JPS63252251A - フロ−サイトメトリ−によるリンパ球の幼若化試験法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は、リンパ球の幼若化試験法に関し、特にフロー
サイトメトリーを用いて螢光強度と細胞数とのヒストグ
ラムを求め、それからリンパ球の正確な幼若化能を試験
する方法に関する。

［従来の技術１ ウィルス等の外敵が体内に侵入すると、これを特異的に
攻撃する細胞が増殖して外敵を殺し、体を守るという免
疫能がある。この免疫の主体は白血球であり、これには
リンパ球、単球及び顆粒球があるが、中でもリンパ球が
大きな役割を占める。

免疫学的な刺激を受けていないリンパ球は形態学的にも
代謝的にも余り変化しないが、抗原刺激を受けて免疫反
応に関与するようになると形態学的に変化し、核酸合成
が活発になって分裂、増殖しく幼若化反応）、より機能
的な免疫細胞へと分化して、免役反応を遂行する。細胞
が分裂、増殖する過程では有余核分裂を繰り返すが、そ
の際核酸（デオキシリポ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（
ＲＮＡ）＋の合成が活発になる。

そのうち特にＤＮＡの吊を測定することにより、分裂増
殖の度合（幼若化の割合）を知ることができる。リンパ
球の幼若化能は、個人や病気により異なるので、個人の
免疫能を調べるための一つの指標となる。

このようなリンパ球の幼若化現象を調べる際に、特異抗
原物質を用いる代りに、色々な抗原特異性を有するリン
パ球を全体的に刺激できる物質（マイトジェン）を使用
することが行われている。マイトジェンを用いるリンパ
球の幼若化試験法として、従来から種々の方法が行われ
ている。

リンパ球の幼若化が進行してＤＮＡの合成が活発化する
と、核酸前駆物質の取込みが起る。

そこで核酸前駆物質としてチミジン（Ｔｈｙｍｉｄｉｎ
ｅ）に３Ｈの放射性物質を結合させたものをリンパ球に
取込ませ、放射線強度を測定することにより、リンパ球
の幼若化反応を調べることができる（「日本臨床」４２
巻、春季臨時増刊号（１９８４）第１３１８頁乃至第１
３２３頁）。

しかし、測定に放射性物質を用いるため、取扱いや廃液
の処理が難かしく、限られた施設でしか実施できない。

また全てのリンパ球をまとめて測定するため、個々の細
胞についての情報が冑られない。さらに培養に用いる細
胞の濃度の調整が異なれば３Ｈ−Ｔｈｙｎｉｄｉｎｅの
取込み最も変わり、継続的に採血した検体に対してｊｉ
！Ｓｌに用いる細胞の濃度に変化があれば、それを補正
しなければデータの解析ができないので、必然的に測定
誤差が大きくなる。

これに対し、ＤＮＡと特異的に結合する螢光色素を用い
て、刺激したリンパ球の螢光強度を測定し、それから幼
若化を調べる方法がある。

螢光色素としてエチジウム・ブロマイド（Ｅｔｈ−ｄｉ
ｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ；　ＥＢ）が広く用いられている
。マイトジェンにより刺激したリンパ球を培養し、ソデ
ィウム・ドデシル・サルフェート（ＳＤＳ）でリンパ球
を溶解し、Ｅ８溶液を添加し、螢光強度を測定する（「
日本臨床」４２巻、春季臨時増刊号（１９８４）第１３
２３頁乃至第１３２７頁）。この方法は核酸−螢光プロ
ーブ法と呼ぶことができる。

一方、浮遊細胞のＤＮＡｆｆ１と細胞数との関係を求め
ることかできる方法として、フローサイトメトリー（Ｆ
ｌｏｗ　ＣＶｔ０１ｌＯｔｒ１７）が知られている（［
フローサイトメトリー−手技と実際−」■応用第２２６
頁乃至第２４０頁）。フローサイトメトリーにより細胞
周期の各段階におけるＤＮＡ量がわかる。

［発明が解決しようとする問題点１ しかしながら、核酸−螢光プローブ法は放射性物質を使
用しないという利点を有するものの、全リンパ球を溶解
して測定するため、個々の細胞についての情報が得られ
ない。また生細胞のみでなく死細胞も測定してしまうの
で、測定誤差の原因となるという問題もある。

また上記フローサイトメトリーでは細胞周期のパターン
がわかるが、それだけではリンパ球の幼若化能を正確に
解析することはできない。

従って、本発明の目的はリンパ球の幼若化能を正確に検
査することができる方法を提供することである。

［問題点を解決するための手段］ 上記目的に鑑み鋭意研究の結果、本発明者は刺激指数、
細胞の増殖率及び細胞周期のＤＮＡ合成期の百分率を全
て解析しなければ正確に幼若化能を調べることができず
、そのうちのいずれか１つが欠けても信頼し得る結果が
得られないことを発見した。またこのようなパラメータ
を同時に得るにはフローサイトメトリーを利用する必要
があり、それにより螢光強度と細胞数との関係を示すヒ
ストグラムを得、それから刺激指数、細胞の増殖率及び
細胞周期のＤＮＡ合成期の百分率を求めることができる
ことを発見し、本発明に想到した。

すなわち、本発明のリンパ球の幼若化試験法は、リンパ
球のＤＮＡと結合する螢光色素を用いてフローサイトメ
トリーにより螢光強度のヒストグラムを求め、前記ヒス
トグラムから刺激指数、細胞の増殖率及びＩＩ胞同周期
ＤＮＡ合成期の百分率を求め、これらのパラメータから
前記リンパ球の幼若化現象を解析することを特徴とする
。

本発明の幼若化試験法の手順は以下の通りである。

（１）全血からのリンパ球の分離 採血した末梢血をリンｌ緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２
〜３倍に希釈し、リンパ球分離液に境界面が乱れないよ
うに静かに１層し、比重遠心法によりリンパ球を分離す
る。リンパ球層だけを分離し、必要に応じてＰＢＳによ
り洗浄して、リンパ球の浮遊液を作成する。

（２）リンパ球の培養 リンパ球の培養液に刺激剤としてマイトジェンを添加し
、約３７℃で３〜４日間培養を行う。またコントロール
としてマイトジェンを添加しないものについても同様の
培養を行う。

マイトジェンとしてＰｈ’／１ｏｈｅｌｌａＱＩＪｌｔ
ｌｔｉｎｉｎ（ＰｌｌＡ）　、Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉ
ｎＡ　（Ｃｏｎ　Ａ）　、Ｐｏｋｅｗｅｅｄｎｉｔｏｇ
ｅｎ　　（ＰＷＭ　）等のレクチンや、Ｌｉｐｏ−ｐｏ
ｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　（Ｌ　Ｐ　Ｓ　）　、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ　Ａ等がある。マイトジェンはＲＰＭＩ−１
６４０等の培養液とともにリンパ球浮遊液に添加する。

マイトジェンを加えたリンパ球は幼若化して分裂、増殖
過程に入るが、加えないもの（コントロール）には幼若
化現象は実質的に起きない。

なお、塩１１細胞を回収するためにリンパ球洗浄遠心機
を用いることにより、一定条件の遠心法により上清を除
去することが可能となり、リンパ球の回収操作によるサ
ンプル間のｌ［ｌＩＩ！数の誤差が解消される。

（３）螢光色素との結合 培養後の検体を試験管に移し、ＰＢＳ等により洗浄し、
トリスバッファー等の媒体に再浮遊させる。得られたリ
ンパ球ｖｐＭ液中のリンパ球の処理には２通りの方法が
ある。第１の方法はトリトンＸ−１００等の界面活性剤
を添加して、リンパ球の細胞核を分解することなく細胞
膜だけ溶解するものである。第２の方法は細胞膜に穴を
あけるために５０％エタノール等の有ａｍ媒（固定液）
で処理するものである。いずれの方法においても細胞核
は破壊されないので細胞ごとの螢光強度を測定すること
ができる。なお、 ＲＮＡについては分解酸素（ＲＮａｓｏ）により分解す
る。

以上のように処理したリンパ球（又はそのｊ！ｌ　（ｌ
１ｗ７１核）のＤＮＡに螢光色素を結合させる。

螢光色素としてはエチジウム・ブロマイド（［Ｂ）が好
適であり、蒸留水で至適濃度に溶解して添加する。

（４）フローサイトメトリーによる測定上記リンパ球又
はその細胞核のサンプルを一定吊吸引し、一定の割合で
測定部に送る。

測定部では加圧したシース流によりサンプルを細い流れ
に絞り、−列の細胞（又は細胞核）の流れを作り、光学
測定部に送る。光学測定部ではレーザー等の光が照射さ
れ、螢光色素と結合したＤＮＡを含有するＩｌｌ胞（又
は細胞核）からは螢光が発生する。この螢光による光信
号は光検知部により電気信号に変換され、個々の細胞（
又は細胞核）の信号強度を記憶するとともに、２次元又
は１次元のヒストグラムとして表示する。

（５）刺激指数、増殖率及びＤＮＡ合成期の百分率の綽
出及び解析 第１図は螢光強度（ＤＮＡｆｆｉ）と細胞数との関係を
表わすヒスｉ・ダラムの概略図である。

第１図に基づき細胞の分裂増殖過程を以下に示す。

（ａ）休止期又は正常な細胞（Ａ） ＤＮ／１ｍは２Ｃであり、Ｇ　ｏ　／　Ｇ　１期と呼ば
れる。

（ｂ）何らかの刺激を受ける。

（ｃ）　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｍ（７）ＸＩＩＩＩＩＩＪＩ　（
Ｂ　）２ｃ＜ＤＮＡ吊＜４ｃであり、８期と呼ばれる。

（ｄ）　Ｒ終的に２倍のＤＮＡｆｆ１に達する（Ｃ）。

ＤＮＡｆｆ１は４ｃであり、Ｇ　ｅ　／　Ｍ期と呼ばれ
る。

（ｅ）２個の細胞に分裂する。

（ａ）〜゛（０）を繰り返すことにより細胞の分裂、増
殖が進行する（細胞回転）。

−第１図のヒストグラムを積算すると、総螢光量を求め
ることができる。従って、下記の式により′刺激指数を
求めることができる。

刺激サンプルの総螢光量 刺ｆｉ　ｌ　ｍ　＝　　コントロールの総螢光量　°ｒ
１）刺激指数が高い程刺激によ・ってＤＮＡ合成が盛ん
に行われることを意味し、幼若化能が高いことになる。

同じヒストグラムから、次式（２）により細胞の増殖率
を求めることができる。

刺激サンプルの総細胞数 増殖率＝　　コントロールの総細胞数−−−−°−（２
）増殖率は細胞回転の速度を意味し、増殖率が高い程細
胞回転が速い。

また、刺激しないサンプル（コントロール）では００７
０１期の細胞がほとんどであるが、刺激したサンプルで
はＳ　＋　Ｇ　ｅ　／　Ｍ期の細胞が増加し、幼若化率
が高い程Ｓ　＋　Ｇ　２／　Ｍ期の細胞が層えるが、一
定の細胞回転に入ると、Ｓ十〇　ｅ　／　Ｍ期は一定の
百分率を示す。従って、Ｓ十Ｇ　ｅ　／　Ｍ期の割合を
求めることにより、逆に幼若化率を調べることができる
。このＳ　＋　Ｑ　＠／Ｍ期のに］合は下記の式（３）
により算出することができる。

３−ト　Ｇ　　ｔ　　／　　Ｍ　　期　　（％　）　　
＝刺激サンプルのＳ期十Ｇ　ｔ　／　Ｍ期の細胞数刺激
サンプルの全細胞数 ×１００・・・・・・・・・（３） リンパ球の幼若化能は上記刺激指数、細胞の増殖率及び
Ｓ　＋　Ｇ　ｅ　／　Ｍ期％を総合的に解析しなければ
正確にはわからない。具体的にいうと、例えば刺激指数
を詳細に解析するには増殖率と細胞周期（Ｓ　＋　Ｇ　
ｅ　／　Ｍ期百分率）を解析する必要がある。というの
は、リンパ球の幼若化機能が十分であればよいが、幼若
化機能が低下している場合と、一部のリンパ球の機能の
みが低下している場合ではこれらのパラメータのパター
ンが異なるからである。また細胞周期の（Ｓ＋　Ｇ　ｅ
　／　Ｍ期（％）だけでも幼若化能が低下しているか九
進しているか正確にはわからない。

というのは、細胞周期は細胞回転の一周期におけるＳ　
＋　Ｇ　２／　Ｍ期の百分率を示すだ（）であり、細胞
回転の速さく増殖率）とともに検討しなければ幼若化能
はわからないからである。さらに個々のリンパ球で幼若
化機能が異なることもあるので、刺激指数だけでも正確
な幼若化能を知ることはできない。

本光明においては、フローサイトメトリーによる螢光強
度のヒストグラムの作成は、コンビ１−夕を使った自動
Ｑｌｆにより行うことができるので、刺激指数、増殖率
及びＳ　＋　Ｇ　２　／　Ｍ期％の算出もコンピュータ
（パソコン）により同時に行うことができる。

（６）リンパ球の形態学的解析 本発明においては細胞膜だＧＪ溶解して、ＩＩ！胞核は
分解しないか、又は細胞膜に穴をあけるだけであるので
、刺激による形態学的変化を観察することができる。Ｉ
ｌｌ胞はマイトジェンによる刺激によりＤＮＡの合成が
盛んになると、大型化するとともに内部構造が複雑化す
る。従って、個々のＩＩ胞（又は細胞核）の前方散乱光
（ＩＩｌ胞の大きさを表わす）と側方散乱光（内部構造
の複雑さを表わす）とをとってサイトグラムを作成する
と、マイトジェン刺激による細胞の形態学的変化を解析
することができる。この形態学的変化を上記３つのパラ
メータと粗合せると、一層正確に幼若化能を調べること
ができる。

［実施例］ 本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。

１１盟ユ ヘパリン加真窄採面管に健常人の末梢血１０Ｉｄを取り
、これを無菌のリン１ｌａｌ衝生理食塩水で２倍に希釈
し、比重を１．０７７に調整したフィコールコンレイを
用いて比重遠心法でリンパ球の分離を行った。

分離したリンパ球はＰＢＳにて３回洗浄後、１ｘ　１０
８Ｃｅｌｌｓ　／ｍ！　（培養至適ｍ度）になるように
１０％ＦＣ８７ＪＤＲＰＭｌ−１６４０にて再浮遊した
。この細胞浮遊液を０．５ｄづつ正確に減菌したカルチ
ャーチューブに分注した。これにマイトジェンとしてＰ
ＨＡ１０μｇ／１１１！を含む１０％１”Ｃ８７ＪｎＲ
ＰＣ８７ＪｎＲＰを０．５ｄ加え、コントロールサンプ
ルには０．５ｄの１０％ＦＯ８加ＲＰＭＩ−１６４０．
７．’りを加えた。このようにして作成したＰ）−ＩＡ
刺激ザンブル３本及びコントロールサンプル１本を、３
７℃の５％ＣＯｅインキュベーターにより、７２時間培
養した。

培ｌ復リンパ球洗浄遠心機を用いて１５００ｒｐｍ（４
００Ｇ＞で７分間遠心俊、２６０ｒｐｍで５０秒間遠心
して上清を除去した。上溝を除去した細胞のベレットに
０．０２％のＥ［３溶液０゜１５ｄとＰＨ７，６のトリ
スバッフＦ−０，２Ｉｄおよび０．１％のトリトンＸ−
１００溶液を２−加え、４℃で２０分間放置し、細胞膜
を溶解した。

その後レーザー・フローサイトメトリー・システム（［
オーツ・スペクトラムＩＪ、オーツ・ダイアグノスティ
ック・システムズＩｎｃ、製）を用いて、フローサイト
メトリーによる測定を行った。ＥＢ−ＤＮＡ複合体から
発する螢光は赤色螢光であつ１こ　。

測定順序としては、まずコントロールサンプルの測定か
ら行い、前方散乱光と側方散乱光とのサイトグラム上に
おいて目的のＩＩＩ胞核の領域を設定し、その領域内の
細胞核について、ＥＢ−ＤＮＡの螢光を換Ｗ（Ｒｅｄ）
パラメータで測定した。

この際、ＩＩ胞同周期休止期が螢光強度の５０〜９０チ
ヤンネルの中央に立つように、換輝値のグラフを設定し
た。また測定値は連動するパソ′コン（ＮＥＣ９８０１
Ｍ）に入力した。

続いて、ＰＩＩＡで刺激したサンプルを測定し、同様に
測定値をパソコンに入力した。そして、コンピュータの
処理によって、コントロール１本の総置光１ｍ　（ｔＱ
ＤＮＡｆｆｌ）　、！＝ＰＨＡｉｉｌＪ１１１１ノ３本
ノサンブルの平均の総螢光量（総ＤＮＡｆｆ１＞の比に
より刺激指数、コントロールとＰＨＡ刺激サンプルの細
胞数より増殖率、及びＰＨＡ刺激のＥＢの螢光（Ｅ（３
の螢光量はＤＮＡ量に比例する）の図形により、細胞周
期のＤＮＡ合成合成内分率をそれぞれ求めた。その結果
を表１に示す。またコントロールサンプル及びＰ　ＨＡ
　ｉｔ’ｌｌ　ｌサンプルについて得られた細胞周期及
びサイトグラムをそれぞれ第２Ａ図乃至第３Ｂ図に示す
。

表１ 以上の結果において、Ｓ夏＝４．１０．ＧＲ＝２．８３
及びＳ　＋　Ｇ　２　／　Ｍ期（％）＝２９．５はいず
れも正常域である。

実施例２ 担癌患者２０名を対象とし、実施例１と同一の手順でフ
ローサイトメトリーによりａｌｆｆｉｆｆｉを求めた。

また同一のリンパ球サンプルについて従来の３１１−ｔ
ｈｙ１ｄｉｎｅ法により３１］−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅの
取込みｆｆｉ（ＣＤｍ）を測定した。両者の関係を第４
図に、示す。第４図から明らかなように、両者の相関性
イはγ＝０．７００と比較的良好であった。

Ｋ皿！ユ 健常人１５名を対象とし、実施例１と同一の手順でフロ
ーサイトメトリーにより総螢光量を求め、刺激指数（＄
１）を算出した。また同一のリンパ球サンプルについて
、従来の螢光光度討を用いた核酸−螢光プローブ法（Ｅ
Ｂ法）により螢光強度を測定し、Ｓｔ値を求めた。両方
法により求めた８１値の相関関係を第５図に示す。その
結果、γ＝０．９２と極めて良好な相関が認められた。

１１旦１ 実施例１と同様の手順で、健常人４４名及び担癌患者７
７名を対象としてＰ　１１　Ａ刺激試験を行った。担癌
患者の内訳は胃癌が１４名、食′ｉ３癌が３名、直腸癌
が５名、卵ＩＡＷ１が１８名、乳癌が１１名、肺癌が２
６名であった。

健常人ではＳ夏＝２．８７±０．５６、ＧＲ＝２．１１
±０．３５　（２９名）及びＳ　十Ｇ　ｅ　／　Ｍ期（
％）＝３６．５±８．０８　（％）（２９名）であった
。一方、担癌患者では５Ｉ＝２．１１±０．７９、ＧＲ
＝１．４１±０．３６　（５２名）及びＳ　＋　Ｇ　ｔ
　、／　Ｍ期（％）＝３３．３±１５．８（％）　（５
２名）であった。これらの結果から、１！ｗ１患者は健
常人に比べ、Ｓｔ及びＧＲともに低値を示し、危険率０
．００１で有意差が認められた。しかし、Ｓ＋Ｇｔ１Ｍ
期の百分率では有意差は認められなかった。しかし担癌
患者のＳｔ≧２゜１１＜Ｓ＋Ｇｅ／Ｍ期（％）＝３９．
１±１０゜２）と８１　＜２．１１　（Ｓ＋Ｇｅ／Ｍ期
（％）＝２３．３±１３．１＞のＳ　＋　Ｇ　ｅ　／　
Ｍ期の百分率では有意差が認められた。

友亙旦１ 健常人２名について、実施例１と同様のフローサイトメ
トリーによる幼若化試験を行った。結果を下記の表２に
示す。

表２ 以上の通り、両者の８１値はほぼ同じであるが、増殖率
及びＳ　＋　Ｇ　ｔ　／　Ｍ期（％）は異なっている。

これは個々の細胞の細胞周期の違いにより生ずるものと
考えられる。このように、ＳＩ値が同じであっても増殖
率及びＳ　十Ｇ　２／　Ｍ期（％）が異なることがある
ので、これらのパラメータを総合的に解析しなければな
らない。

友ｉ旦１ 疾忠者３名について、実施例５と同様の比較試験を行っ
た。結果を表３に示す。

表３ いずれについても５ｌｌａは低い値を示し、幼若化能が
低下していることが認められる。Ｃ及びＤについては［
！Ｉ’ａ数が僅かに増加しているので、ごく一部の細胞
は正常な機能を有していると認められる。

一方Ｅについては、増殖率が１より小さいので、［１１
１ａ数が減少していることがわかる。ところが、Ｓ　＋
　Ｇ　ｅ　／　Ｍ期（％）が２６．３と比較的大きいの
で、合成期の細胞も存在する。以上の結果から、刺激に
よって細胞障害を受けやすい細胞と幼若化能の低下した
細胞とが存在することがわかる。

実施例７ 本例はＳ　＋　Ｇ　２　／　Ｍ期（％）がほぼ同値を示
す検体についての比較を示す。

社常人２名について実施例１と同様にフローサイトメト
リーにより刺激指数、増殖率及びＳ＋Ｇ２／ＭＩＩＩＪ
（％）を求めた。結果を表４に示す。

表４ ・　　Ｓ　十Ｇ　２／　Ｍ期（％）については、被検Ｉ
ＦとＧのサンプルはほぼ同値を示すが、刺激指数及び増
殖率については１」の方がはるかに高い。これは個人に
よって細胞回転の速度に差があることを意味する。

実施例８ 本例は８１値が１（ＰＩ−ＩＡ未１１ｉ１ＪＩＩｋコン
トロールサンプルとＰ　ＨＡ　１１４Ｊ　？ｌｌｌサン
プルのＤＮＡ量が開開）の場合についての検討を示す。

被検者１］について、実施例１と同様の幼若化試験を行
なった。結果を表５に示す。

表５ 以上の結果から、Ｓｔ値が１．０１とほぼ１であるので
ＰＨＡ　ＹＩＪ激によりＩ［細胞は幼若化していないよ
うに思われるが、Ｓ＋Ｇｇ／Ｍ期（％）が１２．５％で
あるので、ＤＮＡ合成期のｌＷＩ胞があることがわかる
。しかし、増殖率を見ると０．９２とＩＩＩ胞数が減少
している。以上のことからＰ　Ｈ八が一部のリンパ球に
細胞障害性を示すことがわかる。

友１璽ユ 本例は増殖率が１の場合についての検討を示す。

被検＠Ｉについて実施例１と同様の幼若化試験を行った
。結果を表６に示す。

表６ 増殖率が１．００であるので、細胞数の変化はないが、
Ｓ　＋　Ｇ　ｅ　／　Ｍ期（％）は１１．６％と低値を
示しているので、ＰＨＡによる細胞障害は認められない
。しかし、５Ｉｉｆｉが低いので全体の細胞の幼若化能
が低下しているものと考えられる。

［発明の効果］ 以上の通り、本発明のフローサイトメトリーによるリン
パ球の幼若化試験法によれば、細胞（又は細胞核）を破
壊せずにＤＮＡを螢光色素で染色し、１ｇづつの細胞の
ＤＮＡＩを測定することによりヒストグラム（細胞周期
）を作成し、これから１ａ輝処理により得られる総螢光
量から刺激指数（８１）を求めるため、死細胞を□除外
した領域（生ｌｌｌｌ１１領域）だｔプから８１値を求
めることができ、測定誤差が少なく、再現性が良い。ま
た細胞数をカウントするので増殖率を得ることができ、
さらに細胞周期が得られるので、ＤＮＡ合成期（Ｓ＋Ｇ
＊／Ｍ期）の割合を求めることができる。

その上、前方散乱光と９０°散乱光のサイトグラムから
、１ｌｌｌＡ（又は細胞核）の形態学的変化も観察する
ことができる。

このように本発明の方法により、リンパ球の幼若化反応
を複数のパラメータで詳ｍｌに検討することができるの
で、正確な幼若化試験を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法により得られる螢光強度−細胞数
のヒストグラムを概略的に示す図であり、第２Ａ図はコ
ントロールサンプルの螢光強度−細胞数のヒストグラム
であり 第２Ｂ図はＰ　ＨＡ　ｉ’ｌＪ　ｍサンプルの螢光強度
−細胞数のヒストグラムであり、 第３Ａ図はコントロールサンプルの細胞核の形態学的変
化を示すサイトグラムであり、第３Ｂ図はＰＨＡ刺激サ
ンプルの細胞核の形態学的変化を示すサイトグラムであ
り、 第４図は本発明の方法と３Ｈ−１ｉｌｙ１１ｉｄｉｎｅ
法との相関関係を表わすグラフであり、 第５図は本発明の方法と核酸−螢光プローブ法との相関
関係を表ねサグラフである。 出願人　　オーツ・ダイアグノスティック・システムズ
株式会社 株式会社ジェイ・エム・エル 代理人　　　弁理士　　高　石　橘　馬第１図 第２Ａ図 第３Ａ図 毘ＩＦ−，中−一一　内部構５　　　　１灘第３Ｂ図 単純←内５礪這→復逼

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）リンパ球のＤＮＡと結合する螢光色素を用いてフ
   ローサイトメトリーにより螢光強度のヒストグラムを求
   め、前記ヒストグラムから刺激指数、細胞の増殖率及び
   細胞周期のＤＮＡ合成期の百分率を求め、これらのパラ
   メータから前記リンパ球の幼若化現象を解析することを
   特徴とするリンパ球の幼若化試験法。
2. （２）特許請求の範囲第１項に記載の方法において、前
   記刺激指数は、前記ヒストグラムを積算することにより
   総螢光量を求め、それと未刺激のコントロールの総螢光
   量との比をとることにより求めることを特徴とする方法
   。
3. （３）特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法に
   おいて、前記リンパ球の幼若化用刺激物質として、フィ
   トヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカナバリンＡ（ｃｏ
   ｎＡ）およびポークウートマイトジェン（ＰＷＭ）など
   のマイトジェンを使用することを特徴とする方法。
4. （４）特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記
   載の方法において、前記リンパ球を刺激する前に細胞膜
   を溶解するが細胞核は破壊しない物質で処理することを
   特徴とする方法。
5. （５）特許請求の範囲第４項に記載の方法において、前
   記細胞膜溶解物質がトリトンＸ−１００であることを特
   徴とする方法。
6. （６）特許請求の範囲第４項又は第５項に記載の方法に
   おいて、前記細胞核の形態学的変化をあわせて測定する
   ことにより、幼若化現象を解析することを特徴とする方
   法。
7. （７）特許請求の範囲第１項乃至第３項のいずれかに記
   載の方法において、前記リンパ球を刺激する前に細胞膜
   に穴をあける物質で処理することを特徴とする方法。
8. （８）特許請求の範囲第７項に記載の方法において、前
   記細胞膜に穴をあける物質がエタノールであることを特
   徴とする方法。
9. （９）特許請求の範囲第７項又は第８項に記載の方法に
   おいて、前記リンパ球の形態学的変化をあわせて測定す
   ることにより、幼若化現象を解析することを特徴とする
   方法。
10. （１０）特許請求の範囲第１項乃至第９項のいずれかに
    記載の方法において、培養上清の除去にリンパ球洗浄遠
    心機を用いることを特徴とする方法。