ITNA20110033A1 - Misura dell' aggregabilità eritrocitaria in flusso in microcapillari - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per TITOLO: "Misura dell' aggregabilità eritrocitaria in flusso in microcapillari"

CAMPO DI APPLICAZIONE

Forma oggetto del presente trovato un sistema per misurare lo stato di aggregazione eritrocitaria come espresso nella rivendicazione principale, denominato in seguito con 1'acronimo "AEF" (Aggregabilità Eritrocitaria in Flusso). Più in particolare la AEF consiste in un sistema basato sull'utilizzo di una cella di flusso in cui sono alloggiati microcapillari di vetro di diametro interno paragonabile alla dimensioni cellulari medie. La misura dell'aggregazione eritrocitaria in flusso consente quindi di riprodurre in vitro le caratteristiche fluidodinamiche del microcircolo sanguigno umano, consentendo di eseguire analisi sullo stato infiammatorio tipico di alcune patologie. L'AEF presenta guindi caratteristiche di grande interesse in campo biomedico e diagnostico.

STATO DELLA TECNICA

E' noto, già dai primi anni dell'800, che la maggior parte della resistenza viscosa al flusso sanguigno è da attribuirsi alla microcircolazione. Tale dissipazione dipende sia dalla rete microcapillare che dalla dinamica e dalle proprietà in flusso dei globuli rossi (o eritrociti) , che occupano circa il 45% del volume totale del sangue (in contrasto con gli altri elementi, guali globuli bianchi e piastrine, che ne occupano circa l'l%). I globuli rossi umani sono cellule di forma discoidale biconcava (che permette loro di rigirarsi, schiacciarsi e ripiegarsi per poter passare all'interno di vasi sanguigni molto sottili), del diametro di 7/8 micrometri. La funzione principale dei globuli rossi è il trasporto di ossigeno nei vasi sanguigni più piccoli (arteriole e capillari) . In presenza delle proteine contenute nel plasma sanguigno, soprattutto del fibrinogeno, i globuli rossi tendono ad aggregarsi in configurazioni chiamate clusters. L'aggregazione dei globuli rossi è influenzata da forze contrastanti: la forza repulsiva tra le cellule cariche negativamente, l'adesione cellula-cellula indotta dalle proteine del plasma e la forza di scorrimento disaggregante generata del flusso sanguigno. L'aggregazione dei globuli rossi dipende guindi sia da fattori esterni (plasma) che da fattori interni (cellule) . In condizioni fisiologiche il flusso sanguigno è sufficiente a disperdere gli aggregati, ma in condizioni di flusso lento e in condizioni patologiche l'incremento dell' aggregabilità dei globuli rossi può causare malfunzionamenti della circolazione e, soprattutto nel microcircolo, l'occlusione dei vasi capillari. L'aggregazione dei globuli rossi aumenta in diverse condizioni patologiche associate a stati infiammatori, infarto miocardico e sepsi batterica. Attualmente la valutazione dell'aggregazione dei globuli rossi in clinica diagnostica avviene indirettamente tramite l'analisi VES (velocità di sedimentazione eritrocitaria) , in cui si osserva la sedimentazione dei globuli rossi in un tubo verticale. Anche se la VES è un indice non specifico dell'attività infiammatoria essa non fornisce informazioni sui meccanismi di formazione degli aggregati di globuli rossi (clusters) in condizioni di flusso. Data la complessità del problema e la difficoltà di condurre analisi in vivo, le principali direzioni della ricerca sono state simulazioni numeriche e sistemi in vitro che simulino le condizioni fluidodinamiche incontrate dai globuli rossi nella microcircolazione. I metodi sperimentali disponibili includono tecniche basate su analisi quantitative del flusso di sospensioni concentrate di globuli rossi in microcapillari e in microcanali.

L'AEF consente di avere informazioni quantitative sul fenomeno di aggregazione eritrocitaria in flusso. In particolare fornisce informazioni quali la probabilità di formazione di clusters in diverse condizioni di flusso, la dimensione dei clusters in funzione della pressione nei capillari e il meccanismo di formazione dei clusters.

ESPOSIZIONE DEL TROVATO

L'AEF (Aggregazione Eritrocitaria in Flusso) è un'analisi che consente di avere informazioni circa lo stato di aggregazione dei globuli rossi in flusso in microcapillari, quindi in condizioni fluidodinamiche simili a quelle del microcircolo umano. I campioni di sangue, prelevati da donatori consenzienti e processati entro 4 ore dal prelievo, vengono centrifugati per separare i globuli rossi da globuli bianchi e piastrine, poi i globuli rossi vengono risospesi in plasma e diluiti fino alla concentrazione desiderata con anticoagulante e albumina. I microcapillari utilizzati sono di vetro, con un diametro interno di 10 micrometri e sono alloggiati all' interno di una cella di flusso collegata a due serbatoi contenenti la sospensione di globuli rossi tramite due tubi flessibili. La cella di flusso viene posta sul tavolino motorizzato di un microscopio, per consentire l'acquisizione di immagini ad alto ingrandimento tramite una telecamera ad alta velocità. La distanza tra i due serbatoi contenenti la sospensione di globuli rossi corrisponde alla pressione imposta sui microcapillari, poiché le altre perdite di carico possono essere considerate trascurabili. Nelle analisi delle immagini acquisite tramite microscopia ottica viene considerato come cluster un aggregato di due o più globuli rossi nel quale la distanza d tra due globuli successivi è inferiore o uguale alla lunghezza di un singolo globulo D (vedere Figura la). I due parametri di controllo sono la frazione volumetrica di globuli rossi, nell'esempio qui presentato fissata al 10%, e la pressione imposta ΔΡ. Ad ogni ΔΡ vengono misurate la dimensione dei cluster, in termini di lunghezza L degli aggregati, e la distanza d tra due cellule successive nel cluster (Figura la). La lunghezza L dei cluster varia al variare della pressione imposta e del numero N di globuli rossi che compongono il cluster stesso. In particolare, L aumenta all'aumentare del numero di globuli N e della pressione imposta, fino al raggiungimento di una pressione critica oltre la quale non varia più (Figura Ib). Questo fenomeno è osservabile anche andando a valutare la distanza d tra i globuli nel cluster in funzione della pressione (Figura ld): d aumenta fino al raggiungimento di un valore di plateau. Inoltre tale distanza aumenta all'aumentare del numero di globuli N presenti nel cluster fino a raggiungere una dimensione critica, corrispondente alla pressione critica precedentemente individuata, raggiunta la quale si ha un allontanamento di un globulo dal cluster. Quindi la dimensione di un cluster, indicata qui come la lunghezza L, aumenta con la pressione imposta in conseguenza di due fattori: i) la distanza d che intercorre tra due globuli adiacenti nel cluster, e ii) la deformazione dei globuli rossi, che aumenta con l'aumentare della pressione. Quindi da un'analisi di questo tipo si può controllare quali pressioni sono più favorevoli alla formazione di cluster di grandi dimensioni, che possono essere dannosi per un'ottimale circolazione sanguigna, soprattutto nei piccoli vasi. Si può inoltre quantificare il fenomeno di fluttuazione della concentrazione di globuli rossi nei microcapillari, che causa zone ricche di cluster precedute e seguite da zone povere di globuli rossi (Figura ld). Per quanto riguarda l'influenza della pressione sulla formazione dei cluster, e sulla loro dimensione e stabilità, il numero di globuli rossi costituenti un cluster è stato contato a tre diversi ΔΡ e in tre diverse posizioni lungo il microcapillare: all'imbocco, al centro e allo sbocco (Figura 2). Anche in questo caso la pressione ha molta influenza sulla formazione e sulla dimensione dei clusters. Si può notare come a bassi ΔΡ (Figura 2a) ci sia una maggioranza di cluster piccoli, formati da 2 o 3 globuli, all'ingresso del capillare. Man mano che ci si allontana dall'imbocco si formano clusters stabili di maggiori dimensioni. All'aumentare della pressione (Figura 2b e 2c) cluster grandi (n>6) diventano meno frequenti, ad indicare che la pressione agisce come una forza disaggregante. Alle alte pressioni (Figura 2c) la distribuzione dei cluster rimane la stessa, indipendentemente dalla pozione nel capillare. Quindi, aggregati di grandi dimensioni, che in vivo potrebbero presentare un fattore di rischio trombotico, tendono a formarsi a bassi valori della pressione e in vicinanza di cambiamenti di sezione del capillare, quali una biforcazione o una strozzatura.

L'AEF (Aggregazione Eritrocitaria in flusso) consente quindi di controllare i parametri che regolano la formazione e la dimensione di aggregati di globuli rossi (clusters) in flusso in microcapillari di dimensioni e geometrie simili a quelle della microcircolazione umana.

Il sistema di misura AEF può essere usato per stimare le condizioni fluidodinamiche che portano alla formazione di clusters di dimensioni maggiori del normale che possono essere un fattore di rischio trombotico.

In alcune patologie in cui i globuli rossi sono meno deformabili, come ad esempio il diabete, i globuli rossi tendono a formare clusters più compatti indicare la maggiore tendenza dei globuli ad aggregarsi e quindi a creare ostacoli al normale flusso sanguigno soprattutto a livello della microcircolo .

L'AEF inoltre può essere usato per studiare l'effetto di farmaci sull'aggregazione eritrocitaria in flusso e per il trasporto ed il rilascio controllato di farmaci.

BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE

Figura la): Indicazione delle dimensioni di riferimento;

Figura lb): Andamento della lunghezza media dei clusters in funzione del numero di globuli rossi costituenti il cluster per quattro diversi valori della pressione imposta;

Figura le) : Andamento della distanza media tra due globuli successivi in un cluster in funzione della pressione imposta;

Figura ld): Effetto della fluttuazione della frazione volumetrica di globuli rossi in un microcapillare ;

Figura 2): Distribuzioni della percentuale di clusters formati dal numero di globuli N in tre diverse zone del microcapillare (imbocco, centro e sbocco) a tre diversi valori della pressione imposta: a)15 mmhg, b)34 mmhg, c) 80 mmHg.

Claims (1)

1. Rivendicazioni dell'invenzione industriale avente per TITOLO: "Misura dell'aggregabilità eritrocitaria in flusso in microcapillari" RIVENDICAZIONI [1] Si rivendica il sistema indicato come AEF (Aggregazione Eritrocitaria in Flusso) per l'analisi della dinamica dell'aggregazione di globuli rossi in flusso in microcapillari o microcanali caratterizzato dal fatto di: a) utilizzare micro capillari o microcanali di vetro o di altri materiali trasparenti (ad esempio, silicone e polimetilmetacrilato) con diametro interno paragonabile o inferiore alle dimensioni cellulari medie (ordine della decina di micron); b) poter visualizzare direttamente i clusters di globuli rossi in flusso tramite videomicroscopia ottica, acquisendone immagini e filmati; c) poter misurare parametri caratteristici dei clusters di globuli rossi, come ad esempio la dimensione dei clusters e la distanza tra globuli successivi in un cluster, in funzione della pressione imposta e della posizione nel microcapillare o nel microcanale tramite tecniche di analisi dell'immagine. [2] Si rivendica il sistema AEF secondo la rivendicazione [1], caratterizzato dal fatto che può essere utilizzato per misurare le proprietà di aggregazione dei globuli rossi. [3] Si rivendica il sistema AEF secondo la rivendicazione [1], caratterizzato dal fatto che può essere utilizzato per analizzare le proprietà di aggregazione di diverse linee cellulari (sia umane che animali) in flusso, come i globuli bianchi e le piastrine. [4] Si rivendica il sistema AEF secondo la rivendicazione [1], caratterizzato dal fatto che può essere utilizzato per analizzare la velocità di tutti i componenti cellulari del sangue in funzione della pressione imposta. [5] Si rivendica il sistema AEF secondo la rivendicazione [1], caratterizzato dal fatto che può essere utilizzato per analizzare l'aggregazione di globuli rossi provenienti da campioni di sangue affetti da tutti i tipi di diabete (diabete primario di tipo 1 e di tipo 2-, diabete secondario e diabete gestazionale), tutti i tipi di policitemia (policitemia primaria, policitemia secondaria e policitemia congenita), e da tutti i tipi di patologie eritrocitarie, come ad esempio sferocitosi, ellissocitosi, anemia falciforme, talassemia di tipo alfa e di tipo beta, emoglobinuria parossistica notturna, mieloma. [6] Si rivendica il sistema AEF secondo la rivendicazione [1], caratterizzato dal fatto che può essere utilizzato con diversi tipi di soluzioni sospendenti (ad esempio, PBS, HEPES), con diverse concentrazioni di albumina e con diversi tipi di albumina (umana e bovina). [7] Si rivendica il sistema AEF secondo la rivendicazione [1], caratterizzato dal fatto che può essere utilizzato in diverse condizioni sperimentali, ad esempio di temperatura, pH, osmolarità e pressioni di 02e C02. [8] Si rivendica il sistema AEF secondo la rivendicazione [1], caratterizzato dal fatto che può essere utilizzato sia con sangue intero che con sospensioni cellulari aventi diversi valori di ematocrito. [9] Si rivendica il sistema AEF secondo la rivendicazione [1], caratterizzato dal fatto che può essere usato per diagnosticare fattori di rischio trombotico e di stadi infiammatori associati a un'alterata aggregazione eritrocitaria. [10] Si rivendica il sistema AEF secondo la rivendicazione [1], caratterizzato dal fatto che può essere usato per studiare l'effetto di farmaci sull'aggregabilità eritrocitaria e sul flusso sanguigno nel microcircolo e per studiare il trasporto ed il rilascio controllato di farmaci.