JPH0562952B2

JPH0562952B2 -

Info

Publication number: JPH0562952B2
Application number: JP8753487A
Authority: JP
Inventors: Akinori Hara
Original assignee: Ortho Diagnostic Systems Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1987-04-09
Filing date: 1987-04-09
Publication date: 1993-09-09
Also published as: JPS63252251A

Description

【発明の詳細な説明】

［産業上の利用分野］本発明は、リンパ球の幼若化試験法に関し、特
にフローサイトメトリーを用いて螢光強度と細胞
数とのヒストグラムを求め、それからリンパ球の
正確な幼若化能を試験する方法に関する。［従来の技術］ウイルス等の外敵が体内に侵入すると、これを
特異的に攻撃する細胞が増殖して外敵を殺し、体
を守るという免疫能がある。この免疫の主体は白
血球であり、これにはリンパ球、単球及び顆粒球
があるが、中でもリンパ球が大きな役割を占め
る。免疫学的な刺激を受けていないリンパ球は形態
学的にも代謝的にも余り変化しないが、抗原刺激
を受けて免疫反応に関与するようになると形態学
的に変化し、核酸合成が活発になつて分裂、増殖
し（幼若化反応）、より機能的な免疫細胞へと分
化して、免疫反応を遂行する。細胞が分裂、増殖
する過程では有糸核分裂を繰り返すが、その際核
酸（デオキシリボ核酸（DNA）及びリボ核酸
（RNA）の合成が活発になる。そのうち特に
DNAの量を測定することにより、分裂増殖の度
合（幼若化の割合）を知ることができる。リンパ
球の幼若化能は、個人や病気により異なるので、
個人の免疫能を調べるための一つの指標となる。このようなリンパ球の幼若化現象を調べる際
に、特異抗原物質を用いる代りに、色々な抗原特
異性を有するリンパ球を全体的に刺激できる物質
（マイトジエン）を使用することが行われている。
マイトジエンを用いるリンパ球の幼若化試験法と
して、従来から種々の方法が行われている。リンパ球の幼若化が進行してDNAの合成が活
発化すると、核酸前駆物質の取込みが起る。そこ
で核酸前駆物質としてチミジン（Thymidine）
に³Hの放射性物質を結合させたものをリンパ球
に取込ませ、放射線強度を測定することにより、
リンパ球の幼若化反応を調べることができる
（「日本臨床」42巻、春季臨時増刊号（1984）第
1318頁乃至第1323頁）。しかし、測定に放射性物
質を用いるため、取扱いや廃液の処理が難かし
く、限られた施設でしか実施できない。また全て
のリンパ球をまとめて測定するため、個々の細胞
についての情報が得られない。さらに培養に用い
る細胞の濃度の調整が異なれば³H−Thymidine
の取込み量も変わり、継続的に採血した検体に対
して培養に用いる細胞の濃度に変化があれば、そ
れを補正しなければデータの解析ができないの
で、必然的に測定誤差が大きくなる。これに対し、DNAと特異的に結合する螢光色
素を用いて、刺激したリンパ球の螢光強度を測定
し、それから幼若化を調べる方法がある。螢光色
素としてエチジウム・ブロマイド（Ethdium
Bromide；EB）が広く用いられている。マィト
ジエンにより刺激したリンパ球を培養し、ソデイ
ウム・ドデシル・サルフエート（SDS）でリンパ
球を溶解し、EB溶液を添加し、螢光強度を測定
する（「日本臨床」42巻、春季臨時増刊号（1984）
第1323頁乃至第1327頁）。この方法は該酸−螢光
プローブ法と呼ぶことができる。一方、浮遊細胞のDNA量と細胞数との関係を
求めることができる方法として、フローサイトメ
トリー（Flow cytometry）が知られている
（「フローサイトメトリー−手技と実際−」応用
第226頁乃至第240頁）。フローサイトメトリーに
より細胞周期の各段階におけるDNA量がわかる。［発明が解決しようとする問題点］しかしながら、核酸−螢光プローブ法は放射性
物質を使用しないという利点を有するものの、全
リンパ球を溶解して測定するため、個々の細胞に
ついての情報が得られない。また生細胞のみでな
く死細胞も測定してしまうので、測定誤差の原因
となるという問題もある。また上記フローサイトメトリーでは細胞周期の
パターンがわかるが、それだけではリンパ球の幼
若化能を正確に解析することはできない。従つて、本発明の目的はリンパ球の幼若化能を
正確に検査することができる方法を提供すること
である。［問題点を解決するための手段］上記目的に鑑み鋭意研究の結果、本発明者は刺
激指数、細胞の増殖率及び細胞周期のDNA合成
期の百分率を全て解析しなければ正確に幼若化能
を調べることができず、そのうちのいずれか１つ
が欠けても信頼し得る結果が得られないことを発
見した。またこのようなパラメータを同時に得る
にはフローサイトメトリーを利用する必要があ
り、それにより螢光強度と細胞数との関係を示す
ヒストグラムを得、それから刺激指数、細胞の増
殖率及び細胞周期のDNA合成期の百分率を求め
ることができることを発見し、本発明に想到し
た。すなわち、本発明のリンパ球の幼若化試験法
は、リンパ球のDNAと結合する螢光色素を用い
てフローサイトメトリーにより螢光強度のヒスト
グラムを求め、前記ヒストグラムから刺激指数、
細胞の増殖率及び細胞周期のDNA合成期の百分
率を求め、これらのパラメータから前記リンパ球
の幼若化現象を解析することを特徴とする。本発明の幼若化試験法の手順は以下の通りであ
る。 (1) 全血からのリンパ球の分離採血した末梢血をリン酸緩衝生理食塩水
（PBS）で２〜３倍に希釈し、リンパ球分離液
に境界面が乱れないように静かに重層し、比重
遠心法によりリンパ球を分離する。リンパ球層
だけを分離し、必要に応じてPBSにより洗浄
して、リンパ球の浮遊液を作成する。 (2) リンパ球の培養リンパ球の培養液に刺激剤としてマイトジエ
ンを添加し、約37℃で３〜４日間培養を行う。
またコントロールとしてマイトジエンを添加し
ないものについても同様の培養を行う。マイトジエンとしてPhytohemagglutinin
（PHA）、ConcanavalinA（ConA）、Pokeweed
mitogen（PWM）等のレクチンや、
Lipopolysaccharide（LPS）、ProteinA等があ
る。マイトジエンはRPMI−1640等の培養液と
ともにリンパ球浮遊液に添加する。マイトジエンを加えたリンパ球は幼若化して
分裂、増殖過程に入るが、加えないもの（コン
トロール）には幼若化現象は実質的に起きな
い。なお、培養細胞を回収するためにリンパ球洗
浄遠心機を用いることにより、一定条件の遠心
法により上清を除去することが可能となり、リ
ンパ球の回収操作によるサンプル間の細胞数の
誤差が解消される。 (3) 螢光色素との結合培養後の検体を試験管に移し、PBS等によ
り洗浄し、トリスバツフアー等の媒体に再浮遊
させる。得られたリンパ球浮遊液中のリンパ球
の処理には２通りの方法がある。第１の方法は
トリトンＸ−100等の界面活性剤を添加して、
リンパ球の細胞核を分解することなく細胞膜だ
け溶解するものである。第２の方法は細胞膜に
穴をあけるために50％エタノール等の有機溶媒
（固定液）で処理するものである。いずれの方
法においても細胞核は破壊されないので細胞ご
との螢光強度を測定することができる。なお、
RNAについては分解酸素（RNase）により分
解する。以上のように処理したリンパ球（又はその細
胞核）のDNAに螢光色素を結合させる。螢光
色素としてはエチジウム・ブロマイド（EB）
が好適であり、蒸留水で至適濃度に溶解して添
加する。 (4) フローサイトメトリーによる測定上記リンパ球又はその細胞核のサンプルを一
定量吸引し、一定の割合で測定部に送る。測定
部では加圧したシース流によりサンプルを細い
流れに絞り、一列の細胞（又は細胞核）の流れ
を作り、光学測定部に送る。光学測定部ではレ
ーザー等の光が照射され、螢光色素と結合した
DNAを含有する細胞（又は細胞核）からは螢
光が発生する。この螢光による光信号は光検知
部により電気信号に変換され個々の細胞（又は
細胞核）の信号強度を記憶するとともに、２次
元又は１次元のヒストグラムとして表示する。 (5) 刺激指数、増殖率及びDNA合成期の百分率
の算出及び解析第１図は螢光強度（DNA量）と細胞数との
関係を表わすヒストグラムの概略図である。第
１図に基づき細胞の分裂増殖過程を以下に示
す。 (a) 休止期又は正常な細胞(A) DNA量は２ｃであり、G₀／G₁期と呼ばれ
る。 (b) 何らかの刺激を受ける。 (c) DNA量の増加期(B) ２ｃ＜DNA量＜４ｃであり、Ｓ期と呼ば
れる。 (d) 最終的に２倍のDNA量に達する(C)。 DNA量は４ｃであり、G₂／Ｍ期と呼ばれ
る。 (e) ２個の細胞に分裂する。 (a)〜′(e)を繰り返すことにより細胞の分裂、
増殖が進行する（細胞回転）。第１図のヒストグラムを積算すると、総螢光量
を求めることができる。従つて、下記の式により
刺激指数を求めることができる。刺激指数＝刺激サンプルの総螢光量／コントロール
の総螢光量……(1) 刺激指数が高い程刺激によつてDNA合成が盛
んに行われることを意味し、幼若化能が高いこと
になる。同じヒストグラムから、次式(2)により細胞の増
殖率を求めることができる。増殖率＝刺激サンプルの総細胞数／コントロールの
総細胞数……(2) 増殖率は細胞回転の速度を意味し、増殖率が高
い程細胞回転が速い。また、刺激しないサンプル（コントロール）で
はG₀／G₁期の細胞がほとんどであるが、刺激し
たサンプルではＳ＋G₂／Ｍ期の細胞が増加し、
幼若化率が高い程Ｓ＋G₂／Ｍ期の細胞が増える
が、一定の細胞回転に入ると、Ｓ＋G₂／Ｍ期は
一定の百分率を示す。従つて、Ｓ＋G₂／Ｍ期の
割合を求めることにより、逆に幼若化率を調べる
ことができる。このＳ＋G₂／Ｍ期の割合は下記
の式(3)により算出することができる。Ｓ＋G₂／Ｍ期（％）＝刺激サンプルのＳ期＋G₂／Ｍ期の細胞数／刺激サンプル
の全細胞数×100 ……(3) リンパ球の幼若化能は上記刺激指数、細胞の
増殖率及びＳ＋G₂／Ｍ期％を総合的に解析し
なければ正確にはわからない。具体的にいう
と、例えば刺激指数を詳細に解析するには増殖
率と細胞周期（Ｓ＋G₂／Ｍ期百分率）を解析
する必要がある。というのは、リンパ球の幼若
化機能が十分であればよいが、幼若化機能が低
下している場合と、一部のリンパ球の機能のみ
が低下している場合ではこれらのパラメータの
パターンが異なるからである。また細胞周期の
（Ｓ＋G₂／Ｍ期（％）だけでも幼若化能が低下
しているか亢進しているか正確にはわからな
い。というのは、細胞周期は細胞回転の一周期
におけるＳ＋G₂／Ｍ期の百分率を示すだけで
あり、細胞回転の速さ（増殖率）とともに検討
しなければ幼若化能はわからないからである。
さらに個々のリンパ球で幼若化機能が異なるこ
ともあるので、刺激指数だけでも正確な幼若化
能を知ることはできない。本発明においては、フローサイトメトリーに
よる螢光強度のヒストグラムの作成は、コンピ
ユータを使つた自動装置により行うことができ
るので、刺激指数、増殖率及びＳ＋G₂／Ｍ期
％の算出もコンピユータ（パソコン）により同
時に行うことができる。 (6) リンパ球の形態学的解析本発明においては細胞膜だけ溶解して、細胞
核は分解しないか、又は細胞膜に穴をあけるだ
けであるので、刺激による形態学的変化を観察
することができる。細胞はマイトジエンによる
刺激によりDNAの合成が盛んになると、大型
化するとともに内部構造が複雑化する。従つ
て、個々の細胞（又は細胞核）の前方散乱光
（細胞の大きさを表わす）と側方散乱光（内部
構造の複雑さを表わす）とをとつてサイトグラ
ムを作成すると、マイトジエン刺激による細胞
の形態学的変化を解析することができる。この
形態学的変化を上記３つのパラメータと組合せ
ると、一層正確に幼若化能を調べることができ
る。［実施例］本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明
する。実施例１ヘパリン加真空採血管に健常人の末梢血10mlを
取り、これを無菌のリン酸緩衝生理食塩水で２倍
に希釈し、比重を1.077に調整したフイコールコ
ンレイを用いて比重遠心法でリンパ球の分離を行
つた。分離したリンパ球はPBSにて３回洗浄後、１
×10⁶Cells／ml（培養至適濃度）になるように10
％FCS加RPMI−1640にて再浮遊した。この細胞
浮遊液を0.5mlづつ正確に減菌したカルチヤーチ
ユーブに分注した。これにマイトジエンとして
PHA10μｇ／mlを含む10％FCS加RPMI−1640を
0.5ml加え、コントロールサンプルには0.5mlの10
％FCS加RPMI−1640だけを加えた。このように
して作成したPHA刺激サンプル３本及びコント
ロールサンプル１本を、37℃の５％CO₂インキユ
ベーターにより、72時間培養した。培養後リンパ球洗浄遠心機を用いて1500rpm
（400G）で７分間遠心後、260rpmで50秒間遠心
して上清を除去した。上清を除去した細胞のペレ
ツトに0.02％のEB溶液0.15mlとPH7.6のトリスバ
ツフアー0.2mlおよび0.1％のトリトンＸ−100溶
液を２ml加え、４℃で20分間放置し、細胞膜を溶
解した。その後レーザー・フローサイトメトリ
ー・システム（「オーソ・スペクトラム」、オー
ソ・ダイアグノステイツク・システムズInc.製）
を用いて、フローサイトメトリーによる測定を行
つた。EB−DNA複合体から発する螢光は赤色螢
光であつた。測定順序としては、まずコントロールサンプル
の測定から行い、前方散乱光と側方散乱光とのサ
イトグラム上において目的の細胞核の領域を設定
し、その領域内の細胞核について、EB−DNAの
螢光を換算（Red）パラメータで測定した。この
際、細胞周期の休止期が螢光強度の50〜90チヤン
ネルの中央に立つように、換算値のグラフを設定
した。また測定値は連動するパソコン
（NEC9801M）に入力した。続いて、PHAで刺激したサンプルを測定し、
同様に測定値をパソコンに入力した。そして、コ
ンピユータの処理によつて、コントロール１本の
総螢光量（総DNA量）とPHA刺激の３本のサン
プルの平均の総螢光量（総DNA量）の比により
刺激指数、コントロールとPHA刺激サンプルの
細胞数より増殖率、及びPHA刺激のEBの螢光
（EBの螢光量はDNA量に比例する）の図形によ
り、細胞周期のDNA合成期の百分率をそれぞれ
求めた。その結果を表１に示す。またコントロー
ルサンプル及びPHA刺激サンプルについて得ら
れた細胞周期及びサイトグラムをそれぞれ第２Ａ
図乃至第３Ｂ図に示す。

【表】以上の結果において、SI＝4.10、GR＝2.83及
びＳ＋G₂／Ｍ期（％）＝29.5はいずれも正常域で
ある。実施例２担癌患者20名を対象とし、実施例１と同一の手
順でフローサイトメトリーにより総螢光量を求め
た。また同一のリンパ球サンプルについて従来の
³H−thymidine法により³H−thymidineの取込み
量（cpm）を測定した。両者の関係を第４図に示
す。第４図から明らかなように、両者の相関性は
γ＝0.700と比較的良好であつた。実施例３健常人15名を対象とし、実施例１と同一の手順
でフローサイトメトリーにより総螢光量を求め、
刺激指数（SI）を算出した。また同一のリンパ球
サンプルについて、従来の螢光光度計を用いた核
酸−螢光プローブ法（EB法）により螢光強度を
測定し、SI値を求めた。両方法により求めたSI値
の相関関係を第５図に示す。その結果、γ＝0.92
と極めて良好な相関が認められた。実施例４実施例１と同様の手順で、健常人44名及び担癌
患者77名を対象としてPHA刺激試験を行つた。
担癌患者の内訳は胃癌が14名、食道癌が３名、直
腸癌が５名、卵巣癌が18名、乳癌が11名、肺癌が
26名であつた。健常人ではSI＝2.87±0.56、GR＝2.11±0.35
（29名）及びＳ＋G₂／Ｍ期（％）＝36.5±8.08（％）
（29名）であつた。一方、担癌患者ではSI＝2.11
±0.79、GR＝1.41±0.36（52名）及びＳ＋G₂／Ｍ
期（％）＝33.3±15.8（％）（52名）であつた。こ
れらの結果から、担癌患者は健常人に比べ、SI及
びGRともに低値を示し、危険率0.001で有意差が
認められた。しかし、Ｓ＋G₂／Ｍ期の百分率で
は有意差は認められなかつた。しかし担癌患者の
SI≧2.11（Ｓ＋G₂／Ｍ期（％）＝39.1±10.2）とSI
＜2.11（Ｓ＋G₂／Ｍ期（％）＝23.3±13.1）のＳ＋
G₂／Ｍ期の百分率では有意差が認められた。実施例５健常人２名について、実施例１と同様のフロー
サイトメトリーによる幼若化試験を行つた。結果
を下記の表２に示す。

【表】以上の通り、両者のSI値はほぼ同じであるが、
増殖率及びＳ＋G₂／Ｍ期（％）は異なつている。
これは個々の細胞の細胞周期の違いにより生ずる
ものと考えられる。このように、SI値が同じであ
つても増殖率及びＳ＋G₂／Ｍ期（％）が異なる
ことがあるので、これらのパラメータを総合的に
解析しなければならない。実施例６疾患者３名について、実施例５と同様の比較試
験を行つた。結果を表３に示す。

【表】いずれについてもSI値は低い値を示し、幼若化
能が低下していることが認められる。Ｃ及びＤに
ついては細胞数が僅かに増加しているので、ごく
一部の細胞は正常な機能を有していると認められ
る。一方Ｅについては、増殖率が１より小さいの
で、細胞数が減少していることがわかる。ところ
が、Ｓ＋G₂／Ｍ期（％）が26.3と比較的大きいの
で、合成期の細胞も存在する。以上の結果から、
刺激によつて細胞障害を受けやすい細胞と幼若化
能の低下した細胞とが存在することがわかる。実施例７本例はＳ＋G₂／Ｍ期（％）がほぼ同値を示す
検体についての比較を示す。健常人２名について実施例１と同様にフローサ
イトメトリーにより刺激指数、増殖率及びＳ＋
G₂／Ｍ期（％）を求めた。結果を表４に示す。

【表】Ｓ＋G₂／Ｍ期（％）については、被検者Ｆと
Ｇのサンプルはほぼ同値を示すが、刺激指数及び
増殖率についてはＨの方がはるかに高い。これは
個人によつて細胞回転の速度に差があることを意
味する。実施例８本例はSI値が１（PHA未刺激コントロールサン
プルとPHA刺激サンプルのDNA量が同量）の場
合についての検討を示す。被検者Ｈについて、実施例１と同様の幼若化試
験を行なつた。結果を表５に示す。

【表】以上の結果から、SI値が1.01とほぼ１であるの
でPHA刺激により細胞は幼若化していないよう
に思われるが、Ｓ＋G₂／Ｍ期（％）が12.5％であ
るので、DNA合成期の細胞があることがわかる。
しかし、増殖率を見ると0.92と細胞数が減少して
いる。以上のことからPHAが一部のリンパ球に
細胞障害性を示すことがわかる。実施例９本例は増殖率が１の場合についての検討を示
す。被検者について実施例１と同様の幼若化試験
を行つた。結果を表６に示す。

【表】増殖率が1.00であるので、細胞数の変化はない
が、Ｓ＋G₂／Ｍ期（％）は11.6％と低値を示して
いるので、PHAによる細胞障害は認められない。
しかし、SI値が低いので全体の細胞の幼若化能が
低下しているものと考えられる。［発明の効果］以上の通り、本発明のフローサイトメトリーに
よるリンパ球の幼若化試験法によれば、細胞（又
は細胞核）を破壊せずにDNAを螢光色素で染色
し、１個づつの細胞のDNA量を測定することに
よりヒストグラム（細胞周期）を作成し、これか
ら積算処理により得られる総螢光量から刺激指数
（SI）を求めるため、死細胞を除外した領域（生
細胞領域）だけからSI値を求めることができ、測
定誤差が少なく、再現性が良い。また細胞数をカ
ウントするので増殖率を得ることができ、さらに
細胞周期が得られるので、DNA合成期（Ｓ＋
G₂／Ｍ期）の割合を求めることができる。その
上、前方散乱光と90°散乱光のサイトグラムから、
細胞（又は細胞核）の形態学的変化も観察するこ
とができる。このように本発明の方法により、リンパ球の幼
若化反応を複数のパラメータで詳細に検討するこ
とができるので、正確な幼若化試験を行うことが
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法により得られる螢光強度
−細胞数のヒストグラムを概略的に示す図であ
り、第２Ａ図はコントロールサンプルの螢光強度
−細胞数のヒストグラムであり第２Ｂ図はPHA
刺激サンプルの螢光強度−細胞数のヒストグラム
であり、第３Ａ図はコントロールサンプルの細胞
核の形態学的変化を示すサイトグラムであり、第
３Ｂ図はPHA刺激サンプルの細胞核の形態学的
変化を示すサイトグラムであり、第４図は本発明
の方法と³H−thymidine法との相関関係を表わす
グラフであり、第５図は本発明の方法と核酸−螢
光プローブ法との相関関係を表わすグラフであ
る。

Claims

【特許請求の範囲】１リンパ球のDNAと結合する螢光色素を用い
てフローサイトメトリーにより螢光強度のヒスト
グラムを求め、前記ヒストグラムから刺激指数、
細胞の増殖率及び細胞周期のDNA合成期の百分
率を求め、これらのパラメータから前記リンパ球
の幼若化現象を解析することを特徴とするリンバ
球の幼若化試験法。２特許請求の範囲第１項に記載の方法におい
て、前記刺激指数は、前記ヒストグラムを積算す
ることにより総螢光量を求め、それと未刺激のコ
ントロールの総螢光量との比をとることにより求
めることを特徴とする方法。３特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方
法において、前記リンパ球の幼若化用刺激物質と
して、フイトヘマグルチニン（PHA）、コンカナ
バリンＡ（conA）およびポークウートマイトジエ
ン（PWM）などのマイトジエンを使用すること
を特徴とする方法。４特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか
に記載の方法において、前記リンパ球を刺激する
前に細胞膜を溶解するが細胞核は破壊しない物質
で処理することを特徴とする方法。５特許請求の範囲第４項に記載の方法におい
て、前記細胞膜溶解物質がトリトンＸ−100であ
ることを特徴とする方法。６特許請求の範囲第４項又は第５項に記載の方
法において、前記細胞核の形態学的変化をあわせ
て測定することにより、幼若化現象を解析するこ
とを特徴とする方法。７特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれか
に記載の方法において、前記リンパ球を刺激する
前に細胞膜に穴をあける物質で処理することを特
徴とする方法。８特許請求の範囲第７項に記載の方法におい
て、前記細胞膜に穴をあける物質がエタノールで
あることを特徴とする方法。９特許請求の範囲第７項又は第８項に記載の方
法において、前記リンパ球の形態学的変化をあわ
せて測定することにより、幼若化現象を解析する
ことを特徴とする方法。１０特許請求の範囲第１項乃至第９項のいずれ
かに記載の方法において、培養上清の除去にリン
パ球洗浄遠心機を用いることを特徴とする方法。