista kärsivien ja sellaisten, 20 jotka eivät niistä kärsi, luovuttajien välillä vallitsevaan eroon vasemman huipun suhteessa oikeaan huippuun ei täydellisesti ymmäretä. Oletetaan kuitenkin, että suurella osalla kasvainsairauksia potevien luovuttajien lymfosyyteistä on membraanipotentiaali jonkin verran sähkönegatii-25 visempi, mikä siten johtaa solujen leimautumista lisäävään MPS-väriaineiden suurempaan sitoutumiseen soluihin ja/tai värien tunkeutumiseen soluihin. Tämän lymfosyyttifraktion membraanipotentiaalin lisääntynyt negatiivisuus voi myös saada MPS-värin fluoresoimaan intensiivisemmin. Kaikissa 30 tapauksissa tämä tuottaisi alhaisen intensiteetin pulssei-hin verrattuna suuremman määrän korkean intensiteetin pulssien laskutapahtumia alentaen alfa-suhdetta alle 2,6:teen. Sellaisista luovuttajista, jotka eivät kärsi kasvainsairauksista, peräisin olevien lymfosyyttien usko-35 taan sitä vastoin olevan vähemmän sähkönegatiivisia, mikä 10 92076 siten johtaa MPS-värin alhaisempaan sitoutumiseen lymfo-syytteihin ja/tai, edellä mainituista syistä johtuen, MPS-väriaineiden alhaisempaan fluoresenssiemissioiden intensiteettiin. Niinpä tämän pitäisi tuottaa suurempi määrä 5 laskutapahtumia alhaisen intensiteetin lymfosyyteille kuin korkean intensiteetin lymfosyyteille ja nostaa siten alfa-suhde yli 2,6:teen.
Heräte- ja emissioaallonpituuksien valinta on ensisijaisesti riippuvainen menetelmässä käytettävän MPS-vä-10 riaineen valinnasta. Syaniiniväreillä, edullisilla MPS-väriaineilla, olemme havainneet saatavan hyvin tyydyttäviä tuloksia, kun lasersäteen aallonpituus on 488 nm ja fluo-resenssiemissiot, joiden aallonpituus on yli 520 nm, rekisteröidään. Kuten Sims ym. ovat huomauttaneet, Bio-15 chemistry, 13, 3315 (1974), sijoittuvat syaniinivärien fluoresenssiemissiot välille noin 496 nm:stä 792 nm:iin. Käytettävissä olevalla laitteistolla me olemme saaneet hyvi tuloksia mittaamalla 520 nm:n yläpuolella olevat fluoresenssiemissiot.
20 Esimerkki
Lymfosyytit erotettiin perifeerisestä verestä otetuista 20 ml:n näytteistä peräisin olevista näytteistä laittamalla osa verinäytteestä, josta osasta oli poistettu fagosyyttiset solut, kerrokseksi sellaisen Ficoll-Trio- ; 25 sil-tiheysgradienttiliuoksen päälle, jonka tiheys 25°C:ssa • · on 1,081 g/cm3 ja jonka osmolaalisuus on 0,320 Osm/kg. Verinäyte ja tiheysgradienttiliuos sentrifugoitiin sentri-fugaalivoimalll 550 Gav lämpötilassa 25°C. Välittömästi plasman ja gradienttiliuosmateriaalin välisen rajapinnan 30 yläpuolella kelluva ohut kerros imettiin talteen Pasteur-pipetillä välttäen niin paljon kuin mahdollista ottamasta yhtään mukaan tiheämpää tiheysgradienttimateriaalia ja kevyempää erotetun solukerroksen yläpuolella kelluvaa plas-mamateriaalia. Näiden materiaalien vähäinen mukanaolo 35 poistetussa solunäytteessä ei kuitenkaan ole ratkaisevaa 11 92076 puheena olevassa tekniikassa. Tämä erottelutekniikka noudattaa ylimalkaisesti tekniikkaa, jonka ovat julkaisseet L. Cercek ja B. Cercek, "Application of the Phenomena of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matric (SCM) 5 in the Diagnosis of Malignant Disorders: a Review", Europ.
J. Cancer, Vol. 13, 903 - 915 (1977) sekä samat tekijät julkaisussa, jolle on pantu otsakkeeksi "Effects of Osmolality and Density of Gradients on the Isolation of SCM-Responding Lymphocytes", Br. J. Cancer, Voi. 38, 163-165 10 (1978). Kuten edellä on mainittu, erotustekniikka ei kui tenkaan ole niin ratkaiseva kuin yllä mainituissa julkaisuissa on ilmaistu, eikä tämän keksinnön mukainen menetelmä rajoitu siihen hyvin tarkoin määrättyyn lymfosyyttien alapopulaatioon, joka vaaditaan julkaisuissa ilmaistuun 15 tekniikkaan. Niinpä puheena olevassa menetelmässä lymfosyyttien erottamiseen muista veren komponenteista käytettävä tekniikka sekä myöhempi erotettujen solujen käsittely ovat paljon vähemmän ratkaisevia kuin julkaisut, joihin edellä on viitattu, vaativat.
20 Verinäytteet saatiin 15:Itä iän ja sukupuolen suh teen yhtäläiseltä terveeltä luovuttajalta, 1. luovuttajilta, joita ei ollut diagnostisoitu pahanlaatuisuudesta kärsiviksi, sekä 15:Itä luovuttajalta, jotka oli positiivisesti diagnostisoitu syöpää poteviksi. Tämän esimerkin 25 tarkoituksiin syövän tarkoin määrätty tyyppi ei ole ratkaiseva. Verinäytteet saatiin myös 6 luovuttajalta, jotka diagnostisoitiin ei-pahanlaatuisia tulehduksellisia sairauksia, sellaisia kuten niveltulehdusta ja muita tulehduksellisia tiloja, poteviksi. Kustakin verinäytteestä 30 edellä kuvatun menettelytavan mukaan eristetyt lymfosyyt-tifraktiot pestiin 6-7 ml:11a säilytysaineita sisältämätöntä 0,9%:istä NaCl-liuosta, minkä jälkeen ne pestiin PBS:llä. Pesujen välillä kukin solususpensio sentrifugoi-tiin sentrifugaalivoimalla 500 GaT ja supernatanttineste 35 kaadettiin pois. Pesun jälkeen kustakin näytteestä saatu 12 92076 solususpensio yhdistettiin uudelleen PBS:n kanssa ja tilavuus säädettiin siten, että muodostui suspensio, jossa oli noin 2 x 106 solua ml:ssa.
Leimaukseen käytettävä dio-C6_(3 ,-liuos valmistet-5 tiin liuottamalla ensin 28,6 mg väriä 10 ml:aan absoluuttista "analar grade"-etanolia. Liuos säädettiin lopulliseen konsentraatioonsa ruiskuttamalla 0,1 ml kantaliuosta 100 ml:aan PBS:ää.
Leimaus toteutettiin yhdistämällä keskenään samat 10 tilavuudet leimausliuosta ja lymfosyyttisuspensiota ja pitämällä seosta yllä kevyesti sekoittaen vähintään 10 minuuttia. Leimaustoimenpiteen päätyttyä fluoresenssijakautumat rekisteröitiin Becten-Dickenson-virtaussytomet-rillä, malli FACS IV (Becten-Dickenson flow cytometer, 15 model FACS IV). MPS-värillä leimatuille soluille annettiin heräte 488 nm:n argonionilaserjuovalla, ja yli 520 nm:n fluoresenssiemissiot rekisteröitiin käyttäen normaaleja FACS IV:n optisia suodattimia. FACS IV-sytometri oli varustettu tietokoneella, joka toimi näytteestä saatujen 20 pulssien rekisteröintiin ja lajitteluun tarkoitettuna pulssianalysaattorina. Yksittäisten solujen virta muodostettiin, kuten edellä on kuvattu, panemalla leimausliuok-sessa olevien solujen susepnsio keskelle sekoituskelpoisen vaippanesteen juoksevaa virtaa, jolloin FACS IV-instrumen-: 25 tin "nozzle-transducer assembly”-osaan saatiin aikaan la- minaarinen samakeskinen virtaus. Tällä tavalla näytteen neste ja sen sisältämät solut pakotettiin nesteen tulovirran keskiosaan, jolloin estettiin soluja koskettamasta laitteen "nozzle-assembly"-osaa ja tuotettiin lasersäteen 30 ohi kulkeva yksittäisten solujen virtaus. Monistusvaloken-no havaitsi lasersäteen ohi virtaavista soluista lähtevät fluoresenssiemissiot ja intensiteetti muunnettiin sähköiseksi pulssiksi, jonka pulssianalysaattori tallensi. Puls-sianalysaattorin lajittelu tuotti, kun piirrettiin puls-35 sien frekvenssi pulssin korkeuden funktiona, kuvioissa 1 13 92076 ja 2 kuvattujen tyypillisten käyrien kaltaisia käyriä. Vasemmanpuoleisen NL- ja oikeanpuoleisen NR-huipun laskuta-pahtumien kokonaismäärät, sekä näistä satu alfa-suhde sellaisille luovuttajille, joiden on diagnostisoitu olevan 5 syövästä vapaita, on ilmoitettu alla taulukossa I. Tulokset sellaisille luovuttajille, jotka on diagnostisoitu syöpää sairastaviksi, sekä sellaisille luovuttajille, jotka on diagnostisoitu sairastavaksi tulehduksellisia sairauksia, sellaista kuten niveltulehdusta, on ilmoitettu 10 vastaavasti taulukossa II ja taulukossa III. 1 .
92076 14
ΓΟ <J\ -H
in · · > w >—i a co t> χ rH (S <0 > ^ o in ίο s· . . [v μ rH K O N 0) VO OS CM (0
U
O rH m -H
00 · · (S (0 .h k σ' in co ^ rH ro «3 i-π ro in «3 rs · · rs Qi
rH K fS Oi O
VO rH 00 >1 m oo ov co rH · · · 3 rH ac rs Ti 00 μ
OO OS -H
00 0 tn oo co o · · oo -rl h a in o μ vo rs in co • 0
is τί ro C
• · O) o« a vo tji m ίο oo rs -h oo 1o s in w • · in ^
CO a Ti Ov VO O -H
00 · CO
00 v X
ov in ^ <o • · in ao > s a rH oo s «3 «3 oo · O1 μ oo Ό m o oo >i (C3 • · o au
VO a m rH -H
co rs Ti -h a a) a oo o • · o » (0 m a vo Ti . <u -h in rH Ti > μ u 3 in oo o) m . . oo -μ μ
Ti a σν o · w oo rs Ti <cj se u
oo oo CD
i · · in ·· -H
. ; 00 a vo o rH -H rH
in 00 · Oi rH
h in Oi a) >1 03 os o m >i ji rs a · ·οο μ o oo σν · a) 1b
Ti in -Ι-) £ h (0 Q)
Ti 00 μ rH
o rH a · · rs μ 3 X O rH . 3 μ
Jtf S H VO > 0 1 0 3 H -rl 3 μ 3 Oi J μ (0 Oi 0
Ei >1 «03
>1 -H
μ at) μ <0 -n m
n -H O
10 Xt C
o μ o o o o» μ μ o o μ <o c 3 o o i μ > μ μ ιο Ό 0 0 s. \ μ w •ο 3 J Κ Η < J 2 2 < μ 15 92076
•H
s' in co o u x co o m h (0 m co > <0
CO S' O P
O' U M
(S CO CO P (0 in in (h in p CO Ή Ή (0 co u · · · m
M CO N H
S' S' <0 »o CO CS CM Oi EN o o CM CO in rH >1
P P CO
VO CO O' 3
vo U · · S* P
CS 00 O' P
in co i-i O
ai p in p
mu··· P
CM CM S' P CO
CM rH O
in C
in o> vo O) vji U · · · (0 CM r*. O 1-H -h vo S' Ό in w co in vo ^ co u · · · Up CM OOP co in co v x ' ' (0 CM O C" <0 > CM o · · · *0 (0
CM Ον ον .-H α P
S' CM O CO
>1 (0
rH S' O' CO (H
H U · · · P
cm co in p P <o
CM P a) CD
in S1 θ' θ' ί (0 ου · · · Op
es co vo p > P
p U 3 a) ίο vD o p p o» U · · · p p o es (0
es P X P
CO
- in es cm ·· p oo U · · · p p
P S' O CM Οι P
S' CM Oi 0)
g X
O U <S CM CM P 3 p . . · (0 Ό H CO S' es -o Λ h in es (0 0)
P P
O vo υ co c^- in p 3
X p . . in 3 P
X es o · > 3 * in CM (S 0 3
P P 3 P
3 Oi J P
(0 Oi O
tn £ * ö>
P Λ P
(0 t-> CO
to PO
(0 X e o p o o a) o m p o o P (0
C 3 O O I P
> p p (0 Ό O 0 "n \ P w
Ό 3 iJ CC P
< *Ά 2 2 < P
Taulukko III
16 92076
Ajo nro 31 32 33 34 35 36
5 Luovuttajatyyppi* I I I I I I
NL/1000 24.6 160.2 142.5 111.5 54.7 309.6 NR/1000 5.5 14.6 14.2 23.5 9.5 33.5 10
Alfa-tekijä 4.5 11.0 10.0 4.75 5.76 9.24 * Luovuttajatyyppi: H (terve, ei syöpää), C (diagnostisoitu syöpää sairastavaksi), I (diagnostisoitu tuleh-15 duksellista tautia sairastavaksi)
Esimerkin tuloksista on nähtävissä, että missään tapauksissa eivät alfa-tekijät pahanlaatuisuudesta kärsivien luovuttajien lymfosyyteille ylitä 2,6:tta. Vastaavasti 20 alfa-tekijät sellaisten luovuttajien lymfosyyteille, joilla ei ole pahanlaatuisuutta, eivät laske alle 2,6:den. Tämä on totta myös silloin kun luovuttaja kärsii muista tulehduksellisista sairaustiloista, sellaisesta kuin niveltulehduksesta .
. 25 Edellä olevasta on nähtävissä, että tämän keksinnön mukainen menetelmä tarjoaa yksinkertaisen testin, jolla luovuttajien verinäytteitä voidaan seuloa luovuttajien kehoissa esiintyvän pahanlaatuisuuden toteamiseksi. Testiin vaaditaan suhteellisen pieni verinäyte ja sen voivat 30 tehdä henkilöt, joilla on tavanomaiset taidot alalla. Vaikka keksintö tässä on kuvattu ja sitä on valotettu viitaten sen tiettyihin toteutusmuotoihin, on ymmärrettävä, että se voidaan toteuttaa toisin liitteenä olevien patenttivaatimusten puitteissa.
Claims (9)
1. Menetelmä ihmisen tai eläimen kehossa olevan pahanlaatuisuuden määrittämiseksi, joka menetelmä käsittää 5 seuraavat vaiheet: mainitusta kehosta otetusta näytteestä peräisin olevien lymfosyyttien leimaamisen saattamalla niiden suspensio, edullisesti niiden fosfaatilla puskuroitu suola-liuossuspensio, joka sisältää 2 x 10”6 solua millilitraa 10 kohti fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta, yhteen fluoresoivan solumembraanipotentiaalille herkän aineen kanssa, jolloin membraanipotentiaalille herkkä aine sidotaan lym-fosyytteihin, lymfosyyttien saattamisen kulkemaan yksitellen koh-15 distetun fluoresenssin viritysenergian lähteen kautta, saaden potentiaalille herkän aineen fluoresoimaan, ja kustakin lymfosyytistä lähtevän fluoresenssiemis-sion intensiteetin mittaamisen, tunnettu siitä, että menetelmä lisäksi kä-20 sittää vaiheen, jossa muodostetaan lymfosyyttien fluore-senssiemission intensiteettiin perustuva bimodaalinen ja-kautumakäyrä ja määritetään käyrästä alhaisemman fluoresenssi-intensiteetin omaavien lymfosyyttien lukumäärän : · suhde korkeamman fluoresenssi-intensiteetin omaavien lym- 25 fosyyttien lukumäärään, joka suhde ilmaisee, onko kehossa pahanlaatuisuutta vai ei.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että membraanipotentiaalille herkkä aine on fluoresoiva väri, joka on valittu ryhmästä, 30 jonka muodostavat syaniinivärit, merosyaniinivärit ja ok-sonolivärit, edullisesti syaniiniväri, joka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat karbosyaniini-, dikarbosyanii-ni- ja trikarbosyaniinivärit. 18 92076
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että membraanipotentiaalille herkkä aine on 3,3'-diheksyylioksakarbosyaniini.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että lymfosyyttisuspensio sekoitetaan samansuuruisia tilavuusosia käyttäen liuokseen, joka sisältää 2,86 x 10-6 g/ml membraanipotentiaalille herkkää ainetta fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa, ja 10 seosta pidetään yllä riittävän kauan, jotta ainakin osa aineesta saadaan sitoutumaan lymfosyytteihin, edullisesti vähintään noin 10 minuuttia.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viritysenergian lähde on la- 15 sersäde, edullisesti lasersäde, jonka aallonpituus on 488 nm.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että leimatut lymfosyytit ruiskutetaan yhteensopivan vaippanesteen juoksevaan virtaan ja 20 saadaan lymfosyyttien ja vaippanesteen laminaarinen, sama-akselinen virtaus, jolloin lymfosyytit pakotetaan yksittäisinä soluina juoksevan virran keskiosaan ennen kuin ne kulkevat viritysenergian lähteen kautta.
: ' 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että kustakin lymfosyytistä lähtevän fluoresenssiemission intensiteetti muunnetaan sähköiseksi pulssiksi, jonka korkeus on suoraan verrannollinen emission intensiteettiin, ja merkitään jakautumakäyrälle, jossa abskissana on pulssin korkeus ja koordinaattana * 30 pulssien lukumäärä, jolloin jakautumakäyrä on bimodaalin- entoisen huipun kuvatessa alhaisemman intensiteetin emissioita ja toisen huipun kuvatessa korkeamman intensiteetin emissioita.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että korkeamman intensiteetin 19 92076 emissioita kuvaavassa huipussa olevien pulssien lukumäärä jaetaan alhaisemman intensiteetin emissioita kuvaavassa huipussa olevien pulssien lukumäärällä, jotta saadaan alfa-kerroin, joka on tunnusomainen pahanlaatuisuuden vaiva-5 amasta kehosta peräisin oleville lymfosyyteille ja pahanlaatuisuudesta vapaasta kehosta peräisin oleville lymfosyyteille.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pahanlaatuisuuden vaivaamasta 10 kehosta peräisin olevien lymfosyyttien alfa-kerroin on pienempi kuin 2,6 ja pahanlaatuisuudesta vapaasta kehosta peräisin olevien lymfosyyttien alfa-kerroin on suurempi kuin 2,6. > · ·> ♦ 20 92076
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/933,982 US4835103A (en) | 1986-11-24 | 1986-11-24 | Differential binding of membrane potential sensitive materials to lymphocytes |
| US93398286 | 1986-11-24 | ||
| US8703054 | 1987-11-20 | ||
| PCT/US1987/003054 WO1988003955A1 (en) | 1986-11-24 | 1987-11-20 | Differential binding of potential sensitive materials by lymphocytes |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI883489A0 FI883489A0 (fi) | 1988-07-22 |
| FI883489A FI883489A (fi) | 1988-07-22 |
| FI92076B true FI92076B (fi) | 1994-06-15 |
| FI92076C FI92076C (fi) | 1994-09-26 |
Family
ID=25464748
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI883489A FI92076C (fi) | 1986-11-24 | 1988-07-22 | Lymfosyyttien tunnusmerkillinen potentiaalille herkkien aineiden sitominen |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4835103A (fi) |
| EP (1) | EP0339028B1 (fi) |
| JP (1) | JPH02501975A (fi) |
| AT (1) | ATE90393T1 (fi) |
| AU (1) | AU611877B2 (fi) |
| CA (1) | CA1312537C (fi) |
| DE (1) | DE3786175T2 (fi) |
| DK (1) | DK169565B1 (fi) |
| FI (1) | FI92076C (fi) |
| NO (1) | NO173409C (fi) |
| WO (1) | WO1988003955A1 (fi) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5260186A (en) * | 1986-03-10 | 1993-11-09 | Boris Cercek | Provision of density specific blood cells for the structuredness of the cytoplasmic matrix (SCM) test |
| JP2549665B2 (ja) * | 1987-07-31 | 1996-10-30 | 東亜医用電子株式会社 | フロ−サイトメトリ用網状赤血球測定試薬 |
| EP0407451A1 (en) * | 1988-03-11 | 1991-01-16 | CERCEK, Boris | General cancer-associated scm-recognition factor, preparation and method of use |
| JPH03122553A (ja) * | 1989-10-04 | 1991-05-24 | Olympus Optical Co Ltd | 光センサー |
| US5355215A (en) * | 1992-09-30 | 1994-10-11 | Environmental Research Institute Of Michigan | Method and apparatus for quantitative fluorescence measurements |
| US6800452B1 (en) * | 1994-08-08 | 2004-10-05 | Science Applications International Corporation | Automated methods for simultaneously performing a plurality of signal-based assays |
| US6351663B1 (en) | 1999-09-10 | 2002-02-26 | Akorn, Inc. | Methods for diagnosing and treating conditions associated with abnormal vasculature using fluorescent dye angiography and dye-enhanced photocoagulation |
| US6944493B2 (en) * | 1999-09-10 | 2005-09-13 | Akora, Inc. | Indocyanine green (ICG) compositions and related methods of use |
| US6443976B1 (en) | 1999-11-30 | 2002-09-03 | Akorn, Inc. | Methods for treating conditions and illnesses associated with abnormal vasculature |
| US7994485B2 (en) * | 2008-04-08 | 2011-08-09 | Carestream Health, Inc. | Apparatus and method for fluorescence measurements using spatially structured illumination |
| US20150182518A1 (en) | 2012-10-26 | 2015-07-02 | Canon Kabushiki Kaisha | Cancer cell inhibitory drug and cancer stem-cell detection probe |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4173136A (en) * | 1977-11-17 | 1979-11-06 | Schroth Wilhelm Heinrich | Method and apparatus for producing multiple groove V-belt pulleys |
| DE2962866D1 (en) * | 1978-03-09 | 1982-07-08 | Merck Patent Gmbh | Method for determining leukaemic cells |
| US4343782A (en) * | 1978-04-20 | 1982-08-10 | Shapiro Howard M | Cytological assay procedure |
| US4424201A (en) * | 1978-11-28 | 1984-01-03 | Rockefeller University | Employment of a mereyanine dye for the detection of malignant leukocytic cells |
| US4727020A (en) * | 1985-02-25 | 1988-02-23 | Becton, Dickinson And Company | Method for analysis of subpopulations of blood cells |
-
1986
- 1986-11-24 US US06/933,982 patent/US4835103A/en not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-11-20 DE DE8888900054T patent/DE3786175T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-11-20 JP JP63500465A patent/JPH02501975A/ja active Pending
- 1987-11-20 WO PCT/US1987/003054 patent/WO1988003955A1/en active IP Right Grant
- 1987-11-20 AU AU10413/88A patent/AU611877B2/en not_active Ceased
- 1987-11-20 EP EP88900054A patent/EP0339028B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-20 AT AT88900054T patent/ATE90393T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-23 CA CA000552502A patent/CA1312537C/en not_active Expired - Fee Related
-
1988
- 1988-07-22 FI FI883489A patent/FI92076C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-07-22 NO NO883260A patent/NO173409C/no unknown
- 1988-07-22 DK DK413688A patent/DK169565B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4835103A (en) | 1989-05-30 |
| AU611877B2 (en) | 1991-06-27 |
| DE3786175T2 (de) | 1993-09-23 |
| NO883260D0 (no) | 1988-07-22 |
| FI92076C (fi) | 1994-09-26 |
| EP0339028B1 (en) | 1993-06-09 |
| DE3786175D1 (de) | 1993-07-15 |
| AU1041388A (en) | 1988-06-16 |
| DK413688D0 (da) | 1988-07-22 |
| NO883260L (no) | 1988-09-23 |
| NO173409B (no) | 1993-08-30 |
| CA1312537C (en) | 1993-01-12 |
| FI883489A0 (fi) | 1988-07-22 |
| WO1988003955A1 (en) | 1988-06-02 |
| ATE90393T1 (de) | 1993-06-15 |
| NO173409C (no) | 1993-12-08 |
| DK169565B1 (da) | 1994-11-28 |
| DK413688A (da) | 1988-09-21 |
| EP0339028A1 (en) | 1989-11-02 |
| FI883489A (fi) | 1988-07-22 |
| JPH02501975A (ja) | 1990-07-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rutili et al. | Protein concentration in interstitial and lymphatic fluids from the subcutaneous tissue | |
| KR101764597B1 (ko) | 생물학적 샘플에서 희귀 사건 분석을 위한 고감도 다중매개변수 방법 | |
| JP2018185316A (ja) | 循環腫瘍細胞の検出方法および哺乳類対象における癌の診断方法 | |
| FI92076B (fi) | Lymfosyyttien tunnusmerkillinen potentiaalille herkkien aineiden sitominen | |
| FR2467402A1 (fr) | Methode d'essai biologique | |
| CA1205365A (en) | Metachromatic dye sorption and fluorescent light emissive means for determination of developmental stages of neutrophilic granulocytic cells and other leukocytes | |
| EP0471792A1 (en) | Methods, reagents and test kits for determination of subpopulations of biological entities | |
| CN109187981A (zh) | 一种快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条与应用 | |
| CN110389221B (zh) | 一种用于分析CD1c+树突状细胞亚群表型和功能的组合配方试剂盒及其应用 | |
| GB2059582A (en) | Dye composition and method for tissue testing | |
| CN106834511B (zh) | 一种基于液体活检的乳腺癌检测的试剂盒 | |
| Saftics et al. | Single extracellular VEsicle nanoscopy | |
| JPH0692971B2 (ja) | 細胞内にとり込まれる蛍光剤を使用する検定方法 | |
| CN111562375B (zh) | 一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞pd-l1表达的免疫荧光试剂盒及检测方法 | |
| CN109253998A (zh) | 基于拉曼增强的金属-包裹物-抗体复合纳米粒子定量检测肿瘤标记物的方法 | |
| CN106841620A (zh) | 一种基于液体活检的结直肠癌检测的试剂盒 | |
| Deleyrolle et al. | Identification and isolation of slow-dividing cells in human glioblastoma using carboxy fluorescein succinimidyl ester (CFSE) | |
| CN115656083B (zh) | 用于肿瘤检测、恶性程度和转移性评估的细胞外囊泡纳米红外光谱检测装置和应用 | |
| Horan et al. | Detection of heteroploid tumor cells | |
| CN106990080A (zh) | 一种基于液体活检的非小细胞肺癌检测的试剂盒 | |
| CN106970221A (zh) | 一种基于液体活检的前列腺癌检测的试剂盒 | |
| Corver et al. | Flow cytometry of human solid tumours: clinical and research applications | |
| CN111638349A (zh) | 一种检测胃癌患者外周血循环肿瘤细胞ca125表达的免疫荧光试剂盒及检测方法 | |
| RU2826249C1 (ru) | Способ детекции онкологических маркеров в образцах опухолевой ткани и устройство для его реализации | |
| Steinkamp | Fluorescence lifetime flow cytometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| MM | Patent lapsed | ||
| MM | Patent lapsed |
Owner name: CERCEK, BORIS |