DK169565B1 - Fremgangsmåde til detektion af en ondartethed i et legeme, der benytter differentiel binding af potentielt sensitive materialer til lymphocytter - Google Patents

Description

i DK 169565 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til detektion af en ondartethed i et legeme, der benytter differentiel binding af potentialfølsomme materialer af lymphocytter.

5 I de seneste år har der været en forøget interesse i benyttelsen af biologiske prober, således som membran- potentialfølsomme farvematerialer, til bestemmelse af ændringer i membranpotentialet af levende celler og eller 10 andre cellulærere strukturer i elektrofysiologiske og biofysiologiske studier af levende celler. Sådanne materialer er f. eks. benyttet til at studere membranpotentialer i blækspruttenerveceller, Cohen LPB et al, J. membrane Biol. 19,1 (1974) i røde blodlegemer, Hoffmann, 15 J.R. og Laris, P.C., Physiol. Lond. 239, 519, (1974) og for frø-hjerte-muskelvæv, Morad, M. og Selema, G., J. Physiol. Lond. 292 , 267 (1972).

Tilsvarende leder studiet af blodlegemets fysiologi til 20 metoder til detektion af sygdomstilstande i menneske- og dyrelegemer. Vi har f. eks. udviklet en fremgangsmåde til tidlig detektion af cancer og andre antigenproducerende sygdomme og legemstilstande ved hjælp af intra-cellulære fluoresceinfluorescenspolarisationsmålinger i levende 25 celler for at kunne studere forandringer i evnen til at strukturere den cytoplasmiske matrix (SCM). SCM omfatter forskellige cellestrukturer således som f. eks. mitochondria, cellemembraner, cellesaft, lysosomer, riboso-mer, kernen og lignende. Vores fremgangsmåde, som i lit-30 teraturen refereres til som "SCM-testen", og den anvendte teknik er resumeret i en publikation af L. Cercek, B. Cereck, "Application of the Phenomenon of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the

Diagnosis of Malignant Disorders: A Review", European 35 Journal of Cancer, Vol. 13, 903-915 (1977). Ved brug af vores teknik kan tidlig diagnose af cancer og andre typer af sygdomme og legemstilstande stort set opnås ved måling 2 af de differentielle respons af en densitetsspecifik subpopulation af perifere blodlymphocytter på f. eks. mitogen phytohaemagglutinin og på cancer-tilordnede antigener. Forandringer i den intra-cellulære fluoresceinfluo-5 rescenspolarisation benyttes til at indikere det differentielle respons af lymphocytterne.

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde kræver imidlertid meget veluddannet og dygtigt personale og ekstremt omhygge-10 lig teknik for at kunne separere og isolere subpopulationen af SCM-responderende lymphocytter fra blodprøverne og udføre fluorescensmålingerne. Yderligere kræver SCM-testteknikken mikroanalysisk præcision i de intra-cellulære fluorescenspolarisations- målinger, høj instrumentfølsom-15 hed og stabilitet. Dårlige teknikker og ikke-dygtig håndtering af lymphocytter, der er følsomme over for forstyrrelser af den metaboliske tilstand, kan resultere i ikke reproducerbare og totalt forkerte test-resultater.

20 1 overensstemmelse hermed vil det være højst ønskeligt at tilvejebringe en screeningsteknik til detektion af cancer, som er simplere og billigere af udføre, og som stort set kan udføres med en lavere grad af teknisk færdighed ved benyttelse af stort set tilgængeligt udstyr, hvorved 25 metodikken i en sådan screeningsteknik kan gøres tilgængelige for praktisk rutineudnyttelse i kliniske laboratorier og selv i lægekonsultationer.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en fremgangs-30 måde til screening af blodprøver for tilstedeværelse af ondartethed i et donor-legeme ved at benytte kommercielt tilgængelig instrumentering til af detektere og registrere test-resultater. 1

Det nye og særegne ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremgår af den kendetegnende del af krav 1.

DK 169565 B1 3

Metodikken i opfindelsen er baseret på differentiel optagelse af et membranpotentialfølsomt materiale ved en bestemt subpopulation af lymphocytter, hvis optagelse er forskellig alt afhængig af, om donor-legemet er plaget 5 med en ondartethed eller ej. Skønt metodikken, der her er defineret, stadig kræver en vis færdighed i isolationen af den korrekte densitetsspecifikke subpopulation af lymphocytter, er den mindre krævende og lettere at udføre for en fagmand.

10

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvender flowcytometri-teknikker og instrumentering, som er velkendte og rigt tilgængelige, og håndteringen af lymphocytterne er mindre kritisk end i den tidligere beskrevne SCM-test.

15

Den foreliggende fremgangsmåde er fortrinsvis egnet til benyttelse som en rutine-cancer- screeningsprocedure, som kan blive benyttet i forbindelse med den førnævnte SCM-test, der er i stand til at tilvejebringe en meget tidlig 20 og specifik diagnose af en ondartethed.

Fremgangsmåden i den foreliggende opfindelse omfatter, at en suspension af levedygtige lymphocytter bringes i kontakt med en opløsning, der indeholder et membranpoten-25 tialfølsomtfluorescensmateriale. Sådanne materialer, som konventionelt refereres til som membranpotentialfølsomme fluorescensfarvestoffer, vil herefter blive refereret til som "MPS-farvestoffer". Kontakten mellem lymphocytsuspen-sionen og MPS-farvestoffet opretholdes i tilstrækkelig 30 tid til at lymphocytterne mærkes med MPS-farvestofmate-rialet.

Efter udførelse af mærkningen som beskrevet ovenfor, passerer de nu mærkede lymphocytter som enkeltceller gennem 35 en fokuseret excitationsenergikilde, som bringer alle MPS-farvestofmaterialer, som lymphocytterne er blevet mærket med, til at fluorescere. Fluorescensemissionsin- 4 tensiteten fra hver celle bliver registreret som en impuls , og antallet af impulser af hver fluorescensintensitet gemmes. Et plot af fordelingen af antallet af impulser versus intensiteten af fluorescensemissionerne fra de 5 mærkede lymphocytter udgør en bimodal kurve, d.v.s. en kurve, der omfatter 2 toppe. Den første top af kurven omfatter impulser af lavfluorescensintensitet, og den anden top omfatter impulser af højfluorescensintensitet. Forholdet mellem det totale antal lavfluorescensimpulser og 10 højfluorescensimpulser fra samme prøve tilvejebringer en faktor, som differentierer lymphocytteme, der er udtaget fra donorer, som er plaget med cancer, fra de lymphocytter, der er udtaget fra donorer, som ikke er plaget med cancer. Denne faktor, som heri refereres som alpha-fakto-15 ren, er blevet fundet til at være mindre end 2,6 for lym-phocytsuspensioner, der er udtaget fra donorer, der er plaget af en ondartethed. Alphafaktorer større end 2,6 er på den anden side forbundet med lymphocytprøver, der er udtaget fra donorer, som ikke er plaget af en ondartet-20 hed. På denne baggrund tilvejebringer fremgangsmåden i den foreliggende opfindelse en screeningstest for tilstedeværelsen af cancer, som er relativ simpel, økonomisk og som kun kræver almindelig teknisk færdighed for at blive udført.

25

Kort beskrivelse af tegningerne

Opfindelsen vil bedre kunne forstås ud fra den detaljerede beskrivelse af opfindelsen sammenholdt med tegninger-30 ne, i hvilke:

Fig. 1 viser et repræsentativt plot af impulsfordelingen af fluorescensemissionen fra en typisk lymphocytprøve, der er udtaget fra en donor, der ikke er plaget med en 35 ondartethed, og

Fig. 2 viser et repræsentativt plot af impulsfordelingen DK 169565 B1 5 af fluorescensemissionen af lymphocytter, der er udtaget fra en donor, der er plaget med en ondartethed.

Detaljeret beskrivelse af opfindelsen 5

Cellerne, der benyttes i fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, er lymphocytter, der er udskilt fra en prøve af blod, fra et legeme, som skal testes. Skønt det i dag ikke er helt forstået, er det opfattelsen, at 10 lymphocytter, som er af T-celletypen, er involveret i genkendelsen af antigener, der er forbundet med ondartethed. Bestemte lymphocytter, der refereres til som SCM-re-sponderende lymphocytter, og som er udtaget fra donorer, der er plaget med cancer, er blevet påvirket in vivo for 15 at genkende antigener, der er forbundet med ondartethed, såsom antigener fra tumorceller, og de har tilsvarende vist sig at have et forskelligt respons på MPS-farvestof-fer sammenlignet med lymphocytter, der er udtaget fra en donor, der ikke er plaget med en ondartethed.

20

Lymphocytterne, der er nyttige i den foreliggende opfindelse, er mest bekvemt udskilt fra blodprøven ved centrifugering af denne på en densitetsgradientopløsning, såsom en blanding af Ficoll 400 (Pharmacia AB) og Triosil 440-25 opløsninger (Nyegaard & Co.). Blodlegemer, der har en densitet mindre end gradientopløsningens, flyder oven på denne og kan blive adskilt fra legemerne, der har densiteter, som er større end gradientopløsningens densitet.

En sådan fremgangsmåde til adskillelse af blodkomponen-30 ter, som er velkendt på området, er f. eks. teknikken, der er publiceret af R. Harris, E. Ukaejiofo, Lancet Vol.

2, 327 (1969). Ved modifikation af gradientopløsningen 3 til en separationsdensitet på 1,08 gram pr. cm ved 25°C og en osmolatitet på 0,320 Osm/kg, vil SCM-responderende 35 lymphocytter flyde oven på gradientopløsningen efter centrifugering af en blodprøve, og de vil adskilles let ved udsugning af cellelaget direkte over plasmagradientopløs- 6 ningsgrænsefladen, som beskrevet af L. Cercek, B. Cercek, Br. J. Cancer, Vol. 28, 163 (1978).

Efter adskillelse fra gradientopløsningen udvaskes cel-5 lerne, fortrinsvis to gange, med en konserveringsmiddel-fri natriumchloridopløsning til injektion og dernæst fortrinsvis to gange med Dulbecco * s phosphatbuffersaltopløsning (PBS). Efter udvaskningen suspenderes cellerne i PBS til brug for test-metoden ifølge den foreliggende opfin-10 delse. Koncentrationen af celler i suspensionen er ikke kritisk, skønt et tilstrækkeligt antal celler må yære til stede i suspensionen, for at kunne fremstille fluorescensintensitetsfordelingskurven, som herefter vil blive forklaret i yderligere detaljer. Gode resultater er ble-15 vet opnået i overensstemmelse med en foretrukken udførelsesform af opfindelsen ved brug af lymphocytsuspensions-koncentrationer i størrelsesordenen 10® celler pr. ml.

MPS-farvestoffer er materialer, som indeholder et fluoro-20 chrom, og som er i stand til at binde på eller gennemtrænge cellemembranen. Den eksakte mekanisme ved hvilken MPS-farvestoffer arbejder er ikke klar, skønt adskillige modeller er blevet foreslået, Sims, et al., Biochemistry 13, 3315 (1974).

25 MPS-farvestofmaterialer, der er i stand til at blive brugt i den foreliggende opfindelse, er valgt blandt cya-nin-, merocyanin- og oxonolfarvestofferne. Blandt mero-cyaninfarvestofferne er merocyaninoxazolon og merocyanin-30 rhodanin. Den mest undersøgte og foretrukne gruppe af farvestoffer er cyaninfarvestofferne, som er blevet fremstillet og studeret af Sims, et al., Biochemistry 13, 3315 (1974). I denne publikation blev omkring 29 cyanin-farvestoffer studeret med hensyn til effekten af farve-35 stoffet på ændringer i cellemembranpotentialer. Et kommercielt tilgængeligt cyaninfarvestof, med hvilket gode resultater er blevet opnået i den foreliggende opfindel- DK 169565 B1 7 se, er 3,3'-dihexyloxacarbocyanin. I overensstemmelse med konventionen, der blev foreslået af Sims, et al., vil dette farvestof blive betegnet ved dets korte notation, diO-Cg _(3)· MPS-farvestofmaterialet bruges i den fore-5 liggende opfindelse som en fortyndet opløsning af farvestoffet i PBS. I opløsningen forekommer koncentrationen af MPS-farvestoffet i området fra omkring 2 x 10-^ til — ft —ft omkring 5 x 10” , fortrinsvis omkring 3 x 10” gram pr.

ml.

10

Da mange af MPS-farvestofmaterialerne kun er lidt opløselige i phosphatbufferede saltopløsninger, foretrækkes det først at danne en mere koncentreret opløsning af MPS-far-vestofmaterialet i ethylenglycol efterfulgt af fortynding 15 af den koncentrerede alkoholopløsning til den ønskede koncentration med PBS.

Efter af have forberedt lymphocytsuspensionen som beskrevet ovenfor bliver lymphocytterne mærket med MPS-farve-20 stofmaterialet. Markeringen udføres mest bekvemt ved at blande lige dele af lymphocytopløsningen med den fortyndede opløsning af MPS-materialet og ved under fortsat svag omrøring at opretholde lymphocytsuspensionsfarveop-løsningsblandingen i en passende periode til at tillade 25 lymphocytterne at blive mærket med MPS-farvestofmateria-let. Normalt er en kontakttid på omkring 10 minutter tilstrækkelig til at effektuere mærkningen af lymphocytterne, skønt kontakten kan blive opretholdt i så lang tid som 1 time uden at ødelægge lymphocytterne. Vi har fun-30 det, at de bedste resultater opnås ved at holde temperaturen af lymphocytsuspensionen/farveopløsningsblandingen ved stuetemperatur (20 °C - 23 eC) under udførelsen af mærkningen. 1

Efter kontakten mellem cellesuspensionen og MPS-farve-stofopløsningen passerer cellerne gennem en fokuseret fluorescensexcitationsenergikilde, som bringer MPS-far- δ vestofmaterialet til at fluorescere. Dette udføres i en fluorescensaktiveret cellesorteringsanordning, hvori den mærkede lymphocytsuspension injiceres i en strøm af skedevæske, som flyder med tilstrækkelig hastighed gennem et 5 rør med lille diameter til at etablere en laminar co-axialstrømning af lymphocytterne inden i skedevæsken. På denne måde adskilles de individuelle lymphocytter til at danne en strøm af individuelle celler inde i skedevæsken. En laserstråle, der omfatter den fokuserede excitations-10 energikilde, rammer i det væsentlige vinkelret på strømningsretningen af den flydende strøm af væske. På denne måde bliver hver individuel lymphocyt belyst med laserstrålen, når den strømmer forbi.

15 Egnede fotoelektriske detektionsanordninger er placeret nede af strømmen ved et punkt, hvor laserstrålen belyser lymphocytterne, og fluorescensintensiteten af hver af lymphocytterne detekteres som en impuls, idet de passerer den fotoelektriske detektionsanordning. Impulserne sendes 20 videre til en impuls tæller, hvor antallet af impulser gemmes i kanaler, der svarer til de enkelte fluorescensintensiteter af impulserne. På denne måde gemmes antallet af impulser for hver fluorescensintensitet til brug ved fremstillingen af fluorescensintensitetsdistributionskur-25 ven.

Som illustreret på fig. 1 og 2 danner data fra hver lymphocy tprøve en bimodal kurve, når impulshøjden (svarende til fluorescensintensiteten) plottes som abscissen og an-30 tallet af tællinger ved denne impulshøjde plottes som ordinaten. Den første top (venstre top) på distributionskurven repræsenterer lav-intensitetlymphocytter, imens den anden top (toppen til højre) på distributionskurven repræsenterer høj-intens!tetslymphocytter. Vi har over-35 raskende fundet, at forholdet mellem antallet af celler i den venstre top og antallet af celler i den højre top (alpha-forholdet) er direkte relateret til tilstedeværel- DK 169565 B1 9 sen eller fravær af en ondartethed i donorlegemet, fra hvilket lymphocytterne blev isoleret. Kurven, der er illustreret på fig. 1, repræsenterer f. eks. en distributionskurve af lymphocytter, der er isoleret fra den do-5 nor, som ikke er plaget med en ondartethed. Det ses, at den venstre top, der repræsenterer lav-intensitetimpul-ser, er væsentlig større end den højre top, som repræsenterer høj-intensitetimpulser. I tilfældet af en fordelingskurve af fluorescensemissionsmærkede celler, der er 10 udtaget fra donorer, som ikke er plaget af en cancer således som f. eks. repræsenteret i fig. 1, er forholdet mellem højre top og den venstre top større end 2,6.

Fig. 2 repræsenterer på den anden side en typisk distri-15 butionskurve for lymphocytter, som blev definitivt diagnosticeret til at have en ondartethed. I dette tilfælde er forskellen mellem antallet af høj-intensitetsimpulser og lav-intensitetsimpulser ikke så stort som i fig. 1, og forholdet mellem venstre top og den højre top er mindre 20 end 2,6.

Grunden til forskellen i forholdet mellem venstre top og den højre top mellem donorer, der har ondartetheder, og de, der ikke har, er ikke fuldstændigt forstået. Det er 25 imidlertid en hypotese, at membranpotentialet af en stor del af lymphocytterne fra donorer med nydannelse af fremmed væv (neoplastiske sygdomme) er noget mere eletronega-tivt og således resulterer i en større binding af MPS-farvestofmaterialet til cellen og/eller cellegennemtræng- 30 ning af farvestoffet, hvilket forøger cellemærkningen.

Den forøgede negativitet af membranpotentialet af denne fraktion af lymphocytterne kan ligeledes forårsage, at MPS-farvestoffet fluorescerer mere intenst. I alle tilfælde vil dette tilvejebringe et større antal tællinger 35 af høj-intensitetsimpulser sammenlignet med lav-intensi tetsimpulser og således bringe alpha-forholdet ned under 2,6. Modsat dette menes lymphocytter fra donorer, der ik- 10 ke er plaget med neoplastiske sygdomme at være mindre elektronegative, hvilket resulterer i en svagere binding af MPS-farvestof til lymphocytterne, og/eller, af de ovenfor nævnte grunde, i en lavere fluorescensemissions-5 intensitet af MPS-farvestofmaterialet. I overensstemmelse hermed skulle dette tilvejebringe et større antal tællinger af lymphocytter med lav intensitet sammenlignet med lymphocytter med høj intensitet og dermed bringe alpha-forholdet over 2,6.

10

Udvælgelsen af excitations- og emissionsbølgelængder er primært afhængigt af valget af MPS-farvestofmateriale, der benyttes i fremgangsmåden. Med cyaninfarvestoffer, der er det foretrukne MPS-farvestofmateriale, har vi fun-15 det, at meget tilfredsstillende resultater opnås, når laserstrålebølgelængden er 4S8 nm og fluorescensemissionen optages ved bølgelængder over 520 nm. Som det er blevet bemærket af Sims, et al., Biochemistry, 13, 3315 (1974), falder fluorescensemissionerne for cyanidfarve-20 stoffer fra omkring 496 nm op til 792 nm. Med det tilrådighed værende udstyr har vi opnået gode resultater ved at måle fluorescensemissionen over 520 nm.

EKSEMPEL

25

Lymphocytter blev separeret fra prøver af 20 ml perifert blod ved at lægge en aliquot af blodprøven, hvorfra de phagocytiske celler var blevet fjernet, på en Ficoll-Triosil densitetsgradientopløsning, der har en densitet 3 30 på 1,081 g/cm ved 25 "C og en osmolatitet på 0,320 Osm/kg. Blodprøven og densitetgradientopløsningen blev centrifugeret ved 550 Gav ved en temperatur på 25°C. Det smalle lag, der flyder umiddelbart over grænsefladen af plasmaet og gradientopløsningsmaterialet, blev suget op 35 med en Pasteur pipette, idet så meget som muligt af det tungere densitetsgradientmateriale og det lettere plasmamateriale over de adskilte cellelag blev undgået. Tiiste- DK 169565 B1 11 deværelsen af noget af disse materialer i de fjernede celleprøver er imidlertid ikke kritisk i den foreliggende teknik. Seperationsteknikken følger generelt teknikken, der er foreslået af L. Cercek, B. Cercek, "Application of 5 the Phenomena of Changes in the Structuredness of

Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diagnosis of Malignant Disorders: a Review", Europ. J. Cancer, Vol. 13, 903 -915 (1977) og af den samme forfatter i en publikation benævnt "Effects of Osmolality and Density of Gradients on 10 the Isolation of SCM-Responding Lymphocytes", Br. J.

Cancer, Vol. 38, 163-165 (1978). Som det imidlertid er nævnt ovenfor, er separationsteknikken ikke kritisk, således som den er foreslået i de førnævnte publikationer, og fremgangsmåden af den foreliggende opfindelse er ikke 15 begrænset til den meget specifikke subpopulation af lym-phocytter, der kræves af teknikken, som nævnes i publikationerne. Den anvendte teknik i den foreliggende fremgangsmåde til adskillelse af lymphocytter fra de tilbageblevne blodkomponenter og den efterfølgende håndtering af 20 de separerede celler er tilsvarende mindre kritisk end det kræves ifølge de ovenfor refererede publikationer.

Blodprøver blev tilvejebragt fra 15 alders- og kønstilpassede sunde donorer, d.v.s. donorer, som blev diagno-25 sticeret til ikke at have en ondartethed, og 15 donorer som blev diagnosticeret til positivt at have cancer. Af hensyn til formålet med dette eksempel er den specifikke type af cancer ikke kritisk. Blodprøver blev også tilvejebragt fra 6 donorer, som blev diagnosticeret til at ha-30 ve ikke-ondartede inflammatoriske sygdomme såsom arthritis og andre betændelsestilstande. Lymphocytfraktionerne, der blev isoleret fra hver af blodprøverne i overensstemmelse med ovennævnte procedure, blev udvasket med 6-7 ml 0,9% natriumchloridopløsning uden konserveringsmidler, og 35 derefter udvasket i PBS. Mellem udvaskningerne blev hver cellesuspension centrifugeret ved 500 G , og superna-tantvæsken blev dekanteret. Efter udvaskningen blev hver DK 169565 B1 12 cellesuspension fra hver prøve rekombineret med PBS, og volumet blev justeret til at udgøre en suspension på omkring 2 x 10^ celler pr. ml.

5 En mærkningsopløsning af diO-Cg -(3) blev forberedt ved først at opløse 28,6 mg farvestof i 10 ml absolut "analar grade " ethanol. Opløsningen blev justeret til dets slut-koncentration ved at injicere 0,1 ml stamopløs-ning i 100 ml PBS.

10 Mærkningen blev effektueret ved at kombinere lige store voluminer mærkningsopløsning og lymphocytsuspension og holde blandingen under let omrøring i mindst 10 minutter.

Ved afslutning af mærkningsproceduren blev fluorescensdi-15 stributionen registreret på et Becton-Dickinson flowcyto-meter, model FACS IV. De MPS-farvestofmærkede celler blev eksiteret med en 488 nm argonionlaserlinie, og fluorescensemissionen over 520 nm blev registreret ved benyttelse af optiske standardfiltre af typen FACS-IV. FACS-20 IV-cytometret var udstyret med en computer, som fungerede som impulsanalysator for registrering og sortering af de opnåede impulser fra prøven. En strøm af individuelle celler blev tilvejebragt som beskrevet ovenfor ved at introducere cellesuspensionen med den mærkede opløsning ind 25 i centret af en flydende strøm af forligelig skedevæske, for derved at etablere en laminar coaxialstrømning inden i dyse-transduceranordningen af FACS-IV-instrumentet. På denne måde blev prøvevæsken og cellerne indeholdt deri, begrænset til den centrale del af væskestrømmen, hvorved 30 cellerne blev forhindret i at berøre instrumentets dyseanordning, og der blev etableret en strøm af individuelle celler forbi laserstrålen. Fluorescensemissionen fra cellerne, der strømmer forbi laserstrålen, blev detekteret af en fotomultiplier, og intensiteten blev omsat til en 35 elektrisk impuls, som blev gemt i impulsanalysatoren. Impulsanalysatoren sorterer impulserne, og, når disse er plottet som impulsfrekvens versus impulshøjden, tilveje- DK 169565 B1 13 bringes der kurver såsom de typiske kurver, der er illustreret på fig. 1 og 2. Det totale antal tællinger i den venstre (NL) og i den højre (NR) top og det resulterende alpha-forhold fra donorer, der er diagnosticeret som væ-5 rende fri for cancer, er vist i tabel 1. Resultaterne fra donorer, der er diagnosticeret til at have cancer og donorer, der er diagnosticeret til at have betændelsessygdomme, såsom arthritis, er vist i henholdsvis tabel 2 og tabel 3.

10 15 20 25 30 1 DK 169565 B1 14 CO O'

* V S

in co c-»

Η X Tf Η N

^ o tn

k ·. IS

H X S N N P

8 c oh in ro k k n o co o in *.

Η X Tf H CO j» ro h co Ln .

k k n -P ^ n no * ros

Η X VO H CO O

Η Ό H D> P >1 CO O _ ,, ra » » CO ·Ρ

Η N Tf v © X

Η X CO N CO h ffl

Φ H

O U

H O

in co +> +> s v co m ro o in o - og Η X VO N CO C i ro h S Tf η m k s in Ό c

VO Tf « w H

Η O X CO N CO „ O Φ

H S

® s in · ro j5 «. in vo δ ro T* ». ». h b* co x co o co © -p u ro c ov in ro h s m s oh Η * ^ ·Ρ

IS X CO CO CO C

Φ -P

O Φ O CO _ c u k k O Η φ in h ·. o

VO X CO N Tf V H

Ό -P

§oi o S v o 01 c VO k w O) in x in h Tf „ ro

X H

Ό in co ·· w k k co Φ

OV O k Qj H

Tf X CO N Tf >t

CO

s co in u

vo k H O

in o - c co x h co in g cn in ^ o co * CO *· kw n x Tf ov in

CO

k k N

OH

Η X S H VO

« u c ^ _ o o H O O li-t Φ u * o o ro o

01 O Φ Η H & -P

u co. \ S. α x © o >< j o* h ro M Q -P 2 2 < fa DK 169565 B1 15 "tf in ^ kV ro

Sin V

CO H

o CO '«ί Q

ro v v η · CO CO * "Τ' o m in h h

cn co h in C

CN v v H JO

CO CN * O

O 'O' ’O' H

oo co cn „ ffl (S3 v v CN X! ^ co m v ε O Η Η H +J o <a ό 0> ro vo CO DJ H > oo σ» v +> o in CO H x © Ή vo H t" £ fcj ro v v in © o cn "tf ?· w £ CJ CN Η H 4J i

ω I

in in σ> in o <o ro v v vo δ h ro o v ©i «η don* h © c •H iH Ό ro ^ co m in w © ro v vo .. > h o o * o © © o m co η Λ m rA +> *8 *1 °v ro S ·

σι σν V O rH

O "tf <N H g $ o ro rH N1 4^ ro s v <n c © co in <« © ^

O CN Η H S' S

•H vH

rH "tf in +> N co °l °l -o § ϋ H vo H § g, © © o vo ro _ w li ro v v o w ® h o * as w u cn h ro

·· H

s *“i I

"tf O V +>

O N* CN CN

S 3 5 °1 I

o m ro cn ^

T

ro co ro in 'v" rH v v in cn o o in ro cn vo

rH

/-v o o

--I * ο o I

© tø ^ O O S

co o φ H rH Ή

m · c o. ro ro α M

©μ O 5 j os -π a NSCQ-P 2 2 <Cl, DK 169565 B1 16 p δ

S

o

(O

JC

-p s' (0 o Ό H O) •H >i

+> CO

•P Λ! Φ (0 P 1H Φ p O O H -P +> <0 CO g o ε Ό _ C <0

». in Dl H

σ» v es to m vD o co _1 f c co h co co σ> ό ·η « w φ H O > φ (0 jS · Æ

ej C^ vO

e2 id p -p in 1 <p to co h in O' in o C rH to Ή o -p in c +> v in in φ φ H ». C"· Dl 5-1 S Η H c3 tf -H 8

* 3J

^ o in w & *. CS O w to

OJ 1 1 "H

CO tf tf O X Ό CO Η Η Η H ^ ··

§5 H

CS Λ -p1 - VO o

Sk ·. P

tf H O

CO Μ Η H rH C

S

* vO w ·. m in rH >ήΙ s ·.

co h es in tf

P

C 1

o O

H o o i id Φ P 1 O O rt o

m o ώ η h ·£ -H

ρ c a \ \ a a © O > J X rH (0 S Q -P 2 Z < fa DK 169565 B1 17

Fra resultaterne af dette eksempel ses det, at i intet tilfælde overstiger alpha-faktorerne 2,6 for lymphocytter fra donorer, der er plaget af en ondartethed. På samme måde falder alpha-faktorerne ikke under 2,6 for lympho-5 cytter fra donorer, som ikke har ondartetheder. Dette er sandt, selv når donoreren er plaget med andre betændelsessygdomstilstande såsom arthritis.

Fra det foregående kan det ses, at fremgangsmåden i den 10 foreliggende opfindelse tilvejebringer en simpel test til screening af blodprøver fra donorer med en ondartethed i deres legeme. Testen kræver en relativ lille blodprøve og kan udføres af personer med almindelige færdigheder på området. Medens opfindelsen er blevet beskrevet og illu-15 streret med reference til bestemte udførelsesformer, er det underforstået, at den kan udformes på anden måde inden for omfanget af de efterfølgende krav.

20 25 30 1

Claims (14)

1. Fremgangsmåde til bestemmelse af en malign!tet i et 5 menneske- eller dyrelegeme, kendetegnet ved, at lymphocytter, der er afledt fra en blodprøve af legemet mærkes ved, at en suspension af disse lymphocytter bringes i kontakt med et fluorescerende materiale, der er følsomt over for et cellemembranpotentiale, og som er 10 bundet til lymphocytterne, at lymphocytterne individuelt bringes til at passere igennem en fokuseret fluorescensexcitationsenergikilde, der bringer det over for membranpotentialet følsomme ma-15 teriale til at fluorescere; at fluorescensemissionsintensiteten fra hver af lymphocytterne måles; 20 at der tilvejebringes en bimodal distributionskurve, der er baseret på intensiteten af lymphocytternes fluorescensemission, og at der bestemmes et forhold mellem antallet af lymphocyt-25 ter med lav fluorescensintensitet og antallet af lymphocytter med høj flourescensintensitet, idet forholdet er en indikation på tilstedeværelsen af malignitet i legemet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det membranpotentialefølsomme materiale er et fluorescensfarvestof valgt blandt cyanin-, merocyanin- og oxonolfarvestofferne. 1

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det membranfølsomme materiale er et cyaninfar-vestof valgt blandt carbocyanin-, dicarbocyanin- og tri- DK 169565 B1 carbocyaninfarvestof ferne.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det membranpotentialfølsomme materiale er 3,3'- 5 dihexyloxacarbocyanin.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at lymphocytsuspensionen omfatter omkring 2 x 10^ celler pr. ml phosphatbufferet saltopløsning. 10

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at lymphocytsuspensionen blandes med lige volumen- ••fi dele af en opløsning, der omfatter 2,86 x 10 af det membranpotentialfølsomme materiale i en phosphatbufferet 15 saltopløsning, og at blandingen opretholdes i tilstrække lig tid til at effektuere binding af i det mindste del af materialet til lymphocytterne.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet 20 ved, at blandingen opretholdes i omkring 10 minutter.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at excitationsenergikilden er en laserstråle.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at laserstrålen har en bølgelængde på 488 nm.

10. Fremgangsmåden ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de mærkede lymphocytter injiceres i en flydende 30 strøm af en forligelig skedevæske, og at der tilvejebringes en laminar coaxialstrømning af lymphocytterne og skedevæsken, hvorved lymphocytterne som individuelle celler tvinges ind i den flydende strømnings centrale del inden de passerer gennem excitationsenergikilden. 35

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at fluorescensemissionsintensiteten fra hver af lym- DK 169565 B1 phocytterne konverteres til en elektrisk impuls, hvis højde er direkte relateret til emissionsintensiteten, og at fluorescensemissionsintensiteten plottes på en distributionskurve med impulshøjden som abscissen og impulsan-5 tallet som ordinaten, idet distributionskurven er bimodal med den ene top repræsenterende lav-intensitetsemission og den anden top repræsenterende høj-intensitetsemission.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 20 ved, at antallet af impulser i toppen, der repræsenterer høj-intensitetsemissioner, divideres med antallet af impulser i toppen, der repræsenterer lav-intensitetsemissionen til opnåelse af en alpha-faktor, der er karakteristisk for lymphocytter, der er afledt fra et legeme, 25 der er plaget af malignitet og for lymphocytter, der er afledt fra et legeme, der er fri for malignitet.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at lymphocytterne, der er afledt fra et legeme med 20 en maglinitet, har en alpha-faktor på mindre end 2,6.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at lymphocy tterne, der er afledt fra et legeme, der er fri for malignitet, har en alpha-faktor større end 25 2'6* 30 1