JPH02501975A - リンパ球による膜電位鋭敏物質の分差結合 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リンパ球による膜電位鋭敏物質の分差結合技術分野 この発明は、リンパ球による膜電位鋭敏物質の分差結合に関し、！＃にリンパ球 による電位鋭敏物質の分差（又は示差）結合を利用して体内の悪性腫瘍を検出す る方法に関する。

背景技術 最近では、住きている細胞の電気性理学および生物物理学的研究において庄きた 細胞および／または他の細胞構造の膜電位における変位を研究するために、膜電 位に敏感な染料のような産物学的プローブの使用に関心が増してきた。例えば、 そのような物質は、イカの大きな軸索細胞（Ｏｏｈｅｎ　ＬＰＢ　ａｔ　ａｍ、 　４゜（ｘｓ７ｑ））　、における膜電位の研究、およびカエルのこの同じ方向 に沿って、血ｇ、ｍ胞生理学の研究は、ヒトおよび動物の体における病気の状態 を検出する方法に向いている。例えば、我々は細胞膜マトリックス（ＳＣＭ）の 組織における変化を研究するために、生きた細胞において細胞内フルオレセイン 螢光偏光測定をして癌および他の抗原を性成する病気を早期に検出する方法を開 発した。ＥＣＭは、例えばミトコンドリア、細胞膜、細胞液、リソソーム、リポ ソーム、核などの如き種々の細胞組織を含む。文献においてｒｓｃＭ試験」と呼 ばれている我々の方法は１次の刊行物に要約されている：　Ｌ、ＣｅｒＣｅｋｙ Ｂ＋Ｃ＠ｒｏｅｋ＊　”ＡｐｐｌｉＯａｊｌＯｎ　ｏｆ　ｔｂｅ　ｐｈｅｎｏｍ ｅｎｏｎ　ｏｆＣｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｄｎｅｓｓ 　ｏｆ　ＯｙｔｏｐｌａｓｍｉｃＭａｔｒｉｘ（ＳＣＭ）ｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｉａ ｇｎｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｍａｌｉｇａｎｔ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：Ａ　Ｒｅｖｉｅ ｗ”、　Ｅｕｒｏｐ＋、Ｔ、Ｃａｎｃｅｒ、　Ｖｏｌ、　ＩＬ　９０５−９１５ （１９７７）。我々の方法を用いて、例えば分裂促進因子フイトヘマグルニチン および癌に関係した抗原に対する末梢血液リンパ球の密度特異細区分の示差応答 を測定することによって、癌および他の病気および体の状態の早期診断が容易に できる。細胞内のフルオレセイン螢光偏光における変化は、リンパ球の示差応答 を示すことに用いられる。

しかしながら、上記の方法は、血液試料からのＳＣＭに応答するリンパ球の細区 分を分離して螢光測定をするために非常に熟練した人および極めて慎重な技術を 必要とする。その上、８０Ｍ試験法は細胞内のフルオレセイン螢光偏光測定にお ける微量分析精度、高計器感度および安定性が要求される。低い技術および代謝 状態の動揺に敏感なリンパ球の未熟な取扱いは非再現性で、全体的に誤差のある 試験結果をもたらすことになる。

従って、行うのに簡単で１）容易に入手できる装置を使用して低度の技術的熟達 度で信頼性をもって実施することができ、それによって診療所および医院におい てもスクリーニング法のような方法をルーチンの使用に実用的にさせるところの 癌の検知のためのスクリーニング法を提供することが極めて必要である。

発明の開示 本発明は、試験結果を検出および記録するために市販の器械を使用することによ って提供者に悪性の腫瘍がある場合に血液試料をスクリーニングする方法を提供 する。本発明の方法はリンパ球の細区分のあるものによる膜電位鋭敏物質の示差 （又は特異的）吸収に基いている。その吸収（又は取込み）は提供１者が悪性腫 瘍に苦しめられているか否かによって異なる。ここで定義された方法は依然とし てリンパ球の標準密度特異細区分の単離に一定の熟達を要するが、それはこれま でよシ低くかつ当業者によって容易に実施されるものである。本発明の方法はよ く理解されていると共に容易に入手できる流動細胞計測法および器械を用いる、 そしてリンパ球の取扱は前述の８０Ｍ試験よシも容易でおる。本性は、前記の８ ０Ｍ試験と共に用いることができ悪性腫瘍の極めて早期のかつ特異の診断ができ るところのルーチンの癌スクリーニング法として用いるのに特に適する。

本発明の方法は生存可能なリンパ球の懸濁液を膜電位鋭敏螢光物質を含有する溶 液と接触させることから成る。通常膜電位鋭敏螢光染料と呼ばれているかかる物 質は以後ｒＭｐｓ染料」と呼ぶ。リンパ球の懸濁液とＭＰＳ染料との接触は、リ ンパ球をＭＰＳ染料で標識化させるのに十分な時間維持される。

その標識化工程に続いて、得られた標識化リンパ球は単一細胞として励起エネル ギーの集中源に通してリンパ球を標識化したＭＰＳ染料に螢光を発せさせる。各 細胞からの螢光放射をパルスとして記録し・それぞれの強さのパルスの数を記憶 させる。リンパ球からの螢光放射のパルス強度とパルスの数との分布曲線は２つ のモードの曲線、すなわち２つのピークからなる曲線である。その曲線の第１の ピークは低螢光強度のパルスを含み、第２のピークは高螢光強度のパルスからな る。試験した各試料について高螢光パルスに対する低螢光パルスの総数の比は、 癌で苦しんでいる提供者から得たリンパ球と癌に侵されていない人のリンパ球と を区別する係数を圧す。

α係数と呼ぶこの係数は、癌に侵されている提供者から得たリンパ球の懸濁液に 対してａ６以下でるることがわかった。一方、癌に侵されていないドナーから得 たリンパ球試料では、１６以上のα係である。

これに基いて５本発明の方法は、癌の存在に対して比較的簡単で経済的そして実 施するのに普通程度の技術を要するスクリーニング試験法を提供する。

図面の簡単な説明 第１図は悪性腫瘍に侵されていないドナーから得た典型的なリンパ球試料からの 螢光放射のパルス分布を示す曲線である。

第２図は悪性腫瘍に侵されているドナーから得たリンパ球の螢光放射のパルス分 布を示す曲線である。

発明を実施するための最良の形態 本発明の方法に利用した細胞は試験せんとする缶体から採取した血液試料から分 離したリンパ球である。それは現在十分に理解されていないけれども。

Ｔａ胞型でおるリンパ球は悪性腫瘍に関連した抗原の認識に含まれると考えられ る。癌に侵されたドナーから得たＳＣＭ一応答リンパ球と呼ぶある糧のリンパ球 は、腫瘍細胞によって形成されるように悪性腫瘍に関係した抗原を認識するため にビボにおいて感作されている。従って悪性腫瘍に侵されていないドナーから得 たリンパ球の場合よシもＭＰＳ染料に対して異なった応答を有することがわかっ た。

本発明に有用なリンパ球は、フィコールＤ　ＯＯ（Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ　Ａ　 Ｂ　）およびトリオシル４１ｉ　０　（Ｎｙｅｇａａｒｄ　＆Ｃ０２）の混合体 溶液のような密度勾配溶液に関して血液試料の遠心分離によって血液試料から最 も便利に分離される。勾配溶液フロートの密度より低い値を有する血液細胞は勾 配溶液の最上部に浮いて、勾配溶液の密度よシ大きい値を有する細胞から分離す ることができる。そのような血液成分の分離法は技術的に周知であシ、例えばハ リスら［Ｒ，Ｈａｒｒｉｓ＋　Ｅ−Ｕｋａｊｉｏｆｏ、　Ｌａｎｃｅｔ、　Ｖｏ ｌ、　２．　’５２７（１９６９）　：ｌによる方法である。勾配溶液を２５℃ でｈｏｇｙ／ｃ！Ｉの分離密度および０．５２００ｓｍ／ｒ；ｐのオスモル濃度 に修正することによってＳＣＭ一応答リンパ球は血液試料の遠心分離後に勾配溶 液の上に浮き、そしてその細胞層を血漿勾配溶液界面上に直接吸引することによ って容易に分離することができる（　Ｌ、Ｃｅｒｃｅｋ、　Ｂ。

Ｃｅｒｃｅｋ　Ｂｒ、Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　Ｖｏｌ、　２Ｌ　１６５（１９７ ｇ）を参月〕。

勾配溶液から分離した後、その細胞は保存剤を含まない塩化ナトリウム溶液で望 ましくは２回、そして次にダルベツコのリン酸緩衝溶液（ｐＢｓ　）で望ましく は２回洗浄する。洗浄に続いて、細胞は本発明の試験法に使用するためにＰＢＳ に懸濁させる。

後で詳細に説明するように螢光強度分布曲線を作るために細胞は懸濁液中に適当 数で存在しなければならないが、懸濁液中の細胞の濃度は決定的ではない。

１０６細胞／Ｍｌの桁でリンパ球の懸濁濃度を利用した本発明の好適実ｔｓ態様 によって良好な結果が得られた。

ＭＰＳ染料は螢光色素を含みかつ細胞膜に結合又は浸透できる物質である。ＭＰ Ｓ染料の作用する正確なＭＷは明らかでにないが、２．５のモデルが提案されて いる［５１ｍ５．　ｅｔ　ａ）＋ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３＋５５１ ５（１９７す〕。

本発明用に適当なＭＰ８染料はシアニン染料、メロシアニン染料およびオキソノ ール染料からなる群から選ぶ。メロシアニン染料の中にはメロシアニン・オキサ シロンおよびメロシアニン・ローダニンがある。最も広く研究されかつ望ましい グループの染料はシムス［５ｉｎｓ、　ａｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ’ ｔｒｙ　ＩＬ　３５１５（１９７す〕らによって調製され、研究されたシアニン 染料である。この刊行物には、細胞膜電位における変化の染料に及ぼす影響に関 して２９のシアニン染料が研究されている。良好な結果が本発明においてオキサ カルボシアニンでおる。シムスらの刊行物に示されている約束に従って、この染 料はその短路記号Ｌｌｏ−ｃ６−（３１によって固定される。ＭＰＳ染料は本発 明にＰＢＳにおける染料の希釈溶液として使用される。その溶液におけるＭＰＳ 染料の濃度は約２×１０〜５ｘｌＯ、望ましくは約５×１０　Ｉ廓である。ＭＰ Ｓ染料の多くはリン酸緩衝溶液にほんの少ししか溶解しないから、最初にエチル ・アルコール中のＭＰＳ染料のさらに濃い溶液を生成し１次にその濃いアルコー ル溶液をＰＢＳで必要な濃度に希釈することが望ましい。

舵述のようにり／バ琢の懸濁液を調製した後、そのリンパ球はＭＰＳ染料で標識 化する。その標識化工程は１等部のリンパ球溶液とＭＰＳ染料との混和物をゆる やかにかくはんしながら混合することによって最も便利に行われる、そのリンパ 球懸濁染料溶液混合体は適当な期間維持してリンパ球をＭＰＳ染料によって標識 化させる。接触はリンパ球に損傷を与えることなく１時間の長い間維持できるけ れども。

普通は約１０分の接触時間がリンパ球を標識化するのに十分である。標識化工程 の間リンパ球の懸濁液／染料溶液の混合体の温１ｆを呈温（２０℃〜２３℃）に 保つことによって最高の結果が得られることがわかった。

細胞懸濁液とＭＰＳ染料溶液との接触に欣いて。

細胞を螢光励起エネルギーの集中源に通してＭＰＳ染料の螢光を発生させる。こ れは螢光活性化細胞選別機において行われ、標識化リンパ球懸濁液はシース流体 内のリンパ球の層状同軸流を得るために小夏径の管を十分な速度で流れるシース 流体流内に注入される。このように個々のリンパ球は分離されてシース流体内に 個々の細胞流を形成する。レーザー・ビームは励起エネルギーの集中源からなシ 、流動する流体流に流れの方向に実質的に垂直に衝突される。

このように５個々のリンパ球はそこを通過する際にレーザー・ビームによって質 問を受ける。レーザ・ビームがリンパ球に質問する点の下流何に適当な光電検出 装置を配置し、各リンパ球の螢光強度をリンパ球が光電検出装置を通過ずる際に パルスとして検出する。パルスの強度はパルス・カウンターへ送られて、そこで そのパルスのカラン）ｔパルスの特定強度を分離するチャンネルに記憶される。

このように、各パルス強度におけるパルスの数は分布曲線を作るために記憶され る。

第１図および第２図に示すように、横座標としてパルスの高さく螢光強度に対応 する）そして縦座標としてそのパルス高さにおけるカウント数をプロットしたと き、リンパ球の各試料からのデータが２つのモード曲線を形成する。分布曲線上 の第１のピーク（左側のピーク）は低強度リンパ球を表わし、第２のピーク（右 側のピーク）は高強度リンパ球を表わす。予想外に我々は、右側のピークにおけ る細胞の数に対する左側のピークにおける細胞の数の比（α比）がす７７球を分 離したドナーの体における悪性腫瘍の存在又は不在に直接関係することを見出し た。例えば、第１図に示した曲線は悪性腫瘍に侵されていないドナーから単離し たリンパ球の分布曲線を示す。低い強度パルスを示す左側のピークは高い強度パ ルスを示す右９のピークよシ実責的大きいことがわかる。第１図で示したような 癌に苦しめられていないドナーから得た螢光放射標識化細胞の分布曲線の場合に 、左側ピークに対する右ｇｉ１ピークの比は乙６以上でちる。

一方、第２図は悪性腫瘍を有すると診断されたドナーから単離されたリンパ球に 対する典型的な分布曲線を示す。この場合の高強度パルスと低強度パルスの数の 間の差は第１図におけるように大きくない、そして石側ピークに対する左側ビー クの比はａ６以下である。

悪性腫瘍を有するドナーと悪性腫瘍を有さないドナー間の左側ビークとｔＪｇＩ ｌｌピークとの比における差の理由は完全にわかっていない。しかしながら、腫 瘍性の障害をもったドナーからの高比率のリンパ球の膜電位は若干大きな電気的 陰性でらシ、従って細胞に対してＭＰＳ染料の結合を強くおよび／−またけ染料 による細胞の浸透を大きく（それは細胞の標識化を増す）すると仮想される。ま た、その比率のリンパ球の膜電位の高陰性はＭＰＳ染料の螢光をよシ強く発光さ せうる。いずれの場合においても、これは、低強度パルスに比べて高強度パルス の大きい数のカウントをもたらし、従ってα比をａ６以下にさせる。これに対し て、腫瘍性の障害に苦められでいないドナーからのリンパ球は電気的陰性が低く 、従ってリンパ球へのＭＰＳ染料の結合を低下させるシよび／またはＭＰＳ染料 による螢光放射強度を低下させると考えられる。従って、これは高強度のリンパ 球と比較して低強度のリンパ球のカウント数を大きくシ、従ってα比を２６以上 にする筈でおる。

励起および放射波長の選択は主としてこの方法に利用するＭＰＳ染料の選択に依 存する。シアニン染料の望ましいＭＰＳ染料で、我々はレーザー・ビームの波長 が４ε８ｎｍであって５２０ｎｍ以上の波長において螢光放射が記録されるとき に極めて満足な結果が得られることを見出した。シムスら（ｓｉｍｓ＋ｅｔ　ａ ｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓ　１３＋　３５１５（１９７キ））によっ て指摘されているように、シアニン染料に対する螢光放射は約１１９６ｎｍ　〜 ７９２ｎ、ｍの範囲である。利用した装置で我々は５２０ｎｍ以上の螢光放射を 測足した良好な結果を得た。

笑施例 食細胞を除去した血液試料の一定分量を、２５℃でＬε０１ｊｌ／ｃＩｌの密度 およびα３２００５ｍ／ｌｐのオスモル濃度を有するフィコール−トリオシルの 密度勾配溶液上に層にすることによって、末梢血液２０ｄ試料からリンパ球を分 離した。血液試料および密度勾配溶液は２５℃において５５０　Ｇ＆、で遠心分 離した。血漿と勾配溶液との界面１上に浮いている狭い層をパスツール・ピペッ トでよシ重い密度勾配材およびよシ軽い血漿材を回避しながら吸引した。しかし ながら、除去された細胞試料にこれら材料が若干量存在することは本性において は重大ではない。

この分離法は一般に次の刊行物に示されている方法に従った：　Ｌ、Ｃｅｒｃｅ ｋ、　Ｂｉｅｒｃｅｋ、”Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆｔｈｅ　Ｐｂｅｎｏｍ ｅｎａ　ｏｆ　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄｎｅｇｓ ｏｆ　Ｃｙｔｏｐｌａｍｉｃ　Ｍａｔｒｉｘ（ＳＣＭ）　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｄｉａ ｇｎｏｓｉｓ　ｏｆＭａｌｉｇｎａｎｔ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｇ：　ａ　ＲｅＮｉ ｅｗ＋、Ｅｕｒｏｐ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ。

Ｖｏｌ、　ＩＬ　９０３−９１５（１９７７）；　ａｎｄ　Ｌ、　Ｃｅｒｃｅｋ 、　Ｂ、Ｃｅｒｃｅｋ。

”Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ　ａｎｄ　Ｄｅｎｓｉｔｙ　ｏｆ 　Ｇｒａｄｉｅｎｔｓｏｎ　ｔｂｅ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＣＭ−Ｒｅ ｓｐｏｎｄｉｎｇ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ”。

Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒｓ　ＶＯｌ、　３ε、　１６５−ｉ６５（１９７ε ）。　しかしながら、前述のように、この分離法は上記刊行物に示されているよ うに臨界的ではなく５本発明の方法は刊行物に示された方法に必要なリンパ球の 極めて特定の細区分に限定されない。従って、残留する血液成分からリンパ球を 分離し分離された細胞の後処理のために本発明に用いる方法は上記刊行物に必要 なものよシ極めて臨界的でない。

血液試料は、年令が１５で同じ性の健康なドナー、すなわち悪性腫瘍を有すると 診断されなかったドナー、および癌を有すると診断された１５人のドナーから得 た。本例の目的のためには特定の種類の癌は重要でない。血液試料は、関節炎お よび他の灸症性状態のような悪性でない炎症性の病気をもつと診断された６人の ドナーからも得た。上記の方法に従って血液試料の各々から単離したリンパ球は 保存薬なしにＮａＣｊの６％溶液６〜７ゴで洗浄し、続いてＰＢＳ中で洗浄した 。洗浄の間にそれぞれの細胞懸濁液は５０００ａｖで遠心分離して、上澄み液は デカントした。洗浄後、各試料からの細胞懸濁液はＰＢＳと再混合したそしてそ の体積を調節して約２　ｘ　１０６細胞／１の懸濁液を得た。

ａ　＝　ｏ　−ｃ　６−（３１の標識化溶液は最初に染料２　＆　６　Ｎｆｌを 無水の分析グレードのエタノール１０′ＩＬｔに溶解することによって調製した 、その溶液はその貯蔵溶液０．１−をＰＢＳ１００＋ｗｊに注入することによっ てその最終１ｌ１１度を調整した。

標識化は等体積の標識化溶液とリンパ球懸濁液を混合しその混合体を少なくとも １０分間軽くかくはんしながら維持することによって行った。標識化工程の完了 時点において螢光分布ｆ　Ｂｅａｔｅｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎの流動細胞計測器 （ＦＡＣ８ｆ型）に記録した。

ＭＰＳ染料標識化細胞は４８１！ｎｍのアルゴン・イオン・レーザー光線で励起 した。そして標準ＦＡＣ８ｙ型光学フ型光タフイルターて５２０ｎｍ以上の螢光 放射を記録した。ＦＡＣ８ｆｆ型細胞計測器は試料から得られたパルスの記録お よび選別のためにパルス分析器の働きをするコンピュータを備えた。個々の細胞 の流れは、標識化溶液中の細胞懸濁液をシース流体の流動流の中心に導入して、 ＦＡＣ８Ｗ型計器のノズル変換アセンブリ内に層状の同軸流を確立することによ って生成させた。このように、試料流体およびそれに含まれた細胞は流体の流動 流の中心部に制限された。従って細胞が計器のノズル・アセンブリに触れるのを 防いで、レーザー・ビームの先に個々の細胞流を提供する。レーザー・ビームを 通シ越して流れる細胞からの螢光放射は光電子増倍管で検出された、そしてその 強さを電気ノ（ルスに変換しそれをパルス・アナライザーによって記憶させた。

パルス・アナライザーのソートは、パルスの度数とパルスの高さとの関係をプロ ットしたとき、第１図および第２図に示した典型的な曲線の如き曲線を与えた。

左側のＮＬピークおよび右側のＮＲビークの総カウント数および癌が無いと診断 されたドナーに対して得られたα比を以下の第工表に示す。癌に侵されていると 診断されたドナーおよび関節炎のような炎症性障害をもつと診断されたドナーに 対する結果をそれぞれ第π表と第１表に示す。

い　：ｒ、―　−ベ ロ　ロ　ｃ５　〆　− ｆ　＜　ｆ＋ 第　ｍ　表 実験Ｎｌ　５１　５２　５ラ　ジ１１　３５　３６ＮＬ／１０００２Ｌ６１６０ ．２１４２−５１１１５５４．７５０５１６Ｎ１￥’１０００５．５１！４．６ １１１．２２３．５師３３，５α係数　４．５　１ＬＯ１ｏ、ｏ　ヰ、７５　５ ．７６　５１２１！＊ドナーのタイプ＝　Ｈ（健康、癌なし）、Ｃ（癌をもつと 診断された）、工（炎症性障害をもつと診断された）実施例の結果から、悪性腫 瘍で侵されたドナーからのリンパ球に対するα係数がａ６を越る場合がないこと がわかる。悪性腫ｇＥヲもたないドナーからのリンパ球に対するα係数は２．６ 以下にならないことがわかる。これは、関節炎のような他の炎症性疾患をもつド ナーの場合でも真実である。

以上の記載から１本発明の方法は提供者に悪性腫瘍がある場合に提供者の血液試 料をスクリーニングする簡単なテストを提供することがわかる。そのテストは比 較的少量の血液試料でよく、普通の技術をもった人によって行うことができる。

本発明は２、ジの実施態様を参押して記載説明されたけれども、請求の範囲内で 糧にの変化、変更があシうることを理解すべきである。

プラント賃（ 手　絖　補　正　書（方式） （審亘宮　殿） １、事件の表示 平成　年　願第　号 ＰＣＴ／ＵＳ８７１０３０５４ ２　発明−吟→の名称、指示商品の名分３、補正する者 事件との関係　特許出願人 ６、補正によシ増加する請求項の数　６〉堰用国際調査報告 １１１−＾　’　”’　？Ｃ’：／ＵＳ　８７１０３０５４国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトまたは動物の生体からの血液試料から得たリンパ球の懸濁液を螢光細胞 膜電位鋭敏物質と接触させて該膜電位鋭敏物質を前記リンパ球に結合させること によって該リパ球を標識化させる工程；前記リンパ球を螢光励起エネルギーの集 中源にそれぞれ通して該膜電位鋭敏物質に螢光を出させる工程； 前記リンパ球の各々からの螢光放射の強さを測定する工程； 前記リンパ球の螢光放射の強さに基いた２つのモードの分布曲線を作り、その曲 線から前記生体における悪性腫瘍の存在を示すところの高い方の螢光強度のリン パ球の数に対する低い方の螢光強度の数の比を決定する工程； から成ることを特徴とするヒトまたは動物における悪性腫瘍を決定する方法。
2. ２．前記膜電位鋭敏物質が、シアニン染料、メロシアニン染料およびオキソノー ル染料から成る群がら選択した螢光染料である請求項１記載の方法。
3. ３．前記膜電位鋭敏物質が、カルボシァニンジカルボシァニンおよびトリカルボ シアニン染料から成る群から選択したシアニン染料である請求項２記載の方法。
4. ４．前記膜電位鋭敏物質が３，３′−ジヘキシルオキサカルボシァニンてある請 求項３の方法。
5. ５．前記リンパ球の懸濁液はリン酸緩衝溶液の１ｍｌ当り約２×１０６細胞から 成る請求項１記載の方法。
6. ６．前記リンパ球の懸濁液は、リン酸緩衝溶液中に前記膜電位敏感物質２８６× １０６からなる溶液の等体積と混合させて、該混合体を前記物質の少なくとも一 部を前記リンパ球に結合させるのに十分な時間保持することから成る請求項１記 載の方法。
7. ７．前記混合体が少なくとも１０分間保持される請求項６記載の方法。
8. ８．前記励起エネルギー源がレーザー・ビームである請求項１記載の方法。
9. ９．前記レーザー・ビームは４８８ｎｍの波長を有する請求項８記載の方法。
10. １０．前記標識化リンパ球は適合性のシース流体の流動する流の中に注入されて 、前記リンパ球とシース流体の層状、同軸流を確立することによって、前記リン パ球を前記励起エネルギー源に通す前に前記流動流の中心部に個々の細胞として 拘束させる請求項１記載の方法。
11. １１．前記リンパ球の各々からの螢光放射の強さを電気的パルスに変換し、放射 の強さに正比例する高さを、横座標としてパルスの高さそして縦座標としてパル スのカウント数とした分布曲線上にプロツトし、該分布曲線が低い方の強度を示 す１つのピークと高い方の強度放射を示すもう１つのピークをもつた２つのモー ドである請求項１記載の方法。
12. １２．高い方の強度放射を示すピークにおけるパルスの数を低い方の強度放射を 示すピークにおけるパルスの数で割ることによつて、悪性腫瘍に侵されている生 体から得たリンパ球および悪性腫瘍を含まない生体から得たリンパ球の特徴を示 すα係数を得る請求項１記載の方法。
13. １３．悪性腫瘍に侵されている生体から得たりンパ球は２６以下のα係数を有す る請求項１２記載の方法。
14. １４．悪性腫瘍を含まない生体から得たりンパ球は２６以上のα係数を有する請 求項１２記載の方法。