NO173409B - Fremgangsmaate for in vitro bestemmelse av malignans - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for in vitro bestemmelse av malignans (ondartethet) ut fra lymfocytter fra en blodprøve, og det særegne vedfremgangs-måten i henhold til oppfinnelsen er trinnene med: - merking av lymfocytter som tilhører undergruppen av SCM-responderende lymfocytter avledet fra en blodprøve ved å bringe en suspensjon derav, foretrukket en suspensjon i fosfatbufret saltløsning inneholdende omtrent 2 x 10^ celler pr. ml saltløsning, i kontakt med et fluorescerende celle-membranpotensialsensitivt material hvorved det membranpotensialsensitive material bindes til lymfocyttene, - lymfocyttene bringes til å passere enkeltvis gjennom en fokusert kilde for fluorescenseksitasjonsenergi som bevirker at det membranpotensialsensitive material fluorescerer, - intensiteten av fluorescensemisjonen fra hver av lymfocyttene måles, - det dannes en bimodal fordelingskurve basert på intensiteten av fluorescensemisjonen fra lymfocyttene og det bestemmes et forhold derfra mellom antallet lymfocytter med lavere fluorescensintensiteter og antallet lymfocytter med høyere fluorescensintensiteter, idet forholdet indikerer lymfocyttenes tilknytning til malignans, slik at et forhold mindre enn omtrent 2,6 er betegnende for lymfocytter forbundet med malignans og et forhold større enn omtrent 2,6 er betegnende for lymfocytter som ikke er forbundet med malignans.

Disse og andre trekk ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen fremgår av patentkravene.

Foreliggende oppfinnelse er basert på differensiell binding av membranpotensialsensitive materialer av lymfocytter og vedrører spesielt en fremgangsmåte for påvisning av ondartethet i en kropp under anvendelse av differensiell binding av potensialsensitive materialer ved hjelp av lymfocytter.

I de senere år har det vært økende interesse for bruk av bio-logiske prober, som f. eks. membranpotensialsensitive fargestoffer, for bestemmelse av endringer i membranpotensial i levende celler eller andre cellulære strukturer ved elektro-fysiologiske og biofysikalske undersøkelser av levende celler. F. eks. har slike materialer vært anvendt for studering av membranpotensial i aksonnerveceller i kjempe-blekksprut, se Cohen LPB et al. J. Membrane Biol. 19, 1

(1974), i røde blodlegemer, se Hoffmann, J.R. og Laris, P.C., Physiol. Lond. 239, 519 (1974), og for froskehjertemuskelvev, seMorad, M. og Selema, G., J., Physiol. Lond. 292, 267

(1972) .

Langs denne samme vei fører studium av blodcellefysiologi til metoder for påvisning av sykdomstilstander i menneske-og dyrekropper. F. eks. er det utviklet en metode for tidlig påvisning av cancer og andre antigenproduserende sykdommer og kroppstilstander under anvendelse av intracellulære fluorescein-fluorescenspolarisasjonsmålinger i levende celler for å studere endringer i struktureringsgraden av cyto-plasmisk matriks (SCM). SCM inkluderer forskjellige celle-strukturer som f. eks. mitokondria, cellemembraner, celle-saft, lysosomer, ribosomer, kjerner o.l. Den tidligere metode, som omtales i litteraturen som "SCM-Test", og den anvendte teknikk er oppsummert i en publikasjon av L. Cercek,B.Cercek, "Application of the Phenomenon of Changes in theStructuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diagnosis of Malignant Disorders: A Review", Europ. J. Cancer, Vol.13, 903-915 (1977). Under anvendelse av denne teknikk kan tidlig diagnose av cancer og andre typer sykdommer og kroppstilstander lett utføres ved å måle de differensielle responser av en densitetspesifikk undergruppe av perifere blodlymfocytter til f. eks. mitogent fytohaemagglutinin og cancerassosierte antigener. Endringer i interacellulær fluoresceinfluorescenspolarisering anvendes for å indikerte de differensielle responser av lymfocyttene.

Den ovenfor beskrevne metode krever imidlertid meget høy-kvalifisert personell og ytterst omhyggelig teknikk for å separere og isolere undergruppeen av SCM-responderende lymfocytter fra blodprøven, og gjennomføring av fluorescens-målingene. I tillegg krever SCM-testteknikken mikroanalytisk. presisjon ved de intracellulære fluorescenspolarisasjonsmålinger, høy instrumentfølsomhet og stabilitet. Dårlig teknikk og ukvalifisert håndtering av lymfocytter som er følsomme for forstyrrelser i den metabolske tilstand kan resultere i ikke-reproduserbare og fullstendig feilaktige testresultater.

Det ville følgelig være meget ønskelig å tilveiebringe en screeningteknikk for påvisning av cancer som er enklere og billigere å gjennomføre, og som pålitelig kan gjennomføres med en lavere grad av teknisk ferdighet under anvendelse av lettere tilgjengelig utstyr slik at metodologien ved en slik screeningteknikk gjøres praktisk for rutineanvendelse i kliniske laboratorier og endog ved legekontorer.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for screening av blodprøver for nærvær av ondartethet i giverkroppen under anvendelse av kommersielt tilgjengelig instrumentering for påvisning og opptegning av testresultater. Metodologien ved oppfinnelsen er basert på differensiell opptagning av et membranpotensialsensitivt material av en viss undergruppe av lymfocytter, idet denne opptagning er forskjellig i avhengighet av om giverkroppen er utsatt for en ondartethet eller ikke. Selvom metodologien definert heri fremdeles krever en grad av ferdighet ved isolasjonen av den riktige densitetspesifikke undergruppe av lymfocytter, er den mindre krevende og lettere utførbar for den fagkyndige. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen anvender strømningscytometriteknikk og instrumentering som er godt forstått og lett tilgjengelig og håndteringen av lymfocyttene er mindre kritisk enn i den tidligere beskrevne SCM-test. Den foreliggende fremgangsmåte er særlig egnet for bruk som en rutinemessig cancer-screeningsprosedyre som kan anvendes i forbindelse med den ovennevnte SCM-test, og er i stand til meget tidlig og spesifikk diagnose av ondartethet. Fremgangsmåten gjennomføres in vitro.

Fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse omfatter at en suspensjon av levedyktige lymfocytter bringes i kontakt med en oppløsning inneholdende et membranpotensialsensitivt fluorescerende material. Slike materialer, som konvensjonelt omtales som membranpotensialsensitive fluorescerende fargestoffer vil i det følgende omtales som "MPS-fargestof fer". Kontakten mellom lymfocyttsuspensjonen ogMPSfargestoffet opprettholdes i tilstrekkelig tid for å tillate merking av lymfocyttene med MPS-fargestoffmaterialet.

Etter merkingsoperasjonen som beskrevet i det foregående føres de nå merkede lymfocytter som enkeltceller gjennom en fokusert kilde for eksitasjonsenergi som vil bevirke at ethvert MPSfargestoffmaterial hvormed lymfocyttene er blitt merket, fluorescerer. Den fluorescerende emisjon fra hver celle opptegnes som en puls og antallet pulser av hver intensitet lagres. En avsetning av fordelingen av antallet pulser i forhold til pulsintensiteten av fluorescense-mis j onene fra de merkede lymfocytter er en bimodal kurve, d.v.s. kurven omfatter to topper. Den første topp av kurven inkluderer pulser med lav fluorescensintensitet og den annen topp omfatter pulser med høy fluorescensintensitet. Et forhold mellom det totale antall lavfluorescenspulser og høyfluorescenspulser for hver testet prøve frembringer en faktor som differensierer lymfocytter avledet fra givere angrepet av cancer fra dem som ikke er angrepet av cancer. Denne faktor, som her omtales som alfafaktoren, er funnet å være mindre enn 2,6 for lymfocyttsuspensjoner som er forbundet med malignans. På den annen side er alfafaktorer på mer enn 2,6 assosiert med lymfocyttprøver som ikke er forbundet med malignans. På denne basis tilveiebringer fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse en screeningtest for nærvær av cancer som er forholdsvis enkel, økonomisk og som krever bare en vanlig grad av teknisk ferdighet ved gjennomføringen.

Oppfinnelsen vil bli forstått mer fullstendig fra den detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen i sammenheng med teg-ningene hvori: Fig. 1 er en representativ fremstilling av pulsfordel-ingene av fluorescerende emisjoner fra en typisk lymfocyttprøve avledet fra en giver som ikke er forbundet med malignans, og Fig. 2 er en representativ avsetning av pulsfordelingen av de fluorescerende emisjoner av lymfocytter avledet fra en giver forbundet med malignans.

Cellene anvendt ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse er lymfocytter separert fra en prøve av blod tatt fra en kropp som testes. Selv om det hittil ikke er fullt ut forstått, antas det at lymfocytter, som er av T-celletypen, er involvert i gjenkjennelse av malignansassos-ierte antigener. Visse lymfocytter, benevnt SCM-responderende lymfocytter, avledet fra givere angrepet av cancer er blitt forbehandlet in vivo for å gjenkjenne malignans-assosierte antigener, slik som dem som dannes av tumorceller, og er følgelig funnet å ha en forskjellig respons overfor MPSfargestoffer enn lymfocytter avledet fra en giver som ikke er forbundet med malignans.

Lymfocyttene anvendbare ved den foreliggende oppfinnelse blir mest passende separert fra blodprøven ved sentrifugering av blodprøven på en densitetsradientoppløsning, som f. eks. en blanding av "Ficoll 400" (Pharmacia AB) og "Triosil 440"

(Nyegaard&Co.) oppløsninger. Blodceller med en densitet mindre enn gradientoppløsningen flyter på toppen av gradient-oppløsningen og kan separeres fra celler med densiteter større enn av gradientoppløsningen. En slik metode for separering av blodkomponenter er godt forstått på området, som f. eks. den teknikk som er publisert av R. Harris, E.

Ukaejiofo, Lancet, vol. 2, 327 (1969). Ved modifisering av gradientoppløsningen til separasjonsdensitet på 1,08 gram/cm-^ ved 25°C og osmolalitet på 0,320 Osm/kg, vil SCM-responderende lymfocytter flyte på gradientoppløsningen etter sentrifugering av en blodprøve og separeres lett ved å løfte opp cellelaget direkte over plasmagradientoppløsnings-grenseflaten, som beskrevet av L. Cercek, B. Cercek, Br. J. Cancer, vol. 28, 163 (1978).

Etter separering fra gradientoppløsningen blir cellene vasket, foretrukket to ganger, med konserveringsmiddelfri natriumkloridoppløsning for injeksjoner og deretter, foretrukket to ganger, med komplett Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (PBS).

Etter vaskingen suspenderes cellene i PBS for bruk ved test-metoden i samsvar med oppfinnelsen. Konsentrasjonen av cellene i suspensjonen er ikke kritisk, selv om et tilstrekkelig antall celler må være tilstede i suspensjonen for utvikling av fluorescensintensitetsfordelingskurven, som mer detaljert forklart i det følgende. Gode resultater er oppnådd i samsvar med den foretrukkede utførelsesform av oppfinnelsen under anvendelse av lymfocyttsuspensjons-konsentrasjoner på omtrent 10^ celler pr. ml.

MPS-fargestoffer er materialer som inneholder en fluorokrom og som er i stand til å bindes på eller penetrere cellemem-branen. Den eksakte mekanisme hvormed MPS-fargestoffer arbeider er ikke klar selv om forskjellige modeller er foreslått, se Sims et al, Biochemistry 13, 3315 .(1974).

MPS-fargestoffmaterialer egnet for bruk ved den foreliggende oppfinnelse selekteres fra gruppen bestående av cyaninfargestoffer, merocyaninfargestoffer og oksonolfargestoffer. Blant merocyaninfargestoffene er merocyaninoksazolon og merocyaninrodanin. De mest grundig undersøkte og foretrukkede grupper av fargestoffer er de cyaninfargestoffer som er fremstilt og undersøkt av Sims et al., Biochemistry 13, 3315 (1974). I denne publikasjon ble omtrent 29 cyaninfargestoffer .undersøkt med hensyn til virkningen på fargestoffet av endringer i cellemembranpotensialene. Et kommersielt tilgjengelig cyaninfargestoff hvormed gode resultater er blitt oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse er 3,3'-diheksyloksakarbocyanin. I samsvar med konvensjonen angitt i publikasjonen til Sims et al, skal dette fargestoff identifiseres ved hjelp av sin forkortede betegnelse, nemlig diO-C5~(3). MPS-fargestoffmaterialet anvendes ved den foreliggende oppfinnelse som en fortynnet oppløsning av fargestoffet i PBS. I oppløsningen varierer konsentrasjonen av MPS-fargestoffet mellom omtrent 2 x 10~6 til omtrent 5 x 10~6, og er foretrukket omtrent 3 x 10~6 gram/ml. Ettersom mange av MPS-fargestoffmaterialene bare er sparsomt opp-løselige i den fosfatbufrede saltløsning, er det foretrukket først å danne en mer konsentrert oppløsning av MPS-farge-stof fmaterialet i etylalkohol etterfulgt av fortynning av den konsentrerte alkoholoppløsning til den ønskede konsentrasjon med PBS.

Etter å ha fremstilt lymfocyttsuspensjonen som beskrevet i det foregående, merkes lymfocyttene med MPS-farge-stof fmaterialet . Merkeoperasjonen gjennomføres mest passende ved sammenblanding av like deler lymfocyttoppløsning med den fortynnede oppløsning av MPS-materialet, og med fortsatt forsiktig omrøring blir lymfocyttsuspensjonfargestoff-oppløsningsblandingen opprettholdt over en passende periode for å tillate merkingen av lymfocyttene med MPS-farge-stof fmaterialet. Vanligvis er en kontakttid på omtrent ti minutter tilstrekkelig for å bevirke merking av lymfocyttene selv om kontakt kan opprettholdes så lenge som en time uten å funnet at de beste resultater oppnås ved å opprettholde tem-peraturen i lymfocyttsuspensjon/fargestoffoppløsningsbland-ingen ved romtemperatur (20 til 23°C) under merkingsoperasjonen.

Etter kontakten mellom cellesuspensjonen og MPS-fargestoff-oppløsningen føres cellene gjennom en fokusert kilde for fluorescenseksitasjonsenergi som bevirker at MPS-fargestoffmaterialet fluorescerer. Dette gjennomføres i en fluor-escensaktivert cellesorterer hvori den merkede lymfocytt-suspensjon injiseres i en strøm av et skjermfluid som strømmer med tilstrekkelig hastighet gjennom et rør med liten diameter for å etablere en laminær koaksial strøm av lymfocyttene inne i skjermfluidet. På denne måte separeres de enkelte lymfocytter til å danne en strøm av enkeltceller inne i skjermfluidet. En laserstråle omfatter den fokuserte kilde av eksitasjonsenergi og stråler bringes til"å slå an mot den flytende strøm av fluid stort sett loddrett på strømningsretningen. På denne måte blir hver enkelt lymfocytt undersøkt av laserstrålen når den strømmer forbi. Egnede fotoelektriske deteksjonsinnretninger er anbragt nedstrøms fra det punkt hvor laserstrålen undersøker lymfocyttene, og fluorescensintensiteten av hver av lymfocyttene detekteres som en puls når denne passerer den fotoelektriske detekteringsinnretning. Pulsintensiteten sendes til en pulsteller hvor tellingen av denne puls lagres i en kanal adskilt for den spesielle intensitet av denne puls. På denne måte blir antallet pulser ved hver pulsinten-sitet lagret for bruk ved utvikling av fordelingskurven.

Som illustrert i fig. 1 og 2, ved avsetning som pulshøyde (tilsvarende fluorescensintensiteten) som abscisse og antallet tellingen ved denne pulshøyde som ordinat, danner dataene fra hver prøve av lymfocytter en bimodal kurve. Den første topp (venstre topp) på fordelingskurven representerer lavintensitetslymfocytter, mens den annen topp (høyre topp) på fordelingskurven representerer høyintensitetslymfocytter. Det ble uventet funnet at forholdet mellom antall celler i venstre topp og antallet celler i høyre topp (alfaforholdet) er direkte relatert til nærvær eller fravær av malignans i kroppen av den giver hvorfra lymfocyttene ble isolert.

F. eks. representerer kurven i fig. 1 en fordelingskurve av lymfocytter isolert fra en giver som ikke er angrepet av malignans. Det sees at den venstre topp som representerer lavintensitetspulser er vesentlig større enn den høyre topp som representerer høyintensitetspulser. I tilfellet av fordelingskurvene av de fluorescerende emisjonsmerkede celler avledet fra givere som ikke er angrepet av cancer, som f. eks. representert i fig. 1, er forholdet mellom høyre topp og venstre topp mer enn 2,6.

Fig. 2 representerer på den annen side en typisk fordelingskurve for lymfocytter isolert fra en giver som ble definitivt diagnostisert med malignans. I dette tilfelle er forskjellen mellom antallet høyintensitetspulser og lavintensitetspulser ikke så stort som i fig. 1, og forholdet mellom venstre topp og høyre topp er mindre enn 2,6.

Grunnene til forskjellen i forholdet mellom venstre topp og høyre topp mellom givere med malignans og dem som ikke har malignans er ikke fullt ut forstått. Det er imidlertid hypotese om at membranpotensialet av en stor fraksjon av lymfocytter fra givere med neoplastiske sykdommer er.noe mer elektronegative slik at dette resulterer i en større binding avMPS-fargestoffmaterial til cellen og/eller penetrasjon av cellen av fargestoffer som øker cellemerkningen. Den økte negativitet av membranpotensialet av denne fraksjon av lymfocytter kan også bevirke at MPS-fargestoffet fluorescerer mer intenst. I alle fall vil dette frembringe et større antall tellinger av høyintensitetspulser sammenlignet med lavintensitetspulser slik at dette bringer alfaforholdet ned under 2,6. I motsetning til dette vil lymfocytter fra givere som ikke er angrepet av neoplastiske sykdommer antas å være mindre elektronegative slik at dette resulterer i lavere binding av MPS-fargestoffet til lymfocyttene og/eller, av de grunner som er angitt i det foregående, lavere intensitets-fluorescensemisjoner av MPS-fargestoffmaterialet. Følgelig vil dette frembringe et større antall tellinger for lymfocytter med lav intensitet i sammenligning med dem med høy intensitet slik at alfaforholdet bringer over 2,6.

Seleksjon av eksitasjons- og emisjonsbølgelengder er primært avhengig av valget av MPS-fargestoffmaterial anvendt ved fremgangsmåten. Med cyaninfargestoffer som er de foretrukkede MPS-fargestoffmaterialer, er det funnet at meget tilfredsstillende resultater oppnås når laserstrålebølge-lengden er 488 nm og fluorescensemisjoner med bølgelengder over 520 nm registreres. Som påpekt av Sims et al., Biochemistry, 13, 3315 (1974), varierer fluorescensemisjonene for cyaninfargestoffene fra omtrent 496 opp til 792 nm. Med tilgjengelig utstyr ble det oppnådd gode resultater ved måling av fluorescensemisjoner over 520 nm.

EKSEMPEL

Lymfocytter ble separert fra prøver av 20 ml perifert blod ved opplegging av en delprøve av blodprøven hvorfra de fago-cytiske celler var blitt fjernet på en Ficoll-Triosil densi-tetsgradientoppløsning med densitet 1,081 g/cm<3>ved 25°C og osmolalitet på 0,320 Osm/kg. Blodprøven og densitetsgrad-ientoppløsningen ble sentrifugert ved 5 50 Gav ved en temperatur på 25°C. Det tynne lag som fløt direkte over grenseflaten mellom plasma og gradientoppløsningsmaterialet ble trukket opp med en Pasteur-pipette idet man unngikk i så sterk grad som mulig det tyngre densitetsgradientmaterial og de lettere plasmamaterialer som fløt over det separerte lag av celler. Nærværet av noen av disse materialer i den fjernede celleprøve er imidlertid ikke kritisk ved den foreliggende oppfinnelse. Denne separasjonsteknikk følger generelt teknikken angitt av L. Cercek, B. Cercek, "Application of the Phenomena of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diagnosis of MalignantDisorders: A Review", Europ. J.Cancer, vol. 13, 903-915

(1977), og av de samme forfattere i en publikasjon med tittel "Effects of Osmolality and Density of Gradients on the Isolation of SCM-Responding Lymphocytes", Br. J. Cancer, vol. 38, 163-165 (1973). Imidlertid, som nevnt i det foregående, er separasjonsteknikken ikke kritisk som angitt i de ovennevnte publikasjoner og fremgangsmåten i samsvar med den foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til den meget spesifikke undergruppe av lymfocytter nødvendig for den teknikk som er angitt i publikasjonen. Følgelig er den teknikk som anvendes ved den foreliggende fremgangsmåte for separering av lymfocyttene fra de øvrige blodkomponenter og den etterfølgende håndtering av de separerte celler langt mindre kritisk enn det som kreves i de ovenfor omtalte pub-likasj oner.

Blodprøver ble oppnådd fra 15 friske givere som var alders-og kjønnstilpasset, d.v.s. givere som ikke var diagnostisert til å ha en malignans, og 15 givere som ble positivt diagnostisert med cancer. For formålet med dette eksempel er den spesifikke type cancer ikke kritisk. Blodprøver ble også oppnådd fra seks givere som ble diagnostisert med ikke-maligne inflammatoriske sykdommer, som f. eks. artritt og andre inflammatoriske tilstander. Lymfocyttfraksjonene isolert fra hver av blodprøvene, i henhold til prosedyren beskrevet i det foregående, ble vasket med 6 til 7 ml av en 0,9 % av NaCl uten konserveringsmidler etterfulgt av vasking 1 PBS. Mellom vaskingene ble hver cellesuspensjon sentrifugert ved 500 Gav og supernatantvæsken ble dekantert. Etter vasking ble cellesuspensjonen fra hver prøve rekombinert med PBS og volumet innstilt til å danne en suspensjon av omtrent 2 x IO<6>celler pr. ml.

En merkingsoppløsning av diO-C5-O) ble fremstilt ved først

å oppløse 28,6 mg av fargestoffet i 10 ml absolutt "analyse-ren" etanol. Oppløsningen ble innstilt til sin endelige konsentrasjon ved injisering av 0,1 ml av hovedoppløsningen i 100 ml PBS. Merking ble gjennomført ved kombinering av like volum av merkingsoppløsningen og lymfocyttsuspensjonen og opprettholdelse av blandingen med forsiktig omrøring i minst ti minutter. Ved fullføringen av merkingsprosedyren ble fluorescensfordelingene registrert på et Becten-Dickenson strømningscytometer, modell FACS IV. De MPS-farge-stoffmerkede celler ble eksitert med en 488 nm argonionlaser-linje og fluorescensemisjoner over 520 nm ble registrert under anvendelse av standard FACS IV optiske filtre. FACS IV cytometeret var forsynt med en regnemaskin som gjorde tjeneste som en pulsanalysator for registrering og sortering

av pulsene oppnådd fra prøven. En strøm av enkeltceller ble frembragt som beskrevet i det foregående, ved innføring av suspensjonen av celler i merkingsoppløsningen i midten av en rennende strøm av forlikelig skjermfluid slik at det ble etablert en laminær koaksial strømning inne i dyse-transduk-torsammensetningen av FACS IV instrumentet. På denne måte ble prøvefluidet og cellene inneholdt deri holdt inne i den sentrale del av den flytende væskestrøm slik at cellene var forhindret fra å røre instrumentdysesammenstillingen og tilveiebragte en strøm av enkeltceller forbi laserstrålen. Fluorescensemisjonene fra celler som fløt forbi laserstrålen ble detektert ved hjelp av en fotoforsterker og intensiteten translatert i en elektrisk puls som ble lagret av puls-analysatoren. Pulsanalysatorsorteringen, avsatt som frekvens av pulser versus pulshøyde frembragte kurver som de typiske kurver illustrert i fig. 1 og 2. De totale tellinger av venstre NL og høyre NR topper og det resulterende alfaforhold for givere diagnostisert som fri for cancer er angitt i følgende tabell I. Resultatene for givere diagnostisert til å ha cancer og givere diagnostisert med inflammatoriske sykdommer som artritt, er angitt i tabell II, henholdsvis

III.

Fra resultatene av eksemplene sees det at ikke i noe

tilfelle overstiger alfafaktorene for lymfocytter med givere angrepet av malignans 2,6. Ved samme forhold faller ikke alfafaktorer fra lymfocytter fra givere som ikke har malignans under 2,6. Dette er tilfellet endog når giveren er utsatt for andre inflammatoriske sykdomsbetingelser som f. eks. artritt.

Fra det foregående sees at fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en enkel test for screening av blodprøver av givere for nærvær av en malignans i giverens kropp. Testen krever en forholdsvis liten blod-prøve og kan gjennomføres av personer med vanlig ferdighet på området.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for in vitro bestemmelse av malignans ut fra lymfocytter fra blodprøve, karakterisert vedtrinnene med: - merking av lymfocytter som tilhører undergruppen av SCM-responderende lymfocytter avledet fra en blodprøve ved å bringe en suspensjon derav, foretrukket en suspensjon i fosfatbufret saltløsning inneholdende omtrent 2 x IO<6>celler pr. ml saltløsning, i kontakt med et fluorescerende celle-membranpotensialsensitivt material hvorved det membranpotensialsensitive material bindes til lymfocyttene. - lymfocyttene bringes til å passere enkeltvis gjennom en fokusert kilde for fluorescenseksitasjonsenergi som bevirker at det membranpotensialsensitive material fluorescerer, - intensiteten av fluorescensemisjonen fra hver av lymfocyttene måles, - det dannes en bimodal fordelingskurve basert på intensiteten av fluorescensemisjonen fra lymfocyttene og det bestemmes et forhold derfra mellom antallet lymfocytter med lavere fluorescensintensiteter og antallet lymfocytter med høyere fluorescensintensiteter, idet forholdet indikerer lymfocyttenes tilknytning til malignans, slik at et forhold mindre enn omtrent 2,6 er betegnende for lymfocytter forbundet med malignans og et forhold større enn omtrent 2,6 er betegnende for lymfocytter som ikke er forbundet med malignans.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat det membranpotensialsensitive material er et fluorescerende fargestoff valgt fra gruppen bestående av cyaninfargestoffer, merocyaninfarge-stof fer og oksonolfargestoffer, foretrukket et cyaninfarge-stof f valgt fra gruppen bestående av karbocyanin-, dikarbo-cyanin- og trikarbocyaninfargestoffer.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2,karakterisert vedat det membranpotensialsensitive material er 3,3'-diheksyloksakarbocyanin.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat suspensjonen av lymfocytter blandes med like volumdeler av en oppløsning omfat-tende 2,86 x 10~6 g/ml av det nevnte membranpotensialsensitive materiale i fosfatbufret saltoppløsning, og at blandingen opprettholdes i tilstrekkelig tid til å bevirke binding av i det minste en del av materialet til lymfocyttene, foretrukket i det minste i omtrent ti minutter.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat kilden for eksitasjonsenergi er en laserstråle, foretrukket med en bølgelengde på 48 8 nm.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat de merkede lymfocytter injiseres inn i en flytende strøm av et blandbart skjermfluid og en laminær, koaksial strøm av de nevnte lymfocytter og det nevnte skjermfluid etableres hvorved lymfocyttene holdes som enkeltceller i senterdelen av den flytende strøm før de passerer gjennom kilden for eksitasjonsenergi.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat intensiteten av fluorescensemisjoner fra hver av lymfocyttene omdannes til en elektrisk puls hvis høyde er direkte relatert til intensiteten av emisjonen, og avsettes på en fordelingskurve med pulshøyde som abscisse og pulstall som ordinat, idet fordelingskurven er bimodal med en topp representerende lavere intensitetsemisjon og den annen topp representerende høyere intensi-tetsemisj on.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat antallet pulser i toppen som representerer høyere intensitetsemisjon oppdeles i antall pulser i toppen som representerer lavintensitetsemisjoner for oppnåelse av en alfafaktor som er karakteristisk for lymfocytter forbundet med malignans og for lymfocytter som ikke er forbundet med malignans.