FI92076C - Lymfosyyttien tunnusmerkillinen potentiaalille herkkien aineiden sitominen - Google Patents

Description

92076

Lymfosyyttien tunnusmerkillinen potentiaalille herkkien aineiden sitominen

Keksinndn ala 5 Tåmå keksintd koskee lymfosyyttien tunnusmerkillistå membraanipotentiaalille herkkien aineiden sitomista ja viela erityisemmin kehossa olevan pahanlaatuisuuden ha-vaitsemiseen tarkoitettua menetelmaa, jossa kåytetSSn hy-vSksi lymfosyyttien tunnusmerkillistå potentiaalille herk-10 kien aineiden sitomista.

KeksinnGn tausta

Viime vuosina on esiintynyt lisSSntynytta kiinnos-tusta biologisten koettimien, kuten esimerkiksi membraanipotentiaalille herkkien vSriaineiden kayttbOn tarkoituk-15 sena maarittaa elSvien solujen ja/tai muiden soluisten rakenteiden membraanipotentiaalin muutoksia elSvien solu-jen såhkttfysiologisissa ja biofysikaalisissa tutkimuksis-sa. Tållaisia aineita on esimerkiksi kdytetty kalmarin jSttilSisaksonisolujen, Cohen LPB ym. J. Membrane Biol.

20 19,1 (1974), punaisten verisolujen, Hoffman, J. R. ja La ris, P. C., Physiol. Lond. 239, 519 (1974), ja sammakon sydamen lihaskudoksen, Morad, M. ja Selema, G., J. Physiol. Lond. 292-267 (1972), membraanipotentiaalin tutki-miseen.

25 Tata samaa linjaa seuraten on verisolujen tutkimus < 9 johtamassa ihmisten ja eiainten kehojen sairaustilojen havaitsemiseen tarkoitettuihin menetelmiin. Me olemme esimerkiksi kehittaneet menetelman syOvan seka muiden anti-geeneja tuottavien sairauksien ja kehan tilojen varhaista 30 toteamista vårten, jossa menetelmassa sytoplasmisen mat-riisin rakenteisuudessa (structuredness of cytoplasmic 9 matrix) (SCM) tapahtuvien muutosten tutkimiseksi kaytetaan solunsisaisen fluoreseiinin fluoresenssin polarisaation mittauksia elåvissa soluissa. SCM sisaitaa monenlaisia 35 solun rakenteita, kuten esimerkiksi mitokondrioita, solu- 2 92076 membraaneja, solunestettå, lysosomeja, ribosomeja, tumia ja vastaavanlaisia rakenteita. Menetelmaståmme, jota kir-jallisuudessa kutsutaan "SCM-testiksi", seka kåytetysta tekniikasta on tehty yhteenveto L. Cercekin ja B. Cercekin 5 julkaisussa "Application of the Phenomenon of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matric (SCM) in the Diagnosis of Malignant Disorders: A Review", Europ. J.

Cancer, Vol. 13, 903-915 (1977). Tekniikkaamme kayttaen on syovan seka muuntyyppisten sairauksien ja kehon tilojen 10 varhainen diagnoosi helposti toteutettavissa mittaamalla perifeerisen veren lymfosyyttien tietyn tiheydeltaan tar-koin maaratyn alapopulaation tunnusmerkilliset vasteet esimerkiksi fytohemagglutiniini-mitogeeniin ja syopåan assosioituneisiin antigeeneihin. Solunsisåisen fluoreseii-15 nin fluoresenssin polarisaation muutoksia kaytetaan indi-koimaan lymfosyyttien tunnusmerkillisiå vasteita.

Ylla kuvattu menetelmå vaatii kuitenkin hyvin kor-keasti koulutetun henkilokunnan ja aarimmaisen varovaisen tekniikan SCM-reagoivien (SCM-responding) lymfosyyttien 20 alapopulaation erottamiseksi ja eristamiseksi verinMyt- teesta seka fluoresenssimittausten tekemiseksi. Lisaksi SCM-testitekniikka vaatii mikroanalyyttista tasmållisyyttå solunsisåisen fluoresenssin polarisaation mittauksissa, ”·' seka suurta laitteiden herkkyyttM ja stabiilisuutta. Huono 25 tekniikka ja metabolisessa tilassa tapahtuville hairioille herkkien lymfosyyttien taitamaton kSsittely saattavat joh-taa toistokelvottomiin ja taysin virheellisiin testitulok-siin.

Niinpa olisikin hyvin toivottavaa saada kåyttoon ·] 30 syovan havaitsemiseen tarkoitettu seulontatekniikka, joka on yksinkertaisempi ja vahemman kallis kayttSa ja joka voidaan luotettavasti panna taytantoon alemman tasoisella teknisellå taitavuudella kayttaen helposti saatavilla ole-vaa laitteistoa ja saattamalla siten tallaisen seulonta-35 tekniikan metodologia kåyttokelpoiseksi kliinisten labo- 3 92076 ratorioiden rutiinikaytdssa ja jopa laakarin vastaanotto-huoneessa.

Yhteenveto keksinndsta

Tama keksintd antaa kåyttddn menetelman, jolla seu-5 lotaan verinaytteita tutkittavassa kehossa esiintyvan pa-hanlaatuisuuden paljastamiseksi kayttamaiia testitulosten ilmaisemiseen ja rekisterdintiin kaupallisesti saatavilla olevaa laitteistoa. Keksinndn metodologia perustuu tietyn lymfosyyttien alapopulaation tunnusmerkilliseen membraa-10 nipotentiaalille herkan aineen sisaankuljetuksen (uptake), joka on erilainen riippuen siita, koetteleeko luovuttaja-kehoa pahanlaatuisuus val ei. Vaikka tåssa maaritelty metodologia viela vaatiikin jonkinasteista taitavuutta oi-kean tiheydeltaan tarkoin maaratyn lymfosyyttien alapopu-15 laation eristyksessa, on se vahemman vaativa ja ammattiin koulutetun toimesta helpommin toteutettavissa. KeksinnOn mukaisessa menetelmassa kaytetaan virtaussytornetrian tek-niikoita ja laitteistoa, jotka tunnetaan hyvin ja joita on helposti saatavillla, ja lymfosyyttien kasittely on 20 vahemman ratkaisevaa kuin aiemmin kuvatussa SCM-testissa. Tama menetelma on erityisen sopiva kaytettavaksi rutiinin-omaisena sydvan seulontamenetelmana, jota voidaan kayttaa yhdessa aiemmin mainitun SCM-testin kanssa, jolla pysty-taan pahanlaatuisuuden hyvin varhaiseen ja spesifiseen .. 25 diagnoosiin.

Taman keksinndn mukaisessa menetelmassa eiavien lymfosyyttien suspensio yhdistetaan sellaisen liuoksen kanssa, joka sisaitaa membraanipotentiaalille herkkaa fluore-soivaa ainetta. Tailaisia aineita, joita tavaksi tulleesti 30 kutsutaan membraanipotentiaalille herkiksi fluoresoiviksi • vareiksi, kutsutaan alempana "MPS-vareiksi". Lymfosyyttien é suspension ja MPS-varin vaiista yhteytta pidetaan ylia riittavan kauan, jotta sallitaan lymfosyyttien leimautu-minen MPS-variaineella.

35 Edelia kuvatun leimaustoimenpiteen jalkeen nyt lei- 4 92076 matut lyrafosyytit johdetaan yksittåisinå soluina kohdis-tetun heråte-energian 1åhteen låpi, jotta mikå tahansa MPS-våriaine, jolla lymfosyytit on leimattu, saadaan fluo-resoimaan. Kustakin solusta låhtevå fluoresenssiemissio 5 taltioidaan pulssina ja kunkin intensiteetin pulssien lu-kumåårå såilytetåån. Kåyrå, jossa pulssien lukumåårån ja-kautuminen esitetåån leimatuista lymfosyyteistå låhtevån fluoresenssiemission pulssien intensiteetin funktiona, on bimodaalinen kåyrå, eli kåyrå sisåltåå kaksi huippua. Kåy-10 rån ensimmåinen huippu sisåltåå alhaisen fluoresenssi-in-tensiteetin pulssit ja toinen huippu sisåltåå korkean fluoresenssi-intensiteetin pulssit. Kullekin testatulle nåytteelle laskettu alhaisen fluoresenssin pulssin koko-naismåårån suhde korkean fluoresenssin pulsseihin tuottaa 15 tekijån, jonka mukaan syOvåstå kårsivån luovuttajan lymfosyytit on erotettavissa sellaisista lymfosyyteistå, jot-ka ovat peråisin luovuttajasta, jolla syOpåå ei ole kes-tettåvånå. Tåmån tekijån, jota tåsså kutsutaan alfa-teki-jåksi, on havaittu olevan pienempi kuin 2,6 sellaisille 20 lymfosyyttisuspensioille, jotka ovat peråisin pahanlaatui-suuden vaivaamista luovuttajista. Toisaalta 2,6:tta suu-remmat alfa-tekijåt ovat yhteydesså sellaisiin lymfosyyt-tinåytteisiin, jotka ovat peråisin luovuttajista, joita pahanlaatuisuus ei koettele. Tallå perusteella tåmån kek-25 sinnOn mukainen menetelmå antaa kåyttOdn sydvån olemassa-olon havaitsemiseen tarkoitetun seulontatestin, joka on suhteellisen yksinkertainen, taloudellinen ja jonka tåy-tåntOOn paneminen vaatii vain tavanomaisen tasoista ammat-titaitoa.

30 Piirrosten lyhyt kuvaus

Keksinttt on tåydellisemmin ymmårrettåvisså keksinnOn yksityiskohtaisesta kuvatuksesta luettuna yhdesså kuvioi-den kanssa, joissa kuvioissa: kuvio 1 on tyypillinen fluoresenssiemissioiden puls-35 sijakautumaa kuvaava kåyrå fluoresenssiemissioiden ollessa 5 92076 lahtdisin tyypillisesta sellaisesta lymfosyyttinaytetta, joka on peraisin luovauttajasta, jolla ei ole pahanlaatui-suutta kestettavåné; ja kuvio 2 on tyypillinen sellaisten lymfosyyttien 5 fluoresenssiemissioiden pulssijakautumaa kuvaava kayra, jotka lymfosyytit ovat peraisin pahanlaatuisuudesta kar-sivasta luovuttajasta.

KeksinnOn yksityiskohtainen kuvas

Taman keksinnOn mukaisessa menetelmassa kdytettavat 10 solut ovat lymfosyytteja, jotka on erotettu tutkittavasta kehosta otetusta verinaytteesta. Vaikka asiaa ei talla hetkelia taysin ymmareta, uskotaan, etta lymfosyytit, jotka ovat T-solutyyppia, ovat osallisina pahanlaatuisuuteen assosioituneiden antigeenien tunnistuksessa. Tietyt lym-15 fosyytit, SCM-reagoiviksi lymfosyyteiksi kutsutut, jotka ovat peraisin syOvasta karsivista luovuttajista, ovat tul-leet in vivo esiherkistetyiksi (prime) tunnistamaan pahanlaatuisuuteen liittyneita antigeeneja, sellaisia kuin kas-vainsolut muodostavat, ja taman mukaisesti niilia on ha-20 vaittu olevan erilainen vaste MPS-v3reihin kuin sellaisil-la lymfosyyteilia, jotka ovat peraisin luovuttajista, joilla pahanlaatuisuutta ei ole kestettdvana.

Tassa keksinnOssa kayttOkelpoiset lymfosyytit ovat verinaytteesta katevimmin eristettavissa sentrifugoimalla . 25 verinaytetta tiheysgradienttiliuoksen, sellaisen kuin Fi- coll 400-liuoksen (Pharmacia A B) ja Triosil 440-liuoksen (Nyegaard & Co.) seoksen, paaiia. Verisolut, joilla on pienempi tiheys kuin gradienttiliuoksella, kelluvat gra-dienttiliuoksen pinnalla, ja ne voidaan erottaa soluista, 30 joiden tiheydet ovat suurempia kuin gradienttiliuoksen. Tailainen veren komponenttien erotteluun tarkoitettu me-netelma, sellainen kuin esimerkiksi R. Harrisin ja E. Uka-ejiofon julkaisema tekniikka, Lancet, Vol. 2, 327 (1969), tunnetaan alalla hyvin. Modifioimalla gradienttiliuos 35 erottelutiheyteen 1,08 grammaa /cm3 25°C:ssa ja osmolaali- 6 92076 suuteen 0,320 Osm/kg, kelluvat SCM-reagoivat lymfosyytit verinaytteen sentrifugoinnin jalkeen gradienttiliuoksen pinnalla ja ne ovat helposti erotettavissa imemaiia vSlit-tOmåsti plasman ja gradienttiliuoksen rajapinnan yiapuo-5 lella oleva solukerros talteen, kuten menetelmén ovat ku-vanneet L. Cercek ja B. Cercek, Br. J. Cancer, Vol. 28, 163 (1978).

Gradienttiliuoksesta erottamisen jalkeen solut pes-tSSn, edullisesti kahdesti, sSilytysaineita sisaitamattb-10 maiia injektioihin tarkoitetulla natriumkloridiliuoksella ja sitten, edullisesti kahdesti, taydelliselia Dulbeccon fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (complete Dul-becco's phosphate buffered saline) (PBS). Pesun jalkeen solut suspendoidaan PBS:aan kaytettavaksi t3m3n keksinnOn 15 mukaisessa testimenetelmasssa. Solujen pitoisuus suspen-siossa ei ole ratkaiseva, joskin suspensiossa taytyy olla riittava maara soluja, jotta fluoresenssi-intensiteetin jakautumiskayra voidaan jaijempana yksityiskohtaisemmin kuvatulla tavalla tehda. Hyvia tuloksia on saatu keksinnOn 20 edullisen toteutusmuodon mukaisesti kayttamaiia lymfosyyt-tisuspension pitoisuuksia, jotka ovat suuruusluokkaa 106 solua ml:ssa.

MPS-varit ovat aineita, jotka sisaitavat fluorokro-min ja jotka kykenevat sitoutumaan solumembraaniin tai . 25 lapaisemaan sen. Tarkka mekanismi, jonka mukaisesti MPS- varit toimivat, ei ole sel·villa, joskin useita malleja on esitetty, Sims ym., Biochemistry 13, 3315 (1974).

Tassa keksinnOssa kaytettavaksi sopivat MPS-variai-neet valikoidaan ryhmasta, joka koostuu syaniinivareista, 30 merosyaniinivareista ja oksonolivareista. Merosyaniiniva-reihin kuuluvat merosyaniinioksatsoloni ja merosyanaiini-rodaniini. Laajimman tutkitun ja edullisen variryhman muo-dostavat syaniinivarit, joita ovat valmistaneet ja tutki-neet Sims ym., Biochemistry 13, 3315 (1974). Tassa julkai-35 sussa tuktittiin noin 29 varia kiinnittaen huomiota sii- 7 92076 hen, mika on membraanipotentiaaleissa tapahtuvien muutosten vaikutus variin. Kaupallisesti saatavilla oleva sya-niinivari, jolla tassa keksinnttssa on saatu hyvia tulok-sia, on 3,3'-diheksyylioksakarbosyaniini. Sen yleisen ta-5 van mukaisesti, joka ilmaistiin Simsin ym:iden julkaisus-sa, tama vari identifioidaan pikakirjoitusmerkitsemista-vallaan, diO-C6.(3) . Tassa keksinndssa MPS-varia kaytetaan varin PBS:aan tehtyna laimeana liuoksena. Liuoksessa MPS-varin konsentraatio vaihtelee vaiilia noin 2 x 10"6 - 5 x 10 10' 6 ja on edullisesti noin 3 x 10'6 grammaa ml:ssa. Koska monet MPS-variaineista ovat vain heikonlaisesti fosfaatil-la puskuroituun suolaliuokseen liukenevia, on edullista tehda MPS-variaineesta ensin konsentroidumpi liuos etyy-lialkoholiin ja laimentaa sitten konsentroitu alkoholi-15 liuos haluttuun konsentraatioon PBS:alia.

Run lymfosyyttisuspensio on tehty edelia kuvatulla tavalla, lymfosyytit leimataan MPS-variaineella. Leimaus-toimenpide tehdaan katevinunin sekoittamalla keskenaan sa-mansuuruiset osat lymfosyyttiliuosta ja MPS-aineen laimeaa 20 liuosta, ja lymfosyyttisuspensiovariliuos-seosta pidetaan ylia, jatkuvasti heliavaraisesti sekoittaen, sopiva aika tarkoituksessa sallia lymfosyyttien leimautuminen MPS-variaineella. Noin 10 minuutin kontaktiaika on normaalisti riittava lymfosyyttien leimautumisen aikaansaamiseksi, . 25 joskin kontaktia voidaan pitaa ylia niinkin kauan kuin 1 tunti ilman, etta aiheutetaan lymfosyyttien vahingoittu-mista. 01emme havainneet, etta parhaat tulokset saadaan pitamaiia lymfosyyttisuspensio/variliuos-seoksen lampOtila leimaustoimenpiteen aikana huoneeniampdtilassa (20°C-30 23° C).

Solususpension ja MPS-variliuoksen vaiisen kontakt in jaikeen solut johdetaan kohdistetun fluoresenssin herate-energian lahteen lapi, joka herate-energian lahde saa MPS variaineen fluoresoimaan. Tama suoritetaan fluoresenssin 35 aktivoimassa solulajittelijassa (fluorescence activated 8 92076 cell sorter), johon leimatut lymfosyytit on ruiskutettu vaippanesteeseen, joka virtaa låpimitaltaan plenen putken lapi riittSvSlia nopeudella saamaan aikaan lymfosyyttien laminaarisen, samankesklsen vlrtauksen vaippanesteessa.

5 Tdlia tavoin yksittaiset lymfosyytit erotetaan toisistaan yksittaisten solujen virran muodostamiseksi vaippanesteeseen. Kodistettu heråte-energian lahde on lasersdde ja sateen annetaan tunkeutua liikkuvaan nestevirtaan suurin piirtein kohtisuorasti virtauksen suuntaa vastaan. Taiia 10 tavalla lasersade osuu jokaiseen yksittaiseen lymfosyyt-tiin taman kulkiessa ohi. Sopivat fotosahkOiset ilmaisu-laitteet sijaitsevat mydtavirtaan siita kohdasta, jossa lasersade osuu lymfosyytteihin, ja kunkin lymfosyytin fluoresenssi-intensiteetti ilmaistaan pulssina lymfosyytin 15 ohittaessa fotosahkdisen ilmaisulaitteen. Pulssin inten-siteetti johdetaan edelleen pulssilaskuriin, jossa kyseis-ta pulssia vastaava laskutapahtuma talletetaan kanavalle, joka on erotettu muista kanavista tata nimenomaista puls-si-intensiteettia vårten. Taiia tavoin kunkin pulssi-in-20 tensiteetin pulssien lukumaara sailytetaan kaytettavaksi jakautumakayran luomisessa.

Kuten kuvioissa 1 ja 2 on kuvattu, muodostaa jokai-sen naytteen tulosaineisto bimodaalisen kayran, kun kayra piirretaan siten, etta abskissana on pulssin korkeus (vas-; 25 taten fluoresenssi-intensiteettia) ja oordinaattana on kyseista pulssin korkeutta vastaavien laskutapahtumien lukumaara. Jakautumakayran ensimmainen huippu (vasen huip-pu) edustaa alhaisen intensiteetin lymfosyytteja, kun taas jakautumakayran toinen huippu (oikeanpuoleinen huippu) 30 edustaa korkean intensiteetin lymfosyyttej3. Olemme yliat-’ taen havainneet, etta vasemmanpuoleisessa huipussa olevien solujen lukumaaran suhde oikeanpuoleisessa huipussa olevien solujen lukumaaraan (alfa-suhde) on suorassa yhtey-dessa pahanlaatuisuuden esiintymiseen sen luovuttajan ke-35 hossa tai pahanlaatuisuuden puuttumiseen sen luovuttajan 9 92076 kehosta, josta lymfosyytit oli eristetty. Kuviossa 1 ku-vattu kayra esimerkiksi edustaa sellaisten lymfosyyttien jakautumakayraa, jotka on eristetty luovauttajasta, joka ei karsi pahanlaatuisuudesta. Nahdaan, ettå alhaisen in-5 tensiteetin pulsseja edustava vasen huippu on huomattavas-ti suurempi kuin korkean intensiteetin pulsseja edustava oikea huippu. Sellaisissa fluoresenssiemissioiden jakau-tumakayrien tapauksissa - jollaista kuvio 1 edustaa, jois-sa leiinatut solut ovat peraisen luovuttajista, joita sydpå 10 ei vaivaa, on oikean huipun suhde vasempaan huippuun suurempi kuin 2,6.

Kuvio 2 edustaa toisaalta tyypillista jakautumakdy-raa sellaisille lymfosyyteille, jotka on eristetty luo-vuttajasta, jolla on pitavasti diagnostisoitu olevan pa-15 hanlaatuisuutta. T3ssa tapauksessa korkean intensiteetin pulssien ja alhaisen intensiteetin pulssien lukumaarien vaiinen ero ei ole niin suuri kuin kuviossa 1, ja vasemman huipun suhde oikeaan huippuun on pienempi kuin 2,6.

Syyta pahanlaatuisuuksista karsivien ja sellaisten, 20 jotka eivat niistå karsi, luovuttajien vaiilia vallitse-vaan eroon vasemman huipun suhteessa oikeaan huippuun ei taydellisesti ymmareta. Oletetaan kuitenkin, etta suurella osalla kasvainsairauksia potevien luovuttajien lymfosyy-teista on membraanipotentiaali jonkin verran sdhkdnegatii-25 visempi, mika siten johtaa solujen leimautumista lisååvaan MPS-v3riaineiden suurempaan sitoutumiseen soluihin ja/tai varien tunkeutumiseen soluihin. Taman lymfosyyttifraktion membraanipotentiaalin lisaantynyt negatiivisuus voi myiis saada MPS-varin fluoresoimaan intensiivisemmin. Kaikissa 30 tapauksissa tama tuottaisi alhaisen intensiteetin pulssei-hin verrattuna suuremman maaran korkean intensiteetin pulssien laskutapahtumia alentaen alfa-suhdetta alle 2,6:teen. Sellaisista luovuttajista, jotka eivat karsi kasvainsairauksista, peraisin olevien lymfosyyttien usko-35 taan sita vastoin olevan vahemman sahkdnegatiivisia, mika 10 92076 siten johtaa MPS-varin alhaisempaan sitoutumiseen lymfo-syytteihin ja/tai, edelia malnltulsta syistå johtuen, MPS-variaineiden alhaisempaan fluoresenssiemissioiden inten-siteettiin. Niinpa taman pitaisi tuottaa suurempi maara 5 laskutapahtumia alhaisen intensiteetin lymfosyyteille kuin korkean intensiteetin lymfosyyteille ja nostaa siten alfa-suhde yli 2,6:teen.

Herate- ja emissioaallonpituuksien valinta on ensi-sijaisesti riippuvainen menetelmassa kaytettavan MPS-va-10 riaineen valinnasta. Syaniinivareilia, edullisilla MPS-variaineilla, olemme havainneet saatavan hyvin tyydyttavia tuloksia, kun lasersateen aallonpituus on 488 nm ja fluo-resenssiemissiot, joiden aallonpituus on yli 520 nm, re-kisterOidaan. Kuten Sims ym. ovat huomauttaneet, Bio-15 chemistry, 13, 3315 (1974), sijoittuvat syaniinivarien fluoresenssiemissiot vaiille noin 496 nm:sta 792 nm:iin. Kaytettavissa olevalla laitteistolla me olemme saaneet hyvi tuloksia mittaamalla 520 nm:n yiapuolella olevat fluoresenssiemissiot.

20 Esimerkki

Lymfosyytit erotettiin perifeerisesta veresta ote- tuista 20 ml:n naytteista peraisin olevista naytteista laittamalla osa verinaytteesta, josta osasta oli poistet- tu fagosyyttiset solut, kerrokseksi sellaisen Ficoll-Trio- ; 25 sil-tiheysgradienttiliuoksen paaile, jonka tiheys 25°C:ssa • · on 1,081 g/cm3 ja jonka osmolaalisuus on 0,320 Osm/kg. Verinayte ja tiheysgradienttiliuos sentrifugoitiin sentri-fugaalivoimalll 550 Gav lampdtilassa 25°C. vaiittdmasti plasman ja gradienttiliuosmateriaalin vaiisen rajapinnan 30 yiapuolella kelluva ohut kerros imettiin talteen Pasteur-pipetilia vaittaen niin paljon kuin mahdollista ottamasta yhtaan mukaan tiheampaa tiheysgradienttimateriaalia ja ke-vyempaa erotetun solukerroksen yiapuolella kelluvaa plas-mamateriaalia. Naiden materiaalien vahainen mukanaolo 35 poistetussa solunaytteessa ei kuitenkaan ole ratkaisevaa 11 92076 puheena olevassa tekniikassa. Tama erottelutekniikka nou-dattaa ylimalkaisesti tekniikkaa, jonka ovat julkaisseet L. Cercek ja B. Cercek, "Application of the Phenomena of Changes in the Structuredness of Cytoplasmic Matric (SCM) 5 in the Diagnosis of Malignant Disorders: a Review", Europ.

J. Cancer, Vol. 13, 903 - 915 (1977) seka samat tekij&t julkaisussa, jolle on pantu otsakkeeksi "Effects of Osmolality and Density of Gradients on the Isolation of SCM-Responding Lymphocytes", Br. J. Cancer, Vol. 38, 163-165 10 (1978). Kuten edelia on mainittu, erotustekniikka ei kui- tenkaan ole niin ratkaiseva kuin ylia mainituissa julkai-suissa on ilmaistu, eika tåm&n keksinndn mukainen menetel-ma rajoitu siihen hyvin tarkoin maarattyyn lymfosyyttien alapopulaatioon, joka vaaditaan julkaisuissa ilmaistuun 15 tekniikkaan. Niinpa puheena olevassa menetelmassa lymfosyyttien erottamiseen muista veren komponenteista kaytet-tava tekniikka seka myOhempi erotettujen solujen kasittely ovat paljon vahemman ratkaisevia kuin julkaisut, joihin edelia on viitattu, vaativat.

20 Verinaytteet saatiin 15:lta ian ja sukupuolen suh- teen yhtaiaiselta terveelta luovuttajalta, 1. luovuttajil-ta, joita ei ollut diagnostisoitu pahanlaatuisuudesta kar-siviksi, seka 15:lta luovuttajalta, jotka oli positiivi-sesti diagnostisoitu syOpaa poteviksi. Taman esimerkin 25 tarkoituksiin syiivan tarkoin maaratty tyyppi ei ole ratkaiseva. Verinaytteet saatiin myfis 6 luovuttajalta, jotka diagnostisoitiin ei-pahanlaatuisia tulehduksellisia sai-rauksia, sellaisia kuten niveltulehdusta ja muita tulehduksellisia tiloja, poteviksi. Kustakin verinaytteesta 30 edelia kuvatun menettelytavan mukaan eristetyt lymfosyyt-tifraktiot pestiin 6-7 ml:11a sailytysaineita sisaitama-tiinta 0,9%:ista NaCl-liuosta, minka jaikeen ne pestiin PBS:lia. Pesujen vaiilia kukin solususpensio sentrifugoi-tiin sentrifugaalivoimalla 500 GaT ja supernatanttineste 35 kaadettiin pois. Pesun jaikeen kustakin naytteesta saatu 12 92076 solususpensio yhdistettiin uudelleen PBS:n kanssa ja tila-vuus sdddettiin siten, ettd muodostui suspensio, jossa oli noin 2 x 106 solua ml:ssa.

Leimaukseen kdytettdvd dio-C6_(3 ,-liuos valmistet-5 tiin liuottamalla ensin 28,6 mg vårid 10 ml:aan absoluut-tista "analar grade"-etanolia. Liuos sdddettiin lopulli-seen konsentraatioonsa ruiskuttamalla 0,1 ml kantaliuosta 100 ml:aan PBS:då.

Leimaus toteutettiin yhdistdmdlld keskenddn samat 10 tilavuudet leimausliuosta ja lymfosyyttisuspensiota ja pitdmdlld seosta ylld kevyesti sekoittaen vdhintddn 10 minuuttia. Leimaustoimenpiteen pddtyttyd fluoresenssija-kautumat rekisterOitiin Becten-Dickenson-virtaussytomet-rilld, malli FACS IV (Becten-Dickenson flow cytometer, 15 model FACS IV). MPS-vdrilld leimatuille soluille annettiin herdte 488 nm:n argonionilaserjuovalla, ja yli 520 nm:n fluoresenssiemissiot rekisterOitiin kdyttden normaaleja FACS IV:n optisia suodattimia. FACS IV-sytometri oli va-rustettu tietokoneella, joka toimi ndytteestd saatujen 20 pulssien rekisterOintiin ja lajitteluun tarkoitettuna pulssianalysaattorina. Yksittdisten solujen virta muodos-tettiin, kuten edelld on kuvattu, panemalla leimausliuok-sessa olevien solujen susepnsio keskelle sekoituskelpoisen vaippanesteen juoksevaa virtaa, jolloin FACS IV-instrumen-; ,· 25 tin "nozzle-transducer assembly”-osaan saatiin aikaan la- minaarinen samakeskinen virtaus. Tdild tavalla ndytteen neste ja sen sisdltdmdt solut pakotettiin nesteen tulovir-ran keskiosaan, jolloin estettiin soluja koskettamasta laitteen "nozzle-assembly"-osaa ja tuotettiin lasersdteen 30 ohi kulkeva yksittdisten solujen virtaus. Monistusvaloken-no havaitsi lasersdteen ohi virtaavista soluista ldhtevdt fluoresenssiemissiot ja intensiteetti muunnettiin sdhkiii-seksi pulssiksi, jonka pulssianalysaattori tallensi. Puls-sianalysaattorin lajittelu tuotti, kun piirrettiin puls-35 sien frekvenssi pulssin korkeuden funktiona, kuvioissa 1 13 92076 ja 2 kuvattujen tyypillisten kayrien kaltaisia kayria. Va-semmanpuoleisen NL- ja oikeanpuoleisen NR-huipun laskuta-pahtumien kokonaismaarat, seka nåista satu alfa-suhde sel-laisille luovuttajille, joiden on diagnostisoitu olevan 5 syOvésta vapaita, on ilmoitettu alia taulukossa I. Tulok-set sellaisille luovuttajille, jotka on diagnostisoitu sydpaa sairastaviksi, seka sellaisille luovuttajille, jotka on diagnostisoitu sairastavaksi tulehduksellisia sai-rauksia, sellaista kuten niveltulehdusta, on ilmoitettu 10 vastaavasti taulukossa II ja taulukossa III. 1 .

14 92076 η σ« -η ιη · · > w >η χ oo χ ^ rH <Ν (0 > 'ί ο ιη ίο "ί1 · · C'' 4-> •Η X Ο 0Η 03 VO CH CM (0 u Ο ή in -Η 00 · · (S (0 <-η χ σ» in to ^ η οο «3 «π οο ιη «3

OvJ · · (Ν Οι η χ <Ν σ Ο νΟ «Η 00 >ι (0 οο σ οο i—( · · · 3 ι—ι κ ον 'ί οο -μ ΟΟ (Ν -Η 00 0 ιη οο 03 Ο · · 00 -Η π χ ιη ο -μ νο μ ιη ο) • 0

IS ^ 00 C

• · Ο) σ κ νο τί ιη ίο οο CM -Η οο 1ο s in w • · ιη ^ οο s ον νο Ο -η οο · to οο ν χ σιη ^ <0 • · ιη χο > s κ ι-Ι οο s χο <0 οο · αν οο ο 03 ο οο >ι «3 • · ο mu νο χ ιη γη -η 00 Ον) τ1 -Η (0 Ο) (0 00 ο • · Ο » (0 ιη χ νο τ1 . ο; -η

ιη |Η ri > V

u 3 ιη οο ο) <η . . οο ν ν ^ χ σ ο w 00 0ν) τ1 <0

SB U

οο οο ω ; · · ιη ·· Ή

. ; 00 X νο ο rH -Η rH

ιη οο · a γ-ι η in a α) >1 03 es ο m >, χ Ν χ · · 00 V 3 χ σ · <0 Ό ιη -i-» .0 Η <0 Q)

^ 00 V rH

Ο rH χ . · <Ν V 3 λ; ο γη . 3 ν X S Η νο > 0 1 0 3

Η -«Η 3 V

3 Οι J -Η Λ Οι 0 Ε-ι >ι «03 >ι Ή

V «3 V

<0 -ο 03 η -Η Ο 10 X c ο ν ο ο β) σ» μ ν ο ο ν <ο C 3 Ο Ο I ιΗ > ι—ι γ-ι <0 Ό

0 0 S. \ ιμ W

•ο 3 J X Η < J 2 2 < Μ 15 92076 •Η ri in co ου··· x co o in h (0 10 co > <0 co u1 o p o> u · · · m cm co co p (0 in in (h in -π CO Ή Ή (0 CD U · · ♦ Μ M CO CM Ρ <0 »0 00 CM CM ft is Ο · · · Ο cm ro in ρ >ι

Ρ P CO

VO CO O' 3

VO U · · *· P

CM CO O' P

in co «-i O

(0 rH c^ in p

in u P

cm cm ^ ρ co

CM rH O

in C

in o> ro O) vji u · · · 10

CM Ρ* Ο P -H

VO Ό in w co in vo ^ co u · · · Up

CM OOP CO

in co v x ' ' (0 cm o t" ao > cm u · · · ao (0

CM O' O' rH ft P

CM O CO

>1 (0

rH O' CO iH

H U · · · P

cm romp ρ (0

CM P a) CD

in τί O' O' · (0 o u · · · a) p

CM CO VO P > P

p in 3 a) to

vD IS Ο P P

σ> U · · · "-r· P P O CM (0

CM P X P

CO

- in CM CM ·· P

ro u · · · p p

P vi O CM Οι P

Vf CM ft a)

g X

IS U CM CM CM P 3 P · · · (0 T3 H CO Ti CM t-> £ H in CM (0 0)

P P

o vo u ro s- m p 3 x p · · m 3 p X cm o · > 3 * in cm cm 0 3

P P 3 P

3 ft J P

(0 ft 0

Eh £ * W

P ao P

(0 TO W

το P O

(0 X c O P O O 0) o> (H P O O P (0

C 3 Ο Ο I P

> p p (0 Ό o O "S \ p w

to 3 iJ 0C P

< *1 2 2 < P

16 92076

Taulukko III

Ajo nro 31 32 33 34 35 36

5 Luovuttajatyyppi* I I I I I I

NL/1000 24.6 160.2 142.5 111.5 54.7 309.6 NR/1000 5.5 14.6 14.2 23.5 9.5 33.5 10

Alfa-tekijå 4.5 11.0 10.0 4.75 5.76 9.24 * Luovuttajatyyppi: H (terve, ei sydpaa), C (diag-nostisoitu syOpaa sairastavaksi), I (diagnostisoitu tuleh-15 dukselllsta tautla sairastavaksi)

Esimerkin tuloksista on nahtavissa, etta missaån ta-pauksissa eivat alfa-tekijSt pahanlaatuisuudesta kårsivien luovuttajien lymfosyyteille ylita 2,6:tta. Vastaavasti 20 alfa-tekijat sellaisten luovuttajien lymfosyyteille, joil-la ei ole pahanlaatuisuutta, eivat laske alle 2,6:den. TåmM on totta myOs silloin kun luovuttaja karsii muista tulehduksellisista sairaustiloista, sellaisesta kuin ni-veltulehduksesta.

. 25 Edelia olevasta on n&ht&viss&, etta taman keksinnOn mukainen menetelmd tarjoaa yksinkertaisen testin, jolla luovuttajien verinSytteita voidaan seuloa luovuttajien kehoissa esiintyvan pahanlaatuisuuden toteamiseksi. Tes-tiin vaaditaan suhteellisen pieni verinayte ja sen voivat 30 tehda henkilOt, joilla on tavanomaiset taidot alalla. Vaikka keksintO tassa on kuvattu ja sita on valotettu vii-taten sen tiettyihin toteutusmuotoihin, on ymmarrettava, etta se voidaan toteuttaa toisin liitteena olevien patent-tivaatimusten puitteissa.

Claims (9)

17 92076 Patentt ivaat imukset

1. Menetelmå ihmisen tai elåimen kehossa olevan pa-hanlaatuisuuden måårittåmiseksi, joka menetelmå kåsittåå 5 seuraavat vaiheet: mainitusta kehosta otetusta nåytteestå peraisin olevien lymfosyyttien leimaamisen saattamalla niiden sus-pensio, edullisesti niiden fosfaatilla puskuroitu suola-liuossuspensio, joka sisaltåå 2 x 10”6 solua millilitraa 10 kohti fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta, yhteen fluore-soivan solumembraanipotentiaalille herkan aineen kanssa, jolloin membraanipotentiaalille herkkå aine sidotaan lym-fosyytteihin, lymfosyyttien saattamisen kulkemaan yksitellen koh-15 distetun fluoresenssin viritysenergian lahteen kautta, saaden potentiaalille herkån aineen fluoresoimaan, ja kustakin lymfosyytistå lahtevan fluoresenssiemis-sion intensiteetin mittaamisen, tunnettu siita, ettå menetelmå lisaksi ka-20 sittaå vaiheen, jossa muodostetaan lymfosyyttien fluore- senssiemission intensiteettiin perustuva bimodaalinen ja-kautumakayra ja maSritetaan kayråsta alhaisemman fluore-senssi-intensiteetin omaavien lymfosyyttien lukumåårån : · suhde korkeamman fluoresenssi-intensiteetin omaavien lym- 25 fosyyttien lukumaaraan, joka suhde ilmaisee, onko kehossa pahanlaatuisuutta vai ei.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siita, etta membraanipotentiaalille herkkå aine on fluoresoiva våri, joka on valittu ryhmåstå, 30 jonka muodostavat syaniinivårit, merosyaniinivårit ja ok- sonolivårit, edullisesti syaniinivåri, joka on valittu ryhmåstå, jonka muodostavat karbosyaniini-, dikarbosyanii-ni- ja trikarbosyaniinivårit. 92076 --- τ_ 18

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta membraanipotentiaalille herk-kå aine on 3,3'-diheksyylioksakarbosyaniini.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, 5 tunnettu siita, etta lymfosyyttisuspensio sekoi-tetaan samansuuruisia tilavuusosia kayttaen liuokseen, joka sisaltåå 2,86 x 10-6 g/ml membraanipotentiaalille herkkaa ainetta fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa, ja 10 seosta pidetaan ylla riittavan kauan, jotta ainakin osa aineesta saadaan sitoutumaan lymfosyytteihin, edullisesti vahintåan noin 10 minuuttia.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta viritysenergian lahde on la- 15 sersade, edullisesti lasersade, jonka aallonpituus on 488 nm.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tun nettu siita, etta leimatut lymfosyytit ruis-kutetaan yhteensopivan vaippanesteen juoksevaan virtaan ja 20 saadaan lymfosyyttien ja vaippanesteen laminaarinen, sama-akselinen virtaus, jolloin lymfosyytit pakotetaan yksit-taisina soluina juoksevan virran keskiosaan ennen kuin ne kulkevat viritysenergian lahteen kautta.

: ' 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, 25 tunnettu siita, etta kustakin lymfosyytista lahte-van fluoresenssiemission intensiteetti muunnetaan sahkois-eksi pulssiksi, jonka korkeus on suoraan verrannollinen emission intensiteettiin, ja merkitaan jakautumakayralle, jossa abskissana on pulssin korkeus ja koordinaattana * 30 pulssien lukumaarå, jolloin jakautumakayra on bimodaalin- entoisen huipun kuvatessa alhaisemman intensiteetin emis-sioita ja toisen huipun kuvatessa korkeamman intensiteetin emissioita.

8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, 35 tunnettu siita, etta korkeamman intensiteetin 19 92076 emissioita kuvaavassa huipussa olevien pulssien lukumåårå jaetaan alhaisemman intensiteetin emissioita kuvaavassa huipussa olevien pulssien lukumåarållå, jotta saadaan al-fa-kerroin, joka on tunnusomainen pahanlaatuisuuden vaiva-5 amasta kehosta peraisin oleville lymfosyyteille ja pahan-laatuisuudesta vapaasta kehosta peraisin oleville lymfosyyteille.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelma, tunnettu siita, ettH pahanlaatuisuuden vaivaamasta 10 kehosta peraisin olevien lymfosyyttien alfa-kerroin on pienempi kuin 2,6 ja pahanlaatuisuudesta vapaasta kehosta peraisin olevien lymfosyyttien alfa-kerroin on suurempi kuin 2,6. > · ·> ♦ 20 92076