NO173409B - Fremgangsmaate for in vitro bestemmelse av malignans - Google Patents
Fremgangsmaate for in vitro bestemmelse av malignans Download PDFInfo
- Publication number
- NO173409B NO173409B NO88883260A NO883260A NO173409B NO 173409 B NO173409 B NO 173409B NO 88883260 A NO88883260 A NO 88883260A NO 883260 A NO883260 A NO 883260A NO 173409 B NO173409 B NO 173409B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- lymphocytes
- intensity
- malignancy
- membrane potential
- fluorescence
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 48
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 96
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 51
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 51
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims abstract description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 39
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 37
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 claims abstract description 33
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000002902 bimodal effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 27
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 17
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 11
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 9
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M merocyanine Chemical compound [Na+].O=C1N(CCCC)C(=O)N(CCCC)C(=O)C1=C\C=C\C=C/1N(CCCS([O-])(=O)=O)C2=CC=CC=C2O\1 DZVCFNFOPIZQKX-LTHRDKTGSA-M 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 3
- GKLGUKVTTNJEBK-UHFFFAOYSA-N 3-hexyl-2-[3-(3-hexyl-1,3-benzoxazol-3-ium-2-yl)prop-2-enylidene]-1,3-benzoxazole Chemical compound O1C2=CC=CC=C2[N+](CCCCCC)=C1\C=C\C=C1/N(CCCCCC)C2=CC=CC=C2O1 GKLGUKVTTNJEBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N WHWLQLKPGQPMY Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C1=CNC=N1 IXKSXJFAGXLQOQ-XISFHERQSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 2
- 239000000298 carbocyanine Substances 0.000 claims 1
- QWYZFXLSWMXLDM-UHFFFAOYSA-M pinacyanol iodide Chemical compound [I-].C1=CC2=CC=CC=C2N(CC)C1=CC=CC1=CC=C(C=CC=C2)C2=[N+]1CC QWYZFXLSWMXLDM-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 3
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 241001388635 Architeuthis dux Species 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- UKIYDXCFKFLIMU-UHFFFAOYSA-M Isopaque Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I UKIYDXCFKFLIMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 argon ion Chemical class 0.000 description 1
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- FAXPCTRHXLEEBC-IVLCTAEISA-M sodium;3-[(4z)-4-[(e,4z)-4-(3-ethyl-4-oxo-2-sulfanylidene-1,3-thiazolidin-5-ylidene)but-2-enylidene]quinolin-1-yl]propane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1N(CC)C(=S)S\C1=C/C=C/C=C/1C2=CC=CC=C2N(CCCS([O-])(=O)=O)C=C\1 FAXPCTRHXLEEBC-IVLCTAEISA-M 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56972—White blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
- Measurement Of Radiation (AREA)
- Radar Systems Or Details Thereof (AREA)
- Magnetic Resonance Imaging Apparatus (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for in vitro bestemmelse av malignans (ondartethet) ut fra lymfocytter fra en blodprøve, og det særegne vedfremgangs-måten i henhold til oppfinnelsen er trinnene med: - merking av lymfocytter som tilhører undergruppen av SCM-responderende lymfocytter avledet fra en blodprøve ved å bringe en suspensjon derav, foretrukket en suspensjon i fosfatbufret saltløsning inneholdende omtrent 2 x 10^ celler pr. ml saltløsning, i kontakt med et fluorescerende celle-membranpotensialsensitivt material hvorved det membranpotensialsensitive material bindes til lymfocyttene, - lymfocyttene bringes til å passere enkeltvis gjennom en fokusert kilde for fluorescenseksitasjonsenergi som bevirker at det membranpotensialsensitive material fluorescerer, - intensiteten av fluorescensemisjonen fra hver av lymfocyttene måles, - det dannes en bimodal fordelingskurve basert på intensiteten av fluorescensemisjonen fra lymfocyttene og det bestemmes et forhold derfra mellom antallet lymfocytter med lavere fluorescensintensiteter og antallet lymfocytter med høyere fluorescensintensiteter, idet forholdet indikerer lymfocyttenes tilknytning til malignans, slik at et forhold mindre enn omtrent 2,6 er betegnende for lymfocytter forbundet med malignans og et forhold større enn omtrent 2,6 er betegnende for lymfocytter som ikke er forbundet med malignans.
Disse og andre trekk ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen fremgår av patentkravene.
Foreliggende oppfinnelse er basert på differensiell binding av membranpotensialsensitive materialer av lymfocytter og vedrører spesielt en fremgangsmåte for påvisning av ondartethet i en kropp under anvendelse av differensiell binding av potensialsensitive materialer ved hjelp av lymfocytter.
I de senere år har det vært økende interesse for bruk av bio-logiske prober, som f. eks. membranpotensialsensitive fargestoffer, for bestemmelse av endringer i membranpotensial i levende celler eller andre cellulære strukturer ved elektro-fysiologiske og biofysikalske undersøkelser av levende celler. F. eks. har slike materialer vært anvendt for studering av membranpotensial i aksonnerveceller i kjempe-blekksprut, se Cohen LPB et al. J. Membrane Biol. 19, 1
(1974), i røde blodlegemer, se Hoffmann, J.R. og Laris, P.C., Physiol. Lond. 239, 519 (1974), og for froskehjertemuskelvev, seMorad, M. og Selema, G., J., Physiol. Lond. 292, 267
(1972) .
Langs denne samme vei fører studium av blodcellefysiologi til metoder for påvisning av sykdomstilstander i menneske-og dyrekropper. F. eks. er det utviklet en metode for tidlig påvisning av cancer og andre antigenproduserende sykdommer og kroppstilstander under anvendelse av intracellulære fluorescein-fluorescenspolarisasjonsmålinger i levende celler for å studere endringer i struktureringsgraden av cyto-plasmisk matriks (SCM). SCM inkluderer forskjellige celle-strukturer som f. eks. mitokondria, cellemembraner, celle-saft, lysosomer, ribosomer, kjerner o.l. Den tidligere metode, som omtales i litteraturen som "SCM-Test", og den anvendte teknikk er oppsummert i en publikasjon av L. Cercek,B.Cercek, "Application of the Phenomenon of Changes in theStructuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diagnosis of Malignant Disorders: A Review", Europ. J. Cancer, Vol.13, 903-915 (1977). Under anvendelse av denne teknikk kan tidlig diagnose av cancer og andre typer sykdommer og kroppstilstander lett utføres ved å måle de differensielle responser av en densitetspesifikk undergruppe av perifere blodlymfocytter til f. eks. mitogent fytohaemagglutinin og cancerassosierte antigener. Endringer i interacellulær fluoresceinfluorescenspolarisering anvendes for å indikerte de differensielle responser av lymfocyttene.
Den ovenfor beskrevne metode krever imidlertid meget høy-kvalifisert personell og ytterst omhyggelig teknikk for å separere og isolere undergruppeen av SCM-responderende lymfocytter fra blodprøven, og gjennomføring av fluorescens-målingene. I tillegg krever SCM-testteknikken mikroanalytisk. presisjon ved de intracellulære fluorescenspolarisasjonsmålinger, høy instrumentfølsomhet og stabilitet. Dårlig teknikk og ukvalifisert håndtering av lymfocytter som er følsomme for forstyrrelser i den metabolske tilstand kan resultere i ikke-reproduserbare og fullstendig feilaktige testresultater.
Det ville følgelig være meget ønskelig å tilveiebringe en screeningteknikk for påvisning av cancer som er enklere og billigere å gjennomføre, og som pålitelig kan gjennomføres med en lavere grad av teknisk ferdighet under anvendelse av lettere tilgjengelig utstyr slik at metodologien ved en slik screeningteknikk gjøres praktisk for rutineanvendelse i kliniske laboratorier og endog ved legekontorer.
Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for screening av blodprøver for nærvær av ondartethet i giverkroppen under anvendelse av kommersielt tilgjengelig instrumentering for påvisning og opptegning av testresultater. Metodologien ved oppfinnelsen er basert på differensiell opptagning av et membranpotensialsensitivt material av en viss undergruppe av lymfocytter, idet denne opptagning er forskjellig i avhengighet av om giverkroppen er utsatt for en ondartethet eller ikke. Selvom metodologien definert heri fremdeles krever en grad av ferdighet ved isolasjonen av den riktige densitetspesifikke undergruppe av lymfocytter, er den mindre krevende og lettere utførbar for den fagkyndige. Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen anvender strømningscytometriteknikk og instrumentering som er godt forstått og lett tilgjengelig og håndteringen av lymfocyttene er mindre kritisk enn i den tidligere beskrevne SCM-test. Den foreliggende fremgangsmåte er særlig egnet for bruk som en rutinemessig cancer-screeningsprosedyre som kan anvendes i forbindelse med den ovennevnte SCM-test, og er i stand til meget tidlig og spesifikk diagnose av ondartethet. Fremgangsmåten gjennomføres in vitro.
Fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse omfatter at en suspensjon av levedyktige lymfocytter bringes i kontakt med en oppløsning inneholdende et membranpotensialsensitivt fluorescerende material. Slike materialer, som konvensjonelt omtales som membranpotensialsensitive fluorescerende fargestoffer vil i det følgende omtales som "MPS-fargestof fer". Kontakten mellom lymfocyttsuspensjonen ogMPSfargestoffet opprettholdes i tilstrekkelig tid for å tillate merking av lymfocyttene med MPS-fargestoffmaterialet.
Etter merkingsoperasjonen som beskrevet i det foregående føres de nå merkede lymfocytter som enkeltceller gjennom en fokusert kilde for eksitasjonsenergi som vil bevirke at ethvert MPSfargestoffmaterial hvormed lymfocyttene er blitt merket, fluorescerer. Den fluorescerende emisjon fra hver celle opptegnes som en puls og antallet pulser av hver intensitet lagres. En avsetning av fordelingen av antallet pulser i forhold til pulsintensiteten av fluorescense-mis j onene fra de merkede lymfocytter er en bimodal kurve, d.v.s. kurven omfatter to topper. Den første topp av kurven inkluderer pulser med lav fluorescensintensitet og den annen topp omfatter pulser med høy fluorescensintensitet. Et forhold mellom det totale antall lavfluorescenspulser og høyfluorescenspulser for hver testet prøve frembringer en faktor som differensierer lymfocytter avledet fra givere angrepet av cancer fra dem som ikke er angrepet av cancer. Denne faktor, som her omtales som alfafaktoren, er funnet å være mindre enn 2,6 for lymfocyttsuspensjoner som er forbundet med malignans. På den annen side er alfafaktorer på mer enn 2,6 assosiert med lymfocyttprøver som ikke er forbundet med malignans. På denne basis tilveiebringer fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse en screeningtest for nærvær av cancer som er forholdsvis enkel, økonomisk og som krever bare en vanlig grad av teknisk ferdighet ved gjennomføringen.
Oppfinnelsen vil bli forstått mer fullstendig fra den detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen i sammenheng med teg-ningene hvori: Fig. 1 er en representativ fremstilling av pulsfordel-ingene av fluorescerende emisjoner fra en typisk lymfocyttprøve avledet fra en giver som ikke er forbundet med malignans, og Fig. 2 er en representativ avsetning av pulsfordelingen av de fluorescerende emisjoner av lymfocytter avledet fra en giver forbundet med malignans.
Cellene anvendt ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse er lymfocytter separert fra en prøve av blod tatt fra en kropp som testes. Selv om det hittil ikke er fullt ut forstått, antas det at lymfocytter, som er av T-celletypen, er involvert i gjenkjennelse av malignansassos-ierte antigener. Visse lymfocytter, benevnt SCM-responderende lymfocytter, avledet fra givere angrepet av cancer er blitt forbehandlet in vivo for å gjenkjenne malignans-assosierte antigener, slik som dem som dannes av tumorceller, og er følgelig funnet å ha en forskjellig respons overfor MPSfargestoffer enn lymfocytter avledet fra en giver som ikke er forbundet med malignans.
Lymfocyttene anvendbare ved den foreliggende oppfinnelse blir mest passende separert fra blodprøven ved sentrifugering av blodprøven på en densitetsradientoppløsning, som f. eks. en blanding av "Ficoll 400" (Pharmacia AB) og "Triosil 440"
(Nyegaard&Co.) oppløsninger. Blodceller med en densitet mindre enn gradientoppløsningen flyter på toppen av gradient-oppløsningen og kan separeres fra celler med densiteter større enn av gradientoppløsningen. En slik metode for separering av blodkomponenter er godt forstått på området, som f. eks. den teknikk som er publisert av R. Harris, E.
Ukaejiofo, Lancet, vol. 2, 327 (1969). Ved modifisering av gradientoppløsningen til separasjonsdensitet på 1,08 gram/cm-^ ved 25°C og osmolalitet på 0,320 Osm/kg, vil SCM-responderende lymfocytter flyte på gradientoppløsningen etter sentrifugering av en blodprøve og separeres lett ved å løfte opp cellelaget direkte over plasmagradientoppløsnings-grenseflaten, som beskrevet av L. Cercek, B. Cercek, Br. J. Cancer, vol. 28, 163 (1978).
Etter separering fra gradientoppløsningen blir cellene vasket, foretrukket to ganger, med konserveringsmiddelfri natriumkloridoppløsning for injeksjoner og deretter, foretrukket to ganger, med komplett Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (PBS).
Etter vaskingen suspenderes cellene i PBS for bruk ved test-metoden i samsvar med oppfinnelsen. Konsentrasjonen av cellene i suspensjonen er ikke kritisk, selv om et tilstrekkelig antall celler må være tilstede i suspensjonen for utvikling av fluorescensintensitetsfordelingskurven, som mer detaljert forklart i det følgende. Gode resultater er oppnådd i samsvar med den foretrukkede utførelsesform av oppfinnelsen under anvendelse av lymfocyttsuspensjons-konsentrasjoner på omtrent 10^ celler pr. ml.
MPS-fargestoffer er materialer som inneholder en fluorokrom og som er i stand til å bindes på eller penetrere cellemem-branen. Den eksakte mekanisme hvormed MPS-fargestoffer arbeider er ikke klar selv om forskjellige modeller er foreslått, se Sims et al, Biochemistry 13, 3315 .(1974).
MPS-fargestoffmaterialer egnet for bruk ved den foreliggende oppfinnelse selekteres fra gruppen bestående av cyaninfargestoffer, merocyaninfargestoffer og oksonolfargestoffer. Blant merocyaninfargestoffene er merocyaninoksazolon og merocyaninrodanin. De mest grundig undersøkte og foretrukkede grupper av fargestoffer er de cyaninfargestoffer som er fremstilt og undersøkt av Sims et al., Biochemistry 13, 3315 (1974). I denne publikasjon ble omtrent 29 cyaninfargestoffer .undersøkt med hensyn til virkningen på fargestoffet av endringer i cellemembranpotensialene. Et kommersielt tilgjengelig cyaninfargestoff hvormed gode resultater er blitt oppnådd ved den foreliggende oppfinnelse er 3,3'-diheksyloksakarbocyanin. I samsvar med konvensjonen angitt i publikasjonen til Sims et al, skal dette fargestoff identifiseres ved hjelp av sin forkortede betegnelse, nemlig diO-C5~(3). MPS-fargestoffmaterialet anvendes ved den foreliggende oppfinnelse som en fortynnet oppløsning av fargestoffet i PBS. I oppløsningen varierer konsentrasjonen av MPS-fargestoffet mellom omtrent 2 x 10~6 til omtrent 5 x 10~6, og er foretrukket omtrent 3 x 10~6 gram/ml. Ettersom mange av MPS-fargestoffmaterialene bare er sparsomt opp-løselige i den fosfatbufrede saltløsning, er det foretrukket først å danne en mer konsentrert oppløsning av MPS-farge-stof fmaterialet i etylalkohol etterfulgt av fortynning av den konsentrerte alkoholoppløsning til den ønskede konsentrasjon med PBS.
Etter å ha fremstilt lymfocyttsuspensjonen som beskrevet i det foregående, merkes lymfocyttene med MPS-farge-stof fmaterialet . Merkeoperasjonen gjennomføres mest passende ved sammenblanding av like deler lymfocyttoppløsning med den fortynnede oppløsning av MPS-materialet, og med fortsatt forsiktig omrøring blir lymfocyttsuspensjonfargestoff-oppløsningsblandingen opprettholdt over en passende periode for å tillate merkingen av lymfocyttene med MPS-farge-stof fmaterialet. Vanligvis er en kontakttid på omtrent ti minutter tilstrekkelig for å bevirke merking av lymfocyttene selv om kontakt kan opprettholdes så lenge som en time uten å funnet at de beste resultater oppnås ved å opprettholde tem-peraturen i lymfocyttsuspensjon/fargestoffoppløsningsbland-ingen ved romtemperatur (20 til 23°C) under merkingsoperasjonen.
Etter kontakten mellom cellesuspensjonen og MPS-fargestoff-oppløsningen føres cellene gjennom en fokusert kilde for fluorescenseksitasjonsenergi som bevirker at MPS-fargestoffmaterialet fluorescerer. Dette gjennomføres i en fluor-escensaktivert cellesorterer hvori den merkede lymfocytt-suspensjon injiseres i en strøm av et skjermfluid som strømmer med tilstrekkelig hastighet gjennom et rør med liten diameter for å etablere en laminær koaksial strøm av lymfocyttene inne i skjermfluidet. På denne måte separeres de enkelte lymfocytter til å danne en strøm av enkeltceller inne i skjermfluidet. En laserstråle omfatter den fokuserte kilde av eksitasjonsenergi og stråler bringes til"å slå an mot den flytende strøm av fluid stort sett loddrett på strømningsretningen. På denne måte blir hver enkelt lymfocytt undersøkt av laserstrålen når den strømmer forbi. Egnede fotoelektriske deteksjonsinnretninger er anbragt nedstrøms fra det punkt hvor laserstrålen undersøker lymfocyttene, og fluorescensintensiteten av hver av lymfocyttene detekteres som en puls når denne passerer den fotoelektriske detekteringsinnretning. Pulsintensiteten sendes til en pulsteller hvor tellingen av denne puls lagres i en kanal adskilt for den spesielle intensitet av denne puls. På denne måte blir antallet pulser ved hver pulsinten-sitet lagret for bruk ved utvikling av fordelingskurven.
Som illustrert i fig. 1 og 2, ved avsetning som pulshøyde (tilsvarende fluorescensintensiteten) som abscisse og antallet tellingen ved denne pulshøyde som ordinat, danner dataene fra hver prøve av lymfocytter en bimodal kurve. Den første topp (venstre topp) på fordelingskurven representerer lavintensitetslymfocytter, mens den annen topp (høyre topp) på fordelingskurven representerer høyintensitetslymfocytter. Det ble uventet funnet at forholdet mellom antall celler i venstre topp og antallet celler i høyre topp (alfaforholdet) er direkte relatert til nærvær eller fravær av malignans i kroppen av den giver hvorfra lymfocyttene ble isolert.
F. eks. representerer kurven i fig. 1 en fordelingskurve av lymfocytter isolert fra en giver som ikke er angrepet av malignans. Det sees at den venstre topp som representerer lavintensitetspulser er vesentlig større enn den høyre topp som representerer høyintensitetspulser. I tilfellet av fordelingskurvene av de fluorescerende emisjonsmerkede celler avledet fra givere som ikke er angrepet av cancer, som f. eks. representert i fig. 1, er forholdet mellom høyre topp og venstre topp mer enn 2,6.
Fig. 2 representerer på den annen side en typisk fordelingskurve for lymfocytter isolert fra en giver som ble definitivt diagnostisert med malignans. I dette tilfelle er forskjellen mellom antallet høyintensitetspulser og lavintensitetspulser ikke så stort som i fig. 1, og forholdet mellom venstre topp og høyre topp er mindre enn 2,6.
Grunnene til forskjellen i forholdet mellom venstre topp og høyre topp mellom givere med malignans og dem som ikke har malignans er ikke fullt ut forstått. Det er imidlertid hypotese om at membranpotensialet av en stor fraksjon av lymfocytter fra givere med neoplastiske sykdommer er.noe mer elektronegative slik at dette resulterer i en større binding avMPS-fargestoffmaterial til cellen og/eller penetrasjon av cellen av fargestoffer som øker cellemerkningen. Den økte negativitet av membranpotensialet av denne fraksjon av lymfocytter kan også bevirke at MPS-fargestoffet fluorescerer mer intenst. I alle fall vil dette frembringe et større antall tellinger av høyintensitetspulser sammenlignet med lavintensitetspulser slik at dette bringer alfaforholdet ned under 2,6. I motsetning til dette vil lymfocytter fra givere som ikke er angrepet av neoplastiske sykdommer antas å være mindre elektronegative slik at dette resulterer i lavere binding av MPS-fargestoffet til lymfocyttene og/eller, av de grunner som er angitt i det foregående, lavere intensitets-fluorescensemisjoner av MPS-fargestoffmaterialet. Følgelig vil dette frembringe et større antall tellinger for lymfocytter med lav intensitet i sammenligning med dem med høy intensitet slik at alfaforholdet bringer over 2,6.
Seleksjon av eksitasjons- og emisjonsbølgelengder er primært avhengig av valget av MPS-fargestoffmaterial anvendt ved fremgangsmåten. Med cyaninfargestoffer som er de foretrukkede MPS-fargestoffmaterialer, er det funnet at meget tilfredsstillende resultater oppnås når laserstrålebølge-lengden er 488 nm og fluorescensemisjoner med bølgelengder over 520 nm registreres. Som påpekt av Sims et al., Biochemistry, 13, 3315 (1974), varierer fluorescensemisjonene for cyaninfargestoffene fra omtrent 496 opp til 792 nm. Med tilgjengelig utstyr ble det oppnådd gode resultater ved måling av fluorescensemisjoner over 520 nm.
EKSEMPEL
Lymfocytter ble separert fra prøver av 20 ml perifert blod ved opplegging av en delprøve av blodprøven hvorfra de fago-cytiske celler var blitt fjernet på en Ficoll-Triosil densi-tetsgradientoppløsning med densitet 1,081 g/cm<3>ved 25°C og osmolalitet på 0,320 Osm/kg. Blodprøven og densitetsgrad-ientoppløsningen ble sentrifugert ved 5 50 Gav ved en temperatur på 25°C. Det tynne lag som fløt direkte over grenseflaten mellom plasma og gradientoppløsningsmaterialet ble trukket opp med en Pasteur-pipette idet man unngikk i så sterk grad som mulig det tyngre densitetsgradientmaterial og de lettere plasmamaterialer som fløt over det separerte lag av celler. Nærværet av noen av disse materialer i den fjernede celleprøve er imidlertid ikke kritisk ved den foreliggende oppfinnelse. Denne separasjonsteknikk følger generelt teknikken angitt av L. Cercek, B. Cercek, "Application of the Phenomena of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matrix (SCM) in the Diagnosis of MalignantDisorders: A Review", Europ. J.Cancer, vol. 13, 903-915
(1977), og av de samme forfattere i en publikasjon med tittel "Effects of Osmolality and Density of Gradients on the Isolation of SCM-Responding Lymphocytes", Br. J. Cancer, vol. 38, 163-165 (1973). Imidlertid, som nevnt i det foregående, er separasjonsteknikken ikke kritisk som angitt i de ovennevnte publikasjoner og fremgangsmåten i samsvar med den foreliggende oppfinnelse er ikke begrenset til den meget spesifikke undergruppe av lymfocytter nødvendig for den teknikk som er angitt i publikasjonen. Følgelig er den teknikk som anvendes ved den foreliggende fremgangsmåte for separering av lymfocyttene fra de øvrige blodkomponenter og den etterfølgende håndtering av de separerte celler langt mindre kritisk enn det som kreves i de ovenfor omtalte pub-likasj oner.
Blodprøver ble oppnådd fra 15 friske givere som var alders-og kjønnstilpasset, d.v.s. givere som ikke var diagnostisert til å ha en malignans, og 15 givere som ble positivt diagnostisert med cancer. For formålet med dette eksempel er den spesifikke type cancer ikke kritisk. Blodprøver ble også oppnådd fra seks givere som ble diagnostisert med ikke-maligne inflammatoriske sykdommer, som f. eks. artritt og andre inflammatoriske tilstander. Lymfocyttfraksjonene isolert fra hver av blodprøvene, i henhold til prosedyren beskrevet i det foregående, ble vasket med 6 til 7 ml av en 0,9 % av NaCl uten konserveringsmidler etterfulgt av vasking 1 PBS. Mellom vaskingene ble hver cellesuspensjon sentrifugert ved 500 Gav og supernatantvæsken ble dekantert. Etter vasking ble cellesuspensjonen fra hver prøve rekombinert med PBS og volumet innstilt til å danne en suspensjon av omtrent 2 x IO<6>celler pr. ml.
En merkingsoppløsning av diO-C5-O) ble fremstilt ved først
å oppløse 28,6 mg av fargestoffet i 10 ml absolutt "analyse-ren" etanol. Oppløsningen ble innstilt til sin endelige konsentrasjon ved injisering av 0,1 ml av hovedoppløsningen i 100 ml PBS. Merking ble gjennomført ved kombinering av like volum av merkingsoppløsningen og lymfocyttsuspensjonen og opprettholdelse av blandingen med forsiktig omrøring i minst ti minutter. Ved fullføringen av merkingsprosedyren ble fluorescensfordelingene registrert på et Becten-Dickenson strømningscytometer, modell FACS IV. De MPS-farge-stoffmerkede celler ble eksitert med en 488 nm argonionlaser-linje og fluorescensemisjoner over 520 nm ble registrert under anvendelse av standard FACS IV optiske filtre. FACS IV cytometeret var forsynt med en regnemaskin som gjorde tjeneste som en pulsanalysator for registrering og sortering
av pulsene oppnådd fra prøven. En strøm av enkeltceller ble frembragt som beskrevet i det foregående, ved innføring av suspensjonen av celler i merkingsoppløsningen i midten av en rennende strøm av forlikelig skjermfluid slik at det ble etablert en laminær koaksial strømning inne i dyse-transduk-torsammensetningen av FACS IV instrumentet. På denne måte ble prøvefluidet og cellene inneholdt deri holdt inne i den sentrale del av den flytende væskestrøm slik at cellene var forhindret fra å røre instrumentdysesammenstillingen og tilveiebragte en strøm av enkeltceller forbi laserstrålen. Fluorescensemisjonene fra celler som fløt forbi laserstrålen ble detektert ved hjelp av en fotoforsterker og intensiteten translatert i en elektrisk puls som ble lagret av puls-analysatoren. Pulsanalysatorsorteringen, avsatt som frekvens av pulser versus pulshøyde frembragte kurver som de typiske kurver illustrert i fig. 1 og 2. De totale tellinger av venstre NL og høyre NR topper og det resulterende alfaforhold for givere diagnostisert som fri for cancer er angitt i følgende tabell I. Resultatene for givere diagnostisert til å ha cancer og givere diagnostisert med inflammatoriske sykdommer som artritt, er angitt i tabell II, henholdsvis
III.
Fra resultatene av eksemplene sees det at ikke i noe
tilfelle overstiger alfafaktorene for lymfocytter med givere angrepet av malignans 2,6. Ved samme forhold faller ikke alfafaktorer fra lymfocytter fra givere som ikke har malignans under 2,6. Dette er tilfellet endog når giveren er utsatt for andre inflammatoriske sykdomsbetingelser som f. eks. artritt.
Fra det foregående sees at fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en enkel test for screening av blodprøver av givere for nærvær av en malignans i giverens kropp. Testen krever en forholdsvis liten blod-prøve og kan gjennomføres av personer med vanlig ferdighet på området.
Claims (8)
1. Fremgangsmåte for in vitro bestemmelse av malignans ut fra lymfocytter fra blodprøve,
karakterisert vedtrinnene med: - merking av lymfocytter som tilhører undergruppen av SCM-responderende lymfocytter avledet fra en blodprøve ved å bringe en suspensjon derav, foretrukket en suspensjon i fosfatbufret saltløsning inneholdende omtrent 2 x IO<6>celler pr. ml saltløsning, i kontakt med et fluorescerende celle-membranpotensialsensitivt material hvorved det membranpotensialsensitive material bindes til lymfocyttene. - lymfocyttene bringes til å passere enkeltvis gjennom en fokusert kilde for fluorescenseksitasjonsenergi som bevirker at det membranpotensialsensitive material fluorescerer, - intensiteten av fluorescensemisjonen fra hver av lymfocyttene måles, - det dannes en bimodal fordelingskurve basert på intensiteten av fluorescensemisjonen fra lymfocyttene og det bestemmes et forhold derfra mellom antallet lymfocytter med lavere fluorescensintensiteter og antallet lymfocytter med høyere fluorescensintensiteter, idet forholdet indikerer lymfocyttenes tilknytning til malignans, slik at et forhold mindre enn omtrent 2,6 er betegnende for lymfocytter forbundet med malignans og et forhold større enn omtrent 2,6 er betegnende for lymfocytter som ikke er forbundet med malignans.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat det membranpotensialsensitive material er et fluorescerende fargestoff valgt fra gruppen bestående av cyaninfargestoffer, merocyaninfarge-stof fer og oksonolfargestoffer, foretrukket et cyaninfarge-stof f valgt fra gruppen bestående av karbocyanin-, dikarbo-cyanin- og trikarbocyaninfargestoffer.
3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2,karakterisert vedat det membranpotensialsensitive material er 3,3'-diheksyloksakarbocyanin.
4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat suspensjonen av lymfocytter blandes med like volumdeler av en oppløsning omfat-tende 2,86 x 10~6 g/ml av det nevnte membranpotensialsensitive materiale i fosfatbufret saltoppløsning, og at blandingen opprettholdes i tilstrekkelig tid til å bevirke binding av i det minste en del av materialet til lymfocyttene, foretrukket i det minste i omtrent ti minutter.
5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat kilden for eksitasjonsenergi er en laserstråle, foretrukket med en bølgelengde på 48 8 nm.
6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat de merkede lymfocytter injiseres inn i en flytende strøm av et blandbart skjermfluid og en laminær, koaksial strøm av de nevnte lymfocytter og det nevnte skjermfluid etableres hvorved lymfocyttene holdes som enkeltceller i senterdelen av den flytende strøm før de passerer gjennom kilden for eksitasjonsenergi.
7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat intensiteten av fluorescensemisjoner fra hver av lymfocyttene omdannes til en elektrisk puls hvis høyde er direkte relatert til intensiteten av emisjonen, og avsettes på en fordelingskurve med pulshøyde som abscisse og pulstall som ordinat, idet fordelingskurven er bimodal med en topp representerende lavere intensitetsemisjon og den annen topp representerende høyere intensi-tetsemisj on.
8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat antallet pulser i toppen som representerer høyere intensitetsemisjon oppdeles i antall pulser i toppen som representerer lavintensitetsemisjoner for oppnåelse av en alfafaktor som er karakteristisk for lymfocytter forbundet med malignans og for lymfocytter som ikke er forbundet med malignans.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/933,982 US4835103A (en) | 1986-11-24 | 1986-11-24 | Differential binding of membrane potential sensitive materials to lymphocytes |
PCT/US1987/003054 WO1988003955A1 (en) | 1986-11-24 | 1987-11-20 | Differential binding of potential sensitive materials by lymphocytes |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO883260D0 NO883260D0 (no) | 1988-07-22 |
NO883260L NO883260L (no) | 1988-09-23 |
NO173409B true NO173409B (no) | 1993-08-30 |
NO173409C NO173409C (no) | 1993-12-08 |
Family
ID=25464748
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO883260A NO173409C (no) | 1986-11-24 | 1988-07-22 | Fremgangsm}te for in vitro bestemmelse av malignans |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4835103A (no) |
EP (1) | EP0339028B1 (no) |
JP (1) | JPH02501975A (no) |
AT (1) | ATE90393T1 (no) |
AU (1) | AU611877B2 (no) |
CA (1) | CA1312537C (no) |
DE (1) | DE3786175T2 (no) |
DK (1) | DK169565B1 (no) |
FI (1) | FI92076C (no) |
NO (1) | NO173409C (no) |
WO (1) | WO1988003955A1 (no) |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5260186A (en) * | 1986-03-10 | 1993-11-09 | Boris Cercek | Provision of density specific blood cells for the structuredness of the cytoplasmic matrix (SCM) test |
JP2549665B2 (ja) * | 1987-07-31 | 1996-10-30 | 東亜医用電子株式会社 | フロ−サイトメトリ用網状赤血球測定試薬 |
WO1989008662A1 (en) * | 1988-03-11 | 1989-09-21 | Boris Cercek | General cancer-associated scm-recognition factor, preparation and method of use |
JPH03122553A (ja) * | 1989-10-04 | 1991-05-24 | Olympus Optical Co Ltd | 光センサー |
US5355215A (en) * | 1992-09-30 | 1994-10-11 | Environmental Research Institute Of Michigan | Method and apparatus for quantitative fluorescence measurements |
US6800452B1 (en) * | 1994-08-08 | 2004-10-05 | Science Applications International Corporation | Automated methods for simultaneously performing a plurality of signal-based assays |
US6351663B1 (en) | 1999-09-10 | 2002-02-26 | Akorn, Inc. | Methods for diagnosing and treating conditions associated with abnormal vasculature using fluorescent dye angiography and dye-enhanced photocoagulation |
US6944493B2 (en) * | 1999-09-10 | 2005-09-13 | Akora, Inc. | Indocyanine green (ICG) compositions and related methods of use |
US6443976B1 (en) | 1999-11-30 | 2002-09-03 | Akorn, Inc. | Methods for treating conditions and illnesses associated with abnormal vasculature |
US7994485B2 (en) * | 2008-04-08 | 2011-08-09 | Carestream Health, Inc. | Apparatus and method for fluorescence measurements using spatially structured illumination |
EP2849743B1 (en) * | 2012-10-26 | 2019-09-25 | Canon Kabushiki Kaisha | Cancer cell inhibitory drug and cancer stem-cell detection probe |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4173136A (en) * | 1977-11-17 | 1979-11-06 | Schroth Wilhelm Heinrich | Method and apparatus for producing multiple groove V-belt pulleys |
EP0004061B1 (de) * | 1978-03-09 | 1982-05-19 | MERCK PATENT GmbH | Verfahren zur Bestimmung leukämischer Zellen |
US4343782A (en) * | 1978-04-20 | 1982-08-10 | Shapiro Howard M | Cytological assay procedure |
US4424201A (en) * | 1978-11-28 | 1984-01-03 | Rockefeller University | Employment of a mereyanine dye for the detection of malignant leukocytic cells |
US4727020A (en) * | 1985-02-25 | 1988-02-23 | Becton, Dickinson And Company | Method for analysis of subpopulations of blood cells |
-
1986
- 1986-11-24 US US06/933,982 patent/US4835103A/en not_active Expired - Fee Related
-
1987
- 1987-11-20 DE DE8888900054T patent/DE3786175T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-11-20 AU AU10413/88A patent/AU611877B2/en not_active Ceased
- 1987-11-20 JP JP63500465A patent/JPH02501975A/ja active Pending
- 1987-11-20 WO PCT/US1987/003054 patent/WO1988003955A1/en active IP Right Grant
- 1987-11-20 EP EP88900054A patent/EP0339028B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-20 AT AT88900054T patent/ATE90393T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-23 CA CA000552502A patent/CA1312537C/en not_active Expired - Fee Related
-
1988
- 1988-07-22 FI FI883489A patent/FI92076C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-07-22 NO NO883260A patent/NO173409C/no unknown
- 1988-07-22 DK DK413688A patent/DK169565B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO883260L (no) | 1988-09-23 |
NO173409C (no) | 1993-12-08 |
DK413688D0 (da) | 1988-07-22 |
AU611877B2 (en) | 1991-06-27 |
FI883489A (fi) | 1988-07-22 |
NO883260D0 (no) | 1988-07-22 |
EP0339028B1 (en) | 1993-06-09 |
ATE90393T1 (de) | 1993-06-15 |
CA1312537C (en) | 1993-01-12 |
JPH02501975A (ja) | 1990-07-05 |
DK413688A (da) | 1988-09-21 |
EP0339028A1 (en) | 1989-11-02 |
AU1041388A (en) | 1988-06-16 |
WO1988003955A1 (en) | 1988-06-02 |
DK169565B1 (da) | 1994-11-28 |
FI883489A0 (fi) | 1988-07-22 |
FI92076B (fi) | 1994-06-15 |
DE3786175T2 (de) | 1993-09-23 |
FI92076C (fi) | 1994-09-26 |
US4835103A (en) | 1989-05-30 |
DE3786175D1 (de) | 1993-07-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Horan et al. | Fluorescent cell labeling for in vivo and in vitro cell tracking | |
Gitlin et al. | The localization of homolgous plasma proteins in the tissues of young human beings as demonstrated with fluorescent antibodies | |
KR970000783B1 (ko) | 생육 세포의 라벨링(Labelling) | |
EP0179107B1 (en) | Metachromatic dye sorption means for differential determination of sub-populations of lymphocytes | |
US4343782A (en) | Cytological assay procedure | |
US5175109A (en) | Reagent for classifying leukocytes by flow cytometry | |
US4331759A (en) | Composition suitable for testing biological tissues and/or liquids, and the method of use | |
Tasaki et al. | Transient changes in extrinsic fluorescence of nerve produced by electric stimulation | |
US4500509A (en) | Metachromatic dye sorption and fluorescent light emmisive means for differential determination of developmental stages of neutrophilic granulocytic cells and other leukocytes | |
KR880005458A (ko) | 생체내 세포추적 | |
GB2074749A (en) | Individual leukocyte determination by means of differential metachromatic dye sorption | |
JPH0415416B2 (no) | ||
CN109187981A (zh) | 一种快速检测β-淀粉样蛋白的量子点免疫层析试纸条与应用 | |
NO173409B (no) | Fremgangsmaate for in vitro bestemmelse av malignans | |
CN110208238A (zh) | 一种基于svm模型结合图像对肺癌组织的精确定位方法 | |
Stewart et al. | A flow system adaptation of the SCM test for detection of lymphocyte response in patients with recurrent breast cancer | |
CN105911292A (zh) | 用于组合分析CD11c+CD11b+ DC亚群以及其分化程度和功能的试剂盒及方法 | |
Arndt-Jovin et al. | Analysis by computer-controlled cell sorter of Friend virus-transformed cells in different stages of differentiation | |
JPH0562952B2 (no) | ||
Holm et al. | Flow Cytometry |