CN104155210B - 基于粘弹性聚焦的光学成像 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于粘弹性聚焦的光学成像。一种被布置成用于检验粒子的装置，其包括：具有至少一个微通道的盒子；在微通道中流动的粘弹性流体，该流体包括粒子的悬浮液，从而影响粒子按照平行于该流体流的至少一维阵列的排列；以及生成在微通道中的粒子的图像的光学放大装置。

Description

基于粘弹性聚焦的光学成像
本申请是申请日为2009年10月1日，申请号为200980147765.5，发明名称为“基于粘弹性聚焦的光学成像”的申请的分案申请。
发明领域
本发明一般涉及微流体设备，并且特别是，本发明涉及用于放大在微流体设备中排列的粒子的图像的装置和方法。
发明背景
微流体技术通常通过采用具有至少一个尺寸小于1毫米的一个或多个通道的设备和通常约为毫微和微微升的微量流体来识别。
微流体用在各种领域如化学与生物反应和分析或者喷墨喷嘴制造中。
微流体技术允许开发小型、有成本效益和高效率的系统，如芯片实验室，其中整个复杂的化学管理及分析系统可以创建在微流体芯片中并与例如电子设备和光学检测系统连接。
应用微流体使微观对象可视化在例如Yang等人的2005/0271548或2007/207061美国申请中被公开，并且血细胞计数器在例如Lievan的6,097,485或Larsen的6,959,618美国专利中被描述。Hou-Pu等人的7,312,085美国专利公开了用于粒子如细胞和/或珠子的微流体操作和/或检测的装置、方法和试剂盒。
使用具有粘弹特性的流体使得将粒子的流体悬浮液注入到微通道中增加在微通道内部的聚焦区中的粒子的浓度(‘粘弹性聚焦’)的装置和方法在A.M.Leshansky、A.Bransky、N.Korin和U.Dinnar的Tunable Nonlinear Viscoelastic“Focusing”in aMicrofluidic Device，Phys.Rev.Lett.98,234501(2007)中以及在PCT申请WO2008/149365中被公开，该申请的共同发明人(Bransky)是本发明的发明人。
发明概述
本发明的一些实施方式的一个方面涉及用于在微通道中流动的粘弹性流体中悬浮的粒子的光学成像以便粒子按照平行于流体流的至少一维阵列排列的方法和装置。
在本发明的一些实施方式中，一个或多个微通道在大致平面的基底如塑料或玻璃板上形成。在微通道中流动的粘弹性流体中悬浮的粒子在微通道中按照一维或二维阵列排列。聚焦在阵列处的光学物镜可选地在合适的照射下提供粒子的放大图像。图像可以由图像采集装置捕获并随后手工地和/或由计算机化程序分析。
在本发明的一些实施方式中，带有微通道和可选地其它结构的基底(以下也称为“盒子(cartridge)”)被可移除地放置在用于采集和分析粒子图像、提供指定结果的装置(以下称为“读取器”)中。优选地，读取器被可选地紧凑地构造为便携式设备。
在本发明的一些实施方式中，盒子包括产生悬浮粒子的排列流所需的结构和/或机构和/或材料。可选地或者作为选择，一些结构和/或机构和/或材料在读取器中被提供或由辅助配件提供。
优选地，盒子是一次性的，并且优选地由廉价材料经济地生产和/或通过有成本效益的过程如连续大规模生产过程经济地生产。
应强调，粘弹性聚焦，即，在微通道中的粘弹性流中按照有序阵列的粒子的排列是在获得清晰光学聚焦图像中的关键因素。此外，根据粒子的结构和刚性(或柔韧性或可挠性)和粘弹性流体流中剪切流的影响，粒子可在某个有利方向上变形和排列。例如，通常具有双凹面形状的红血细胞在流动方向上拉长并与平侧面上下对齐，能够捕获一致的细胞形状而不是具有不同方向的细胞的清晰聚焦图像，具有不同方向的细胞的部分在焦点外。还应注意，粘弹性流和聚焦可仅在压力梯度下内在地得到，而无需任何外部场(例如，电场或磁场)，简化了用于粘弹性聚焦的装置和方法。
在说明书和权利要求中，下列术语及其派生词暗示各自的非限制性特征：
微通道-诸如具有至少约或大于100微米的长度和垂直于长度的圆形或矩形横截面的槽或管的通道，在圆形或矩形的横截面中，其至少一个尺寸约或小于100微米。
浅微通道-关于下层表面具有明显(例如五倍或更多)大于垂直尺寸(“高度”)的水平横截面尺寸(“宽度”)的微通道。
粒子-微观粒子。通常，粒子具有约或小于25微米的平均最大尺寸或者约或小于15微米的平均直径。这些粒子可具有有机或无机起源或两者的组合，包括微球、微珠、矿物(例如粘土)、花粉、胶束、囊泡、细胞器或细胞(多细胞生物体或单细胞如细菌的)以及活细胞。
悬浮的(粒子)-分散在整个流体例如在悬浮液但不排除乳液中的粒子(例如在亲水性流体中的脂肪颗粒)。
微结构-被构造成具有在亚毫米范围中的至少一个尺寸，通常为100微米或更小(例如微通道或其入口和出口，见下文)。
基底-大致平面的材料，如塑料或玻璃板，适于在其中和/或其上形成结构。
盒子-形成有一个或多个微通道和可选的其它微结构并可选地包括额外的一个或多个元件和/或机构的基底。
物镜-包括例如一个或多个透镜和/或反射镜和/或棱镜的光学放大装置或系统，其适合于或设计成用于手工观察和/或电子采集。
(波长的)带宽-在光谱曲线的最大高度的一半处的宽度。
单色(光)-具有或看起来只有一种颜色，特征为诸如小于100纳米或50纳米的窄带宽。
紧凑装置-包括被紧密或密集地组装以减小尺寸和/或重量但可能以价格和/或性能为代价的部件的装置。
大致平面-具有大部分是平面的表面，不排除一些从那里的偏差，例如弯曲或凹痕或隆起。一般可类似地适用于其它特征如大致柱状。
半-部分或不完全地或在实体的某种程度上，例如而不是限制，在实体的25％和75％之间的范围内。
半透明-半透明和/或漫射(散射透射的和反射的光)。
生物(化合物、材料)-源于生物源或处于活动状态或参与生物过程或具有类似于被特征化的生物化合物的结构的化合物或材料。
固态(光源)-发射光而没有灯丝或气体放电的协助并且通常比后两者小的电子(而不是电气)设备。例如LED、OLED、PLED或基于电致发光或热发光(由热的施加激励，到低于导致白炽的那些温度的温度)或化学发光的其它设备。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供一种被布置成用于检验粒子的装置，其包括：
(a)盒子，其具有至少一个微通道；
(b)粘弹性流体，其在微通道中流动，该流体包括粒子的悬浮液，从而使得粒子按照平行于流体流的至少一维阵列排列；以及
(c)光学放大物镜，其生成在微通道中的粒子的图像。
在一些实施方式中，装置还包括被配置成可释放地夹住盒子的支架。
在本发明的一些实施方式中，盒子是一次性的。
在本发明的一些实施方式中，盒子按照常规是可更换的。
在一些实施方式中，盒子还包括促进粘弹性流体在微通道中流动的至少一个微结构。
在一些实施方式中，粘弹性流体在微通道中的流动至少部分地由压力梯度驱动。
在一些实施方式中，粘弹性流体在微通道中的流动独立于外部施加的电力或磁力或离心力或引力的任一个。
在一些实施方式中，至少一维阵列是二维大致平面的阵列。
在一些实施方式中，粒子被以阵列暂停在微通道中。
在一些实施方式中，装置还包括照射微通道中的粒子的至少一个光源。
在一些实施方式中，光是单色的。
在一些实施方式中，光源距所述盒子的距离至少在光学上或机械上或其组合上被最小化。
在一些实施方式中，至少一个光源至少连接到盒子或包括在盒子中。
在一些实施方式中，光源包括固态光源。
在一些实施方式中，物镜被构造成以色差校正或景深的至少一个为代价减小复杂性、成本、大小或其组合的至少一个。
在一些实施方式中，物镜被固定地聚焦在微通道中的粒子阵列处。
在一些实施方式中，物镜包括至少一个塑料光学元件。
在一些实施方式中，粘弹性流体包括为在微通道中流动的流体中的悬浮粒子的排列提供足够的粘度和弹性的溶剂和成分。
在一些实施方式中，成分包括具有在约50kDa和1000kDa之间的分子量的聚合物。
在一些实施方式中，粘弹性流体包括用于分散悬浮粒子的至少一种成分。
在一些实施方式中，粘弹性流体是生物相容的。
在一些实施方式中，从生物样品采集粒子。
在一些实施方式中，生物样品包括血液、血浆、淋巴液、尿液、脑脊液(CSF)或骨髓的至少一个。
在一些实施方式中，粒子包括细胞。
在一些实施方式中，细胞包括血细胞。
在一些实施方式中，细胞包括细菌。
在一些实施方式中，细胞包括活细胞。
在一些实施方式中，粒子包括与在粒子上存在的其它化合物或大分子反应或键合的化合物或大分子。
在一些实施方式中，键合化合物包括生物化合物。
在一些实施方式中，键合化合物包括蛋白质或DNA或RNA的至少一个。
在一些实施方式中，键合化合物包括抗原或抗体的至少一个。
在一些实施方式中，存在于粒子上的其它化合物包括生物化合物或大分子。
在一些实施方式中，粒子包括磁性组分。
在一些实施方式中，磁性组分包括磁芯。
在一些实施方式中，粒子包括铁磁组分。
在本发明的一些实施方式中，装置还包括用于电子地捕获由物镜生成的图像的装置。
在本发明的一些实施方式中，装置还包括至少一个处理器，至少一个处理器执行被配置成用于分析被捕获的图像中的粒子并提供定性或定量结果的至少一个的程序。
在一些实施方式中，结果包括粒子形状、粒子类型、生理状况指示或病理状况指示的至少一个。
在一些实施方式中，结果包括粒子计数、粒子浓度、粒子大小、粒子大小分布、粒子形状或其派生物的至少一个。
在一些实施方式中，结果包括细胞类型的确定。在细胞类型的另外的实施方式中，结果包含细胞计数、细胞浓度、细胞大小、细胞大小分布、细胞形状、细胞形态、或其派生物的至少一个。
在一些实施方式中，结果包括至少一个常规临床测试结果。
在一些实施方式中，结果包括至少一个常规临床血液测试结果。
在一些实施方式中，结果包括生物学意义或临床意义的至少一个的值或者指示的至少一个。
在一些实施方式中，结果包括脑膜炎的值或指示的至少一个。
在一些实施方式中，结果包括白血病的值或指示的至少一个。
在一些实施方式中，结果包括细菌性感染的值或指示的至少一个。
在一些实施方式中，结果包括胎儿肺成熟度的值或指示的至少一个。
在一些实施方式中，提供结果包括下列操作的至少一个：将结果存储在机器可读介质上、显示结果或打印结果。
在本发明的一些实施方式中，装置还包括显示屏。
在一些实施方式中，装置还包括打印机。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供一种用于检验粒子的试剂盒，试剂盒包括形成有至少一个微通道的至少一个盒子，至少一个微通道适于使在其中流动的粘弹性流体中悬浮的粒子按照平行于流的至少一维阵列排列。
在一些实施方式中，盒子还包括便于粘弹性流体在所述微通道中流动的微结构。
在一些实施方式中，盒子包括粘弹性流体或其组分的至少一个。
在本发明的一些实施方式中，试剂盒包括粘弹性流体或其组分的至少一个。
在一些实施方式中，试剂盒包括用于观察粒子的放大图像或分析粒子这两个操作的至少一个的装置。
在一些实施方式中，盒子与显微镜载玻片相容。
在一些实施方式中，试剂盒包括操作指南。
根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供一种用于分析粒子的方法，其包括：
(a)提供形成有至少一个微通道的基底；
(b)提供适于使粒子的悬浮液在微通道中流动从而使粒子按照平行于流的至少一维阵列排列的粘弹性流体；
(c)提供用于分析的粒子；
(d)使粒子在所述粘弹性流体中悬浮；
(e)使带有悬浮粒子的粘弹性流体在所述微通道中流动，以便粒子按照平行于流体流的至少一维阵列排列；以及
(f)通过在所述阵列中的粒子处聚焦的光学装置生成在微通道中的粒子的图像。
在本发明的一些实施方式中，该方法还包括分析图像。
在本发明的一些实施方式中，分析包括：
(a)捕获由光学装置生成的图像；以及
(b)通过计算设备执行被配置成分析被捕获的图像中的粒子的程序。
在一些实施方式中，分析还包括提供分析的定性或定量结果的至少一个。
在一些实施方式中，提供结果包括下列操作的至少一个：将结果存储在机器可读介质上或显示结果或打印结果。
在一些实施方式中，粒子包括细胞。
在一些实施方式中，粒子包括活细胞。
在一些实施方式中，粒子包括血细胞。
在一些实施方式中，粒子包括与其它化合物反应或附到其它化合物的化合物。
在一些实施方式中，使粘弹性流体在微通道中流动包括施加压力梯度。
在一些实施方式中，使粘弹性流体流动独立于外部施加的电力或磁力或离心力或引力的任一个。
在本发明的一些实施方式中，至少一维阵列是二维大致平面的阵列。
在一些实施方式中，提供粘弹性流体包括将给流体提供足够的粘度和弹性用于使粒子在微通道中排列的成分溶于溶剂中。
附图的简要说明
在附图中，出现在一个以上的附图中的相同或重复或相当或相似的结构、元件或部分一般被标有相同的参考数字，可选地标有用于参考特定对象的额外的一个或多个字母。重复或相当或类似的部分可能不被重复地标记和/或描述。附图中所示的部件和特征的尺寸是为了表示的方便或清楚而选择的，并不一定按比例或真实的远近关系示出。为便于清楚，一些元件或结构没有被示出或仅部分地和/或以不同的远近关系示出。
图1A示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的具有在基底上形成的被覆盖微通道的盒子的透视局部视图；
图1B示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的具有形成有微通道和其它微结构的基底的盒子的俯视图；
图1C示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的悬浮粒子在其中流动的微通道的剖面的透视图；
图2A示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的读取器及其部件。
图2B示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的紧凑的读取器及其部件；
图3A示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的具有微通道并包括与微通道相对的LED的盒子；
图3B示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的具有微通道并包括布置在盒子的侧面的LED的盒子；
图3C示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的具有微通道并包括在盒子的盖上在微通道的每侧处的LED的盒子；
图4A示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的包括多个盒子的试剂盒；
图4B示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的包括多个盒子和在一个或多个注射器中的一种或多种流体的试剂盒；
图4C示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的包括多个盒子和在一个或多个容器中的一种或多种流体组分的试剂盒；
图5示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的概述在观察在粘弹性流体中排列的粒子的放大图像时的行为的流程图；
图6示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的用于俘获并分析在粘弹性流体中排列的粒子的放大图像的行为的流程图；
图7示出根据本发明的示例性实施方式的如实验I中在微通道中的粘弹性流体流中排列的血细胞(在预处理之后)的图像；以及
图8示出根据本发明的示例性实施方式的如实验II中在微通道中的粘弹性流体流中排列的血细胞(在预处理之后)的图像。
本发明的实施方式的描述
下面的描述涉及本发明的实施方式的一个或多个非限制性实例。本发明不被所描述的实施方式或附图限制，并可以按照各种方式或配置或变化实践。本文所使用的术语不应被理解为限制性的，除非另有说明。
本文所使用的非限制性的章节标题仅仅是为了方便而不应被解释为限制本发明的范围。
通用术语
在说明书和权利要求中，除非另有说明，术语“处理器”或“计算机”或其派生词没有限制地表示能够执行所提供的或并入的程序和/或能够控制和/或访问数据存储装置和/或其它装置如输入和输出端口的装置。
在说明书和权利要求中，除非另有说明，术语“软件”、“程序”、“过程”或“软件模块”(“模块”)或“软件代码”(“代码”)可以没有限制地可互换地使用，并表示可由诸如处理器的装置访问和执行的一个或多个指令或指示，该装置可选地涉及其它硬件或软件部件，如存储器、输入/输出接口或操作系统。
在说明书和权利要求中，除非另有说明，术语“优选的”、“优选地”、“典型的”或“典型地”以及它们的词尾变化和词形变化不限制本发明或者其实施方式的范围。
在说明书和权利要求中，除非另有说明，术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”以及它们的词尾变化和词形变化表示“包括但不限于”。
当叙述值的范围时，它只是为了方便或简洁并包括所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。除非另有说明，任何数值还包括实现实施方式或方法的实用近似值，并且积分值不排除分数值。
综述
在典型的实施方式中，粘弹性流体与形成悬浮液的粒子混合并流入在盒子中形成的微通道中，其中粒子按照大致柱状或平面的阵列在流体流中排列。盒子被放置在读取器中，其中微通道被可选地照射，并且聚焦在粒子阵列处的透镜放大粒子图像。放大的图像由相机采集，相机将图像传输到计算机，计算机处理和分析图像以提供一些指定的结果。
上面的简要描述没有限制地用来在下面提供本发明的一些实施方式的变化形式的更详尽的描述和讨论的框架和/或参考。
粘弹性流体
在本发明的一些实施方式中，粘弹性流体包括介质(例如，溶剂)如水和提供足够高的粘度(例如>5cP)和弹性用于使粒子在微通道中排列的额外的合成物或物质，例如提高溶液的弹性的聚丙烯酰胺(PAA)。
在一些实施方式中，介质包括溶解的高分子量(MW)聚合物(例如50-1000kDa)，例如以上的聚丙烯酰胺(PAA)、聚乙二醇(PEG)、聚蔗糖、多聚葡萄糖(葡聚糖)、甲基纤维素或黄原胶。当粒子包括生物实体或分子如活细胞或被抗体涂覆或连接的珠子时，使用生物相容性物质可能是有利的。
在一些情况中，高分子量聚合物引起粒子如活细胞的聚集(见例如图8)，并可能对粒子的行为(例如红血细胞的膜的运动，见下文)有其它不利影响。为减轻或减少或消除不利影响，可以使用防范措施，例如以下措施的一个或多个：(a)将低MW聚合物添加到高MW，(b)添加尿素和/或卵磷脂和/或阿司匹林(乙酰水杨酸)，(c)使用具有宽MW分布的聚合物或(d)泊洛沙姆(高分子表面活性剂)。
此外，将球形剂添加到高分子量聚合物促使细胞如红血细胞获取球形形状而不是正常的双凹圆盘形、口形红细胞、棘状红细胞或其它形状。球形在若干方面是有利的。第一，通过显著减少由高分子量聚合物引起的细胞聚集，用于粘弹性聚焦。第二，球形形状通过粘弹力更有效地聚焦。以及第三，具有球形成形的细胞实现(相对于其它形状)更好的光学聚焦，并便于更方便和/或更可靠的几何推导如细胞的直径或体积(相对于诸如扁平或细长盘的其它形状)。若干球形剂被用在血细胞计数中用于减少来自散射的细胞方向噪声，例如，烷基硫酸盐的碱金属盐(例如十二烷基硫酸钠)或两性离子表面活性剂(如3-(N-N-二甲基十二烷基胺)丙烷磺酸盐(DAPS)或N303-(N,N-二甲基肉豆蔻基氨)丙烷磺酸盐(TDAPS))或非离子型表面活性剂(例如辛基苯酚乙氧基化物)。
在一些情况中，高MW聚合物包括葡聚糖>50kDa、PVP>50kDa、甲基纤维素、藻酸盐、聚蔗糖或PAA，而在一些情况中，低MW包括葡聚糖<40kDa、PEG<40kDa或PAA。
盒子
在本发明的典型实施方式中，通过在基底上形成一个或多个微通道，可选地形成额外的结构或机构例如用于流体进入和退出微通道的结构(分别是入口和出口)、压力梯度机构、材料混合室或压力阀(以下共同表示为“微结构”)来制造盒子。可选地，基底被形成有用于在读取器或其它装置中保持和/或放置盒子的结构和/或机构。
在下面的描述中，对微通道或另一微结构的提及没有限制地暗示多个这样的结构。
在典型的实施方式中，基底是大致平面的透明材料片，其具有一厘米数量级的长度和宽度以及一毫米数量级的厚度，在一些情况下类似于显微镜载玻片或滑动盖。基底由诸如PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、PDMA(聚二甲基硅氧烷)或其他它聚合物材料或硅或玻璃的材料制造，其中可制造微结构，包括生物相容性微结构。在一些情况中，制造包括使用若干高生产量方法的一个或多个，如注射模塑、软光刻、激光烧蚀、X射线光刻、光纤拉制或热模压。
在一些情况中，微通道和/或其它微结构和/或盒子(或其一部分)例如通过在高温和高压下粘合或者通过使用合适的胶粘剂被一层材料覆盖。可选地，盒子被涂有保护层(例如耐划伤)，并被可选地放置在保护和/或操作箱中(例如，用于放置在读取器中的孔或槽)。一般，盖和/或涂层至少对于用来观看微通道及其内容物的光带宽是透明的。
在一些实施方式中，微结构由本领域已知的下面方法制造，例如在S.Franssila、John Wiley和Sons的Introduction to Microfabrication,2004 ISBN0470851058,9780470851050中的或在其它出版物例如Printing meets lithography,The IndustrialPhysicist,8(4)2002或A.Bransky等人的Biosens.Bioelectron.22,165(2006)和A.Bransky等人的Microvasc.Res.73,7(2007)中的方法。其它参考资料包括，例如，R.M.McCormick、R.J.Nelson、M.G.Alonso-Amigo、D.J.Benvegnu和H.H.Hooper的Anal.Chem.,1997,69,262、D.Qin、Y.Xia和G.M.Whitesides的Adv.Mater.,1996,8,917、F.Dang、S.Tabata、M.Kurokawa、A.A.Ewis、L.Zhang、Y.Yamaoka、S.Shinohara、Y.Sinohara、M.Ishikawa和Y.Baba的Anal.Chem.,2005,77,2140、Z.Meng、S.Qi、S.A.Soper和P.A.Limbach的Anal.Chem.,2001,73,1286、Z.Chen、Y.Gao、J.Lin、R.Su和Y.Xie的J.Chromatogr.,A,2004,1038,239、L.Martynova、L.E.Locascio、M.Gaitan、G.W.Kramer、R.G.Christensen和W.A.MacCrehan的Anal.Chem.69(1997),p.4783或者Samuel K.Sia、George M.Whitesides的Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane)for biological studies,Electrophoresis2003,24,3563–3576。
在本发明的一些优选实施方式中，盒子是一次性的，这至少部分地通过在大规模生产的过程如连续压印(类似于印刷)中使用价格适当的材料而被允许。可选地或者作为选择，盒子是可装满的，可选地包括为此目的的结构或机构，例如用于清洗微通道的机构或用于装满流体的结构。
图1A示意性地示出具有被覆盖微通道102的盒子100的透视局部视图，微通道102在具有底面156和顶面154的基底14上形成。微通道102具有长度112、水平尺寸114(宽度)和垂直尺寸116(高度)，如相应的双箭头所指示的，并由盖106覆盖，盖106具有与基底顶面154的分界面。微通道102进一步示出浅微通道，因为水平尺寸114明显大于垂直尺寸116。在本发明的一些实施方式中，水平尺寸114在100微米的数量级而垂直尺寸116在10微米的数量级。
图1B示意性地示出根据一些示例性实施方式的具有底面156和侧面152的盒子100的俯视图，基底14形成有微通道102和其它微结构，盒子100包括流体入口122、样品入口124、混合室126以及出口室128。
在一些实施方式中，粘弹性流体被应用或注入到入口122，或者流体在盒子100的制造过程中被密封在入口122中，然后流体从入口122流入连接的混合室126中。可选地，盒子100包括多个入口122，允许例如当最后的粘弹性流体的有益特性可能在时间上降低或以其他方式改变时提供用于随后混合的粘弹性流体的分离的组分。
在一些实施方式中，样品入口124包括毛细管，其吸引包括粒子的悬浮液或乳状液的流体样品，样品从毛细管流入连接的混合室126中。可选地或者作为选择，样品流体被注入或以其它方式应用到样品入口124中。
进入混合室126的流体在室中混合并流入微通道102的进口端120中。可选地，盒子100包括彼此连接并最终连接到微通道102的多个混合室126，以便提供一些成分的预混合和与另一成分或多种成分的随后混合。例如，使粘弹性流体与一些添加剂(例如，分散剂或染料)预混合，并且随后使此混合物与样品混合。
在一些实施方式中，出口室108与微通道102的出口端130连接用于收集(排出)在微通道102中流动的流体。
在本发明的一些实施方式中，流体和其中的悬浮粒子通过粘附力和/或通过压力梯度被吸引到微通道102并在微通道102中流动，而没有任何附加的力或场如电场或磁场或引力(例如离心力或场)。
在一个示例性的变化形式中，压力梯度由出口室128提供，出口室128具有比盒子外的环境压力小的压力或相对于流体入口压力小的压力(以下称“真空”)。可选地，出口室128是或者包括真空室。可选地或者作为选择，出口室128包括或连接到真空囊或泵，如弹性微型泵。在一些实施方式中，真空由暂时性的屏障或阀与微通道102隔离，以便为了提供压力梯度，通过打破屏障或打开阀例如在其上按手指，在出口室128和微通道102之间产生连接。
在另一示例性变化形式中，压力梯度通过对入口122中的粘弹性流体(或其组分)施加比微通道102和/或出口室128中的压力大的压力(以下称“高压”)来提供。可选地，高压由将流体应用到入口122的注射器来提供。可选地或者作为选择，盒子100包括具有高压的室，其例如由通过按手指或其它方法打开的阀连接到入口122。可选地或者作为选择，盒子100包括连接到入口122的柔性室，使得通过按柔性腔，压力被施加到入口122。
本领域的技术人员应理解，其它变化形式和组合可用于提供压力梯度以使粘弹性流体在微通道102中流动。
在本发明的一些实施方式中，在微通道102中的流体流速大约是0.1cm/s和1cm/s之间的数量级，虽然根据情况如流体组成和特性、粒子类型及其浓度、装置(例如相机拍摄速度)或操作要求(例如测量速度)，该速率可被设定或更改为其它速度。
盒子100作为具有微通道的盒子的非限制性实例被提出并讨论。在本发明的一些实施方式中，对微通道附加的微结构和/或机构可变化。例如，在一些实施方式中，盒子100没有分开的流体和样品入口，而是一个入口，在入口中，流体和样品被可选地混合，或其中流体和样品的混合物被应用或注射。或者，可选地，盒子100没有混合室。或者，可选地，盒子100不包括出口室并且流体例如通过孔排出。
粒子和聚焦
一旦粘弹性流体与粒子的悬浮液或乳状液流入微通道102，粒子就按照与流体流平行的一维或二维阵列排列(“粘弹性聚焦”)。
在浅微通道的情况下，粒子按照二维片状阵列排列。在分别具有相同或相似的水平尺寸114和垂直尺寸116例如具有大致方形或圆形的横截面的微通道的情况下，粒子按照大致柱状的阵列排列。
剪切流中例如粘弹性流中的柔韧粒子响应于剪切而被变形，并且在特定的方向上排列。作为粒子的特定非限制性实例，红血细胞(RBC)根据剪切应力和环境粘度而拉长并在粘弹性聚焦中在特别的方向上排列，同时展现出外部膜绕内部旋转的奇特动态行为，如在例如Avishay Bransky等人的An automated cell analysis sensing system based on amicrofabricated rheoscope for the study of red blood cells physiology,Biosensors and Bioelectronics22(2006)165–169以及其中的参考资料中或者在Pozrikidis C.1995Finite deformation of liquid capsules enclosed by elasticmembranes in simple shear flow.J.Fluid Mech.297,123-152、PozrikidisC.2003.Modeling and simulation of capsules and biological cells或者Pozrikidis,C.,2003.Numerical Simulation of the Flow-Induced Deformation ofRed Blood Cells Ann.Biomed.Eng.,31,1194–1205中描述的。
在一些情况或实施方式中，当对粒子形状进行分析时，尤其是当得出定量结果时，流体流引起的变形必须被加以考虑(见下文)。
图1C示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的微通道102的剖面的透视图，微通道102具有明显大于高度116的宽度114(浅微通道)并具有使悬浮粒子140(RBC作为实例)按照大致平面的阵列排列的足够长度112。
在粘弹性流体(未示出)中悬浮的RBC粒子140进入微通道102的进口端120并沿由箭头144指示的方向顺流流动。在粒子140进入微通道时，它们仍然是无序的，但在粒子140顺流流动时，它们往往排列成二维阵列，如微通道中由括弧146所指示的区域周围可以看到的。在粒子140进入微通道中由括弧148所指示的区域并顺流流动时，粒子140形成椭圆形，并沿一致方向按照由水平面142所指示的片状阵列排列。
在本发明的一些实施方式中，粒子140构成或包括其它细胞。在一些实施方式中，粒子140构成或包括有机和/或无机微球或微珠，其可选地具有配合基或其它化合物例如连接到或者包括在表面中或粒子内的抗原或抗体，可选地键合到额外的化合物如抗体或抗原。在一些其它实施方式中，粒子140构成或包括可选地带有连接到其上的其它化合物的其它实体，如矿物质，例如粘土粒子。在一些实施方式中，粒子140构成或包括流体或半流体粒子，如胶束或囊泡。
应注意，一旦粒子在微通道流动的流体中按照阵列排列，就可例如通过减少或消除压力梯度来使流暂停或停止，并且粒子将保持在受到粘弹性流体中的浮力和重力影响的阵列(“冻结”)中。由于粘弹性流体是粘的，所以在很多情况下，即使粒子最终下沉到微通道底部，但是该下沉足够缓慢以便允许观察和分析阵列中的图像，如下所述。可选地，这些粒子通过诸如增加粘弹性流体的粘度的方法例如通过冷却(例如珀尔帖效应)或通过合适的化学试剂的扩散被适当地固定(或实际上固定)于静止流体中的适当位置。可选地或者作为选择，如果粒子有电偶极子或能够获得感应偶极子，则粒子可以通过施加合适的电场来固定。
在本发明的一些实施方式中，从生物源、一般从生物流体采集这些粒子。例如血液、血浆、淋巴液、尿液、脑脊液(CSF)或骨髓。
在本发明的一些情况或实施方式中，粒子包括由无机和/或有机化合物制成或包括无机和/或有机化合物的微珠(例如微球)。可选地，微珠包括或连接到或涂有有机反应或生物反应的化合物，也就是与其它化合物发生反应或连接到其它化合物(例如受体)的化合物。例如药物、抗体、抗原、酶、细胞或其部分(例如细胞器)、激素或与有机或生物实体发生反应或连接到有机或生物实体的任何化合物。在本发明的一些情况或实施方式中，粒子包括细胞或其部分，包括可选地血细胞。
在本发明的一些情况或实施方式中，粒子包括其它化合物或诸如粘土或其它矿物的物理结构或者胶束、囊泡或具有流体介质中的异质形式的任何结构。
一般且如下所述的粘弹性聚焦适合于为分类器如荧光激活细胞分类器提供粒子聚焦束。诸如微珠的粒子包括或连接或涂有蛋白质或DNA或RNA或其它生物化合物如抗原或抗体或其它化合物。这些粒子可例如通过具有磁性组分如磁芯或具有可被磁化的铁磁组分或具有可被充电并维持充电所需的持续时间的组分而被电力地或磁性地充电。珠子被聚焦在阵列例如大致柱状的阵列中，以及在例如通过特定荧光(例如颜色)被挑选后，粒子根据施加的磁场或电场被分类(多路传输)。珠子或其它粒子也可例如当粒子被涂有或键合用于与一种或多种目标化合物连接(或粘附)的酶时被用在ELISA(酶联免疫吸附测定)中，并且可随后例如如上所述被分类。
光学观察
当粒子140在平面142周围按照一致形状和方向排列时，粒子140可以都(或者至少其绝大部分)通过放大光学系统(物镜)被光学聚焦和观察。由于粒子140的垂直扩散(即，平行于图1C的尺寸116)实际上是微不足道的，所以在景深需求被放宽或甚至取消时，物镜可通过设计折衷来简化。
在一些实施方式中，从横跨物镜，即，穿过微通道的方向照射粒子140(底部照射)。可选地或者作为选择，在微通道上照射粒子(顶部照射)。
在本发明的一些情况或实施方式中，粒子清晰可见并与下面的介质(例如流体、基底)区分开来。在一些其它情况或实施方式中，粒子不可区分，并例如通过偏振光照射或本领域的其它方法如暗场来加强。
在一些实施方式中，一些着色技术被用来加强和/或区分粒子140。例如，当白血球悬浮液被使用时，白血球可通过获取不同的颜色来染色和区别。如果无生命白血球的悬浮液足够，则可使用例如本领域普遍的染色剂，例如Wright(CAS NO.68988-92-1)或Giesma(CAS NO.67-56-1)。可选地或者作为选择，当需要活白血球的悬浮液时，则可使用诸如Astrazon橙黄G(CAS NO.3056-93-7)或中性红(CAS NO.553-24-2)或Griefswalders蓝的染色剂(其在水中易溶并且不需要洗涤)，见例如美国专利458122和4400370。
在一些实施方式中，光具有在红外和/或可见光和/或紫外线区域中的特定范围(颜色)，可选地包括颜色的组合。在一些实施方式中，光是单色的，例如具有相对于相应区域例如小于100纳米或50纳米的窄带宽。在色差校正需求被放宽甚至取消时，使用单色光允许通过设计折衷进一步简化物镜。
使用可见光，粒子140可手工地例如通过物镜和目镜或用连接到物镜并在显示器上重现图像和/或打印输出的相机如数字静止或视频摄像机被光学地观察。然而，使用红外线或紫外线辐射，需要辅助设备例如带有对紫外线或红外线辐射作出响应的传感器的相机。
应注意，对于诸如图1C的142的二维阵列(片)的提及也可适用于一维阵列(列)，同时允许几何差异。
读取器
带有在微通道中按照一维或二维阵列粘弹地排列的粒子的盒子(以下称“活动”盒子)一般而非限制性地通过带有流过微通道102的粒子140的盒子100被表示在下面的讨论和相应的附图中，如上面关于图1A-C所描述的。
在本发明的典型实施方式中，盒子100被放置在读取器中，在读取器中，粒子形状通过物镜再现并被电子地捕获用于在监视器上观察和/或由图像处理和/分析装置处理。
图2A示意性地示出读取器200及其部件，包括照射源202、盒子支架204(“支架”)、光学物镜206(由其中的透镜状元件象征性地表示)以及图像采集设备208(“相机”)。读取器200还配备有所需的电源、连接线和触头(未示出)。
活动盒子100可移除地连接到固定地保持盒子的支架204，以实现在粒子阵列(例如图1C中的阵列142)处的物镜206的稳定聚焦。照射源202提供穿过支架204并穿过盒子以及至少部分地穿过粒子的光，并且物镜206将粒子图像光学地投射在相机208中的图像传感器212(例如CMOS或CCD)上。相机208捕获图像传感器212的图像，并可能在转换和/或预处理后向监视器(屏)214提供图像用于视觉观察。另外地或者可选地，相机208将图像转移到计算机216，计算机216处理图像并可选地分析它以提供一个或多个定性或定量结果。可选地或者作为选择，可选地在处理例如增强、背景减弱或本领域已知的其他视觉效果后，监视器214接收来自计算机216(而不是来自相机208)的图像。可选地或者作为选择，监视器214包括计算机216的一部分。
在一些实施方式中，结果被呈现在监视器214上。可选地或者作为选择，读取器200包括打印机(未示出)，且计算机216可选地提供结果或其部分的打印输出和/或粒子或其部分的图像。
在一些实施方式中，相机208捕获以视频模式的粒子图像，即，作为图像的序列，同时粒子随微通道中的粘弹性流体移动。可选地或者作为选择，足够快的图像采集被使用，同时粒子随微通道中的粘弹性流体移动。在一些实施方式中，粘弹性流体的流被暂停并且粒子如上所述被固定，以便只有一次(或几次)捕获被采集。
照射源202提供合适颜色的光以产生良好质量的图像，例如具有最可得到或足够或合理的清晰度和/或不同和/或对比的形状的粒子的图像。在一些实施方式中，光是单色的，并且颜色可选地从预先设定的组或根据照射源202的能力来选择。可选地或者作为选择，颜色例如根据粒子的性质和/或颜色被可变地设置。在一些实施方式中，光被偏振或配置为暗场或显微镜领域中使用的其它照射技术。
在一些实施方式中，照射源202从上面照射支架204上的盒子100，并且物镜206根据从微通道中的粒子反射的光将图像投射在传感器212上。可选地或者作为选择，读取器200包括两个或多个光源202，光源202从盒子的下面和/或上面以不同颜色和强度照射来提高或最大化粒子图像(如在清晰度、对比度等方面)的质量。可选地，读取器200包括倾斜地或从侧面(与盒子100的厚度垂直或成锐角的表面(如图1B的表面152))照射盒子的光源202。
在本发明的一些实施方式中，光源202包括至少一个固态光源单元。在一些实施方式中，固态光源单元包括LED、OLED、PLED之一或其它电致发光设备之一(以下称“LED”)。
在一些实施方式中，支架204被制造或形成以便协助在由支架204支撑的活动盒子100中的粒子的照射。例如，支架204包括例如在支架204的区域218中的活动盒子中微通道下的光漫射器或滤波器或偏振镜或准直器(例如菲涅尔透镜)的至少一个。在一些实施方式中，支架204以与盒子100包括LED或多个LED类似的方式包括LED或多个LED，如下所述并在各自的图3A-C中示出的(并且为了简洁和清楚不再重复)。
在一些实施方式中，盒子100包括照射微通道102的一个或多个LED。
图3A示意性地示出盒子100，其具有微通道102并包括(或连接)微通道对面的盒子的下部分处的LED302。LED302通过电触头304被驱动并照射微通道102。可选地，LED302包括提供均匀或近似均匀的照射的漫射器和/或半透明盖。可选地，LED302代表布置在盒子100的下表面156周围的多个LED。
图3B示意性地示出盒子100，其具有微通道102并包括(或连接)布置在盒子的侧面处的LED302。基底104的上表面(或其部分)周围的界面层154或盖106的下表面(或其部分)例如通过适当的涂覆或材料的折射率的选择是反射性的。由LED302发射的射到层154的光朝向盒子100(或基底104)的下表面156反射。表面156例如通过涂覆是反射性的，并反射层154所反射的光或LED302直接发射的光，并将光向上引导到微通道102。可选地，层156是波状的或地面或半透明的，使得层156反射协助通知微通道102的照射的漫射或散射光。可选地，层154也是漫射性的或半透明的，并从其使反射的光散射，进一步协助通知微通道102的照射。
图3C示意性地示出盒子100，其具有微通道102并包括(或连接)在微通道的每侧处的盖106上的LED302。图3C示出照射微通道102的另一变化形式。应当理解，LED的数量及其位置和方向以及反射和漫射或散射表面的性质可变化，以实现适于一般和/或特定需求的照射。
在一些实施方式中，作为LED302的附加或替代形式，如上关于3A-C所述的光的照射和漫射和散射可由其它光源如点灯泡、光纤导向器或其它装置来实现，所有这些装置一般而非限制性地由图2A中的光源202代表。
在本发明的一些实施方式中，盒子100由在预先设定位置中的支架204支撑，以便物镜206聚焦在排列的粒子处而没有任何进一步的调整。可选地或者作为选择，物镜206自动地聚焦在排列的粒子处，其中聚焦由相机208和/或计算机216例如通过最大化图像的对比度或其它特征来控制和/或驱动。在一些实施方式中，自动聚焦通过移动连接到物镜206或其中的部件的机构来实现(例如使物镜中光学元件之间的距离变化)。可选地或者作为选择，支架204相对于物镜206移动。可选地或者作为选择，手工聚焦通过观察监视器214上显示的图像或使用可选的辅助目镜来执行。在一些优选实施方式中，当盒子作为使用读取器200的部分被放置和释放时，焦点没被改变或被极小地改变，并且只是偶尔，或遵循操作或服务协议，聚焦被检查和/或调整。
在本发明的一些实施方式中，读取器200提供盒子100的微结构的一个或多个功能。例如，在盒子100被处置并安装在支架204上时，通过连接到出口室128的真空装置来提供压力梯度。或者作为另一实例，在盒子100被布置并安装在支架204上时，提供连接到流体入口122的粘弹性和/或附加性贮存器。
在本发明的一些优选实施方式中，盒子100是一次性的物品，并经常可移除地放置在读取器200中，类似于使用显微镜载玻片。
在一些实施方式中，在盒子100可与其它等效的或兼容的盒子交换作为日常工作程序的意义上，盒子100是可替换的。可选地，盒子100常规地可移除地放置在读取器200中作为可装满的盒子，其具有方便操作如清洁、再填充流体或装满真空的结构，其中其的至少部分配置在读取器200中。在可选实施方式中，盒子100通常被包括作为读取器200的一部分，并根据服务协议或故障被替代，其中读取器200提供诸如粘弹性流体供应、压力梯度和清洗的功能。
支架204便于通过诸如在一条或多条弹性带、夹子(类似于文件夹)、夹具(例如钳子)、揿钮下滑动、使孔与销匹配或配合到插孔或任何合适的可释放紧固件或机构的方法或机构来可移除地支撑或可移除地连接或可移除地夹住(共同表示为“夹住”)读取器200中的盒子100，。
在本发明的一些实施方式中，盒子100在机械上和/或光学上与可选地作为有盖的载玻片的显微镜载玻片相容。例如，盒子100可连接到光学显微镜并可被视为通过目镜或通过相机和可选地其它设备如计算机辅助来观察的常规载玻片。
优地，在一些实施方式中，光源202与相机208配合，以便光源202仅在捕获图像的持续时间内照射。光源202和相机208的协调(同步)例如通过避免盒子100或粒子140的可能的过热和可能的变形和/或避免粒子140的可能的光降解和/或节省在电池供电的读取器200中可能相当大的功率可能是有利的。可选地，当相机208没有捕获以允许观察盒子100时，光源202变暗。
回来参考图2A，在本发明的一些实施方式中，照射源202、支架204、物镜206和相机208被封装在可以进入以将活动盒子100夹到支架204的箱210中。可选地，计算机216和/或监视器214和/或打印机(未示出)也被封装在箱210中。可选地或者作为选择，计算机216和监视器214以及可选地打印机(未示出)被一起封装在箱210的外部。
压缩读取器
在本发明的一些优选实施方式中，读取器200被构造为紧凑的装置，其包括作为密集包装的部件以减小读取器200的大小的操作元件。紧凑的构造可以允许使用读取器200作为桌面单元或非固定单元或作为便携式单元、可选地电池操作的单元，同时可能损害一些成本和/或性能。
图2B示意性地示出根据本发明的示例性实施方式的紧凑读取器220及其部件。类似于图2A的读取器200及使用类似或等效于其部件的部件，读取器220没有限制地保留读取器200的如上所述的一些特征和/或能力和/或功能。为了清楚和简洁，一般在下面只讨论紧凑读取器220的一些实施方式的特定特征。
在本发明的一些实施方式中，读取器220包括：
(a)箱210，其具有用于盒子插入的开口230。优选地，箱210被配置和设计成为了方便处理和操作(见下文)而可选地具有操作相关或吸引人的色彩及形状。
(b)盒子支架204，其被配置成例如通过用于卡扣锁住和弹跳释放的机构或用于活动盒子100的简单而舒适的插入和固定以及随后简单和容易的释放的任何其它机构来方便可移除地夹住活动盒子100。
(c)光源，其优选地作为使用选定或确定的颜色穿过盒子100中的微通道102照射的一个或多个LED302。可选地，例如根据一些特定的应用或粒子类型，一个或多个LED302从其它或额外的方向照射微通道102。一般来说，没有限制地，LED302也代表其它光源，优选地小型化的这样的光纤导向器(也见图2A的相应读取器200上的光源204)。
(d)物镜206，其可能通过反射镜222以折叠光路被分成两个部分206a和206b，实现读取器220的紧凑配置。物镜部分206a和206b以及反射镜222代表为读取器220的紧凑配置所设计的可选的更多部分和元件。
(e)图像采集设备208，其包括光传感器212，光传感器212捕获被照射的微通道102及其中的粒子的图像。优选地，图像采集设备208是为特定要求和小尺寸和/或功率消耗所设计的小型相机或定制设备。
(f)显示屏214，其在箱210的外表面上，例如LCD屏，优选地作为彩色显示器。
(g)在箱210的外表面上的四向按钮224和开关(矩形)/灯组226，代表用于控制、操作或与读取器220的部件或操作交互作用的任何元件，如仪器操作的领域中已知的或以其他方式发展的。
(h)带有所需存储器以及其它外围部件和机构(“计算机”)216的一个或多个处理器，其执行与操作和控制读取器220相关的一个或多个所提供的程序和与图像处理和其它可选应用相关的一个或多个程序。在典型的优选实施方式中，计算机216此外还与图像采集设备208、屏幕214、照射源302、控制元件224和226以及物镜206的用于自动聚焦在活动盒子100中的粒子上的可选的运动机构相互作用和/或控制这些元件。
(i)电源，其由用图形表示的电池228代表，电池228给读取器220的部件如计算机216、显示器214、LED30、互作用型元件224和226分配电功率。可选地，功率也被提供给物镜206和/或反射镜222以便为了适当的聚焦/或改变放大倍率而移动。在一些实施方式中，电源228连接到市电电源。可选地或者作为选择，电源228是可选地由一个或多个可再充电电池驱动的一个或多个电池。(配电未被示出)。
可选地，读取器220还包括小型打印机，如使用热敏纸的打印机。
作为典型的非限制性例子，计算机216检测诸如来自按钮组26的模式选择的设置或在显示器214上显示菜单，在显示器214上，诸如模式设置的选择由四向按钮224进行。计算机216接收来自图像采集设备208的图像，并且根据读取器220的设置来处理图像，而同时并随后在屏幕214上显示图像或其部分或其经处理的部分。根据读取器220的设置，计算机216对处理过的或原始图像执行一个或多个特定分析(或作为图像处理的部分)，并在屏幕214上以图形和/或字母数字显示结果。读取器220的模式或设置可显示在屏幕214和/或灯组226上。为操作方便，作为读取器220的可选模式，一旦盒子100被适当地夹在支架204上，传感器(例如电触头或光学或磁传感器)就指示计算机216捕获微通道102中的图像，并继续进行图像处理和/或分析。
在一些实施方式中，可选地为了减少空间(以及可选地减少成本，至少在大规模生产中)，相机208和计算机216合并成可选地包括一个或多个集成电路的单个单元(或复合单元)(例如包括图像传感器、处理器以及辅助设备如存储器和输入/输出端口的CMOS)。
在一些实施方式中，当接通电源时，读取器220在默认模式中，例如在模式中，在插入盒子时，它采集图像并执行预先设定的处理和分析，并在屏幕上显示预先设定的图像和数据。
在一些实施方式中，读取器220包括连接其它计算机或设备用于操作例如数据存储、检索或统计分析或其它所需要的操作(未示出)的接口装置和/或机构(例如包括软件)。
应注意，在一些实施方式中，关于读取器220所描述的特征或能力或功能适用于读取器200，其没有限制地代表活动盒子100的广义读取器。
试剂盒
在本发明的一些实施方式中，一个或多个盒子被提供为试剂盒。一般来说而没有限制地，在下面的讨论和相应的图中由如上关于图1A-C所描述的盒子100代表盒子。
图4A示意性地示出包括多个盒子100的试剂盒400。在一些实施方式中，盒子100是空的(没有任何流体或粒子或其它组分例如真空囊)。可选地，盒子100包括真空如真空囊或室，或者出口室128产生真空以提供压力梯度(如上所述)。可选地或者作为选择，盒子100包括例如在入口122中的粘弹物(或其组分)。
图4B示意性地示出包括多个盒子100的可选地类似或相同于试剂盒400的试剂盒430，并且还包括一种或多种流体，例如对使用粘弹性流体或其组分的准备。在一些实施方式中，在注射器402中提供流体，注射器402可用于将流体注入到盒子100的入口122。可选地或者作为选择，提供多个注射器，其包含粘弹性流体和/或用于产生所需的粘弹性流体的组分。
图4C示意性地示出可选地类似或等同于试剂盒400或430的试剂盒450，其包括多个盒子100，并还包括一个或多个容器404如瓶或管(例如类似于牙膏管)中的一种或多种流体。一种或多种流体包括对使用粘弹性流体或其组分的准备。
在一些实施方式中，试剂盒中的一些或全部流体被提供为粉末或其它形式如凝胶，其随后溶解在另一流体例如粘弹性流体组分或溶剂如水或酒精或任何溶剂中，其中溶剂可选地被提供为试剂盒的一部分或作为额外元件。在一些情况下，单独地在试剂盒中提供组分，因为对使用液体的准备可能在时间上和/或由于环境条件如温度而降低，或当粘弹性流体的变化形式可准备用于各种目的例如添加化合物以防止某些粒子(例如RBC)的聚集或凝结或添加用于区分白血球的染色剂时。
在本发明的一些实施方式中，试剂盒包括图4A-C所示的试剂盒400、430或450的任意组合或变化形式，其中虚线代表试剂盒中任何数量的附属物品(例如盒子100)(包括单个物品)。
在一些实施方式中，试剂盒包括读取器，例如图2B的紧凑读取器220。
在一些实施方式中，试剂盒包括用户指南，其包括操作指令如文本和/或说明并可选地包括安全措施。
在一些实施方式中，试剂盒包括箱，其优选地为了其部件的快速和方便的接近和处理来配置。
方法
下面关于图5和6描述用于根据本发明的一些实施方式观察和/或分析粒子的方法。
图5示意性地示出根据本发明的一些实施方式的概述在观察在粘弹性流体中排列的粒子的放大图像中的行为的流程图。
微观粒子如血细胞或珠悬浮在具有用于使粒子在微通道中排列的特性的粘弹性流体中(502)。
流体在具有适于使粒子按照一维或二维阵列排列从而使粒子相应地排列的尺寸的微通道中流动(504)。
透镜例如可选地带有目镜的显微镜物镜聚焦在微通道中的粒子阵列处(506)以及粒子形状的放大图像被观察(508)。
可选地，对这些粒子进行形状、浓度、密度或任何其他派生物的分析(510)。
图6示意性地示出根据本发明的一些实施方式的用于捕获和分析在粘弹性流体中排列的粒子的放大图像的行为的流程图。
形成有至少一个微通道的基底(602)和适于使粒子在微通道中按照至少一维阵列排列的粘弹性流体(604)以及用于观察和/或分析的粒子(606)被提供。
这些粒子悬浮在粘弹性流体中(608)并且悬浮液在微通道中流动，从而使粒子按照一维或二维阵列排列(610)。在一些实施方式中，使流体流动至少部分地通过施加压力梯度而实现，优选地没有任何外部施加的电力或磁力或离心力或引力。
光学装置例如聚焦在阵列处的放大物镜用来形成(即，生成)在微通道中的粒子的图像(612)，并且图像由图像采集设备如相机捕获(614)。
粒子的被捕获的图像被传送到计算设备，其执行被配置成分析被捕获的图像中的粒子的所提供的程序(616)，并且分析的结果例如通过显示监视器和/或打印输出由计算设备(618)提供。
程序的功能性
在本发明的一些实施方式中，给计算设备例如与分别诸如图2A或2B的读取器200或220的读取器连接或内置在读取器中的计算机(或处理器)提供由计算机执行的一个或多个程序，其中包括下列功能的一个或多个程序：
预处理
为了更好的质量或清晰度，修改图像或其区域。例如，过滤背景噪声或减弱背景，或加深图像或其内容(例如粒子形状)或其它操作例如修改对比度或亮度或用于提高图像质量或清晰性的其它参数如色彩。
图像处理(分析)
提取在图像中嵌入的信息。例如，至少一般或近似地分割或blob分析、隔离和/或提取并确定粒子的形状或形态，例如圆的、细长的、分枝的、纤维状的、纤维的、螺旋的或环形的，或者确定特征如凸度或偏心率。可选地，程序随后根据染色的颜色确定粒子的(例如标识)粒子类型，例如白血球类型，如上所述。
在一些实施方式中，基于图像的区域的形状和/或基于所提取的粒子形状，程序提供粒子的大小和/或体积和/或密度和/或浓度的计算或估计。
在一些实施方式和情况中，程序提供定量结果(例如粒子的浓度)。可选地或者作为选择，程序提供定性结果(例如粒子类型)。可选地，程序同时提供定量和定性结果。
在一些实施方式中，程序基于所提取或确定的特征(例如粒子的大小)的一个或多个推导和操作来提供值。可选地，推导包括采用例如本领域已知的和/或得自校准程序的或以其他方式获得的实验或假设值。
可选地，基于例如粒子的形状或大小或浓度或其它所确定的数据，程序提供生物学意义或临床意义的至少一个的值或指示或建议，例如，可能的或看似真实的身体或生理或病理状况的推理或指示。
在一些实施方式中，当粒子包括生物实体或样品时，程序提供至少一些测量或评估，如在临床或生物领域中普遍的。
例如，在一些实施方式中，粒子包括红血细胞(RBC)，并且程序提供结果例如RBC计数(例如，CBC)、压积细胞体积(PCV)或平均红细胞体积(MCV)或派生物或其相关的量，例如红细胞分布宽度(RDW)或血红蛋白相关的结果如平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。在一些实施方式中，粒子包括白血细胞(WBC)并且程序提供结果，例如微分白血细胞计数或血小板计数(PLT)或派生物或其相关的量。
作为另一实例，在一些实施方式中，脑脊髓液(CSF)样品被用来分析白细胞特别是中性白细胞或多形核白细胞以及传染性制剂、细胞碎片和在感染或伤害(脓细胞)的部位处形成的组织流体，用于评估脑膜炎的可能性。白细胞或其他细胞或实体可选地被染色以区分并识别和/或量化，以便有合理的脑膜炎评估。
作为又一实例，来自淋巴或骨髓的淋巴细胞可以通过若干受体和分化抗原的存在被区分，或者淋巴瘤和/或白血病细胞被区分，然后分析和可选的量化被执行以提供白血病评估。
因此，在一些实施方式中，可使用其它样品和粒子。例如，可为了评估胎儿肺成熟度而提供化验细菌的尿(细菌感染)、或化验具有在微米范围内的片层体直径(其通常在美国是不可检测的)和片层体计数(LBC)的粒子的羊水。
自动聚焦
光学透镜或物镜的自动聚焦基于最大对比度或清晰度(至少在所关注的特定区域处)。物镜或其部件或样品(例如盒子)被移动以例如响应于由程序确定的聚焦通过计算机所控制的机构使聚焦最大化。例如，程序可实现量化清晰度的函数例如高斯-拉普拉斯算子(LoG)，并改变焦点以使LoG函数最大化。
在本发明的一些实施方式中，当粒子包括细胞或其它生物实体例如带有附着的抗原或其它化合物如药物的微珠时，测量包括例如在生物或医学化验和/或分析和/或评估的领域中已知的具有化学或生物学或医学或临床意义的值或指示。
显示
图像显示器，其例如设置屏幕或监视器(例如，图2A或2B的屏幕114)的像素，或打印在纸上。
操作&控制
读取器如图2A或2B的读取器200或220及其部件的操作和控制，例如由相机控制图像捕获、感测手工控制(例如，按钮或菜单选择)或与可选的外部计算机的交互作用。
算法
在一些实施方式中，图像相关的一个或多个程序基于或实现本领域的算法或方法，例如在B.Jahne的Practical Handbook on Image Processing for ScientificApplications,CRC Press,1977或J.C.Russ的The Image Processing Handbook,CRCPress1995或A.K.Jain的Fundamentals of Digital Image Processing,Prentice Hallint.1989或图像处理、模式识别及其应用的许多书籍、文章和出版物中的算法或方法。在许多情况下，神经网络被用于细胞图像分析和可选地也涉及模糊逻辑的模式识别。例如，C.H.Chen的Fuzzy logic and neural network handbook,Mcgraw-Hill ComputerEngineering Series,1996(ISBN:0-07-011189-8)以及许多其它相关的出版物。
示例性实验
实验I
通过热模压来准备由PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)制成的具有200微米的宽度(水平方向)和20微米的高度(垂直方向)的微通道。
0.6％w/v PAA(AP30)的粘弹性溶液溶于1毫升PBS(pH值7.4)和1.5mg/ml EDTA中并迅速与来自指尖的20μL的全血混合，产生血粒子的悬浮液。
悬浮液被注入到微通道中并在负梯度(真空)下在微通道中流动，在微通道中，细胞在各种压力梯度下在微通道的中心处在一层中排列(“集中”)。
图7示出在如上所述的实验条件下在微通道中的粘弹性流体流中排列的血细胞的被采集的图像(实验I)。
为清楚起见，图像通过诸如水平均衡、亮度/对比度调整和背景减弱的操作来预处理。
红血细胞以某种较小的聚集清晰地在焦点(在粘弹性聚焦粒子处的光学焦点)上。一些棘状细胞(形态上改变的红血细胞)由于pH值高于约7.4而可见。
基于例如图7的被采集的图像，细胞浓度可以通过下列公式得到：
Con＝N x D/(FOV x H)
其中：
Con是RBC的浓度；
N是RBC的数目；
D为RBC的稀度；
FOV是光学视场区域；以及
H是微通道的高度。
个别RBC的体积可通过计算RBC的面积并乘以经验系数从所采集的图像得到，并且MCV可通过平均RBC的体积得到。
实验II
使用上面实验I中的微通道，来自指尖的血混合于0.8％w/v葡聚糖40kDa、100ppm的PAA AP45、9.5g/L的HEPES、0.90g/L葡萄糖(右旋糖)和7.00g/L氯化钠的溶液中，产生在微通道中流动的血细胞的悬浮液。
图8示出在如上所述的实验条件下在微通道中流动的粘弹性流体中排列的血细胞的被采集的图像(实验II)。
为清楚起见，图像通过诸如水平均衡、亮度/对比度调整和背景减弱的操作来预处理。
血细胞清晰地在焦点上，虽然相当大的聚集发生(例如，相对于实验I)，然而单独的细胞仍然可以被区分。使用500kDa葡聚糖，而不是上述的40kDa，聚集被消除了。
实验III
1％的碱性橙21和0.1％的中性红染料的5μl水溶液溶于DI水中，并与25μl的全血混合。溶液随后以1：50的比例溶于0.6％w/v PAA(AP30)的溶液中，并进一步溶于PBS(pH值7.4)和1.5mg/ml EDTA l中，产生血细胞的悬浮液。悬浮液在如上对实验I所描述的50微米宽和200微米高的微通道中流动。
血细胞在微通道中排列，并且细胞由染料差别地染色(见上文)。使用已知的图像处理技术，如上面所述，可能计算并区分白细胞的特殊的5种类型：中性白细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞、淋巴细胞和单核细胞。
具体实施方式的前面描述将如此充分地揭示本发明的一般性质，其他人可以通过应用现有的知识很容易地为各种应用修改和/或改写这样的具体实施方式，而无需过度的实验并且不偏离一般概念，因此，这样的改写和修改应该并被规定为在所公开的实施方式的等效形式的意义和范围内被理解。应理解，本文采用的措辞或术语是为了描述而不是限制的目的。用于执行各种所公开的功能的装置、材料和步骤可采用各种可选形式而不偏离本发明。

Claims (11)

1.一种被配置用于在血液分析仪中使用的盒子，所述盒子包括：
样本入口，其被配置为接收包括待被检验的粒子的血液样本；
粘弹性流体，其在所述盒子的制造过程中被密封在所述盒子的流体入口中；
混合室；以及
微通道，所述微通道具有进口端和出口端；
其中所述样本入口、所述流体入口、所述混合室和所述微通道被配置为能够：
在经由所述样本入口将所述待被检验的粒子引入所述盒子之后，在所述混合室中将所述待被检验的粒子与所述粘弹性流体混合，以提供所述待被检验的粒子与所述粘弹性流体的混合物；以及
使所述混合物从所述微通道的所述进口端流动通过所述微通道至所述微通道的所述出口端，其中所述待被检验的粒子与所述粘弹性流体的所述混合物从所述进口端通过所述微通道至所述出口端的流动引起粒子在聚焦区中按至少一维阵列排列，其中所述聚焦区包括所述微通道的中心。
2.根据权利要求1所述的盒子，其中所述盒子还包括透明的查看区域，以能够获得粒子在所述微通道中的光学图像。
3.根据权利要求1所述的盒子，其中所述粘弹性流体包括至少一种高分子量聚合物。
4.根据权利要求1所述的盒子，其中所述盒子是一次性的。
5.根据权利要求1所述的盒子，其中所述盒子是可更换的。
6.根据权利要求1所述的盒子，其中所述盒子还包括将所述微通道与压力梯度隔离形成真空的阀。
7.根据权利要求1所述的盒子，其中所述微通道被定大小和定形状以容纳血液细胞的阵列，所述血液细胞的阵列的宽度为多个血液细胞，深度为大约一个血液细胞。
8.根据权利要求3所述的盒子，其中所述至少一种高分子量聚合物具有在50kDa和1000kDa之间的分子量。
9.根据权利要求1所述的盒子，其中所述微通道包括被配置成引起所述待被检验的粒子粘弹性聚焦的尺寸。
10.根据权利要求1所述的盒子，其中所述至少一维阵列是二维阵列。
11.根据权利要求1所述的盒子，其中所述微通道具有小于100微米的水平尺寸。
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