FR2478317A1 - Procede et composition pour la determination des categories individuelles de leucocytes par sorption differentielle d'au moins un colorant metachromatique - Google Patents

Abstract

PROCEDE ET COMPOSITION POUR LA DETERMINATION DES CATEGORIES INDIVIDUELLES DE LEUCOCYTES PAR SORPTION DIFFERENTIELLE D'AU MOINS UN COLORANT METACHROMATIQUE. ON MET EN CONTACT, EN MILIEU AQUEUX ENTRE 21 ET 40C ENVIRON, UN ECHANTILLON DU SANG (OU DES LEUCOCYTES), SANS FIXATEUR, AVEC AU MOINS UN COLORANT CATIONIQUE QUATERNAIRE BASIQUE, ET L'ON EXAMINE, AU MICROSCOPE OPTIQUE, LA LUMIERE REFLECHIE, DIRECTE OU AVEC UN FILTRE COLORE. APPLICATION : ETABLISSEMENT DE LA FORMULE LEUCOCYTAIRE DU SANG PAR ETUDE DU SPECTRE DE LA LUMIERE REFLECHIE, A DES FINS D'EXAMEN CLINIQUE OU DE DIAGNOSTIC.

Description

La présente invention concerne un perfection-

nement apporté au domaine de la cytologie et, plus parti-

culièrement, un procédé et une composition de coloration vitale pour la détermination au microscope de la formule leucocytaire du sang, ce qui permet d'effectuer, dans le

champ d'un microscope, des opérations optiquesde diffé-

rentiation, identification, comparaison et numération de

chacun des cinq types de globules blancs du sang en uti-

lisant un seul colorant pur, sans fixation et de façon plus précise et plus rapide qu'on ne le pouvait jusqu'à présent à l'aide d'appareils manuels ou automatisés pour

l'établissement de cette formule leucocytaire du sang.

Ehrlich a permis de reconnaître plus facilement des éléments biologiques par examen au microscope et en

vue d'une observation photographique en utilisant des co-

lorations (à l'aide de colorants dérivés de l'aniline) pour identifier certains globules blancs du sang. Ehrlich

a été le premier à noter que certains colorants sont méta-

chromatiques, en observant que la coloration de la cel-

lule oblige celle-ci à prendre ou absorber une couleur différente de celle du colorant ou de la couleur à laquelle on s'attendait d'après le colorant. On a observé, par exemple, que les globules basophiles prennent une couleur différente de celle du colorant. Il a également été indiqué que d'autres spécimens histologiques, différents des globules sanguins, se colorent en plusieurs couleurs

différentes identifiables.

Un passage en revue de l'état de la technique indique qu'il est de pratique quasi-universelle d'appliquer, avant la coloration (qui utilise d'ordinaire plusieurs

colorants chimiques différents mélangés), un mode opéra-

toire de fixation pouvant exiger jusqu'à une demi-heure de traitement avant qu'on puisse soumettre le spécimen biologique au processus de coloration. Les fixateurs sont généralement des conservateurs et dénaturants qui nuisent

souvent à la sensibilité de la sorption du ou des colo-

rants. Par exemple, les fixateurs comprennent le formal-

déhyde, aussi bien sous forme liquide que de vapeur, des alcools absolus (méthylique), du picroformol, etc. Très souvent, les cellules vivantes ne se colorent pas à

l'aide de colorants vitaux et des fixateurs sont essen-

tiels pour la coloration des spécimens. La cytochimie

comprend des renseignements considérables sur les techni-

ques mises au point pour assurer une coloration reproduc-

tible des globules sanguins. De nombreux additifs essen-

tiels sont normalement instables et se détériorent ra-

pidement, ce qui rend difficile et parfois peu sûre l'identification des cellules. Le docteur Thomas E. Necheles a observé, à propos de l'analyse des leucocytes,

que "ce système a subi peu ou pas de changement en 50 ans".

Or,la coloration constitue bien un moyen pour discerner des détails qu'il serait impossible, sinon, de discerner, en soumettant à une réaction colorée des

cellules et leurs constituants colorables, que ces consti-

tuants soient métaboliques, fonctionnels ou pathologiques.

Les hôpitaux des Etats-Unis d'Amérique ont com-

mencé à dénombrer les leucocytes dès le début du 20e siècle en utilisant le dénombrement ainsi obtenu comme un indice

permettant, par exemple, de savoir si une chirurgie d'ur-

gence est nécessaire. Dans les seuls Etats-Unis d'Amérique, on établitchaque jour plus d'un demi-million de formules leucocytaires du sang, la plupart du temps par des méthodes manuelles. Il est important d'effectuer des dénombrements de l'ensemble des globules blancs, d'établir une formule leucocytaire et de transmettre sans retard les résultats obtenus. Le temps constitue un facteur essentiel et l'on souhaite toujours obtenir et transmettre plus rapidement

les analyses requises.

La valeur du dénombrement des leucocytes et de l'établissement de leurs proportions relatives ayant été établie, la demande tendant à obtenir une analyse rapide des éléments figurés du sang s'est développée de sorte qu'en commençant au voisinage de 1950 avec le travail de Mellors et de Papaincolaou (1952), le développement des divers appareils automatisés pour l'établissement d'une formule leucocytaire a donné divers instruments en 1980: L'appareil "CYDAK" a servi très tôt à étudier s'il était

possible de réaliser une classification des globules san-

guins, ce qui a souligné l'importance des modes opéra- toires de coloration spécialisée et des caractéristiques ont été extraites des histogrammes de la densité optique de chaque image de globule. Ce mode opératoire a établi la possibilité de différencier les globules en quatre des cinq classes de leucocytes, à savoir les neutrophiles, les éosinophiles, les lymphocytes et les monocytes. Young

a publié en 1969 les résultats d'une classification auto-

matisée des cinq classes de globules et Bacus a étendu

en 1971 la différentiation.

On admet cependant que des systèmes de différen-

tiation automatisée se fondent actuellement sur l'utilisa-

tion de plusieurs colorants et de systèmes de dégradation de colorants ou sur la mesure d'une fluorescence indirecte

en faisant appel à des colorants fluorescents. Ces der-

nières méthodes sont décrites dans les brevets des Etats-

Unis d'Amérique n0 3 916 205 et no 4 146 604. On notera dans ce cas également que le procédé ainsi décrit dans les brevets utilise des fixateurs, ce qui correspond à la

pratique courante.

Dans la coloration des éléments figurés du sang selon la technique antérieure, il a été observé qu'il est

de pratique courante d'utiliser deux ou plusieurs colo-

rants combinés (colorations de Romanowski, Giemsa et Wright).

Il est difficile d'assurer un contrôle de la qualité lors de la mise en pratique de ces méthodes. Elles exigent une

standardisation de la préparation de chaque colorant fai-

sant partie de la composition à utiliser, ainsi que du procédé de coloration des spécimens. Dans le développement des appareils automatisés pouvant établir avec succès une formule leucocytaire du sang, la reproductibilité de la coloration est encore plus importante pour permettre la

vérification de l'analyse.

Mogler a indiqué en 1973 que la composition colorante "LARC" (utilisée dans des appareils automatisés du commerce pour l'établissement d'une formule leucocytaire) consiste en un mélange d'environ dix colorants dérivés de la thiazine, de l'éosine Y et de la 21, 41, R'-tribromofluorescéine (P.N. Marshall). Les compositions colorantes actuelles se trouvent le plus souvent dans des solutions alcooliques de fixateurs et comportent deux ou plusieurs

colorants en combinaison. Une analyse précise de la colo-

ration vitale des éléments figurés du sang est ainsi ren-

due extrêmement difficile. Avec la difficulté présentée par l'oxydation réglée du bleu de méthylène, essentielle

pour les colorations de Romanowski, par exemple, les pro-

blèmes de contrôle de la qualité des dix colorants-diffé-

rents individuellement ajoutés pour la coloration, tels

qu'on les utilise en combinaison, deviennent impression-

nants.

Il a été admis en pratique qu'une standardisa-

tion poussée et l'adoption d'un nombre limité de composi-

tions colorantes garantiraient une plus grande précision

et une meilleure reproductibilité des études cytologiques.

On a observé que l'utilisation des fixateurs entraîne une introduction grave d'artéfacts, ce qui crée des difficultés d'interprétation et une mauvaise interprétation lors de la différentiation et de la numération des leucocytes. Il a été indiqué que des ajustements du pH, des cations de métaux lourds, constituent des facteurs empêchant des tests cytochimiques de s'effectuer de la façon attendue. Il a été noté que certains colorants, notamment les colorants azoiques, font apparaître une précipitation non spécifique

autour des globules; d'autres modifications de dégénéres-

cence des échantillons de globules fixés du sang compren-

nent la formation de vacuoles, d'une structure en "feuille

de trèfle" des noyaux, la distorsion des formes des glo-

bules, la présence de salissureset une gêne pour la réali-

sation d'une coloration parfaite. On admet l'importance d'effectuer le plus rapidement possible des dénombrements

différentiels sur des cellules aussi vivantes que possi-

ble afin d'obtenir des formules leucocytaires d'une uti-

lité et d'une valeur optimales. L'utilisation de solu-

tions alcooliques de colorants gêne la coloration vitale.

Pour autant qu'on le sache, des compositions colorantes hydrosolubles fraîchement préparées montrent le minimum d'effet de dénaturation lors de l'examen par coloration vitale des éléments figurés du sang. Tous les colorants sont plus ou moins toxiques pour les globules du sang, mais certains le sont plus que d'autres. Il est important que les globules examinés restent vivants aussi longtemps que possible. La rapidité de la coloration raccourcit bien évidemment le temps d'exposition, ce qui donne plus de chances d'examiner les leucocytes avant qu'ils ne perdent toute leur vitalité. On souhaite pouvoir établir par des moyens automatisés des formules leucocytaires

du sang obtenues en un plus petit nombre de minutes.

Des études et un passage en revue de la manière antérieure d'effectuer sous le microscope des analyses

des éléments figurés du sang et un diagnostic d'une mala-

die ont indiqué qu'il n'est pas inhabituel pour des patho-

logistes de réchauffer le colorant et l'échantillon de sang jusqu'à des températures d'environ 370C, voisines

de celle du corps, avant de réaliser le contact. Le doc-

teur Sabin avait une "boîte chaude" pour garantir le

réglage de la température.

Il a également été noté que certains colorants utilisés dans l'art antérieur sont très sensibles aux

températures. La littérature indique que le violet cresy-

lecht n'est pas utile comme colorant au-dessus de 30'C et que le rouge neutre plus couramment utilisé ne colore pas au-dessus d'environ 320C. Aux fins du procédé ici décrit,

on considère comme important que le colorant puisse co-

lorer des leucocytes à des températures aussi élevées que 370, et l'on n'a pas observé de difficulté, avec les

colorants choisis, jusqu'à des températures d'environ 40'C.

Il a été trouvé que la présente invention se limite à des colorants cationiques basiques, et qu'à titre

de classe, ils sont relativement peu nombreux en compa-

raison de l'ensemble des diverses classifications des co-

lorants connus. L'ouvrage "Colour Index" pour 1956-1963 énumère environ 3 000 colorants organiques de synthèse. Parmi eux, 190 seulement sont cationiques. Sur une liste relativement étendue de colorants cationiques basiques d'un catalogue disponible, 61 ont été essayés pour servir

dans la présente invention. Sur le nombre total des colo-

rants essayés, trois se sont avérés utiles aux fins et dans le cadre de la présente invention. Dans un autre

examen de dix-huit colorants quaternaires basiques figu-

rant dans une liste de colorants présentés au public, un seul s'est avéré colorerde manière métachromatique une

espèce de leucocytes.

Pour autant qu'on le sache, l'art antérieur n'a pas enseigné que des colorants quaternaires cationiques basiques, capables de colorer sélectivement des espèces de leucocytes, peuvent efficacement opérer de manière métachromatique et à des températures de 370-400C. L'art

antérieur ne décrit pas l'utilisation de colorants spéci-

fiques pour distinguer instantanément des monocytes d'au-

tres espèces de leucocytes. L'art antérieur ne décrit pas

de procédé simple pour identifier et compter les lympho-

cytes.

La présente invention constitue un progrès pour la cytologie en proposant une série de moins d'une douzaine de colorants organiques cationiques quaternaires basiques

qui sont sélectivement sorbés par un ou plusieurs leuco-

cytes du sang circulant, ce qui améliore de manière inha-

bituelle l'identification et la différentiation des membres de l'espèce générale des globules blancs du sang. L'espèce générale des leucocytes du sang circulant comprend des

leucocytes polymorphonucléaires ou neutrophiles, des éosi-

nophiles, des basophiles, des lymphocytes et des monocytes.

Jusqu'à présent, il fallait utiliser des moyens cytochi-

miques et des colorations complexes pour une différentia-

tion, ce qui nécessitait souvent au moins une heure de préparation fastidieuse pour effectuer la préparation

et l'analyse sous le microscope d'une seule espèce géné-

rale ou de ses types.

La pratique de la présente invention permet

maintenant de colorer de manière différentielle et d'iden-

tifier à l'aide d'un seul colorant pur par un seul contact

en milieu aqueux avec un échantillon de sang veineux péri-

phérique sans fixateur à la température du corps, ou avec un spécimen de ce sang enrichi en leucocytes, chacune des cinq espèces ou chacun des cinq types de globules blancs énumérés. Cette identification s'effectue très rapidement, sans cytochimie soigneuse ni préparation complexe. Chaque type ou espèce de leucocytesen sorbant ou, au contraire en ne sorbant pas, le colorant dans certains cas, se différentie en réfléchissant une image comportant des couleurs différentes dont le spectre permet l'identification, en sorbant d'autres couleurs du spectre de la lumière normale, ce qui comprend surtout la lumière visible mais n'exclut pas l'infrarouge ou l'ultraviolet, ce qui est important pour un équipement automatique non

limité par la sensibilité de l'oeil humain.

Ainsi, on peut différencier chaque type indivi-

duel de ses voisins, on peut compter les globules de chaque type, déterminer le nombre total des leucocytes, étudier la morphologie de chaque type et effectuer de nombreuses déterminations qui ont une grande valeur pour les sciences

de la santé.

Fondamentalement, le même colorant pur confère par sorption une teinte différente à chacun des leucocytes

précités, selon la qualité du colorant et le type de leu-

cocytescolorés. En l'absence de fixateurs, un colorant basique est sorbé de manière métachromatique telle que chaque classe, type ou espèce de leucocytes réfléchit un spectre lumineux ou une couleur caractéristique qui diffère de ceux de chaque autre classe, type ou espèce de leucocytes présent dans l'échantillon. On pense que la métachromasie des huit colorants principaux utilisés dans la présente invention est quasi-unique. Les quatre premiers colorants énumérés au tableau I colorent chaque classe, type ou espèce de leucocytes de manière que le globule réfléchisse une couleur spectrale de différence identifiable. Ces

colorants, combinés ou utilisés isolément, permettent cha-

cun la mise en pratique de l'invention. Les quatre colo-

rants énumérés ensuite sur le tableau I effectuent la coloration métachromatique de l'ensemble des classes, types

ou espèces de leucocytes, à l'exception des lymphocytes.

Chaque espèce sorbe le colorant métachromatique de manière à réfléchir une couleur ou un spectre lumineux distinctif dans la lumière visible. Des combinaisons des colorants

de la présente invention peuvent s'avérer utiles pour cer-

taines analyses de leucocytes.

La base principale pour l'identification de cette nouvelle classe de colorants est constituée par leurs

courbes spectrales.

Chaque colorant est identifié par un nom bien défini, lorsque celui-ci est connu, ou par un nom attribué s'il n'y a pas de nom connu. Une base secondaire pour l'identification est un numéro de publication dans "Colour

Index" ou un numéro "Michrome" lorsque celui-ci est connu.

Dans les exemples et la description détaillée qui suivent,

les formules chimiques développées sont parfois utilisées, lorsqu'elles sont connues, pour identifier les colorants

utiles de la présente invention. Dans un seul cas, le co-

lorant utile est de nature si obscure que rien n'a été

trouvé pour en éclairer l'histoire, la chimie ou l'utili-

sation. Ce colorant obscur est connu sous le nom de bleu Greifswalder. Dans un second cas, une référence obscure

trouvée après une recherche poussée a indiqué que ce co-

lorant, appelé bleu Borrel (ou bleu de Borrel) dérive directement du bleu de méthylène. Son mode de préparation

est indiqué ci-après. D'après les renseignements concer-

nant la fabrication et la structure du bleu de méthylène, il s'avère que la définition chimique générale de la

structure probable des colorants englobe le bleu Borrel.

Les termes de classification servant ici à identifier les colorants remarquables utilisables aux fins de l'invention, à savoir "un colorant organique

cationique métachromatique quaternaire basique" com-

prennent tous les colorants purs connus énumérés aux tableaux 1, II et III et qui s'avèrent utiles aux fins de la présente invention. Tous les colorants composés connus sont structurellement apparentés et entrent dans

le cadre de la classification précitée. Les trois colo-

rants figurant au tableau II sont métachromatiques au sens limité utilisé par Ehrlich, mais ils sont également très inhabituels du fait qu'ils sont spécifiquespour les seuls monocytes. Seuls les monocytes sont colorés par contact en milieu aqueux avec ces colorants. Leur utilisation

peut également se conjuguer avec celle des colorants énu-

mérés au tableau I. Le terme net de "vital", ou "encore vivant", tel qu'on l'utilise ici, apporte une limitation relativement

importante. Cela s'applique à l'échantillon de sang d'ori-

gine et aux globules vivants fraîchement retirés d'un or-

ganisme vivant, ou-d'un organisme fraîchement sacrifié

ou de son équivalent. Tel qu'il sert ici, ce terme en-

tend exclure tous les "fixateurs" mais permet l'utilisa-

tion d'anticoagulants (héparine, E.D.T.A. Lacide éthylène-

diamine-tétra-acétique7 etc.). Les globules du sang peuvent

être retirés de la moelle des os, de l'urine et d'autres spé-

cimens biologiques qui les contiennent.

Dans tous les cas, des observations sous le mi-

croscope sont destinées à comprendre un éclairage par la

lumière blanche qui est normalement utilisée en microsco-

pie clinique. Un établissement automatisé d'une formule leucocytaire du sang est maintenant devenu possible avec éclairage normal à la lumière blanche mais, pour autant qu'on le sache, aucun équipement commercial ou industriel actuel n'est directement utile pour cela. Le procédé de l'invention permet le succès du développement de moyens, apparentés à des calculatrices ou ordinateurs, pour l'établissement automatique d'une formule leucocytaire du sang et l'invention surmonte de nombreux problèmes qui

retardent le succès de ce développement.

Les colorants remarquables utilisés aux fins de la présente invention servent en solution aqueuse filtrée

à la concentration d'environ 1 % du colorant pur. La con-

centration du colorant n'est pas particulièrement critique mais elle permet des variations. On préfère utiliser des solutions aqueuses tant qu'elles sont fraîches et sans inclusion d'additifs toxiques. L'utilisation de fixateurs

classiques peut totalement inhiber la réaction métachroma-

tique entre le colorant et le type ou la classe spécifique

de leucocytes.

Le terme "métachromatique" semble avoir été utilisé pour la première fois par Ehrlich pour décrire une coloration dont la couleur apparente ou teinte change en cas de sorption par certaines cellules. Le colorant est dit présenterde la métachromasie, et il a été observé que cette caractéristique constitue une propriété d'un nombre relativement faible de colorants purs, principalement des colorants basiques qui colorent en une teinte différente des éléments des tissus. La métachromasie se définit également comme l'hypothèse de spectres colorés différents émis par des substances différentes colorées par le même colorant. En cytologie, des granules métachromatiques sont ceux qui présentent une teinte différente de celle

du colorant utilisé pour les colorer.

Deux facteurs sont impliqués dans l'exposé ci-

dessus du sens des termes "métachromatique" et "métachro-

masie".L'un est la cellule biologique (et ses parties spécialisées), qui a été appelée " métachromatique" ou "chromotrope", ce qui est une qualité ou un caractère du spécimen de celulle biologique, et l'autre est la qualité du colorant. Un très petit nombre de colorants possèdent

la qualité essentielle pour stimuler une ou des struc-

tures au sein d'une cellule ou d'un globule de manière

que cette ou ces structures présentent de la métachromasie.

conn (9e ddition) indique "il existe un très petit nombre de colorants purs présentant cette réaction". On a trouvé peu de rapports indiquant que le phénomène implique plus

de deux spectres colorés distincts. Dans un cas "une colo-

ration nucléaire vert-bleu clair avec une métachromasie violette du cartilage" a été décrite. Cependant, avec des

solutions de coloration normalement appliquées à des tis-

sus fixés, dont la nature chimique et physique est altérée

par les habituelles opérations de préparation à la colo-

ration, le caractère des structuresbiologiques naturelles se trouvant au sein d'un spécimen de cellule ou de globule peut se trouver altéré et être rendu non sensible à ce qui pourrait, sinon, réagir ou provoquer une réaction, de sorte qu'une coopération essentielle entre les structures biologiques naturelles et le colorant, et une sorption de

ce colorant, ne se produisent pas.

Le fait qu'un petit nombre seulement de colorants sont"métachromatiques" et exercent un rôle métachromatique sur les différentes parties de la cellule ou du globule explique les difficultés rencontrées lors de la découverte de la coopération étonnamment efficace, ici décrite, entre

les leucocytes et les colorants de la présente invention.

La large classe des colorants basiques,qui en-

globe les colorants métachromatiques de la présente inven-

tion,comprend ceux dans lesquels le groupe auxochrome est un groupe amino primaire, secondaire ou tertiaire. Un atome d'azote au moins joue le rôle d'azote quaternaire et, lors de l'addition d'un anion incolore, le plus souvent un acide halogéné, il peut former un sel. Comme les acides halogénés sont relativement forts en comparaison de la base immonium, ces sels ont le plus souvent une réaction légèrement acide ou présentent un pH acide. Le groupe organique chromophore est un cation, qui porte une charge positive, et l'ion halogène ou halogéné constitue l'anion ou apporte la charge négative. La nouveauté et l'utilité du procédé ici décrit résident dans un certains nombres de concepts. Pour la première fois, on peut facilement et rapidement colorer, à l'aide essentiellement d'un colorant pur, tous les globules blancs ou leucocytes du sang circulant présents

dans un spécimen de globules vivants. Par exemple, un pro-

cédé permet d'identifier, de différencier et d'étudier des lymphocytes exclusivement en utilisant un seul colorant,

le bleu Borrel, à une température d'environ 21-250C. Lors-

qu'on l'utilise à la température normale du sang (37 C), le même colorant colore de manière différentielle et permet d'identifier chaque espèce de leucocytespar une teinte

différente de réflexion spectrale.

Les monocytes ont été étudiés jusqu'à présent

par des modes opératoires cytochimiques complexes néces-

sitant une heure fastidieuse de cytochimie soigneuse. Ils

peuvent maintenant être identifiés et étudiés instantané-

ment pour un diagnosticà l'aide d'un seul colorant pur

choisi de la présente invention.

Voici un exemple illustratif de la pratique générale de la présente invention: on prépare une solution, à 1 % dans de l'eau distillée, du colorant cationique quaternaire basique choisi. Si la pratique en indique la nécessité, on peut mélanger, sous forme de solutions,un ou plusieurs des

colorants en cause.

Si l'étude concerne seulement des monocytes, on choisit un colorant cationique quaternaire basique dans la classe consistant en la carbocyanine K5 et les colorants méthyliques et polynéthyliques du groupe formé par le rouge basique 13 (courbe spectrale 9) et le violet basique 16

(courbe spectrale 8).

Cependant, si le leucocyte spécifique intéres-

sant est constitué par des lymphocytes, le bleu Borrel, utilisé à la température réglée de 200-250C est spécifique pour l'étude des seuls lymphocytes, et en maintenant la température du colorant et la température de l'échantillon de sang "vital" à une température inférieure à celle du sang normal on provoque, de façon très surprenante, la coloration sélective des seuls lymphocytes. On a trouvé que ce colorant ne colore pas des leucocytes autres que

les lymphocytes dans cette gamme de basse température.

Cependant, si l'on augmente légèrement la température pour parvenir à la température du sang normal ou du corps (37--400C), le bleu Borrel utilisé comme seul colorant pur permet une définition spectrale et une différentiation

de l'ensemble des cinq types de leucocytes.

On prépare, en vue d'une utilisation ultérieure, un échantillon frais de sang entier (sans utilisation de fixateurs), additionné d'agents anticoagulation connus, par exemple l'héparine, E.D.T.A. ou du citrate et dont les érythrocytes ont été enlevés par centrifugation, lyse hypotonique, sédimentation par gradient de densité ou par d'autres procédés analogues, ou un échantillon de plasma enrichi en leucocytes (ou globules blancs du sang)

par l'une des diverses techniques physico-chimiques suggé-

rées ci-dessus.

On prépare la solution aqueuse du colorant pur unique choisi, com=e décrit sur les tableaux I et II,

ou l'on mélange des solutions en combinant deux ou plu-

sieurs des colorants purs de ces tableaux I et II (comme

illustré sur le tableau III) pour produire une seule so-

lution aqueuse de colorant. (Une étude des diverses pro-

portions volumétriques de la solution aqueuse du ou des colorants et des diverses concentrations des solutions

aqueuses de colorants peut indiquer les conditions opti-

males à appliquer pour diverses analyses cytologiques spécifiques). Un peu d'expérimentation peut conduire à des combinaisons spécifiques présentant des avantages particuliers. Cela est envisagé et se situe à la limite

du cadre du présent exposé.

Les échantillons de sang peuvent provenir de diverses sources, comme des échantillons frais de sang

veineux dont les érythrocytes ont été enlevés (par centri-

fugation, lyse hypotonique, sédimentation par gravité, sédimentation par gradient de densité, etc.), ou bien l'échantillon peut être un plasma enrichi en globules blancs par des techniques physico-chimiques comme cellesmentionnées ci-dessus.

On préfère réunir le colorant aqueux et l'échan-

tillon de sang, tous deux fraîchement préparés, à la température du sang ou du corps normal (environ 360-40'C) lorsque les plans des analyses l'indiquent. On obtient généralement une coloration plus nette à la plus forte température. La solution de colorant et le sang se comportent bien lorsqu'on les réunit ou combine selon un rapport volumétrique d'environ 1:4. On agite doucement le mélange durant plusieurs secondes et l'on examine une goutte de ce mélange immédiatement en montage humide en plaçant une lamelle de verre sous un microscope optique ou à l'aide d'un équipement automatisé pour l'établissement d'une

formule leucocytaire, si on dispose d'un tel équipement.

D'autres façons d'assurer un contact entre le colorant et les globules sanguins comprennent l'utilisation de milieux connus, par exemple la gélatine, des émulsions,

etc., imprégnés du colorant à une concentration d'envi-

ron 1 % de ce colorant. Il est cependant tout à fait important de ne pas fixer le spécimen de sang, comme cela est généralement fait. La fixation de l'échantillon gêne gravement l'action métachromatique inhabituelle des

* colorants de la présente invention.

Chaque type de leucocytes ou de globules blancs du sang peut être identifié et être distingué de chaque autre type, classe ou espèce par la couleur spectrale différentielle sorbée ou par la réflexion spectrale différente provenant de chaque espèce colorée de manière caractéristique. Les exemples présentés ci-dessus à titre illustratif permettront à un expert de mieux apprécier les possibilités du nouveau procédé proposé. Parmi les divers avantages de ce procédé, on peut citer notamment

la possibilité d'une numération du nombre total des leuco-

cytes, la numération des espèces de leucocytes, le diag-

nostic des maladies, notamment des leucémies, et la sur-

veillance de monitorage de patients auxquels on applique

divers traitements critiques comme par exemple une chimio-

thérapie, un traitement par des rayonnements, par ACTH (hormone corticotrope), etc. On connaît l'importance fondamentale, pour le diagnostic et le traitement de nombreuses maladies, de l'identification et de la numération de toutes les espèces

de leucocytes.

Les exemples qui suivent la description plus

détaillée de l'invention sont destinés à illustrer l'uti-

lité de l'invention et sa pratique. Il va de soi qu'il ne

sont pas exhaustifs ou limitatifs.

La présente invention propose donc une seule com-

position d'au moins un colorant pur remarquable, et un procédé pour distinguer des autres chaque espèce, type ou classe de la série des leucocytes présents dans le sang, et qui comprennent des leucocytes polymorphonucléaires

(neutrophiles, maturesou immatures), éosinophiles, baso-

philes, lymphocytes et monocytes, par l'examen sous le

microscope d'un seul échantillon de sang vital, l'utilisa-

tion d'un éclairage normal à la lumière blanche permettant la différentiation, l'identification, la comparaison, la diagnose et la numération de chacune des espèces précitées

de leucocytes.

Au moins un échantillon de sang encore vivant

et sans fixateur est mis en contact intime, dans un envi-

ronnement aqueux, avec au moins un colorant organique cationique quaternaire basique aqueux capable de colorer

de manière métachromatique au moins quatre des cinq es-

pèces précitées de leucocytes à la température normale

du corps (ou température du sang normal; environ 370C).

Il est extrêmement inhabituel et très pratique de pouvoir choisir d'utiliser un seul des colorants purs

précités pour une analyse donnée quelconque de leucocytes.

Il n'est cependant pas essentiel d'utiliser un seul des colorants purs de la présente invention aux fins ici décrites, car l'invention n'exclut pas l'utilisation de mélanges. L'expérience actuellement acquise avec les colorants cationiques quaternaires basiques permet de

considérer comme extraordinaire la découverte selon la-

quelle, parmi le grand nombre de ces colorants examinés,

seul un petit nombre peuvent assurer la coloration dif-

férentielle de quatre espèces de leucocytes ou de la

totalité des espèces de leucocytes.

Chacun des quatre premiers colorants présentés au tableau I colore chaque espèce de leucocytes avec une réponse spectrale suffisamment différente dans la lumière

visible pour permettre l'identification, la différentia-

tion et la numération de chacune des cinq espèces. Trois des colorants précités sont identifiés par leur structure chimique, ce qui suffit à établir que ce sont des colorants organiques cationiques basiques quaternaires ayant la

propriété inhabituelle de métachromasie notée, c'est-à-

dire que le même colorant confère à chaque leucocyte une

couleur ou teinte spectrale individuellement différente.

On observera également sur le tableau I que celui-

ci présente quatre colorants supplémentaires entrant dans les mêmes caractéristiques de classe que celles indiquées ci-dessus. Cependant, ces quatre colorants n'ont aucun effet de coloration sur des lymphocytes. Mais, lorsqu'on utilise l'un quelconque de ces colorants purs avec du bleu

Borrel à environ 210-400C, on obtient également une colora-

tion différentielle complète de tous les leucocytes, comme dans le cas des quatre premiers colorants présentés au

tableau I.

Sur le tableau 1, le bleu Borrel est extrêmement

inhabituel par sa possibilité de ne colorer que des lympho-

cytes à basse température (par exemple 210-250C). Cela per-

met des études individuelles de cette espèce de globules blancs sans autre séparation. Cependant, lorsqu'on travaille

TABLEAU I

Identité du Courbe spectrale, Leucocytes Eosinophiles Basophiles Lymphocytes Monocytes

colorant identité et polymorpho-

métachroma- source nucléaires tique (neutrophiles) 1 Bleu de Courbe specGranules Granules Granules Noyau Noyau Greifswalder trale n 1 jaunes verts bleus bleu-vert pourpre 21-40 C pas de n CI (Chroma) 2 Bleu Borrel Courbe spec- (non (non (non Noyau (non 21-25 C traie n 2 colorés) colorés) colorés) bleu-vert colorés) Michrome n 376 Bleu Borrel (Chroma) Granules Granules Granules Cytoplasme Cytoplasme 37-400 C bleus pourpres rouges et noyau pourpre bleu-vert Granules rose rouge 3.Bleu de Courbe spec- Granules Granules Granules Noyau Cytoplasme Rhodanile traie n 3 magenta pourpres rouges bleu-vert lilas 21-40 C Michrome n 1156 Cytoplasme E. Merck rouge 33 Bleu de Courbe spec- Noyau Granules Granules Noyau vert Noyau Toluylène traie n 11 bleu pourpres rouges pourpre 21- 40 C CI n 49410 Granules Cytoplasme (Math. Cole & jaunes pourpre Bell Norwood, Ohio) j-' -J -'J Co (-34 -'J TABLEAU I (suite) Identité du Courbe spectrale, Leucocytes Eosinophiles Basophiles Lymphocytes Monocytes

colorant identité et polymorpho-

métachroma- source nucléaires tique (neutrophiles) 4 Bleu de Courbe specGranules Granules Granules (non Noyau nuit trale n0 4 verts bleus pourpres colorés) pourpre 21-400C CI no 44085 Cytoplasme (Chroma) vert Prune pure Courbe spec- Granules Granules Granules (non Noyau (bleu Gallon trale n0 5 bruns verts pourpres colorés) pourpre CI no 51040 (Chroma.) 6 Violet de Courbe spec- Granules Granules Granules (non Noyau Hofmann trale n0 6 verts pourpres rouges colorés) pourpre 21-400C CI no 42530 Granules (Chroma) rouges 7 Orangé Courbe spec- Granules Granules Granules (non Granules

basique n021 trale no 7 (matures) bruns rouges colorés) Cytoplas-

21-400C CI no 4835 jaune foncé miques (Bayer) Granules orangés (immatures) orangés o, NI -9J Co Lq --J

avec un échantillon et du colorant aux températures nor-

males du sang, on peut étudier toutes les espèces à la fois à l'aide d'un échantillon de sang plus un colorant

formé par ou contenant du bleu Bdrrel.

Le premier colorant présenté sur le tableau I,

le bleu de Greifswalder, est disponible dans le commerce.

Cependant, après des recherches poussées et quelques exa-

mens préliminaires chimiques et physiques, on n'a pu trou-

ver aucune référence permettant d'en identifier la struc-

ture chimique. Comme cela se produit parfois dans le domaine des colorants, une identification positive de ce colorant très utile s'effectue à l'aide de son analyse spectrale, qui est reproduite dans sa courbe spectrale n0 1. Dans l'exemple 1, on s'est également fondé sur une

chromatographie en couche mince.

On note également que, lorsque leur structure

chimique est certaine, les colorants de la présente inven-

tion sont parfois appelés ou classés comme des colorants méthiniques ou polyméthiniques et sont parfois appelés des colorants du type carbocyanine. On suppose que le nom ou classe de colorants méthiniques ou polyméthiniques

est lié à la structure de pontage entre les noyaux aro-

matiques complexes qui contiennent au moins un atome d'azote quaternaire dans leur structure cyclique. Les groupes chromophores sont cationiques. On peut supposer que la présence d'une structure cyclique contenant de

l'azote aromatique peut constituer la source de. la nomen-

clature "carbocyanine". Le brevet des Etats-Unis d'Amérique no 2 126 852 permet un peu de comprendre un groupe de structuresde colorants cationiques quaternaires basiques complexes à pont méthine, portant la désignation des carbocyanines. Le dernier colorant présenté sur le tableau I et appelé orangé basique n0 21 est remarquable aussi du fait qu'il permet à un observateur expérimenté d'effectuer une distinction spectrale entre des granules matures et

immatures de leucocytes polymorphonucléaires ou neutro-

philes. La nette réponse spectrale d'identification des monocytes est avantageuse également pour des études de

cytologie, comme on y reviendra par la suite.

Tous les colorants organiques entrant dans le cadre du procédé de la présente invention sont utilisés

en solution aqueuse.- On peut en faire varier la concen-

tration (ou "force")pour correspondre aux conditions particulières d'une étude donnée, mais il s'est avéré

généralement possible d'utiliser des solutions fralche-

ment préparées et filtrées du colorant pur dans de l'eau

distillée à la concentration d'environ 1 % du colorant.

Lorsqu'on prépare des lamelles de microscope

pour des analyses différentielles, visuelles ou automa-

tiques, de leucocytes, il est essentiel d'utiliser le

spécimen de sang préparé sans aucune addition d'un fixa-

teur, et l'on préfère dans presque tous les cas utiliser une température d'environ 360 à 400à, c'est-à-dire la

température du corps, pour le contact permettant la colo-

ration. Un passage en revue des articles et travaux anté-

rieurs a indiqué que Sabin et d'autres chercheurs remar-

quables dans le domaine de la chimie du sang ont préféré

travailler dans cette gamme de température.

Le comportement du bleu Zorrel est exceptionnel et inhabituel (voir exemple 2 et courbe spectrale 2), et son utilisation la plus avantageuse se situe généralement autour de 370C. Lorsqu'on les utilise au voisinage de

370C, tous les colorants, y compris le bleu Borrel, per-

mettent une différentiation spectrale plus nette et plus intense des spectres colorés d'identification, avec une

métachromasie spectralement plus aiguë.

Cependant, on a trouvé à l'origine que tous les colorants de la présente invention sont efficaces à la température ambiante d'environ 21 à 230C. Comme mentionné ci-dessus, à cette basse température, le bleu Borrel est particulièrement remarquable. Son seul rôle consiste alors à colorer les lymphocytes en une teinte bleu-vert et il

ne présente pas, à cette plus basse température, l'excep-

tionnelle qualité de métachromatisme total présentée au

tableau I.

Ainsi, le bleu Borrel est, parmi les colorants de la présente invention, le seul colorant connu pouvant être utilisé pour ne colorer que des lymphocytes. Les lymphocytes peuvent être exclusivement colorés dans un milieu aqueux environnant sans fixateur, par

exemple à 220C, et seuls les lymphocytes pré-

sentent alors un spectre caractéristique différentiel

î0 et peuvent être exclusivement étudiés.

Cependant, aux températures du sang normales, comme on le voit sur le tableau I, l'échantillon de sang coloré par du bleu Borrel est universel, car ce colorant

a coloré de manière différentielle et spectralement dif-

férente chacun des cinq types de leucocytes, ce qui est

également le cas du bleu de Greifswalder, du bleu de rho-

danile et du bleu de toluylène.

On doit bien souligner que, dans le procédé de la présente invention, il faut éviter l'utilisation de fixateurs. Il est clair également que le terme "vital" ou l'expression "encore vivant" apportent une limitation

et sont intimement associés au concept du sang sans fixa-

teur. Pour pouvoir être qualifié d'encore vivant, l'échan-

tillon contenant les globules est enlevé ou récupéré d'un

organisme vivant ou fraîchement sacrifié ou de son équi-

valent. Les globules et cellules doivent être vivants au

moment de leur récupération et, au moment de la prépa-

ration de la lame de microscrope, être aussi près que

possible, même pour la température, de l'état vivant nor-

mal.

Bien que l'on n'entende pas se lier par une théo-

rie quelconque, on peut indiquer qu'il est bien connu que

presque n'importe quel additif étranger a tendance à déna-

turer des matières protéiniques. Jusqu'à présent, l'uti-

lisation des fixateurs pour préparer des échantillons de sang en vue de la coloration a constitué une pratique universelle. L'expérience a indiqué que la fixation gêne la coopération entre le métachromatisme du globule et la

qualité métachromatique des colorants de la présente in-

vention. On évite aussi, ainsi, des artéfacts ennuyeux

dans le champ d'examen.

On a l'habitude d'utiliser des anticoagulants dans l'échantillon de sang franchement prélevé, par exemple de l'héparine et de l'E.D.T.A.. Cependant, moins on altère

la nature vivante des leucocytes à examiner après colora-

tion et plus précise pourra être l'analyse.

Les colorants utilisés selon le procédé de la présente invention colorent de façon métachromatique et vitale plusieurs types de globules blancs du sang dans tous les cas et l'ensemble des cinq types de globules

blancs lorsque l'on préfère choisir ce procédé. La colora-

tion est assez instantanée pour qu'aux températures nor-

males du sang (370C), le cytologiste ne doive pas attendre ni faire appel à de la cytochimie fine avant que ne se produise le développement de la couleur des globules et une différentiation spectrale des cinq types ou espèces de leucocytes, avant de commencer ses études sous le

microscope, en utilisant un équipement manuel ou un équi-

pement automatisé pour la détermination de la formule

leucocytaire du sang.

Voici des catégories et types d'échantillons de sang sans fixateur que l'on peut utiliser 1) du sang entier additionné d'un anticoagulant (E.D.T. A., citrate, héparine); 2) des suspensions de leucocytes obtenues par sédimentation, à l'aide de dextrane et/ou par gravité, d'un sang entier additionné d'un anticoagulant; 3) des échantillons de sang entier traités par une solution hypotonique pour lyser les globules rouges du sang, ce qui laisse principalement les globules blancs et les plaquettes; 4) des échantillons d'autres fluides corporels, comme du fluide spinal, pleural ou ascitique, ainsi que des échantillons d'un fluide d'articulation ou de tissu conjonctif dans lesquels les globules blancs du sang sont intéressants.

La présente invention ne propose pas spécifi-

quement un équipement automatisé pour l'établissement d'une formule leucocytaire du sang, mais de tels systèmes

et équipements ont fait l'objet d'un examen en profondeur.

La conférence du Collège des pathologistes américains (Aspen, Colorado, août 1975) a publié une série d'articles alors présentés, dans une collection intitulée "Differential Leukocyte Counting" (établissement de la formule leucocytaire du sang). Ces rapports concernent le développement et l'état de la technique dans le domaine des calculatrices pour l'établissement automatique d'une formule leucocytaire du sang. On peut également se référer aux brevets précités des Etats-Unis d'Amérique no 3 916 205

et n0 4 146 604, selon lesquels on utilise certains colo-

rants fluorescents en des combinaisons particulières pour une différentiation automatique de certains leucocytes

et d'autres globules du sang en se fondant sur la sensi-

bilité à la lumière fluorescente. Ces références sont considérées comme pertinentes pour le sujet étudié et aux fins visées par le présent mémoire. Il y a lieu de noter

que les brevets précités supposent une fixation des cel-

lules qui est habituelle dans les études de leucocytes

sous le microscope.

L'art antérieur indique plusieurs niveaux de

discrimination lors de l'établissement d'une formule leu-

cocytaire du sang. La différentiation entre des globules polymorphonucléaires et des globules "mononucléaires" a une importance fondamentale ou principale. A un niveau intermédiaire, la différentiation des polymorphes ou polynucléaires en des neutrophiles, des éosinophiles et des basophiles, et la séparation des "mononucléaires" entre des monocytes et des lymphocytes, sont considérées

comme en principe possibles.

Un troisième niveau apparent de difficulté im-

plique la différentiation des neutrophiles en des formes

247OU317

immatures et matures, et la division des lymphocytes en des types normaux et réactifs, ce qui a donné lieu à

des controverses.

La technique des équipements automatisés d'éta-

blissement d'une formule leucocytaire du sang se trouve clairement actuellement en état de développement. On semble principalement faire appel à de l'équipement manuel. On affirme que de l'équipement automatisé appartient à deux groupes généraux ou classes: 1) les dispositifs de reconnaissance des structures; et 2) les dispositifs de différentiation cytochimique. Il en ressort que les méthodes de coloration de l'art antérieur ontservi avec plus ou moins de succès et que des opérateurs utilisant des machines peuvent suivre l'opération sur la base d'une

étude ou d'une numération cellule par cellule. Habituel-

lement, on n'effectue une numération différentielle que sur cent cellules. Si les systèmes cytochimiques sont

précis, ils ont encore besoin du développement de dispo-

sitifs satisfaisants d'étalonnage et ils exigent des opé-

rateurs hautement qualifiés.

Le système de l'équipement "LARC" a utilisé des microscopes optiques classiques. Il semble cependant que

l'équipement du type "LARC" ne soit plus disponible.

Comme indiqué ci-dessus, les brevets précités décrivent des compositions, un procédé et un appareil pour un comptage différentiel et une classification des types de leucocytes, ce qui comprend la distinction de

certains leucocytes, à savoir les éosinophiles, les mono-

cytes, les lymphocytes, les neutrophiles matures et imma-

tures (mais on ne trouve rien de particulier à propos des basophiles) en conférant une fluorescence caractéristique à tous les leucocytes. La lumière émise sous l'effet d'une lumière fluorescente d'irradiation est mesurée, et les types de leucocytes sont classés selon les intensités relatives de la lumière émise dans la région des longueurs

d'onde caractéristiques de chaque colorant fluorescent.

Les brevets précités décrivent un équipement ou système permettant un établissement automatisé de la formule leucocytaire avec indication des leucocytes spécifiques cités. Un bref examen d'ensemble du procédé décrit dans les brevets précités fait ressortir les points sui-

vants: 1) la présence d'au moins deux sources de lu-

mière est essentielle, ce qui comprend la lumière vio-

lette et ultraviolette; 2) une troisième source de lu-

mière semble également nécessaire; 3) le système exige

des colorations effectuées à l'aide de plusieurs colo-

rants fluorescents pour identifier et différencier les types de leucocytes; 4) le système exige l'emploi de frottis de sang fixé à l'alcool; 5) le temps nécessaire pour la coloration est de l'ordre de 10 min; on rince

durant 1 min puis l'on sèche; 6) il semble que l'inten-

sité de la fluorescence diminue dans l'ordre suivant: a) les éosinophiles vers b) les neutrophiles vers c) les monocytes vers d) les lymphocytes. (L'identification des

basophiles n'est pas décrite). 7) dans un système compor-

tant des tubes à écoulement, les globules sanguins sont fixés par du formaldéhyde et colorés par trois solutions colorantes différentes; 8) un comptage différentiel et une classification de la fluorescence des leucocytes décelés sont réalisés à l'aide des taux ou rapports entre la lumière fluorescente; 9) l'exemple il de l'un des brevets cités indique l'identification de quatre seulement

des cinq types ou espèces de leucocytes; 10) trois co-

lorants fluorescents sont spécifiés; il faut les combiner pour produire une combinaison de "colorant unique" et cette combinaison semble essentielle, et pas seulement avantageuse, pour la mise en oeuvre du procédé antérieur décrit. Dans le présent exposé, seule de la lumière blanche ordinaire est essentielle. Il n'est pas nécessaire

d'en faire varier l'intensité. Lorsqu'on utilise les co-

lorants ici décrits ou les solutions de coloration du

présent exposé, on peut utiliser vraiment "un seul" colo-

rant pur. Cependant, il a été également découvert que l'on peut également utiliser encore les colorants purs aussi bien à l'état combiné que isolément pour amplifier ou augmenter la différentiation spectrale, si nécessaire, de chacune des cinq espèces ou catégories individuelles

de leucocytes ce qui, dans le cas des combinaisons, pro-

cure un progrès considérable par rapport aux limitations apparentes du procédé des brevets précités utilisant de multiples colorants fluorescents et donne une identité spectrale individuelle fondamentale et simple en lumière "blanche", ce qui va fortement faciliter le fonctionnement d'un équipement automatisé d'établissement des formules leucocytaires du sang et lui permettre d'être productif et plus précis pour identifier, différencier et dénombrer des leucocytes spécifiques aussi bien que la totalité des leucocytes. De même, le fait que l'on utilise une technique "vitale" permet d'utiliser un système ou équipement de monitorage continu pour le diagnostic et le traitement en

hôpital lorsque l'on souhaite réaliser en continu des ob-

servations de leucocytes critiques.

Les expressions de coloration vitale et de colo-

rant vital n'excluent pas la possibilité d'une perfusion continue des vaisseaux sanguins d'organismesvivants et d'un monitorage en continu de l'ensemble des cinq espèces ou catégories de globules blancs du sang pendant leur passage dans un tube spécialisé en vue de l'observation

et de la numération.

On sait que la plupart des colorants sont toxiques lorsqu'on les utilise dans des conditions de coloration vitale. Il a été noté que les globules blancs sont facilement endommagés si tous les globules rouges sont colorés dans une boîte chaude à 370C. L'art antérieur

a également noté que si un groupe de cellules ou de glo-

bules subit des stimulations ou des dégâts, la réaction à des colorants peut se modifier nettement. Il n'est pas inhabituel que certaines colorations demandent des périodes relativement longues, de l'ordre d'une demi-heure,

pour obtenir le maximum d'intensité de couleur. Les colo-

rants de la présente invention colorent quasi-instanta-

nément les leucocytes et l'on n'a pas besoin d'un temps quelconque après ce contact. Ainsi, les globules sont soumis à un examen pendant qu'ils sont sous la forme la

moins dénaturée actuellement connue.

En se référant plus particulièrement aux courbes spectrales 1 à 10 apparaissant sur les dessins annexés, on observe que deux courbes séparées sont tracées sur le graphe par le même instrument. Les courbes supérieures, qui ont en général les plus basses crêtes et la plus grande fréquence de variation de pente, représentent la réponse en lumière ultraviolette, cependant que les courbes initialement inférieures présentent en général des crêtes plus hautes et en plus petit nombre et constituent les

courbes de réponse en lumière visible.

Une identification positive des colorants par des renseignements précis sur leur structure chimique n' est souvent connue que du fabricant et lui est parfois même totalement inconnue. Même le nom des colorants ou des solutions de coloration ne comportant qu'un seul colorant n'est pas sans présenter des incertitudes. La nomenclature systématique ne constitue pas l'un des points forts de l'art des colorants. L'introduction des numéros de mention

dans l'ouvrage "Colour Index" est considérée comme une iden-

tification fiable, lorsque ces numéros sont connus. Il existe d'autres systèmes d'indexation ou de désignation des couleurs (numéros M1ichrome) et ces systèmes ont été utilisés pour une identification supplémentaire, lorsqu'ils

sont connus.

- Les noms utilisés ici sont destinés à identifier par correspondance les courbes spectrales portant le nom du colorant. Lorsqu'on les connaît, le numéro dans "Colour Index" et le nom du fabricant (source) du colorant sont indiqués (voir tableau 1). Lorsqu'ils sont disponibles, les renseignements sur la structure chimique ont été cités dans les exemples illustratifs. Tous les colorants utilisés

ici ont été obtenus sous la forme la plus pure possible.

L'étude des courbes de réponse spectrale a indiqué dans

l'ensemble que ces colorants sont relativement purs. Lors-

que la structure chimique est connue et indiquée, il existe une crête prédominante et relativement nette dans la courbe

de réponse en lumière visible, ce qui reflète la probabi-

lité de la pureté du colorant et vérifie l'hypothèse de

cette pureté.

Pour la définition dans le présent mémoire, l'arbitre final quant à l'identification des noms de colorants utilisés doit être l'ensemble des courbes 1 à il associées à ces noms. Ces courbes sont facilement et relativement bien reproductibles, et on se fonde sur elles

comme sur "l'empreinte digitale" permettant une identifi-

cation finale des solutions utiles de colorant décrites

et à utiliser dans le procédé ici présenté pour une co-

loration différentielle des cinq types de leucocytes, à savoir les leucocytes polymorphonucléaires ou neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles, les lymphocytes et les

monocytes, qui sont tous intéressants dans l'étude cyto-

logique des globules blancs du sang et pour le diagnostic

de diverses maladies. Les solutions de coloration présentées au tableau I sont très

inhabituelles du fait qu'elles permettent une différentiation spectrale des membre de la grande classe des globules blancs du sang ou leucocytes, en permettant

la mise en oeuvre d'une technique de sorption des colo-

rants par les globules pour la différentiation des cinq types de leucocytes. On notera que chaque solution de

colorant simple du tableau I colore de manière métachroma-

tique au moins quatre types de globules blancs du sang et permet également une différentiation, par des couleurs spectrales différentes, de chaque type, espèce ou classe

de leucocytes colorés.

TABLEAU II

Rouge basique 13 Courbe spectrale 8 (General Analine) Leucocytes

polymorpho-

nucléaires (neutrophiles) (non colorés) Eosinophiles (non colorés) Basophiles (non colorés) Lymphocytes (non colorés) Monocytes Noyau rouge Cytoplasme rouge 9 Violet basique 16 (non colorés) (non colorés) (non (non Noyau vert Courbe spectrale 9 colorés) colorés) Cytoplasme (Dupont) rose Carbocyanine K-5 (non colorés) (non colorés) (non (non Noyau rouge Courbe spectrale 10 colorés) colorés) Cytoplasme (Kodak) rose D

TABLEAU III

Colorants en Leucocytes Eosinophiles Basophiles Lymphocytes Monocytes

composition polymorpho-

de mélange nucléaires (neutrophiles) _ 11 Carbocyanine K-5 Granules Granules Granules bleu-vert Noyau brun + bleus pourpres rouges rougeâtre Bleu de Rhodanile Cytoplasme brun (21-40 C) rougeâtre 12 Violet basique 16 Granules Granules Granules Noyau Noyau rose + bleus pourpres rouges bleu-vert Cytoplasme rose Bleu Borrel pourpre

(21-40 C)

13 Violet basique 16 Granules Granules Granules (non Noyau rouge + jaune foncé bruns rouges colorés) Granules et Orangé basique 21 Cytoplasme (3740 C) rouges 14 Carbocyanine K-5 Couleur comme Couleur comme Couleur (non Synergie entre + en 7 en 7 comme en 7 colorés) 7 et 10

Orangé basique 21 plus intense plus intense meilleure couleurs inten-

(37-40 C) fort contraste définition sifiées excel-

lentes noJ J-J -J TABLEAU III (suite) Colorants en Leucocytes Eosinophiles Basophiles Lymphocytes Monocytes

*composition polymorpho-

de mélange nuéclaires (neutrophiles) Bleu de nuit Granules Granules Granules Noyau Noyau pourpre + verts bleus pourpres bleu-vert Cytoplasme Bleu Borrel vert

(37-40 C)

16 Prune pure Granules Granules Granules Noyau Noyau pourpre + bruns verts pourpres bleu-vert Granules Bleu Borrel rouge vif (37-40 C) Couleurs inten sifiées 17 Orangé basique 21 Granules Granules Granules Noyau Cytoplasme + verts jaunes rouges bleu-vert bleu Bleu Borrel

(37-40 C)

w r%] 9-'J o9 L4 -..à -qI On se référant aux trois colorants présentés au tableau II, on observe qu'ils ne possèdent pas la qualité intense, large et inhabituelle de métachromasie

multiple des colorants du tableau I. S'ils sont métachro-

matiques en un sens limité ou plus faible, en agissant

sur un seul type de leucocytes, ils ont une nature spé-

cifique et inhabituelle du fait que chacun est un colorant spécifique d'un seul type, les monocytes. En colorant immédiatement les noyaux de ces globules et en ne colorant pas les autres globules, ces colorants constituent un moyen simple, instantané et précis d'identification et

de différentiation des seuls monocytes.

Dans l'art antérieur, l'identification et la différentiation des monocytes ont été réalisées à l'aide d'un traitement cytochimique complexe et long des globules impliquant une réaction de détermination de l'absence

d'estérase, la préparation des globules fixés, une hexazo-

tation, un ajustement du pH et une coloration à l'aide de plusieurs colorants, ce qui a demandé environ 60 min pour réaliser ce qui, à l'aide de l'un quelconque de ces trois colorants, isolément ou en combinaison, si on le désire, peut être effectué en moins d'une minute par un simple contact du colorant et de l'échantillon sanguin en système aqueux. Dans le procédé ici décrit, il se produit une coloration préférentielle instantanée des noyaux des monocytes. Après avoir assuré 10 min environ de contact avec

le colorant, on peut commencer à observer la faible méta-

chromasie du colorant dans les cellules autres que les monocytes. Cependant, cet effet est retardé, il n'est pas aussi intense, il n'engendre pas de confusion et l'analyse -- des monocytes peut être achevée avec une bonne précision et une bonne reproductibilité à l'aide des colorants du

tableau II.

Dans la recherche qui a conduit au présent exposé, on a évalué un très grand nombre de colorants appartenant à des classes très diverses. La seule classe générale dont la chimie s'est avérée présenter quelques possibilités

pour les fins visées ici a été celle des colorants catio-

niques quaternaires basiques. Parmi tous les colorants disponibles dans cette classe et qui ont été examinés, seuls ceux énumérés au tableau I se sont avérés être fortement métachromatiques avec un développement rapide d'une réponse spectrale différentielle pour au moins quatre types ou espèces différents de leucocytes. Les colorants cités sur le tableau II sont identifiés par

leurscourbesspectrales(courbesspectrales n0 8, 9 et 10).

Ces trois colorants n'ont montré qu'une synergie de métachroma-

tisme limité avec tous les types de leucocytes, mais la spécificité de ces colorants particuliers à l'égard

des monocytes est remarquablement importante.

L'identification et la numération des monocytes ont été simplifiées par la découverte de ce groupe de colorants inhabituels. La réaction classique des estérases non spécifiques, sensible aux fluorures, que l'on utilise en cytochimie pour identifier les monocytes demande souvent au moins une heure pour aller à son terme et exige une manipulation cytochimique précise pour être couronnée de succès. L'un quelconque des colorants précités permet d'effectuer simplement, sans ajustement chimique et en une période de l'ordre de quelques minutes, la coloration d'une suspension de caillot sanguin ou du sang entier et

leur examen. La coloration du noyau des monocytes est ins-

tantanée par le procédé de l'invention.

En utilisation initiale, les colorants du ta-

bleau II identifient immédiatement les monocytes par une coloration caractéristique de leurs noyaux. Pour autant qu'on le sache, on ne connaît pas actuellement de mode

opératoire de coloration instantanée, qui colore spéci-

fiquement le noyau des monocytes. Le colorant de la courbe spectrale n0 10, qui est appelé ici carbocyanine K-5, est le seul colorant basique du type carbocyanine parmi les dix-huit colorants de cette classe proposés par le fabricant (Kodak) pour une étude exploratoire qui se soit avéré efficace pour la coloration de n'importe quel leucocyte. L'intensité progressive de la coloration des noyaux au cours d'une courte période d'exposition

suggère l'existence d'une affinité inhabituelle du colo-

rant "carbocyanine K-5" pour les substances des noyaux des monocytes.

L'identification, la différentiation et la nu-

mération des monocytes ont une grande importance diagnos-

tique. L'augmentation du nombre des monocytes dans le sang peut indiquer la présence d'une tuberculose active, d'une septicémie ou d'un empoisonnement du sang et des lymphomes comme la maladie de Hodgkins. La présence d'un nombre

accru de monocytes dans le sang de personnes en convales-

cence après une anémie hypoplastique ou aplastique peut entraîner un pronostic favorable pour le patient. Des analyses rapides et précises, sous le microscope, des monocytes par le procédé de l'invention permettent et

favorisent une application prolongée d'une technique inté-

ressante de traitement.

La détection, l'identification et la numération

des leucocytes polymorphonucléaires (neutrophiles) consti-

tuent des paramètres critiques dans toutes les évaluations des éléments du sang. Ces éléments sont particulièrement importants pour le diagnostic des infections aiguës comme la pneumonie ou la péritonite, pour lesquelles le nombre

des neutrophiles augmente. Ce sont des paramètres impor-

tants pour la surveillance de monitorage de patients soumis à une chimiothérapie ou à un traitement par des rayons. Des nombres réduits peuvent apparaître dans le cas d'une infection accablante, comme manifestation de la toxicité d'une drogue ou d'un médicament, de l'hyperactivité

de la rate et en cas de leucémie aiguë.

Si le nombre absolu des neutrophiles tombe au-

dessous de 1 000/mm3, le risque d'infection augmente net-

tement. Les colorants de la présente invention colorent en général instantanément les granules ou lysosomes qui constituent la structure caractéristique d'identification

des leucocytes polymorphonucléaires ou neutrophiles.

Les éosinophiles, comme les basophiles, sont impliqués dans les réactions d'allergie. Les lymphocytes sont impliqués en cas d'inflammation et à un plus grand degré dans des réactions d'immunité et en cas de réponse à des antigènes (corps étrangers).

La numération des éosinophiles sert à surveil-

ler l'administration médicale de l'hormone corticotrope ACTH lors du traitement d'états cliniques. Les méthodes antérieures ont introduit des artefacts pouvant susciter une confusion et des formes indéfinies pouvant ressembler

aux éosinophiles. La précision de la numération des glo-

bules du sang diminue avec le temps, dans le cas des tech-

niques de l'art antérieur, entre le moment de la prépara-

tion de l'échantillon du sang et le moment de l'achèvement de la numération. On utilise alors essentiellement des

colorants multiples. Il faut souvent effectuer des colo-

rations à l'aide de colorants acides et basiques. Les

colorants utilisés tendent alors à se séparer de la solu-

tion par cristallisation au repos.

On sait que les lymphocytes, qui peuvent être spécifiquement identifiés à l'aide du bleu Borrel, sont

liés à des inflammations et à des phénomènes immunitaires.

Leur nombre augmente dans le sang de personnes présentant

une leucémie lymphatique chronique et des personnes at-

teintes de coqueluche. La numération peut diminuer dans le cas de patients soumis à une chimiothérapie ou à une

radiothérapie, dans le cas de patients présentant un lym-

phome et divers types de déficiences immunologiques héré-

ditaires. Les basophiles ont un cytoplasme contenant de gros granules riches en des substances cationiques comme

l'héparine, la sérotonine et l'histamine. Ils sont impli-

qués, par exemple, dans des réactions d'allergie.

Le principal progrès dans le domaine en cause a été la découverte qu'il existe un très petit nombre de colorants remarquables qui colorent de façon différentielle les leucocytes, la découverte de l'identité de ces quelques colorants et de la possibilité de les utiliser isolément et sous forme pure pour une identification et une étude, aussi bien manuellesqu'automatiques, de chaque type ou espèce de leucocytes. Il est clair que l'on peut trouver des avantages potentiels à utiliser des combinaisons

de ces colorants remarquablement utiles à des fins cyto-

logiques. Le tableau III illustre les résultats de l'uti-

lisation de combinaisons des colorants spécifiques des tableau I et II. L'utilisation de la carbocyanine K-5 et de l'orangé basique 21 permet, à la température du

sang, une identification et une définition spectrale no-

tablement améliorée des neutrophiles, des éosinophiles,

des basophiles et des monocytes, par rapport à l'utilisa-

tion de l'orangé basique 21 seul.

Le tableau III illustre cinq combinaisons de solu-

tions de colorants fondanentallement utiles et univer-

selles de la présente invention. La combinaison compor-

tant de la prune pure et du bleu Borrel semble présenter une activité synergique d'intensification de la définition spectrale des colorants individuels de la première série des colorants métachromatiques cationiques quaternaires basiques, pour les cinqtypes ou catégories de leucocytes cités. Les colorants présentés au tableau II sont également

utiles et figurent dans les combinaisons du tableau III.

Les huit colorants présentés au tableau I et qui sont précisément identifiés par leur courbe spectrale montrent un métachromatisme inhabituellement complet. Non seulement ils colorent de façon classique les globules en une couleur ou teinte spectrale différente de celle du colorant lui-même,mais tous les colorants présentés au tableau I colorent chacun des cinq types de leucocytes en une teinte différente, que l'on peut distinguer par voie spectrale, dans le cas des quatre premiers colorants, et chaque type ou espèce des quatre leucocytes est coloré par le second groupe de quatre colorants métachromatiques du tableau I. On constate que, dans le cas du second groupe de quatre colorants, seuls les lymphocytes ne sont pas colorés. Les lymphocytes, seuls, peuvent être colorés par du bleu Borrel à 250C pour une étude spécifique, ce qui est une anomalie très intéressante et utile de ce

colorant particulier.

L'étude des huit colorants du tableau I, dont l'identité chimique est bien connue et qui présentent une métachromasie inhabituelle lorsqu'on les utilise sur des

échantillons de sang sans fixateur, comme ici décrit, in-

dique que ces colorant peuvent être classés génériquement comme étant des colorants cationiques, métachromatiques,

basiques, caractérisés par la présence dans leur struc-

ture d'un atome d'azote quaternaire; leur partie anionique

est un ion incolore, commodément un ion halogéné ou ha-

logène et le plus souvent l'ion chlorure.

Une autre qualité nettement définie des colo-

rants utilisables du tableau I et du tableau II de la présente invention est que ces colorants peuvent servir

dans une gamme de température allant d'environ 21 à en-

viron 40C. Dans la totalité de cette gamme de la tempé-

rature, la coloration des types de leucocytes qui sont colorés s'effectue sans altérer ou modifier la morphologie

des globules (la seule modification portant sur la cou-

leur). Pour autant qu'on le sache, le degré de synergie

entre chaque type de leucocytes et les colorants du ta-

bleau I de la présente invention, pour une réponse de métachromatisme lorsqu'on met en contact le colorant et

les constituants cellulaires, est tout à fait remarquable.

Il va de soi que l'examen au microscope optique de la lumière réfléchie et de son spectre comporte des

opérations classiques de choix d'un filtre coloré qui, avan-

tageusement, présente un spectre réglable correspondant à celui de la lumière réfléchie par chaque catégorie (ou par l'ensemble) des leucocytes, et d'un dispositif ou moyen

de comptage ou de numération utilisant notamment la colo-

rimétrie trichromatique.

EXEMPLE 1

(Bleu de Greifswalder - courbe spectrale no 1) Six patients présentant une leucémie lymphoîde chronique typique ont donné des échantillons de 50 ml de sang veineux périphérique (traités à l'héparine). Les

donneurs présentaient de la lymphadénopathie, de l'hépa-

tomégelie, de la splénomégalie, des moelles d'os montrant

le remplacement virtuel par des lymphocytes semblant ma-

tures, et des numérations de globules blancs se situant entre 50 000 et 100 000/mm Dix personnes présumées normales ont donné des échantillons de sang, ainsi que deux patients présentant des syndromes viraux et dont les numérations de globules blancs se situaient entre 11 000 et 15 000/mm3 avec 70 à 80 % de lymphocytes atypiques dans le sang des veines

périphériques. Ces échantillons ont servi pour la compa-

raison et à titre de témoins.

Dans un tube à essai en verre de 10 x 75 mm, contenant cinq gouttes de sang entier, on a introduit également une goutte d'une solution aqueuse fraîchement préparée et filtrée de bleu de Greifswalder (Chroma), à

pH 2,1. On a doucement agité les mélanges et l'on a im-

médiatement examiné une goutte du mélange, en montage humide, sous le microscope optique puis, à des intervalles de 60 s,jusqu'à 15 min après l'addition du colorant à

l'échantillon de sang comportant un anticoagulant (hépa-

rine). (Le sang n'a pas été autrement fixé à l'aide d'un

additif dénaturant quelconque).

Dans les échantillons d'un sang normal, le bleu de Greifswalder a coloré les noyaux et le cytoplasme des

lymphocytes normaux en leur conférant une couleur bleu-

vert. Les neutrophiles ont présenté des granules jaunes, les éosinophiles des granules verts, les basophiles des granules bleus et les monocytes ont présenté un noyau pourpre. Ainsi, le même et seul colorant a permis une identification nette de toutes les classes de globules blancs normaux, chacune présentant une valeur spectrale

identifiable et distincte.

Il a été également trouvé que l'échantillon de

sang additionné de colorant a été stable au chauffage jus-

qu'à la température de 370C (température normale du sang) sans variation de la différentiation caractéristique des

leucocytes présents dans les échantillons.

En comparant des échantillons d'un sang normal avec ceux de patients présentant une leucémie lymphoide chronique, il a été observé que le colorant a coloré les noyaux et le cytoplasme des lymphocytes de leucémiques en leur conférant une couleur brun rouge profond. De cette façon, des lymphocytes normaux peuvent se distinguer de lymphocytes d'une leucémie lorsqu'on se fonde sur une

réaction de coloration différente.

On pense que des applications de cette technique de sorption, par les globules d'un sang encore en vie, de colorants métachromatiques très choisis qui colorent chacun des types de leucocytes selon des spectres colorés différents et identifiables ou qui ne colorent pas l'une des classes ou l'un des types de leucocytes, vont augmenter les possibilités de cytochimie pour l'analyse des éléments figurés du sang. On augmente ainsi les possibilités de numération des divers globules de manière manuelle ou à l'aide d'un équipement automatisé d'établissement d'une

formule leucocytaire du sang, et l'on facilite la confir-

mation d'une maladie par une identification positive.

Le bleu de Greifswalder est un colorant très remarquable du fait qu'à des températures comprenant au moins celles normalement intéressantes en cytochimie et

qui vont des températures ambiantes (250C) à la tempéra-

ture normale du sang (370C), ce colorant confère à chacune des cinq classes ou catégories de leucocytes en cause ici une couleur ou teinte spectrale caractéristique distincte et identifiable du fait de cette différence. Ce colorant

est métachromatique à un degré inhabituel et remarquable.

Le bleu de Greifswalder figure dans le tableau I sans indication d'un numéro de Colour Index. Le colorant

2 4 7 8 3 1 7

est disponible chez Chroma Gesellschaft Schmid & Company,

Stutgart, Unterturkheim (République Fédérale d'Allemagne).

D'autres colorants biologiques utilisés dans la présente invention et énumérés avec l'indication de Chroma comme source peuvent être obtenus en s'adressant à la même compagnie. Une analyse par chromatographie en couche mince du bleu de Greifswalder confirme que ce colorant est un

mélange formé surtout de trois colorants cationiques qua-

ternaires basiques. Des données incomplètes indiquent que ces trois colorants sont probablement la Safranine "O" (CI n' 50240), le bleu de méthylène (CI n0 52015) et le

violet de méthyle (CI n' 42535) ou s'en rapprochent.

Bien que l'expérience prouve que le bleu de

Greifswalder n'est pas un colorant pur, chacun des consti-

tuants ci-dessus est à bon droit classé parmi les colo-

rants cationiques quaternaires basiques. On peut donc considérer que ce colorant fait bien partie de cette classe.

EXEMPLE 2

(Bleu Borrel - courbe spectrale n0 2) Des échantillons de sang veineux périphérique héparinisé ont été obtenus, au moment du diagnostic et avant traitement, sur six patients présentant une leucémie lymphoblastique aiguë, sur huit patients présentant une leucémie myéloblastique aiguë, sur dix patients présentant une leucémie myélomonocytaire aiguë et sur dix volontaires

supposés normaux.

Sur les vingt-quatre cas connus de maladie,

des études cytochimiques de routine ont été effectuées.

Dans le cas de la leucémie lymphoblastique aiguë, des études immunologiques ont indiqué qu'un cas était du type

à cellules B, trois cas du type à cellules indifférenciées.

Le cas du type à cellules B a été positif à l'essai de désoxynucléotidyltransférase terminale. Tous les cas de leucémie aiguë ont été jugés typiques du point de vue

morphologique aussi bien que cytochimique.

2 4783 17

Du plasma riche en leucocytes a été obtenu à partir des

échantillons héparinisés par sédimentation des érythro-

cytes à 4CC en 60 min. A cinq gouttes de plasma riche en leucocytes, ainsi obtenu sur chaque échantillon, dans un tube à essai en verre de 10 x 75 mm, on a ajouté une goutte d'une solution aqueuse fraîchement préparée et filtrée

de bleu Borrel, et l'on a doucement agité les tubes du-

rant plusieurs secondes. A des intervalles de 1 à 10 min

à une température d'environ 210C, on a retiré des échan-

tillons du mélange des cellules et du colorant et on les a examinés sous le microscope sous forme d'un montage humide. En raison de la similitude censée exister entre

le bleu de méthylène et le bleu Borrel, un essai de con-

trôle a été effectué en ajoutant une solution aqueuse à 1 % de bleu de méthylène à des échantillons séparés de leucocytes normaux et de leucocytes de leucémie. Tous les échantillons ont été traités et examinés de manière semblable. Une huile d'immersion a été utilisée comme milieu de montage, car on avait antérieurement noté un

affaiblissement de teinte en cas d'utilisation de "Per-

mount". Peu après l'addition du colorant, on a vu

dans le champ du microscope l'adhérence de petites parti-

cules du colorant le long de la membrane cellulaire des lymphocytes normaux et des lymphoblastes de leucémie provenant de tous les patients présentant une leucémie lymphoblastique aiguë. Dans tous les types normaux et autres types cytologiques de blastes de leucémie, une adhérence du colorant à la membrane cellulaire ne s'est

pas produite de manière visible.

Dans les lames présentant une adhérence des particules du colorant, la membrane cellulaire est apparue plus rugueuse avec de faibles excroissances. Une légère coloration bleue et des nucléoles sont apparus au bout de plusieurs minutes-dans ces cellules, et cela a viré au bleu foncé en 5 min environ. Les lymphocytes normaux et

247 317

et les lymphoblastes de leucémie sont alors apparus dégé-

nérés avec un noyau et du cytoplasme délabrés. La colora-

tion bleu foncé du noyau, que l'on trouve dans les lympho-

blastes de leucémie, n'a pas été observée dans les mono-

cytes de leucémie et les myéloblastes de leucémie. Les cellules lymphoides ont présenté une couleur bleu-vert foncé. Au bout de 10 minutes, seule une pâle coloration jaune du noyau et une coloration en vert clair des granules a été décelable dans les neutrophiles, les éosinophiles et les basophiles. Dans les monocytes, des structures en

forme de bâtonnets colorés en bleu (probablement des mito-

chondries) ont été décelables.

Dans le cas comparatif d'utilisation du bleu de méthylène, on a vue une coloration faible mais observable du noyau des lymphocytes normaux et des lymphoblastes de leucémie, mais cette coloration a présenté une intensité spectrale sensiblement moins nette que dans le cas du

bleu Borrel.

Dans un mode opératoire d'essaisséparés, appli-

qué à des échantillons semblables d'un sang humain normal après sédimentation, à la température d'environ 370C (température normale du sang), il a été découvert une démarcation très intéressante concernant la coloration des leucocytes. A cette température, tous les leucocytes sont devenus colorés (comme l'étaient tous les leucocytes

en présence du bleu de Greifswalder de l'exemple i à en-

viron 220C). Dans ce cas, les neutrophiles ont présenté des granules bleus, les éosinophiles des granules pourpres, les basophiles des granules rouges, les lymphocytes un

cytoplasme et du noyau bleu-vert et les monocytes un cyto-

plasme pourpre ainsi que des granules rouges à roses.

Ainsi, avec du bleu Borrel à de basses tempé-

ratures ambiantes (inférieures à environ 250C), seuls les lymphocytes ont présenté une forte sorption de coloration spectrale, mais à la température normale du sang (370C),

tous les leucocytes ont été identifiables de manière dif-

férentielle par la sorption spectrale caractéristique d'un

seul colorant.

La sensibilité à la température de ce colorant

métachromatique cationique quaternaire basique inhabi-

tuel permet une nette différentiation des lymphocytes, car le noyau des lymphocytes est ainsi coloré en bleu-

vert à environ 21'-250C.

Tous les autres leucocytes ne sont pas colorés, et l'on peut effectuer sous le microscope, à cette basse

température, toutes les études cytologiques que l'on es-

time nécessaires. Cependant, à la température normale du sang chaud (370C) , tous les autres leucocytes, à savoir les neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles et les monocytes, se différencient chacun des autres lorsqu'on

utilise un seul colorant métachromatique.

L'essai à 370-400C (tableau III) de mélanges du bleu Borrel avec du violet basique 16 a donné peu de changement, sauf que l'on a observé que toutes les couleurs

sont légèrement moins vives pour les monocytes, qui pré-

sentent également des noyaux roses.

Il est probable qu'une numération à l'aide d'un instrument et d'une calculatrice sera rendue plus précise

lors de la différentiation par une méthode optique utili-

sant une machine et des mélanges de colorants, notamment dans le cas des études des monocytes. LQrsqu'on a utilisé, par exemple, le bleu Borrel avec du violet basique 16 (tableau III) sur du sang chaud (370C), on a noté que

toutes les couleurs des leucocytes colorés ont été légère-

ment plus foncées et plus nettes que lors de l'utilisation

du bleu Borrel seul à la même température.

Des recherches poussées n'ont pas indiqué la structure exacte du bleu Borrel. Cependant des directives pour sa fabrication ont été trouvées dans "Microtomists Formulary and Guide" (guide et formulaire pour utilisateur de microtomes), ouvrage publié par Blaikston & Company, New York (1956), dans lequel l'un des auteur, Peter Gray, révèle une méthode de fabrication consistant à préparer tout d'abord une solution alcaline de nitrate d'argent en

ajoutant une solution aqueuse à 3 % d'hydroxyde de so-

dium à 100 ml d'une-solution à 0,5 % de nitrate d'argent jusqu'à ce qu'ilne se produise plus de précipité. Le précipité est lavé et clarifié par décantation. On ajoute au précipité une solution aqueuse à l % de bleu de méthy- lène. On fait bouillir durant 5 min, on refroidit et filtre

pour obtenir le "bleu de Borrel".

Il est donc clair que le colorant ainsi produit est un colorant métachromatique cationique quaternaire basique, qui peut éventuellement comporter un hydroxyle

à la place de l'anion halogène d'origine, ou qui est peut-

être complexé avec le fragment argent.

Le colorant est indiqué comme bleu de Borrel Michrome no 376 dans le dernier catalogue de E. Merck

1s (Ed. Gurr).

EXEMPLE 3

(Bleu de rhodanile - courbe spectrale n0 3)

De multiples échantillons de sang veineux péri-

phérique ont été obtenus sur des volontaires normaux et des volontaires leucémiques. On en a obtenu des leucocytes de "couenne" ou croûte de caillot par centrifugation de

parties aliquotes, d'un volume de 50 ml de sang hépa-

rinisé et enlèvement de la couche de croûte avec remise

en suspension dans du plasma autologue, ou par sédimenta-

tion du sang entier contenant 5 ml de dextrane à 6 % dans

une solution saline normale puis récupération des leuco-

cytes de la couche de plasma. Une série analogue a utilisé

du sang entier.

Les volontaires comprenaient des patients pré-

sentant une leucémie monocytaire.aiguë, une leucémie myéloblastique aiguë, une leucémie lymphoblastique aiguë,

une leucémie granulocytaire chronique, une leucémie lym-

phocytaire chronique et une leucémie des cellules de plasma ainsi que des patients présentant de la monocytose (500/mm3

associée à de la septicémie.

A des échantillon de sang normal ou de sang

leucémique contenant 6 x 106 leucocytes par milli-

litre, on a ajouté deux gouttes d'une solution aqueuse fraîchement préparée et filtrée à 1 % de bleu de rhodanile (Gurr, voir la courbe spectrale n0 3) à pH 3,1 dans un tube à essai en verre de 10 x 75 mm. Les tubes contenant le mélange ont été agités durant plusieurs secondes et mis à incuber à la température ambiante durant-5 min. A des intervalles d'une minute après cette addition, une goutte du mélange a. été regardée en montage humide, sous une

lamelle en verre propre, dans un microscope optique clas-

sique.

Dans des échantillons de sang normal et de sang provenant de patients présentant de la septicémie et de la monocytose, les neutrophiles ont contenu de nombreux

* granules colorés en magenta et dont la dimension, l'em-

placement et le nombre ont correspondu à des granules

rendus visibles par des colorants panoptiques classiques.

Le cytoplasme des neutrophiles a été coloré en rouge. Les lymphocytes et les monocytes n'ont contenu que quelques

petites structures bleues semblant granulaires et ana-

logues à de la poussière. Les éosinophiles ont contenu des granules colorés en violet foncé ou en pourpre, et les basophiles ont contenu des granules rouges. Les noyaux des lymphocytes se sont colorés en bleu-vert intense. On a observé une coloration du cytoplasme des monocytes en lilas pâle. Les noyaux de tous les leucocytes du sang périphérique (ou sang circulant) se sont colorés en vert pâle.

Dans des échantillons de sang provenant de pa-

tients présentant une leucémie myéloblastique aiguë et une leucémie lymphoblastique aiguë, on a pu voir de rares petites structures granulaires bleues dans le cytoplasme des blastes de leucémie. Ces structures ont semblé plus nombreuses dans le cas des myéloblastes de leucémie. Une coloration du cytoplasme n'a pas été décelable dans les

conditions de l'expérience.

*Dans des monocytes de leucémie provenant de patients présentant une leucémie monocytaire aiguë, on a trouvé dans le cytoplasme de la plupart des blastes des structures bleues semblant ponctuées. Dans la minute qui a suivi l'addition du colorant, les blastes de tous les patients présentant une leucémie monocytaire aiguë ont montré une coloration remarquable en rose profond du cyto- plasme. Dans certains cas, cette coloration a présenté une configuration laminaire striée. Dans d'autres cas, la coloration a été profonde et diffuse. Les nucléoles de ces types de blastes de leucémie et d'autres types de blastes de leucémie ont présenté une faible coloration violacée. Dans du sang de patients présentant une leucémie

granulocytaire chronique, une leucémie lymphocytaire chro-

nique ou une leucémie à plasmocytes, les monocytes n'ont pas présenté de coloration rose du cytoplasme. De même, les lymphocytes de leucémie et les cellules d'un plasma néoplastique n'ont pas montré de coloration distincte du

cytoplasme par le bleu de rhodanile.

Le bleu de rhodanile est un colorant obscur (peu connu) formé par la condensation de la rhodamine B avec du bleu Nil (voir la courbe spectrale n0 3). Jusqu'alors, ce colorant a eu une application limitée en cytochimie. Des

études montrent une coloration métachromatique rose re-

marquable du cytoplasme des monocytes de leucémie par du bleu de rhodanile, colorant dont la couleur ordinaire est du bleu. Cette couleur spectrale n'est pas celle observée dans des monocytes normaux. La coloration des monocytes par le bleu de rhodanile semble utile pour distinguer les monocytes normaux, qui présentent une faible coloration métachromatique pourpre ou lilas, des monocytes de leucémie qui montrent une réaction métachromatique rose intensément positive. Lorsqu'on a utilisé une solution de coloration classique pour des substances métachromatiques, il n'a pas été possible de mettre en évidence ces matières lors d'études effectuées sur des cellules fixées. On suppose

que les structures bleues, paraissant ponctuées, du cyto-

plasme des blastes de leucémie,que le colorant vital bleu de rhodanile a colorées,représentent des lysosomes et/ou des mitochondries. La ou les substances du cytoplasme, responsables de la métachromasie rouge notée dans le cas de l'utilisation du bleu de rhodanile sur des cellules vivantes, ne sont pas identifiées. Il est suggéré que la métachromasie rouge avec du bleu de rhodanile complète le test déjà existant de détermination des propriétés des mnonocytes par recherche d'une estérase non spécifique sensible au fluorure. S'il est

i0 intéressant pour marquer des cellules d'origine monocy-

taire, ce test cytochimique est limité dans sa spécificité, puisque de nombreux types de cellules ou globules présentent une activité d'estérase non spécifique. On pense que la

sensibilité au fluorure amplifie la spécificité-de l'esté-

rase non spécifique de type monocytaire. Tel qu'il est

actuellement formulé, le test cytochimique de détermina-

tion d'une estérase non spécifique est souvent difficile à réaliser, puisqu'il dépend d'ajustements précis du pH, ainsi que de substrats frais et d'interactions complexes

entre le colorant et les substances de liaison ou copu-

lation. En comparaison de la réaction de détermination de l'estérase non spécifique dans le cas des monocytes normaux ou de leucémie, la réaction métachromatique du bleu de rhodanile possède quelques avantages. Elle est avantageuse pour identifier les blastes de leucémie. La

sélectivité de coloration des monocytes de leucémie sug-

gère la présence dans ces cellules d'une anomalie remar-

quable, voire unique et en tout cas non identifiée jusqu'à

présent, en comparaison des monocytes normaux. La colora-

tion est avantageuse aussi du fait qu'elle peut être ap-

pliquée à des globules vivants de leucémie aiguë qui n'ont pas été soumis à diverses formes de fixation telles qu'on

les utilise dans des techniques classiques de cytochimie.

Cette technique de coloration vitale minimise les problèmes soulevés par les artéfacts de coloration et de fixation pouvant se présenter dans des spécimens traités de la

façon usuelle.

Le test au bleu de rhodanile est rapide (moins

d'une minute du départ à la fin) en comparaison d'une pé-

riode d'au moins une heure pour la coloration cytochimique habituelle de recherche d'une estérase non spécifique. De même, la mé- tachromasie rose obtenue avec le bleu de rhodanile n'exige pas l'utilisation d'un inhibiteur comme du fluorure de

sodium puisque, jusqu'à présent, aucun autre type de glo-

bules de leucémie ne semble présenter la réaction méta-

chromatique rose. A mesure que l'expérience s'accumule, notamment avec d'autres types de leucémie comprenant la leucémie à cellules ciliées et la phase leucémique du lymphome à histiocytes, la réaction métachromatique rose

produite par le bleu de rhodanile promet d'être une addi-

tion importante à l'étude cytochimique des cellules et

globules de la leucémie aiguë.

Le tableau I indique la coloration des leucocytes normaux par le bleu de rhodanile. Le bleu de rhodanile possède la structure chimique ci-après: {H ^^^^a c(o.N <CzH Jh Ci N<c2HsL C49H48N503C1: poids moléculaire 780,902 Un diagnostic cytotopique exact est essentiel, car il existe maintenant un traitement spécifique pour chaque type cytotopique de leucémie aiguë. Le bleu Borrel, le bleu de rhodanile et la carbocyanine K-5 ont tous servi avec succès, dans le travail ici décrit, à distinguer un genre de globules de leucémie aiguë d'un autre genre de

globules.

EXEMPLE 4

(Bleu de nuit - courbe spectrale no 3) Des leucocytes de couche de caillot ou de couenne

(concentration finale:5 x 106/ml) ont été préparés à par-

tir de 60 ml de sang veineux héparinisé provenant de dix volontaires normaux. Ces préparations ont été obtenues

par centrifugation de sang périphérique héparinisé, en-

lèvement de la couche de croûte ou de couenne et remise

en suspension dans du plasma autologue ou par sédimenta-

tion. Dans des expériences séparées, on a également utilisé

du sang entier.

Une goutte d'une solution aqueuse filtrée à 1 %

de bleu de nuit (Chroma) fraîchement préparée à été incor-

porée à cinq gouttes de l'échantillon de sang obtenu comme

décrit ci-dessus. Les mélanges de leucocytes et de colo-

rants ont été doucement agités, et une goutte du mélange a été examinée immédiatement sous forme de montage humide sous un microscope optique, puis à des intervalles de

s jusqu'à 15 min après l'addition du colorant à l'échan-

tillon de sang. Lorsque l'on a utilisé des techniques cyto-

chimiques classiques de détermination de myéloperoxydase

d'une estérase spécifique, d'une estérase non spé-

cifique avec du fluorure et PAS, les leuco-

cytes du sang périphérique ont montré des réactions ty-

piques.

Pour établir les propriétés de coloration des lysosomes par le colorant, des lysosomes (granules) ont été séparés de cellules granulocytiques (leucocytes polymorphonucléaires, éosinophiles, basophiles) de 100 ml de sang veineux périphérique obtenu sur cinq volontaires

présumés normaux d'après des méthodes bien établies.

secondes après l'addition du bleu de nuit à une suspension préparée de leucocytes des échantillons sanguins précités ou à du sang entier, les granules de leucocytes polymorphonucléaires se sont colorés en brun jaune. En une minute-, les granules se sont colorés en vert foncé. Les noyaux des leucocytes polymorphonucléaires ont semblé colorés en vert pâle. Au bout d'une minute, les noyaux des lymphocytes ont paru ne pas être colorés (ou

présentaient une très faible coloration lavande). Cer-

tains des lymphocytes ont contenu des structures de formes en bâtonnets semblant vertes et correspondant, par leur dimension et leur forme, à des mitochondries telles qu'on peut les rendre visibles avec du vert Janus B.

Le cytoplasme des lymphocytes n'a pas semblé se colorer.

Au bout d'une minute, les noyaux des monocytes ont paru être de couleur lavande pâle et, au bout de 2 min, les noyaux de monocytes ont semblé être de couleur pourpre profond. Le cytoplasme des monocytes a semblé d'un vert intense, et il a contenu une structure bleue semblant

granulaire ainsi que des structures vertes semblant fi-

brillaires. Avec des propriétés tinctoriales nettement développées, les monocytes peuvent se distinguer nettement d'autres leucocytes du sang périphérique. Dans la minute qui a suivi l'addition du colorant à des préparations de cellules, les granules des éosinophiles se sont colorés en bleu et les granules des basophiles en un pourpre métachromatique. Les noyaux de ces cellules ont semblé

ne pratiquement pas se colorer (ou en lavande très pâle).

En se fondant sur des limitations inhérentes à des spécimens colorés par des colorants panoptiques, un certain nombre de tests cytochimiques ont été mis au point pendant les quelques dizaines d'années précédentes, en vue de distinguer plus précisément un type de globules

du sang d'un autre type. En général, ces tests sont-des-

tinés à déceler une quantité accrue d'un type de substance dans une cellule ou un globule particulier, en comparaison

d'un autre globule, ou en vue de déceler une ou des sub-

tances dans un organisme caractéristique d'une cellule par

rapport à une autre. Par exemple, l'activité d'une esté-

rase non spécifique est habituellement élevée chez les

monocytes, et cette activité semble particulièrement sen-

sible à une inhibition par du fluorure de sodium. De même, l'identification des cellules granulocytaires dépend, pour

la plupart, d'une démonstration de propriétés de lysosomes.

Pour cela, la détection d'activités demyéloperoxydase et

d'estérase spécifique a été utile pour des tests cyto-

chimiques. Les granules de lysosomesdes éosinophiles con-

tiennent de la myéloperoxydase qui résiste à une inhibi-

tion par du cyanure de sodium, et des granules de baso-

philes présentent une coloration métachromatique sous l'effet de divers colorants, ce qui est dû en partie à leur teneur élevée en des substances cationiques comme l'héparine. Jusqu'à présent, on n'a pas décrit un test cytochimique généralement accepté pour la détection et

l'étude des lymphocytes.

Les présentes études montrent une coloration vitale rapide des leucocytes du sang périphérique par le bleu de nuit. Le bleu de nuit est un colorant basique peu connu dont la formule chimique est présentée à la fin du présent exemple. Il a été rarement utilisé pour des

colorations en biologie. La coloration vitale des granu-

locytes humains normaux par le bleu de nuit montre rapi-

dement que ces cellules peuvent se distinguer les unes des autres en se fondant sur des propriétés de coloration et la dimension des lysosomes, et qu'elles peuvent se distinguer d'autres globules sanguins ne contenant pas ces types de lysosomes. En outre, l'absence virtuelle de

coloration des lymphocytes par le colorant facilite l'iden-

tification des lymphocytes.

Les monocytes montrent une réaction particu-

1èiêrement intense de coloration du noyau, ainsi que de coloration du cytoplasme. Alors que le colorant lui-même est bleu profond en solution et qu'il présente une seule crête d'absorption à 616 nm (voir la courbe spectrale no 4), les noyaux des monocytes se colorent en pourpre profond

et le cytoplasme des monocytes en vert-bleu à vert pro-

fond. Le cytoplasme des monocytes contient des structures

fibrillaires qui se colorent en vert et dont l'identifi-

cation est facile par la technique de coloration vitale.

Ces structures peuvent être analogues à des structures 2i78317 laminairesfibrillaires semblables mises en évidence dans des études d'ultrastructures des monocytes humains. Puisqu'on

ne les trouve pas dans d'autres types de leucocytes hu-

mains normaux, les structures fibrillaires vertes peuvent également servir à distinguer les monocytes d'autres types

de leucocytes.

En comparaison des solutions classiques en

cytochimie pour la coloration d'identification des mono-

cytes, des leucocytes neutrophiles, éosinophiles et baso-

philes, la coloration vitale des leucocytes du sang péri-

phérique par le bleu de nuit présente plusieurs avantages.

Elle est avantageuse car elle est rapide et demande moins de 2 min pour le développement du maximum de couleurs. Elle

est avantageuse aussi car elle évite l'utilisation de sub-

strats synthétiques et de colorants azoiques complexes et

de substances de copulation ou de liaison comme on en uti-

lise dans des tests cytochimiques classiques. Les tests cytochimiques antérieurs sont difficiles à interpréter en raison d'une précipitation non spécifique des réactifs

colorés, d'une détérioration des substrats et de la néces-

sité d'ajustements complexes du pH et de la teneur en

ions métalliques.

La technique ci-dessus de coloration vitale, qui utilise des globules sanguins vivants et leurs affinités différentielles pour une coloration vitale par du bleu de nuit, évite la production d1artéfacts apparaissant souvent

en présence de fixateurs classiques. Le demandeur consi-

dère que la technique de coloration vitale proposée ici

permet, de façon plus précise qu'en utilisant les solu-

tions classiques de coloration actuellement en usage, de localiser dans la cellule le colorant associé, par exemple, à des lysosomes, à des structures fibrillaires, à de la chromatine de noyau. Avec l'accumulation de l'expérience et l'amélioration de la technologie d'automatisation de

détermination d'une formule leucocytaire du sang, la colo-

ration vitale de leucocytes du sang périphérique par du bleu de nuit apportera une contribution importante à la cytochimie des globules sanguins et des cellules de la

moelle osseuse.

Le bleu de nuit possède la structure chimique suivante O/O N(C2Hs)a

HN CQ [CI-]

CH3

C38H42N3

poids moléculaire 576; poids cationique 541

EXEMPLE 5

(Prune pure - courbe spectrale n 5) On a ajouté une goutte d'une solution aqueuse à l % du colorant prune pure (également connu sous le nom

de bleu Gallo E; courbe spectrale no 5), fraîchement pré-

parée avant utilisation, à cinq gouttes d'une suspension de leucocytes de caillot (concentration finale: 5 x 10 6/mM, préparée à partir de 60 ml de sang veineux héparinisé

provenant de dix volontaires normaux. Dans une série sé-

parée d'expériences, on a utilisé du sang veineux entier plutôt que la croûte de caillot ou "couenne". La température de l'échantillon de sang et du colorant a été maintenue au voisinage de 370C (température du corps) , des essais préalables ayant établi que le colorant peut s'utiliser

à une température supérieure à 21'C jusqu'à environ 40'C.

Au bout de 2 min environ, le nucléoplasme des monocytes s'est coloré en pourpre intense, notamment dans les zones d'hétérochromatine. Le cytoplasme des monocytes est apparu en pourpre. Les noyaux des lymphocytes se sont colorés en lavande très pâle (ou ne se sont pas colorés du tout). Les leucocytes polymorphonucléaires ont présenté des granules bruns, les éosinophiles des granules verts et

les basophiles ont été identifiés par des granules pourpres.

?4783 1 7

Les érythrocytes et les plaquettes n'ont pas présenté de

coloration visible.

On a ainsi trouvé une nouvelle application inat-

tendue d'un colorant antérieurement peu connu et qui servait alors principalement à la teinture des textiles. La colora- tion du noyau et du cytoplasme est rapide et elle permet facilement de distinguer les quatre classes de leucocytes

qui se colorent et la variété restante du groupe des glo-

bules blancs, les lymphocytes, qui résiste à une coloration métachromatique par ce colorant cationique quaternaire basique, lequel possède la structure suivante Prune pure

COOCH,

ci (H,C)aN.4 v OH C16H15N205Cl; poids moléculaire 350,761

EXEMPLE 6

(Violet de Hofmann - courbe spectrale no 6) On a utilisé une série d'échantillons, de 60 ml

chacun, de sang veineux héparinisé provenant de dix volon-

taires normaux, pour préparer, dans des tubes à essai en verre de 10 x 75 mm, un groupe d'échantillons contenant des leucocytes de caillot ou de couenne et un autre groupe

d'échantillons contenant du sang entier (cinq gouttes).

On a préparé une solution aqueuse contenant 1 %

de violet de Hofmann, qui est un colorant cationique qua-

ternaire métachromatique basique dont le numéro du Colour Index est CI no 42530. On pense que la structure suivante représente le vrai violet de Hofmann. Cependant, la courbe spectrale n0 6 (figure 6 annexée) constitue "l'empreinte digitale" du colorant utilisé dans ce travail exploratoire et la preuve décisive de ce que l'on entend désigner par

le nom utilisé ici.

On pense que le vrai violet de Hofmann possède la structure suivante /(OQ N(C2Hs)2 o,/O -N( aHsX ch3[l CH,

C38H42N3C1

poids moléculaire 576; poids cationique 541 L'importance du nombre et de la qualité des substituants alkyles (méthyle et éthyle) n'a pas encore

été étudiée.

On a incorporé, au contenu de chacun des tubes à essais, à la température du sang normal (370C) une goutte de la solution aqueuse fraîchement préparée à 1 %

du colorant cationique métachromatique basique correspon-

dant à la courbe spectrale no 6. On a examiné des gouttes des échantillons en montage humide, sous le microscope optique, à des intervalles d'une minute jusqu'à 15 min

après l'addition du colorant à l'échantillon de sang.

Les monocytes ont présenté une coloration en pourpre intense du noyau et du cytoplasme, et les granules ont été colorés en rouge. En 2 min, tous les leucocytes

du sang périphérique ou circulant, à l'exception des lym-

phocytes, ont présenté une différentiation spectrale: les

neutrophiles ont présenté des granules verts, les éosino-

philes des granules pourpres, les basophiles des granules rouges, les lymphocytes n'ont essentiellement pas été

colorés et les monocytes ont été caractérisés par la pré-

sence d'un noyau pourpre et de granules rouges. La méta-

chromasie du colorant s'est ainsi fortement manifestée.

L'utilisation de la technique de coloration vitale ci-

dessus a minimisé l'amplitude et l'importance de certains des problèmes apparaissant lors d'une fixation et de l'utilisation de substrats synthétiques et a minimisé également les interactions complexes entre des produits

de catalyse enzymatique et de colorants azolques instables.

Un équipement automatisé de détermination de la formule leucocytaire peut ainsi devenir plus applicable,, grâce

à l'utilisation d'un microscope optique (à lumière nor-

male), ce que permet le caractère métachromatique de ce colorant spécifique, ainsi que celui des autres colorants qui se sont avérés présenter une métachromasie extrême de différentiation des leucocytes précités, comme illustré

dans le présent mémoire.

EXEMPLE 7

(Orangé basique n0 21 - courbe spectrale no 7) On a préparé à la concentration de 1 % en milieu

aqueux une série de colorants méthiniques et polyméthini-

ques, à identification chimique spécifique. Dans le large groupe de ces colorants cationiques quaternaires basiques,

on a trouvé qu'un seul est métachromatique. Ce seul colo-

rant métachromatique a coloré des granules d'éosinophiles en brun, des basophiles en rouges, et des granules du

cytoplasme de monocytes en orangé, ce qui permet une dif-

férentiation spectrale des catégories du groupe des leu-

cocytes. On a trouvé aussi que, de façon tout à fait re-

marquable, la coloration différentielle des neutrophiles aussi bien matures qu'immatures est plus spécifique que celle obtenue à l'aide de n'importe quel colorant ayant la caractéristique métachromatique de colorer de manière différentielle plusieurs leucocytes. Il a été trouvé que

les neutrophiles matures peuvent être identifiés spec-

tralement par la présence de granules d'un jaune sombre et que des granules immatures peuvent être identifiés par leur réflexion spectrale orange. Seuls les lymphocytes semblent ne pas avoir accepté la coloration ou ne pas être colorés dans un spectre identifiable. Cependant, lorsqu'on combine ce colorant avec du bleu Borrel, on constate que l'ensemble des cinq catégories de leucocytes

spécifiques est spectralement identifiable (voir tableau III).

Le colorant polyméthinique en cause est identi-

fié comme étant un colorant métachromatique cationique quaternaire basique ayant la courbe spectrale n0 7. Le colorant a été identifié comme étant de l'orangé basique lno 21 (également connu sous le nom de orangé Albright et de orangé G Astrazone (200)). La structure chimique est indiquée ci-après, et ce colorant est encore désigné par

le n0 CI 48035.

orangé basique n0 21 Colour Index n0 48035 Comme indiqué sur le tableau III, il a été trouvé que ces combinaisons de carbocyanine K-5 et de l'orangé basique no 21 ont une meilleure différentiation spectrale permettant de distinguer et d'identifier en vue d'une numération, dans un seul échantillon de sang, les neutrophiles, les éosinophiles, les basophiles et les

monocytes. La définition des monocytes a été considérable-

ment plus nette et plus prononcée que lorsque l'on utilise

l'autre colorant seul, ce qui indique un effet de synergie.

EXEMPLE 8

Zrouge basique 13 (courbe spectrale n0 8; CI 48015) et violet basique 16 (courbe spectrale n0 9; CI 48013)7 On a évalué vingt-deux colorants provenant d'une

source commerciale. Parmi eux, un seul a été remarquable-

ment metachromatique. C'est l'orangé basique 21 (courbe spectrale n0 7) de l'exemple 7. Deux autres de cette série

se sont avérés être très inhabituels car, comme la carbo-

cyanine K-5 de l'exemple 10 (courbe spectrale n0 10), ils ont coloré spécifiquement l.es monocytes seulement, et cette

coloration a été instantanée. Ils sont cités en tête de cet exemple.

Ces deux derniers colorants, comme tous les colorants usuels décrits dans la présente invention et

dont la structure est connue, sont des colorants orga-

niques cationiques quaternaires basiques capables de co-

lorer des leucocytes et, dans ce groupe particulier de

globules, ils ne colorent spécifiquement que les mono-

cytes. Dix personnes présumées normales ont donné des échantillons de sang veineux. Chaque échantillon a été prélevé, additionné d'héparine, utilisé sous forme de sang entier et préparé pour l'obtention d'une suspension de caillot sans fixation. Des solutions aqueuses à la concentration d'environ 1 % de chacun des colorants purs ci-dessus indiqués ont été fraîchement préparées dans de l'eau distillée et filtrées. A cinq goutte du sang entier ou de la suspension riche en leucocytes, dans deux séries successives d'échantillons de sang provenant de chacun des dix patients, on a incorporé une goutte de la solution

de rouge basique 13 et, dans la seconde série, une solu-

tion de violet basique 16. Dans les essais effectués sur les première etseconde séries, seuls les monocytes ont présenté une coloration immédiate avec les deux colorants ci-dessus. Dans le cas du rouge basique 13, le noyau s'est coloré en rouge ainsi que le cytoplasme. Dans la série avec le violet basique 16, le noyau a été plus rose et le

cytoplasme a également présenté une couleur pouvant géné-

ralement se classer dans le rose. Alors que l'aspect des couleurs était spectralement différent, on n'a disposé

d'aucun instrument de colorimétrie trichromatique précise.

La coloration des monocytes a, cette fois encore, été remarquable, comme dans le cas de l'utilisation de la carbocyanine K-5 de l'exemple 10, et chacun des trois colorants a donné une coloration de couleur suffisamment

différente pour permettre à l'oeil de déterminer l'exis-

tence de différences (voir tableau II).

On a utilisé aussi ces trois colorants en les combinant aux principaux colorants du tableau I, comme

représenté sur le tableau III.

Il a été observé que si un seul colorant pur,

(camne dans le cas du tableau I) permet d'obtenir une ré-

ponse spectrale assez différente pour clairement identifier chaque espèce de leucocytes, certaines combinaisons, no- tamment celles obtenues à l'aide d'au moins l'un des trois colorants:la carbocyanine K-5, le rouge basique 13 et le violet basique 16, offrent la possibilité d'une certaine

synergie observée pour l'intensité des couleurs.

Voici la structure chimique du rouge basique 13 CH3 i -013 CH2CH12ClCI

- C _

C3 + rouge basique 13

CI 48015

Voici la structure chimique du violet basique 16 2 5 téC2C-> Ns CH

CH3 + H

violet basique 16

CI 48013

On sait que le brevet des Etats-Unis d'Amérique n0 2 179 895 décrit des colorants de la série méthinique englobant le rouge basique 13. Ce colorant est également connu sous le nom de rose Genacyl G, rose Astrazon FG, rose basique 2S, rose cationique, etc. Voici d'autres noms du violet basique n0 16 violet rouge Astrazon 3R; Astraviolet 3R, rouge brillant Sevron 2-B, etc.

EXEMPLE 9

(Bleu de toluylène - courbe spectrale n0 11) Le bleu de toluylène, obtenu par la condensation

de la m-toluylène-diamine avec le chlorhydrate de p-nitroso-

diméthylaniline, a été préparé sous forme d'une solution

* aqueuse à 1 % et filtrée, comme dans les exemples précé-

dents. Comme dans les exemples précédents aussi, du sang veineux provenant de dix volontaires normaux a été

réparti en deux séries d'échantillons sanguins identifiés.

Une série a donné lieu à la préparation de suspensions de leucocytes de caillot ou de couenne. Une seconde série a

été traitée sous forme du sang veineux entier. Les échan-

tillons ont été maintenus dans une boîte chaude à envi-

ron 370C.

Une goutte de la solution du colorant a été

incorporée à chacun des échantillons en vue de leur obser-

vation. Dans chacun des cas, comme indiqué ci-dessus, l'échantillon contenant du colorant a été soumis à une

observation sous un microscope optique, comme cela cons-

titue le mode opératoire général d'observation "manuelle" des leucocytes. Dans chaque cas, dans les 5 min environ

qui ont suivi l'incorporation du colorant aqueux à l'échan-

tillon de sang préparé sans aucun fixateur comme l'alcool

méthylique, la formaline, etc., les neutrophiles ont pré-

senté un noyau bleu et des granules jaunes, les éosino-

philes se sont distingués par des granules pourpres, les

basophiles ont présenté des granules rouges, les lympho-

cytes un noyau vert et les monocytes ont présenté un noyau pourpre et du cytoplasme pourpre. L'utilisation d'un seul colorant métachromatique pur, caractérisé par sa nature cationique, la présence d'un atome d'azote quaternaire et d'un anion halogène, a permis de différencier par voie

spectrale l'une de l'autre chacune des espèces ou caté-

gories de globules blancs du sang. S'il a déjà été établi

que certains colorants peuvent donner à des spécimens bio-

logique une couleur différente de celle du colorant (méta-

chromasie), on n'a pas encore indiqué qu'un seul colorant

basique pur, sans réglages externes de pH ni autre pré-

paration, peut servir à colorer des leucocytes à la température du corps dans un milieu environnant aqueux,

sans fixation, pour permettre d'identifier par des dif-

férences spectrales chacune des cinq espèces individuelles

de leucocytes.

Voici la formule structurelle générale du bleu de toluylène NH2 H2N Q N <" N(CH,)z [CrI HC C15H19N 4c poids moléculaire 291; poids cationique 256

EXEMPLE 10

(bromure de 1,1 -diéthyl-2,2 1-cyanine; courbe spectrale 10) Dix-huit colorants du groupe des carbocyanines, présentant les structures chimiques et les potentiels rédox progressifs énumérés dans Science, 30 avril 1974 et Scientific American, mai 1974 (publicité Kodak) ont été

soumis à des essais d'évaluation de leurs avantages poten-

tiels pour des études du sang encore vivant d'un leucémique.

A) Dans des séries d'essais effectués en double, des échantillons de plasma riche en leucocytes et de sang entier provenant de personnes normales et de patients

présentant une leucémie aiguë ont été soumis à une colo-

ration effectuée avec chacun des dix-huit colorants de

l'ensemble de la série précitée à potentiels rédox progres-

sifs. On a mélangé par douce agitation une goutte d'une solution aqueuse à 1V% du colorant pur avec cinq gouttes

de l'échantillon de sang héparinisé contenant des leuco-

cytes. Seul le bromure de 1,1 -diéthyl-2,2 -cyanine ci-dessus (appelé ici "carbocyanine K-5") a donné une sorption spectrale intense ou coloration instantanée des leucocytes, spécifiquement dans le cas des monocytes. Une coloration progressive en rouge des noyaux a continué à

se développer en une demi-heure. La raison de la sélecti-

vité particulière de ce colorant pour les noyaux des mo-

nocytes uniquement n'est pas entièrement expliquée. On constate cependant qu'il s'agit d'un colorant cationique quaternaire basique présentant une qualité ou propriété remarquable.

B) Des échantillons de sang encore vivant pro-

venant de personnes normales et des patients suivants présentant une leucémie non traitée, ont été soumis à

coloration par de la carbocyanine K-5. Les essais de colo-

ration ont porté sur des échantillons de plasma riche en

des leucocytes sédimentés par gravité et sur du sang vei-

neux entier. On n'a pas noté de différences importantes lorsque l'on a comparé, au cours de la série des essais,

les résultats obtenus avec des échantillons de sang en-

tier et ceux obtenus avec des échantillons de plasma riche

en leucocytes.

Le sang a été prélevé sur 20 personnes normales,

8 personnes présentant une leucémie lympho-

blastique aiguë,

6 personnes présentant une leucémie myéloblas-

tique aiguë, 10 personnes présentant une leucémie monocytaire aiguë.

Dans tous les cas, les échantillons de sang ci-

dessus ont été soumis à des colorations cytochimiques selon la pratique antérieure, comprenant des détermination d'estérase spécifique, d'estérase non spécifique avec inhibition par du fluorure, de PAS (acide périodique de Schiff) et de myéloperoxydase pour confirmer la forme morphologique de ces échantillons de leucémie. Il a été observé que tous les cas étaient typiques aussi bien du

point de vue morphologique que cytochimique.

On a ajouté une goutte (solution aqueuse à 1 %) du colorant de cyanine choisi à cinq gouttes de sang en- tier dans un tube à essai en verre de 10 x 75 mm contenant l'échantillon de sang encore vivant. On a réglé à environ x 106 cellules ou globules par millilitre la concentra-

tion des globules. Le pH a été de 6,2. Des essais cyto-

l0 chimiques courants destinés à distinguer les types de

cellules ou globules ont établi que ces globules consis-

taient en 1) des leucocytes polymorphonucléaires; 2) des lymphocytes; 3) des éosinophiles; 4) des basophiles; et ) des monocytes, ce qui a également été déterminé par

une coloration de Wrights.

Environ 1 min après l'addition du colorant à des échantillons de sang normal, on a décelé cinq à vingt structures en forme de bâtonnets dans le cytoplasme des

monocytes et lymphocytes. Dans les quelques minutes sui-

vantes, le noyau des monocytes normaux et des leucémiques s'est coloré tout d'abord en rose pâle. En 10 min, le noyau a présenté une couleur rose profond et finalement un rouge orangé vif avec un peu de luminescence apparente

(éclairage par unelampe à incandescence). Sous un micros-

cope Zeiss pour fluorescence, les noyaux et le cytoplasme

des monocytes normaux ont présenté une fluorescence rouge.

Les noyaux d'autres leucocytes d'un sang péri-

phérique normal se sont à peine colorés, et le plus sou-

vent ne se sont même pas colorés. Les granules d'autres leucocytes, des éosinophiles polymorphonucléaires et des basophiles se sont colorés en jaune pâle à jaune verdâtre à peine discernable. Les érythrocytes n'ont pas présenté

de coloration visible.

Les échantillons de sang provenant de patients présentant une leucémie lymphoblastique aiguë n'ont montré qu'une coloration des mitochondries, comme les myéloblastes de patients présentant une leucémie myéloblastique. Les échantillons de sang provenant de patients présentant une leucémie monocytaire aiguë ont cependant présenté une coloration des noyaux en rouge orangé intense et une fluorescence rouge des noyaux après 5 à 10 min, comme dans le cas des monocytes normaux. Les observations ci-dessus, et d'autres encore,

démontrent l'affinité caractéristique,concluante et inha-

bituelle, de ce colorant spécifique de la série des car-

bocyanines pour les substances des noyaux des monocytes.

Il ressort également des analyses fondées sur des observations humaines que l'on peut rendre plus utiles ces équipements automatisés d'établissement d'une formule leucocytaire du sang et en agrandir le champ d'action pour leur permettre d'utiliser avantageusement la technique ci-dessus de coloration afin de différencier, compter et classer les leucocytes différents et notamment, comme ici, des monocytes, par un seul contact en milieu aqueux d'un

colorant, ou d'une combinaison de colorants, avec un échan-

tillon de sang maintenu en vie, sans fixation préalable ni

dénaturation risquant d'introduire des artéfacts.

La poursuite de l'expérimentation sur l'utili-

sation de la carbocyanine K-5 combinée à des colorants métachromatiques décrits dans la présente invention a indiqué que l'on obtient des résultats particulièrement remarquables dans le cas d'une combinaison à 1:1 avec de l'orangé basique n0 21 (lequel correspond à la courbe spectrale no 7). Lorsque l'on a utilisé la combinaison précitée, les leucocytes ont présenté dans chaque cas une couleur plus nette et plus intense permettant une meilleure différentiation spectrale que lors de l'utilisation de l'orangé basique 21 seul, mais avec la même couleur en gros à l'examen visuel. Seuls les lymphocytes ne se sont

pas colorés. Ce mélange de colorants constitue une excel-

lente combinaison permettant une différentiation claire et nette et une bonne numération des neutrophiles, des

éosinophiles, des basophiles et des monocytes.

La carbocyanine K-5 a également été utilisée en combinaison avec du bleu de rhodanile. L'avantage a été marqué et observable, mais avec moins de synergie que celle trouvée dans le cas de la combinaison orangé

basique 21 - carbocynanine K-5 (voir tableau III).

Voici la structure chimique de la carbocyanine K-5. L'anion chlore peut être remplacé par n'importe

quel halogène -

Carbocyanine K-5 Dans l'exposé et les exemples ci-dessus, on a un peu souligné l'importance des progrès ici décrits pour leur application à de l'équipement automatisé d'établissement d'une formule leucocytaire du sang. On ne connaît pas d'équipement actuellement disponible qui

puisse, tel qu'il vient de série et sans devoir être mo-

difié, tirer avantage du procédé ici décrit, lequel a été

appliqué dans le cas d'une observation humaine, c'est-à-

dire "manuelle". Les experts en ce domaine et ceux qui tra-

vaillent dans le domaine de la technologie médicale savent

l'importance, pour des fins très diverses, d'une détermi-

nation rapide et précise des divers éléments d'une formule leucocytaire du sang. Il a été estimé qu'aux Etats-Unis d'Amérique, on effectue chaque jour un demi-million de déterminations d'une formule leucocytaire du sang, la plupart du temps par des techniques "manuelles" pour un prix annuel supérieur à 750 millions de dollars (soit

environ 3,75 milliards de francs).

De telles formules leucocytaires, établies par voie manuelle ou automatisée, exigent fondamentalement de

bonnes qualités d'identification, de différentiation spec-

trale et de numération, et elles peuvent faciliter le

diagnostic dans la pratique médicale. Comme indiqué ci-

247 317

dessus, le progrès proposé pour ces caractéristiques fon-

damentales donnera, sans aucun doute possible, naissance à des progrès de l'équipement auxiliaire automatisé en cause. Les formules sanguines, telles que celles dont il est ici question, qu'elles soient établies par voie manuelle ou automatisée, constituent des aides d'une

importance vitale pour l'examen de7s personnes et la déter-

mination de la nature de leur maladie. Une formule leuco-

cytaire précise, une bonne analyse et une étude cytolo-

gique des leucocytes peuvent faciliter le diagnostic, le pronostic et le traitement de fièvre d'origine inconnue, d'une infection virale ou non pyogène,d'une infection pyogène de l'appendice, de la vésicule biliaire, des tubes de Fallope; le pronostic concernant des patients présentant diverses maladies à divers stades; des maladies malignes comme la maladie de Hodgkins; des maladies pulmonaires; la surveillance du traitement des patients par des stéroides des hormones corticosurrénales ou des composés analogues;

divers genres de leucémies aiguës et chroniques; la dif-

férence de diagnostics entre un infarctus aseptique ou une

infection aseptique des os, d'une part, et de l'ostéomyé-

lite, d'autre part; des infections bactériennes et de

nombreuses autres questions médicales.

Les procédés décrits ci-dessus permettent d'ef-

fectuer des interprétations cliniques et de tirer des con-

clusions en partant de la coloration de leucocytes prove-

nant du sang veineux, de la moelle d'os, de l'urine ou d'autressources de sang encore vivant, ce qui comprend des spécimens contenant du sang d'une hémorragie masquée, dite

à sang occulte.

Tel qu'il sert ici, le terme métachromatique

concerne non seulement la qualité particulière et inhabi-

tuelle des colorants ici décrits, mais aussi la qualité de divers constituants, comme par exemple le noyau et le cytoplasme, de chaque espèce individuelle de leucocytes qui coréagissent de manière métachromatique d'une façon

ressemblant un peu à de la synergie pour produire la dif-

férentiation de réponse spectrale permettant les progrès ici décrits pour la cytochimie. Essentiellement, chaque espèce ou catégorie de globules blancs sorbe (ou bien ne sorbe pas) un seul colorant métachromatique d'une façon inhabituelle et remarquable, de sorte que chaque globule

ayant sorbé du colorant émet par réflexion un spectre lu-

mineux individuel et différent d'une espèce à l'autre.

Il va de soi que, sans sortir du cadre de l'in-

vention, de nombreuses modifications peuvent être apportées au procédé et à la composition pour la détermination des leucocytes individuels par la sorption différentielle d'un colorant métachromatique. Ainsi, une telle composition peut comporter au moins deux colorants dont l'un au moins est

choisi parmi ceux figurant sur les tableaux I et II.

Claims (10)

REVENDICATIONS.

1. Procédé d'examen et d'analyse, sous le mi-

croscope, des éléments figurés d'un sang encore vivant par détermination spectrale individuelle des catégories de leucocytes permettant une différentiation, une identi- fication, une comparaison et une numération, par voie

optique, de leucocytes comprenant des leucocytes polymor-

phonucléaires (neutrophiles), des éosinophiles, des baso-

philes, des lymphocytes et des monocytes, procédé carac-

térisé en ce qu'on met en contact, dans un environnement aqueux, au moins un échantillon de sang encore en vie et

sans fixateur avec au moins un colorant organique catio-

nique métachromatique quaternaire basique aqueux capable

de colorer, par un phénomène métachromatique, des leuco-

cytes à la température normale du sang (370C) afin d'obte-

nir une différence spectrale, dans le cadre du spectre de la lumière visible, de la lumière réfléchie par les catégories individuelles précitées de leucocytes, selon que leur structure cellulaire a été colorée par sorption du ou des colorants ou, au contraire, n'a pas été colorée par absence de sorption, le spectre de la lumière réfléchie par chaque catégorie individuelle de leucocytes ayant sorbé du colorant présentant un ordre de grandeur de différences, par rapport au spectre de la lumière réfléchie par la même catégorie non colorée, suffisantes pour l'identification, la comparaison et la numération de chaque catégorie de

leucocytesayant répondu à l'action du colorant.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé

en ce que le colorant cationique métachromatique quater-

naire basique unique choisi présente une réponse spectrale sensiblement identique à celle du bleu de Greifswalder (courbe spectrale n0 1), du bleu de toluylène (courbe spectrale no 11), du bleu Borrel (courbe spectrale n0 2), du bleu de rhodanile (courbe spectrale n0 3), du bleu de nuit (courbe spectrale n0 4), de la prune pure (courbe spectrale n0 5), du violet de Hofmann (courbe spectrale

n0 6) et de l'orangé basique 21 (courbe spectrale n0 7).

3. Procédé selon la revendication 1, caracté-

risé en ce qu'on utilise dans un environnement aqueux, en une combinaison capable de colorer des leucocytes à la température normale du sang (370C), plus d'un seul colorant organique cationique métachromatique quaternaire basique pur, à savoir un premier colorant choisi parmi le bleu de toluylène (courbe spectrale n0 11), le bleu Borrel (courbe spectrale n0 2) , le bleu de rhodanile (courbe spectrale n0 3), le bleu de nuit (courbe spectrale n0 4), la prune pure (courbe spectrale n0 5), le violet de Hofmann (courbe spectrale n0 6) et l'orangé basique 21 (courbe

spectrale no 7), et leurs combinaisons, et un second colo-

rant organique cationique quaternaire basique pur, spéci-

fique pour les monocytes et choisi parmi le rouge basique 13 (courbe spectrale n0 8), le violet basique 16 (courbe spectrale n0 9) et la carbocyanine K-5 (courbe spectrale

n0 10).

4. Procédé d'analyse, sous le microscope, des éléments figurés du sang encore vivant par détermination spectrale individuelle des leucocytes en permettant une différentiation, une comparaison et une numération par voie optique, ce procédé étant caractérisé en ce qu'on

soumet un échantillon de sang encore vivant et sans fixa-

teur à une coloration par contact de cet échantillon de sang, en environnement aqueux, avec du bleu Borrel (courbe

spectrale n0 2) à une température inférieure à la tempéra-

ture normale (370C) du sang mais non inférieure à environ 210C, et en ce qu'on effectue sur les lymphocytes, ainsi sélectivement et uniquement colorés, les déterminations

analytiques pouvant s'avérer nécessaires.

5. Procédé d'analyse, sous le microscope, des

monocytes d'un sang vivant coloré de manière différen-

tielle à l'aide d'un colorant organique cationique qua-

ternaire basique choisi parmi le rouge basique 13 (courbe spectrale no 8), le violet basique 16 (courbe spectrale n0 9) et la carbocyanine K-5 (courbe spectrale n0 10) et leurs mélanges, procédé caractérisé en ce qu'on soumet

au moins un échantillon de sang encore vivant, sans fixa-

teur, à une coloration par contact, à une température d'environ 210C à 40'C dans un environnement aqueux, avec un ou plusieurs des colorants cidessus, ce qui colore sélectivement les monocytes et permet d'effectuer sur les monocytes ainsi colorés les opérations de différentiation, comparaison, numération et étude, par voie optique, qui

peuvent s'avérer nécessaires.

6. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le colorant organique est choisi parmi l'orangé basique 21 (courbe spectrale n0 7), le violetde Hofmann (courbe spectrale n0 6), la prune pure (courbe spectrale no 5) et le bleu de nuit (courbe spectrale no 4) et leurs

combinaisons, ce qui permet de réaliser une différentia-

tion optique de tous les leucocytes du fait que toutes

les catégories de leucocytes, sauf les lymphocytes, pré-

sentent alors les effets d'une coloration métachromatique.

7. Procédé d'analyse, sous le microscope, des éléments figurés d'un sang encore vivant selon lequel on effectue une détermination spectrale, en un seul examen d'un échantillon de sang, permettant une différentiation, une comparaison et une numération, par voie optique, de deux catégories choisies et spécifiques de leucocytes, à

savoir les lymphocytes et les monocytes, procédé caracté-

risé en ce qu'on soumet un échantillon de sang encore vi-

vant, sans fixateur, à une coloration par contact de cet échantillon, dans un environnement aqueux, avec du bleu

Borrel (courbe spectrale n0 2) associé à un second colo-

rant choisi parmi la carbocyanine K-5 (courbe spectrale n0 10), le violet basique 16 (courbe spectrale n0 9), le rouge basique 13 (courbe spectrale n0 8) et leurs mélanges,

en opérant à une température ambiante de 21 à 250C.

8. Procédé d'analyse, sous le microscope, des éléments figurés du sang encore vivant, selon lequel on effectue une détermination spectrale individuelle des

monocytes se distinguant des autres catégories de leuco-

cytes, le procédé étant caractérisé en ce qu'on soumet au moins un échantillon de sang encore vivant, sans fixateur, à une coloration par contact dans un environnement aqueux avec au moins un colorant organique cationique quaternaire basique aqueux choisi parmi la carbocyanine K-5 (courbe spectrale n0 10), le violet basique 16 (courbe spectrale

n0 9) et le rouge basique 13 (courbe spectrale n0 8).

9. Procédé selon l'une quelconque des revendica-

tions 1 à 6 et 8, selon lequel on soumet un seul échan-

tillon de sang à un contact, en milieu aqueux, avec au moins

un colorant organique cationique métachromatique quater-

naire basique aqueux capable de colorer, de manière méta-

chromatique à la température normale du sang (370C), les leucocytes individuels présents dans l'échantillon et l'on soumet les globules ainsi colorés à une différentiation et une numération, procédé caractérisé en ce qu'on effectue la différentiation à l'aide d'un filtre coloré choisi ayant une gamme spectrale réglable, sensible au spectre réfléchi

par chaque catégorie des globules blancs du sang de l'échan-

tillon colorée de manière différente et en ce qu'on effec-

tue la numération à l'aide d'un dispositif activé par de la lumière réfléchie, ce qui permet un comptage différentiel

du nombre des leucocytes de chacune des catégories indi-

viduelles présentes dans l'échantillon examiné sous le mi-

croscope et dans un champ déterminé de microscope, c'est-

à-dire la détermination de la formule leucocytaire du sang.

10. Composition utile pour la coloration diffé-

rentielle, l'identification et la différentiation des es-

pèces ou catégories de leucocytes à des températures com-

prises entre environ 210C et 400C, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins deux colorants dont l'un au moins est un colorant choisi parmi le bleu de Greifswalder (courbe spectrale n0 1), le bleu Borrel (courbe spectrale n0 2), le bleu de rhodanile (courbe spectrale no 3), le bleu de toluylène (courbe spectrale n0 11), le bleu de

nuit (courbe spectrale n0 4), la prune pure (courbe spec-

trale n0 5), le violet de Hofmann (courbe spectrale n0 6),

l'orangé basique 21 (courbe spectrale no 7), la carbo-

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cyanine K-5 (courbe spectrale n 10), le rouge basique 13 (courbe spectrale n 8) et le violet basique 16

(courbe spectrale n 9).