DE112005002567T5

DE112005002567T5 - Eine neue Sonde und deren Verwendung in Bioaffinitäts-Analysen

Info

Publication number: DE112005002567T5
Application number: DE112005002567T
Authority: DE
Inventors: Ville Laitala; Alice Ylikoski
Original assignee: Wallac Oy
Current assignee: Wallac Oy
Priority date: 2004-10-19
Filing date: 2005-10-18
Publication date: 2007-11-22
Also published as: GB0707067D0; GB2433993B; GB2433993A; WO2006042907A1

Abstract

Homogene Bioaffinitäts-Untersuchung mit den Schritten:
a) Bereitstellen einer markierten Sonde mit
(i) einem TR-FRET-Markierungspaar mit einem lumineszenten Energiedonator mit angeregtem Zustand mit langer Lebensdauer und einem Lumineszenzakzeptor mit angeregtem Zustand mit geringer Lebensdauer; und
(ii) einem reaktiven Gebiet, das in der Lage ist, eine zu bestimmende Bioaffinitäts-Komponente zu erkennen;
b) Inkontaktbringen der markierten Sonde mit einer Probe, von der erwartet wird, dass diese die Bioaffinitäts-Komponente aufweist;
c) Ermöglichen, dass die Sonde und die Bioaffinitäts-Komponente eine Erkennungsreaktion vollziehen; wobei die Sonde eine unterschiedliche Energietransfereffizienz in Bezug auf den Donator und den Akzeptor aufweist, wenn eine Reaktion mit der Bioaffinitäts-Komponente stattfindet, im Vergleich zu einer nicht reagierenden Sonde;
d) Messen eines Energietransfer-basierten Signals von dem Akzeptor der reagierten Probe;
e) Messen eines Energietransfer-basierten Signals von dem Akzeptor einer nicht reagierten Sonde in einer Referenzuntersuchung;
f) Vergleichen der in den Schritten d) und e) gewonnenen...

Description

Gebiet der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine markierte Sonde zur Verwendung in Bioaffinitäts-Untersuchungen auf der Grundlage eines zeitlichen Fluoreszenzresonanzenergieübertrags, wobei die Sonde einen Energiedonator sowie einen Energieakzeptor aufweist und wobei das Energieübertragungssignal des Akzeptors gemessen werden soll. Die Erfindung betrifft eine homogene zeitaufgelöste Fluoreszenzresonanzenergietransferuntersuchung für die Bioaffinität unter Anwendung der Sonde. Die analytenspezifische Erkennungsreaktion zwischen der Sonde und dem Analyten bzw. dem zu untersuchenden Stoff verursacht eine Änderung des Energieübertragungssignals der Sonde. Die Energieübertragungssignale der reagierenden und nicht reagierenden Sonden werden auf der Grundlage der Lebensdauer der Signale unterschieden.
Hintergrund der Erfindung
Die Veröffentlichungen und andere Materialien, die hierin verwendet werden, um den Hintergrund der Erfindung darzustellen, und insbesondere Fälle, die zusätzliche Details in Bezug auf die praktische Umsetzung bieten, sind hiermit durch Bezugnahme miteingeschlossen.
Es findet ein Förster-artiger nicht strahlender Dipol-Dipol-Energietransfer ((Förster 1948) Annalen der Physik, 6, 55) zwischen zwei Molekülen unter der Bedingung statt, dass ihre Energien (Emission des Donators (D) und Absorption durch den Akzeptor (A)) überlappen und sie unter einem geeigneten Abstand zueinander angeordnet sind. Der Energieübertrag erfordert eine geeignete Orientierung der Schwingungen der Moleküle. Die Energietransfereffizienz E ist gegeben durch die Gleichung E = 1/(1 + r⁶/R₀ ⁶), wobei r den Abstand zwischen dem Donator und dem Akzeptor angibt, und R₀ eine Abstandsparametereigenschaft des Donator-Akzeptor-Paares und des dazwischen liegenden Mediums ist. Die nutzbare Abstandsskalierung für FRET-Experimente unter Anwendung konventioneller Donator-Akzeptor-Paare beträgt ca. 10–100 Å.
Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET), der auch als Lumineszenzresonanzenergietransfer (LRET) bezeichnet wird, wenn Lanthaniddonatoren verwendet werden, hat eine vielfältige Anwendung sowohl in der Forschung als auch in bioanalytischen Technolgien als Plattform für homogene Analysen und als eine spektroskopische Regel zur Messung von Abständen in Biomolekülen erfahren. Ullman war der erste, der die Anwendung eines Förster-artigen nicht strahlenden Energietransfers in homogenen bioanalytischen Untersuchungen auf der Grundlage einer Antikörper-Erkennungsreaktion beschrieb (Ullman, Scharzberg und Rubenstein (1967) J. Biol. Chem., 251: 4172) und es wurden eine große Anzahl geeigneter Donator/Akzeptor-Sondierungspaare seither entwickelt und in Immunountersuchungen eingesetzt (für einen Überblick siehe I. Hemmilä, Anwendungen der Fluoreszenz in Immuno-Untersuchungen, Wiley, NY, 1991, Kapitel 8.3.4).
Die zeitauflösende (TR) Fluorometrie (Zeitauflösung im Zeitbereich von Mikro- oder Millisekundenbereich) ist ein exzellentes Messschema für homogene Untersuchungen, da man damit eine vollständige Unterscheidung im Bezug zum Nanosekunden-Lebensdauerzeitbereich des Fluoreszenzhintergrunds, der durch organische Verbindungen und Lichtstreuung hervorgerufen wird, erreichen kann. Zu geeigneten Donatoren für TR-FRET-Messungen gehören unter anderem Lanthanidchelate (Cryptate) und einige andere Metallligandenkomplexe, die eine fluoreszente Lebensdauer im Mikro-Millisekundenbereich aufweisen, die daher ebenso ermöglichen, dass der Energietransfer im Mikro-Millisekundenbereich auftritt. Dies ermöglicht die zeitaufgelöste Erkennung des FRET-Signals. Insbesondere Lanthaniden und ihre fluoreszenten Komplexe besitzen eine große Bedeutung als Donatoren in TR-FRET-Messungen. Fluoreszente Lanthanid-Chelate wurden als Energiedonatoren bereits seit 1978 von Stryer, Thomas und Meares verwendet. (Siehe beispielsweise Thomas et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci., 75: 5746); und seit dieser Zeit wurden eine große Anzahl homogener TR-FRET-basierter Analysen beschrieben und patentiert (Mathis (1995) Clin. Chem., 41, 1391; Selvin et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91, 10024) zusammen mit ihren Beschränkungen und Nachteilen.
Wenn gewisse interessierende Moleküle in großem Maßstabe untersucht werden, beispielsweise bei der Reihenuntersuchung von medizinischen Substanzen, werden für gewöhnlich homogene Untersuchungsverfahren bevorzugt, da diese leichter auszuführen und zu automatisieren sind als traditionelle heterogene Analysen mit mehreren Phasen. Ein sehr üblicher Weg zum Ausführen einer FRET-(oder TR-FRET)-basierten homogenen Untersuchung besteht darin, separate Donator- und Akzeptor-markierte Bindungspartner zu verwenden (beispielsweise markierte Antikörper), die sich mit dem Analytenmolekül verbinden und einen Analyten-spezifischen Energietransferkomplex bilden. Eine weitere sehr übliche Art, eine FRET-(oder TR-FRET)-basierte homogene Untersuchung auszuführen, besteht darin, das konkurrierende Untersuchungsschema einzusetzen, das beispielsweise markierte Antikörper-markierte Antigen-Paare verwendet, und wobei das Hinzufügen eines nicht markierten Antigens (Analyt) eine Änderung des Energietransfersignals hervorruft. Es existieren auch andere Ausführungsformen, aber sehr häufig sind zwei separate markierte Reaktionspartner wesentlich, um die Untersuchung auszuführen. Dies erhöht die Anzahl der erforderlichen Untersuchungsschritte und in einigen Fällen kann dies einen Einfluss auf die Empfindlichkeit der Untersuchung ausüben, wenn geeignete Bindungspartner mit hoher Affinität nicht verfügbar sind.
Einige Energietransfer-basierte Verfahren, in denen lediglich eine einzelne markierte Komponente erforderlich ist, um die Analyten-spezifische Antwort zu erhalten, wurden ebenso veröffentlicht und patentiert. Diese Verfahren konzentrieren sich auf die Erkennung von Nukleinsäuresequenzen und verwenden doppelt markierte (Donator und Akzeptor) zielobjektspezifische Sonden. Diese Verfahren verwenden ein wechselwirkendes FRET-Markierungspaar, das für gewöhnlich aus einem fluoreszenten Reporterfarbstoff und einem nicht fluoreszenten Akzeptormarkierungsstoff besteht. Eine fluoreszente Akzeptormarkierung ist ebenso möglich.
Das „TaqMan"-Verfahren wird von Gelfand et al. im US-Patent 5,210,015 und Livak et al., US-Patent 5,538,848 beschrieben. Das TaqMan-Verfahren verwendet doppelt markierte Oligonukleotidsonden, in denen sowohl der fluoreszente Reporterfarbstoff und der Löscher in dem gleichen Oligonukleotid angeordnet sind und die Donatorsignaländerung in der Untersuchung beruht auf der Taq-DNA-Polymerasespaltung der hybridisierten Sonde. Diese Spaltung liefert eine Möglichkeit, die Löschermarkierung und den fluoreszenten Reporterfarbstoff zu trennen.
Ein weiteres Verfahren unter Anwendung einer doppelt markierten Oligonukleotidsonde ist das sogenannte „Molekularleuchtfeuer", das im US-Patent 5,925,517 beschrieben wird. Ein molekulares Leuchtfeuer ist ein Oligonukleotid, dessen Endgebiete miteinander bei Fehlen eines Ziels hybridisieren, die aber separiert werden, wenn das zentrale Gebiet der Sonde mit seiner komplementären Zielobjektsequenz ein Hybrid bildet. Der intramolekulare Hybrid, der durch Endgebiete gebildet wird, bringt die wechselwirkenden Markierungen sehr nahe zusammen und die Ausbildung des steifen Sonde-Zielobjekt-Hybrids liefert eine Möglichkeit, die wechselwirkenden Markierungen zu separieren, was die Grundlage der Signaländerung in der Analyse ist.
Sowohl das TaqMan-Verfahren als auch das Verfahren mit dem molekularen Leuchtfeuer sind Lösch-basierte Untersuchungen, in denen die Änderungen beim Löschen des fluoreszenten Reporterfarbstoffs (Donator) während der Untersuchung beobachtet wird. Im System mit dem molekularen Leuchtfeuer werden gewisse zusätzliche Hybridisierungsproze duren (Selbsthybridisierung) erforderlich, um die Signale von freien (nicht mit den Ziel- bzw. Target verbundenen) und gebundenen Sonden zu separieren. Das TaqMan-Verfahren erfordert eine enzymatische Aktivität, die ein Anheben des Signals ermöglicht. Diese Sonden sind nicht auf eine Nukleinsäureerkennung eingeschränkt.
Ferner wurde ein TR-FRET-Verfahren unter Anwendung eines großen Proteinkomplexes, der mit einem Akzeptor markiert ist, und einem lumineszenten Donator mit einem angeregten Zustand mit großer Lebensdauer, wobei die Änderungen der Donatorlebensdauer gemessen werden, von Getz et al. ((1998) Biophysik J, 74: 2451) beschrieben.
Eine einzelne Sonde, die mit dem Donator und dem Akzeptor markiert ist, wobei das Energietransfersignal des Akzeptors in einer TR-FRET-Untersuchung gemessen wird, und wobei die Signale von den reagierten und nicht reagierten Formen der Sonde unter Anwendung der Lumineszenzlebensdauer separiert werden, ist im Stand der Technik nicht beschrieben.
Überblick über die Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine homogene Bioaffinität-Untersuchung bzw. Analyse auf der Grundlage der Verwendung einer markierten Sonde mit: einem TR-FRET-Markierungspaar mit einem lumineszenten Energiedonator mit angeregtem Zustand mit hoher Lebensdauer und einem lumineszenten Energieakzeptor mit einem angeregten Zustand mit geringer Lebensdauer, ein reaktives Gebiet, das ausgebildet ist, mit zu bestimmende Bioaffinitäts-Komponente zu erkennen. Die markierte Sonde, die im Vergleich zu der nicht reagierten Sonde eine unterschiedliche Energietransfereffizienz zwischen dem Donator und dem Akzeptor aufweist, wenn diese mit der Bioaffinitäts-Komponente in Reaktion gebracht werden, wird mit einer Probe in Kontakt gebracht, von der erwartet wird, dass diese die Bioaffinitäts-Komponente aufweist, und es wird eine Erkennungsreaktion mit der Bioaffinitäts-Komponente ermöglicht. Das von dem Energietransfer abhängige Signal von dem Akzeptor der reagierten Probe wird gemessen und mit dem auf dem Energietransfer beruhenden Signal von dem Akzeptor einer nicht reagierten Sonde in einer Referenzuntersuchung verglichen; und das Vorhandensein oder das Fehlen der Bioaffinitäts-Komponente in der Probe wird auf der Grundlage einer Differenz in den Akzeptorsignalen bestimmt.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beruht die Signalmessung auf einer Messung der Lebensdauer von gewonnenen Fluoreszenzsignalen.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Signalmessung als eine Intensitätsmessung mit Zeitfenster ausgeführt, vorzugsweise mit einem Zeitfenster, das nach einer Verzögerung von mindestens 1 μs geöffnet wird, gerechnet von dem Zeitpunkt der Anregung des Donators.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Messung in einem Zeitfenster ausgeführt, das nach einer kurzen Verzögerung geöffnet wird, vorzugsweise einer 25 μs, oder noch vorteilhafter von 1–10 μs, gerechnet ab dem Anregungspuls.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Messung in einem Zeitfenster ausgeführt, das geöffnet wird, nachdem das Signal auf der Grundlage der kurzen Energietransferlebensdauer von der reagierten Sonde im Wesentlichen zerfallen ist, d. h., vorzugsweise nach mehr als 25 μs, und noch vorteilhafter nach mehr als 50 μs.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine markierte Sonde zur Verwendung in Bioaffinitäts-Untersuchungen, wobei die Sonde umfasst

– ein zeitaufgelöstes Fluoreszenzresonanzenergietransfer-(TR-FRET)-Markierungspaar mit einem Energiedonator und einem Energieakzeptor,
– ein reaktives Gebiet, das ausgebildet ist, mit der zu bestimmenden Bioaffinitätskomponente zu reagieren,

Erfindungsgemäß ist der Donator vorzugsweise eine lumineszente Markierung mit angeregtem Zustand mit langer Lebensdauer, wobei die Lebensdauer des angeregten Zustands mindestens 1 Mikrosekunde beträgt, und wobei der Akzeptor eine lumineszente Markierung mit einem angeregten Zustand mit kurzer Lebensdauer ist, und wobei die Sonde eine Nukleinsäure, ein Polypeptid mit 2 bis 70 Aminosäuren oder ein Antikörper- oder Antikörperfragment ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A und 1B zeigen zwei Beispiele der Messung mit Zeitfenster des Sondierungssignals.
2A und 2B zeigen das Prinzip der dualen Analytenerkennung unter Anwendung der Sonde der Erfindung.
3 zeigt die gemessenen Akzeptorzerfallskurven für hybridisierte und nicht hybridisierte Formen der DNA-Sonde im Beispiel 1.
4A und 4B zeigen eine vereinfachte Darstellung, die die Hybridisierung der DNA-Sonde mit dem Ziel-DNA die D-A-Wechselwirkung behindert und den D-A-Abstand beeinflusst.
5 ist eine grafische Darstellung des Ergebnisses des in Beispiel 2 beschriebenen Tests. Die Figur zeigt die Verbindung einer DNA-Sonde in einer Intensitäts-basierten Erkennung mit Zeitfenster eines Nukleinsäureziels.
6 ist eine grafische Darstellung des Ergebnisses des in Beispiel 3 beschriebenen Test. Die Figur zeigt die Verwendung einer DNA-Sonde und der Lumineszenzlebensdauer beim Erkennen eines Nukleinsäurezielobjekts.
7A und 7B zeigen die Ergebnisse einer Hybridisierungsuntersuchung, die im Beispiel 4 beschrieben ist, wobei die Ergebnisse von Untersuchungen mit einzelnem Analyten und doppelten Analyten zweier unterschiedlicher DNA-Sonden verglichen wurden.
8A und 8B zeigen das Prinzip der Helicase-Untersuchung, die im Beispiel 6 beschrieben ist. Die Untersuchung verwendet eine Einfachstrang-DNA-Sonde.
9A und 9B zeigen das Prinzip der Helicase-Untersuchung, die im Beispiel 7 beschrieben ist. Die Untersuchung verwendet eine Doppelstrang-DNA-Sonde.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Sonde bereit mit einem Energiedonator- und einer Energieakzeptormarkierung und einem reaktiven Gebiet, das in der Lage ist, mit einer zu analysierenden Bioaffinitäts-Komponente zu reagieren. Die Sonde ermöglicht eine vereinfachte homogene Erkennung in einem abgeschlossenen Bereich der Bioaffinitäts-Komponente, die in einer Probe oder einer Testkomponente vorhanden ist. Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass bei der Reaktion zwischen der Sonde und der Bioaffinitäts-Komponente die Lebensdauer des Energietransfersignals sich ändert. Das auf dem Energietransfer beruhende Akzeptorsignal der in einer Reaktion teilgenommenen Sonde kann direkt von dem auf dem Energietransfer beruhenden Akzeptorsignal der nicht an der Reaktion teilnehmenden Sonde ohne Notwendigkeit für weitere Untersuchungsschritte oder eine Manipulation der Sonde getrennt werden.
Definitionen und bevorzugte Ausführungsformen der Bioaffinitäts-Untersuchung
Der Begriff "Bioaffinitäts-Untersuchung bzw. Bioaffinitäts-Analyse" soll ein qualitatives oder quantitatives Verfahren zum Bestimmen eines Analyten, d. h. einer Bioaffinitäts-Komponente in einer Probe, bezeichnen, die eine Probe mit einer Testverbindung oder eine biologische Probe, etwa eine Gewebeprobe, eine Körperflüssigkeit oder eine andere Probe, die aus einer natürlichen Quelle, etwa dem Körper eines Säugetiers, stammt. Zu geeigneten Bioaffinitäts-Untersuchungen gehören Erkennungsreaktionen auf der Grundlage von Bindungen, Nichtbindung oder einer anderen Modifizierung der markierten Sonde durch die zu bestimmende Bioaffinitäts-Komponente.
Bioaffinitäts-Komponente
Eine "Bioaffinitäts-Komponente" soll einen Analyten bezeichnen, der in einer biologischen Probe oder einer Testkomponente vorhanden ist. Die Komponente kann beispielsweise eine Nukleinsäure, etwa DNA oder RNA, ein Protein, etwa ein Enzym oder ein Antikörper, ein Hapten, ein Kohlenhydrat oder Fett oder Kombinationen davon sein.
Sonde
Die Begriffe "Sonde, zerfallsauflösende Sonde, durch Zerfall aufgelöste Sonde" soll als eine Substanz verstanden werden, die in der Lage ist, mit der zu bestimmenden Bioaffinitäts-Komponente zu reagieren. Als typische nicht beschränkende Beispiele können eine Nukleinsäure- oder eine modifizierte Nukleinsäuresonde genannt werden (etwa als Peptidnukleinsäure, verriegelte Nukleinsäure). Der Begriff beinhaltet Einfachstrang- oder Doppelstrang-DNA sowie Einfachstrang- oder Doppelstrang-RNA. Die Nukleinsäuresonde kann modifizierte Purin- oder Pyrimidinbasen enthalten. Die Nukleinsäuresonde umfasst eine Sequenz aus vorzugsweise mindestens 6 Nukleotiden. Eine weitere bevorzugte Form einer Sonde ist eine Polypeptidsonde. Die Polypeptidsonde kann modifizierte Aminosäurereste enthalten. Die Polypeptidsonde umfasst vorzugsweise 2–70 Aminosäurereste. Für die einfachere Herstellung der markierten Sonde enthält vorteilhafterweise die Polypeptidsonde 2–50 oder lediglich 2–40 Aminosäuren. Noch vorteilhafter enthält die Polypeptidsonde lediglich 2–30 oder 2–15 Aminosäuren.
Reaktion
Die Begriffe "Reaktion, reaktiv" bezeichnen typischerweise eine Erkennungsreaktion zwischen der Sonde und der zu bestimmenden Bioaffinitäts-Komponente. Beispiele derartiger Reaktionen sind Nukleinsäurehybridisierungen, in denen die Watson-Crick-Verbindungen zwischen Einzelstrangnukleinsäurezielobjekten und Sonden gebildet werden. Bindungen von Proteinen, etwa Antikörpern oder Antikörperfragmenten mit Antigenen, etwa Nukleinsäure- oder Polypeptidsonden; Bindung von Proteinen, wie etwa Transkriptionsfaktoren an Nukleinsäuresonden. Ferner soll der Begriff "Reaktion" so verstanden werden, dass dieser Begriff auch das Gegenteil umfasst, d. h. Aufbrechen von Bindungen. Als ein typisches Beispiel kann die enzymatische Aufbrechung von Watson-Crick-Bindungen in Doppelstrang-Nukleinsäure genannt werden. Wenn daher die Sonde eine markierte Doppelstrang-Nukleinsäure ist, in der die Markierungen in dem gleichen Strang angeordnet sind, kann diese Probe verwendet werden, das Vorhandensein eines Enzyms (beispielsweise Helikase) in einer Probe zu bestimmen. Des Weiteren soll die "Reaktion" auch eine Modifizierung der Sonde bezeichnen. Ein Beispiel einer derartigen Reaktion ist eine Polypeptidsonde, die als ein Zielobjekt bzw. Target für eine enzymatische Modifizierung dienen kann. Das "reaktive Gebiet" der Sonde bezeichnet einen speziellen Teil der Sonde, der in der Reaktion teilnimmt. Typischerweise kann das reaktive Gebiet zwischen dem Donator und dem Akzeptor angeordnet werden, wobei auch eine andere Anordnung möglich ist. Daher kann das reaktive Gebiet beispielsweise benachbart zu dem Donator-Akzeptor-Paar angeordnet sein.
Sekundäre Struktur, Änderung der sekundären Struktur
Der Begriff "sekundäre Struktur bzw. Sekundärstruktur" bezeichnet eine Struktur der Sonde, die die Sonde unter unterschiedlichen Reaktionsbedingungen annimmt (die reagierten bzw. nicht reagierten Formen der Sonde). Zusätzlich zu den Reaktionsbedingungen ist die sekundäre Struktur auch durch die primäre Struktur der Sonde bestimmt. Die primäre Struktur der Sonde ist durch die Nukleotidsequenz der Nukleinsäuresonde und durch die Aminosäuresequenz der Polypeptidsonde bestimmt. Eine Reaktion der Sonde mit einer Bioaffinitäts-Komponente bewirkt höchstwahrscheinlich eine Änderung der sekundären Struktur der Sonde. Zum Beispiel kann die freie nicht reagierte Sonde eine "nicht gerade", etwa eine gewellten/verdrehte/gewundene Form z. B. aufgrund der Wechselwirkungen zwischen den Markierungen aufweisen (in Beispiel 1 gezeigt), so dass die Markierungen nahe aneinander sind und die Reaktion bewirkt eine Ausrichtung der Sonde in gerader Richtung, wodurch somit der Abstand zwischen dem Donator und dem Akzeptor vergrößert wird. Als Beispiel kann die Bindungsreaktion einer Einzelstrang-Nukleinsäure mit einer komplemen tären Einzelstrang-Nukleinsäure (Sonde) angeführt werden. Diese Art der Reaktion führt typischerweise zu einer geradlinigeren Ausrichtung der Sonde. Als ein Beispiel einer Reaktion, die zu einer "nicht geradlinigen", beispielsweise einer gewellten/verdrehten/gewundenen Struktur einer Sonde führt, etwa so gerade wie im nicht reagierten Zustand, wenn die Sonde mit einer Bioaffinitäts-Komponente reagiert, kann Entschraubung einer Doppelstrang-Nukleinsäuresonde durch das Helikase-Enzym (im Beispiel 7 gezeigt) genannt werden. Die Änderung der sekundären Struktur umfasst ferner das Aufspalten, beispielsweise Aufspaltung durch Enzyme, der Sonde. Ferner umfasst die Änderung der sekundären Struktur auch die Modifizierung, beispielsweise einer enzymatischen Modifizierung des Aminosäurerestes der primären Struktur der Sonde.
Markierungswechselwirkung
Eine Markierungswechselwirkung bezeichnet eine Wechselwirkung, die in natürlicher Weise zwischen dem Donator und dem Akzeptor unter den Untersuchungsbedingungen auftritt und die den D-A-Abstand beeinflussen kann. Als nicht beschränkende Beispiel seien die Stapelungs- und Ladungswechselwirkungen zwischen Markierungen genannt, die im Falle einer flexiblen Sondenstruktur den D-A-Abstand (Beispiel 1) beeinflussen können. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die spezielle Reaktion zwischen der Sonde und der Bioaffinitäts-Komponente die Auswirkung der Markierungswechselwirkung ändern.
FRET
FRET betrifft typischerweise einen Förster-artigen nicht strahlenden Dipol-Dipol-Energietransfer zwischen einem fluoreszenten Donatormolekül und einem Akzeptormolekül, das fluoreszierend oder nicht fluoreszierend sein kann. Für ein gewisses Markierungspaar kann der kritische Energietransferabstand R₀ unter Anwendung der folgenden Gleichung berechnet werden:
wobei J das spektrale Überlappungsintegral zwischen der Donatoremission und der Akzeptorabsorption, q_D die Donatorquantenausbeute, η der Brechungsindex des Mediums und κ ein Faktor ist, der mit der Orientierung zwischen dem Donator und dem Akzeptor in Beziehung steht.
Der Förster-artige Energietransfer ist stark von dem Abstand zwischen dem Donator und dem Akzeptor abhängig. Die Energietransfereffizienz E eines gewissen Markierungspaares ist durch die Gleichung definiert: E = 1/(1 + r6/R0 6)wobei r den tatsächlichen Abstand zwischen dem Donator und dem Akzeptor beschreibt.
R₀ definiert den D-A-Abstand, bei welchem die Energietransfereffizienz zwischen dem angegebenen D-A-Markierungspaar 50% beträgt. Der R₀-Wert eines D-A-Markierungspaares kann verwendet werden, um grob den maximal nutzbaren D-A-Abstand in der Untersuchung abzuschätzen. Beispielsweise erzeugt ein D-A-Abstand von 1,44225·R₀ ein E = 0,1 (lediglich 10% Energietransfereffizienz). Die Parameter in der R₀-Gleichung repräsentieren die grundlegenden Erfordernisse für den Förster-artigen Energietransfer, und eine Änderung in diesen Parametern führt zu einer Änderung des Energietransfers des ausgegebenen D-A-Paares, obwohl der eigentliche D-A-Abstand ungeändert bleibt. Als Faustregel wird typischerweise ein großes spektrales Überlappungsintegral betrachtet, wenn effiziente D-A-Paare ausgewählt werden. Die Berechnung des spektralen Überlappungsintegrals ist in der Literatur beschrieben und ist dem Fachmann bekannt.
In dieser Anmeldung soll FRET auch andere Energietransfermechanismen einschließen, die nicht notwendigerweise die Erfordernisse eines Förster-artigen Energietransfers erfüllen, die jedoch dennoch in der Lage sind, eine auf Energietransfer beruhende Akzeptoremission zu erzeugen, und wobei die Effizienz des Energietransfers durch gewisse Parameter beeinflusst werden kann.
TR-FRET
In der TR-FRET wird die Änderung des Energietransfers auf Grundlage der Lebensdauer von gewonnenen Fluoreszenzsignalen oder unter Anwendung einer Intensitätsmessung mit Zeitfenster gemessen, wobei die Fluoreszenzintensität einer Probe nach einer gewissen Verzögerung gemessen wird, die ab dem Donatoranregungspuls gemessen wird. Die mittlere Lebensdauer der Probe kann auch gemessen werden, indem mindestens zwei Intensitätsfenster mit Zeitsteuerung von der gleichen Probe gemessen werden. Eine Intensitätsmessung mit Zeitfenster (oder eine lebensdauerbasierte Analyse) kann verwendet werden, um den Störhintergrund in einer Untersuchung zu unterdrücken, in der die Lebensdauer des Hintergrundsignals kleiner ist als die Lebensdauer des eigentlichen Energietransfersignals. Normalerweise beinhaltet dies die Verwendung eines Donators mit langer Lebens dauer (oder/und eines Akzeptors) in dem FRET-Paar. Ein spezieller Vorteil wird erreicht, wenn die Lebensdauer des freien Donators deutlich länger ist als die Lebensdauer des freien Akzeptors (τ_D >> τ_A). In diesem Falle wird die Lebensdauer des auf dem Energietransfer beruhenden Akzeptorsignals als eine Funktion der Donatorlebensdauer und der Energietransfereffizienz (siehe die folgende Definition von "Energietransfereffizienz") bestimmt und das auf dem Energietransfer beruhende Akzeptorsignal tritt auf sehr ähnlichem zeitlichen Maßstab mit dem Donator auf. Eine Intensitätsmessung mit Zeitfenster (oder eine Lebensdaueranalyse) kann verwendet werden, um das Signal von direkt angeregten Akzeptoren zu eliminieren, die durch den Donatoranregungspuls angeregt werden.
Lumineszenzlebensdauer
In dieser Beschreibung sind die Begriffe Lumineszenzlebensdauer, Lebensdauer und Zerfallszeit gleichbedeutend.
Energietransfersignal
In dieser Beschreibung ist die auf dem Energietransfer beruhende Akzeptorfluoreszenz als ein Energietransfersignal bezeichnet.
Energietransfereffizienz
Die Energietransfereffizienz E und ihre Abhängigkeit von der Lebensdauer des auf dem Energietransfer beruhenden Akzeptorsignals in dem Förster-artigen Energietransfer ist durch die Gleichung definiert: E = 1/(1 + r6/R0 6) = 1 – τAD/τD,wobei τ_D die Lebensdauer des freien Donators und τ_AD die Lebensdauer der auf dem Energietransfer beruhenden Akzeptoremission ist. Der zuletzt genannte Teil der Gleichung gilt nur, wenn τ_D >> τ_A. Die Reaktion der Sonde mit der Bioaffinitäts-Komponente kann eine gewisse Änderung in dem Abstand zwischen dem Donator und dem Akzeptor hervorrufen. Somit bedeutet die Änderung des Abstandes auch eine Änderung von E zwischen dem Donator und dem Akzeptor. Eine Vergrößerung des Abstandes r führt zu einem kleineren E und umgekehrt. Im Allgemeinen kann eine beliebige Reaktion, die den D-A-Abstand beeinflusst, so betrachtet werden, dass diese eine gewisse Auswirkung auf die Energietransfereffizienz ausübt, unabhängig von dem genauen Mechanismus des ablaufenden Energietransfers.
Der Abstand zwischen den Markierungen ist nicht der einzige Parameter, der durch die Reaktion beeinflusst werden kann. Eine Änderung in einem der Parameter, die den kritischen Energietransferabstand R₀ definieren (spektrales Überlappungsintegral, Donatorquantenausbeute, Brechungsindex des Mediums, Orientierungsfaktor) oder allgemein eine Änderung in den Fluoreszenzeigenschaften des Donators oder Akzeptors oder der Umgebung, die diese umgibt, kann zu einer Änderung in der Energietransfereffizienz beitragen.
Donatoren
Der Donator soll in dieser Erfindung eine lumineszente Markierung mit einem angeregten Zustand mit langer Lebensdauer sein, der zusammen mit dem Akzeptor mit angeregtem Zustand mit kurzer Lebensdauer (τ_D >> τ_A) die Energietransfereffizienzabhängigkeit der Lebensdauer des induzierten Akzeptorsignals ermöglicht. Dies ermöglicht ferner die Intensitätsmessung mit Zeitfenster des Akzeptorsignals und die Analyse des induzierten Akzeptorsignals auf Basis der Lumineszenzlebensdauer. Dies bedeutet, dass die angeregte Lebensdauer des Donators mindestens 1 Mikrosekunde betragen soll. Bevorzugt werden Donatoren mit 10 Mikrosekunden oder mehr; insbesondere vorteilhaft sind Donatoren mit einer Lebensdauer von 100 Mikrosekunden oder mehr.
Als Beispiele bevorzugter Donatoren können Lanthanidchelate, aufwärts konvertierende Phosphore (die auch als aufwärts konvertierende Chelate bezeichnet werden), Porphyrinkomplexe und Metallchelatkomplexe auf der Grundlage von Metallionen der Gruppen VII und VIII der Übergangselemente genannt werden. Geeignete Ligandenstrukturen für Lanthanidchelate gemäß dieser Erfindung sind beispielsweise beschrieben in WO 98/15830 und in dem US-Patent 5,998,116 und den darin zitierten Schriften. Aufwärts konvertierende Phosphore sind beispielsweise in dem US-Patent 5,891,656 beschrieben, und deren Anwendungen in herkömmlichen homogenen Energietransferuntersuchungen sind beispielsweise in WO 2004/086049 beschrieben.
Akzeptoren
Der Akzeptor ist vorzugsweise ein stark lumineszentes Molekül mit einer Quantenausbeute, die möglichst nahe an eins (1) liegt und mit einem hohen molaren Absorptionskoeffizienten, vorzugsweise über 100000. Vorzugsweise besitzt der Akzeptor eine spektrale Überlappung mit dem Donator, so dass das Absorptionsspektrum des Akzeptors mit dem Emissionsspektrum des Donators überlappt. Ein bevorzugtes Merkmal des Akzeptors ist seine scharfe Emission bei einer Wellenlänge, bei der der Donator ein Minimum besitzt oder gar keine Emission aufweist. Die Lebensdauer des Akzeptors soll so sein, dass die Emission der di rekt angeregten Akzeptoren vollständig innerhalb 1 Mikrosekunde nach dem Anlegungspuls zerfallen ist. Beispiele geeigneter Akzeptoren sind in WO 98/15830 und den darin zitierten Schriften offenbart, wobei auch andere Akzeptoren im Stand der Technik bekannt sind.
Zeitfenster
Der Fachmann erkennt, dass wenn τ_D >> τ_A, die Lebensdauer des Energietransfersignals als eine Funktion von τ_D und durch die Energietransfereffizienz in dem Donator zu dem Akzeptor definiert ist. Dieses Phänomen ist unabhängig von dem exakten Mechanismus des Energietransfers, und eine Änderung der Energietransfereffizienz kann immer so gesehen werden, dass diese eine Änderung der Lebensdauer des Energietransfersignals hervorruft.
In der Förster-artigen FRET ist die Lebensdauer des Energietransfersignals durch die Gleichung definiert: E = 1 – τAD/τD (gilt, wenn τ_D >> τ_A) wobei E die Energietransfereffizienz, τ_AD die Lebensdauer oder der Zerfall des Energietransfersignals und τ_D die Lebensdauer des freien Donators ist. Wenn die Reaktion beispielsweise zu einer Verringerung von E führt, ergibt dies wiederum ein größeres τ_AD im Vergleich zu dem Akzeptorzerfall der nicht reagierten Sonde. Diese Tatsache ermöglicht die Unterscheidung zwischen der an der Reaktion teilgenommenen Sonde und der nicht reagierten Sonde unter Anwendung einer Intensitätsmessung oder Lumineszenzlebensdauermessung mit Zeitfenster. Das Prinzip einer Messung mit Zeitfenster ist in 1A gezeigt. Das zeitgesteuerte Messfenster (TR-Fenster) w wird unter Anwendung einer Verzögerungszeit bzw. Wartezeit geöffnet, nach der das Energietransfersignal der nicht reagierten Sonde (gestrichelte Linie) zerfallen ist, und das Energietransfersignal der reagierten Sonde (durchgehende Linie) kann ohne Hintergrund detektiert werden. Eine alternative Option besteht darin, eine sehr geringe Verzögerungszeit (1–10 μs) und ein TR-Fenster zu benutzen, wobei beide Signale gleichzeitig detektiert werden können. Die Reaktion der Sonde führt zu einer Verringerung des Signals.
Wenn die Reaktion der Sonde ein Anwachsen von E hervorruft, führt dies zu einem doppelt exponentiellen Akzeptorzerfall, wobei die reagierten Sonden eine Population mit verkürzter Lebensdauer im Vergleich zur Lebensdauer der nicht reagierten Sondenpopulation hervorrufen, siehe 1B. In diesem Falle kann das TR-Fenster (w) unter Anwendung einer Ver zögerungszeit geöffnet werden, nach welcher das Signal mit kurzer Lebensdauer der an der Rektion teilgenommenen Sondenpopulation zerfallen ist, und es wird die Reduzierung des Signals mit langer Lebensdauer der Probe (durchgezogene Linie) im Vergleich mit dem Kontrollprobensignal (gestrichelte Linie) gemessen. Eine alternative Option besteht darin, sehr geringe Verzögerungszeiten (1–10 μs) und ein TR-Fenster zu verwenden, wobei beide Signale gleichzeitig gemessen werden können. Die Reaktion der Sonde ruft eine Vergrößerung des Signals hervor.
Detektion mehrerer Analyten
Die Sonde gemäß der Erfindung kann verwendet werden, um eine einfache Untersuchung mehrerer Analyten auszuführen, wobei mehrere Analyten gleichzeitig aus dem gleichen Untersuchungsmedium heraus nachgewiesen werden können. Eine Mehranalytenuntersuchung ist möglich, wenn jede analytenspezifische Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt:

(1) Deutlich spektral auflösbare Emissionen und damit unterschiedliche Analytensignale, die unter Anwendung einer optischen Filterung separiert werden können.
(2) Emissionen der gleichen Wellenlänge, aber mit unterschiedlichen auflösbaren Lebensdauern. Die Analytensignale können unter Anwendung der Lumineszenzlebensdaueranpassung separiert werden.
(3) Emissionen von teilweise der gleichen Wellenlänge (übersprechen), jedoch mit unterschiedlichen Lebensdauern. Die Analytensignale können unter Anwendung der Lumineszenzlebensdaueranpassung oder unter Anwendung einer Intensitätsmessung mit Zeitfenster zusammen mit optischer Filterung getrennt werden. Dieser spezielle Fall ist in den 2A und 2B gezeigt. In 2A entspricht die durchgezogene Linie dem Zerfall des Analyten 2, die gestrichelte Linie entspricht dem Zerfall des Analyten 1 und die gepunktete Linie ist der Zerfall der nicht an der Reaktion teilgenommenen Sonden. In 2B entsprechen die nicht ausgefüllten Diamantsymbole dem Emissionsspektrum des Analyten 1 und die nicht ausgefüllten Dreiecke entsprechen dem Emissionsspektrum des Analyten 2. Der Analyt 1 besitzt eine Emission im optischen Kanal des Analyten 2 (CH 2), aber das Übersprechen wird durch Anwendung eines geeigneten TR-Fensters für den Analyten 2 (w2) verhindert. Das Signal des Analyten 2 existiert in dem TR-Fensters des Analyten 1 (w1), aber ein Übersprechen wird durch Verwenden eines geeigneten optischen Kanals für den Analyten 1 (CH1) verhindert.

Lumineszenzlebensdaueranalyse
Wenn eine Intensitätsmessung mit Zeitfenster nicht angewendet wird, können die Signale der reagierten und nicht reagierten Sonden mit einer Lumineszenzlebensdaueranalyse der Probe aufgelöst werden. Zeitbereichs- oder Frequenzbereichsmessungen werden typischerweise für die Bestimmung der Lebensdauer eingesetzt. Beide Messtechniken, deren Anwendungen und deren zugehörige Datenanalyseverfahren in der Literatur beschrieben sind, sind dem Fachmann vertraut. Die Lebensdaueranalyse kann auf einer Untersuchung auf der Grundlage einer durch Zerfall auflösbaren bzw. erkennbaren Sonde angewendet werden, indem beispielsweise das folgende Verfahren angewendet wird: die Zerfallseigenschaften einer Sonde, die speziell für die Analyse sind, werden zuerst vorbestimmt, indem die Zerfallszeiten der reagierten und nicht reagierten Sonde (positive Probe und Referenzprobe) gemessen werden. Die nicht reagierte Sonde erzeugt eine einfach exponentiell Zerfallszeit τ_non-reacted. Die positive Probe zerfällt typischerweise entsprechend zweifach exponentieller Zerfallszeiten τ_non-reacted und τ_reacted oder zerfällt einfach exponentiell mit nur der Zerfallszeit τ_reacted. Die eigentlichen Untersuchungsproben werden dann gemessen und die erhaltenen Daten werden einer geeigneten Lebensdauergleichung unter Verwendung der vorbestimmten Zerfallszeiten τ_non-reacted und τ_reacted als Konstanten einer Datenanpassung unterzogen. Üblicherweise werden Zerfallsdaten an die Gleichung angepasst:
wobei I(t) die Intensität der Probe in einem gewissen Zeitpunkt ist. Der Begriff A_i entspricht der Größe der lumineszenten Population, die mit der Zerfallszeit τ_i emittiert. Im Falle einer Einzel-Analytenuntersuchung ist das Ergebnis eine zweifach exponentielle Anpassung, die die Populationsparameter A_reacted und A_non-reacted erzeugt. Das Untersuchungsergebnis wird im Vergleich zu den Populationsparametern der positiven Probe und der Referenzprobe aufgelöst bzw. getrennt. Im Falle einer Multianalytenuntersuchung ist jede Sonde vorzugsweise so gestaltet, dass sie unterschiedliche Zerfallszeiten aufweist, während sie mit dem Zielobjekt reagiert. Jeder Analyt erzeugt dann seinen eigenen Exponentialterm für die Lumineszenzdaten und das Untersuchungsergebnis wird unter Anwendung einer Mehrfachexponentiellanpassung aufgelöst.
Schon das Vorhandensein einer gewissen Zerfallszeitkomponente in dem Probensignal ist ein qualitatives Maß für das Vorhandensein der Bioaffinitäts-Komponenten in der Probe.
Diese Beispiele sind angegeben, um die lebensdauerbasierte Analyse der Untersuchung darzustellen, wobei nicht beabsichtigt ist, den Schutzbereich der Erfindung einzuschränken. Es sind auch andere Verfahren mit Lebensdaueranalyse anwendbar.
Vorteile der Erfindung
Die zerfallsauflösbare Sonde der Erfindung ermöglicht eine einfache Untersuchung, in der die zeitaufgelöste homogene Erkennung des Analyten ausgeführt werden kann, wobei lediglich ein zusätzlicher Reagent (die Sonde) pro Analyt verwendet wird. Eine homogene Untersuchung für ein gewisses interessierendes Zielobjekt kann daher ausgeführt werden, wobei lediglich ein Untersuchungsschritt angewendet wird. Die erfindungsgemäße Sonde umfasst Donator- und Akzeptormarkierungen, und es sind keine zusätzlichen Schritte, etwa das Abspalten oder eine andere Manipulation der nicht reagierten oder reagierten Sonden erforderlich, um die Untersuchungsergebnisse in aufgeschlüsselter Weise zu erhalten.
Die erfindungsgemäße Sondierungsgestaltung ermöglicht einen einfachen Weg, um homogene Analytenuntersuchungen auf der Grundlage der Emission eines Energietransfersignals auszuführen. Die Verwendung lediglich einer Bioaffinitäts-Verbindung pro Analyt ist ein Vorteil im Hinblick auf die Selektivität und Empfindlichkeit einer Untersuchung.
Beispiele
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um weitere bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darzustellen, wobei diese jedoch nicht den Schutzbereich der Erfindung einschränken sollen. Der Fachmann erkennt, dass bei einer weiteren Entwicklung der Technologie das erfindungsgemäße Konzept auf diverse andere Weisen eingerichtet werden kann. Die Erfindung und ihre Ausführungsformen sind nicht auf die zuvor beschriebene Beispiele eingeschränkt, sondern diese können innerhalb des Schutzbereichs der Patentansprüche variieren.
Beispiel 1
Durch Zerfall erkennbare DNA-Sonde
Dieses Beispiel zeigt eine Einzelstrang-DNA-Sonde gemäß der vorliegenden Erfindung, in der die Energietransfereffizienz zwischen der reagierten und nicht reagierten Form der Sonde unterschiedlich ist. In diesem speziellen Falle verringert die spezielle Reaktion mit dem Zielobjekt bzw. Target die Energietransfereffizienz.
Eine DQB1*0302-Target-spezifische Sonde (5' TTT CCG CCT GCC GC 3') wurde mit ihrem 5'-Ende mit einem stabilen fluoreszierenden W8194 Eu-Chelat (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac) und mit ihrem 3'-Ende mit organischen Fluorophor Alexa Fluor 647 (molekulare Sonden) markiert. Die Hybridisierung von 10 nM DQB1*0302-Sondierungsmaterial und einem 2 nM DQB1*0302-Zielobjekt (5' CTC GGC GGC AGG CGG CCC CAC GTC GCT GTC GAA GCG CAC GAT CTC TTC T 3') wurde in einem Gesamtvolumen von 200 μl mit 75 mM Tris-Cl (pH 8,5), 50 mM KCl, 20 mM (NH₄)₂SO₄, 3 mM MgCl₂, 0,1% Triton X-100 ausgeführt. Die Hybridisierungsreaktion wurde zunächst bei 40°C 30 min. lang und dann bei 22°C 30 min. lang initiiert, woraufhin die Probe mit einer Pipette auf eine Mikrotiterplatte mit 25 μl/Vertiefung (1508-0010, PerkinElmer Life and Analytical Sciences) aufgebracht wurde. Die zeitaufgelösten Messungen wurden auf einem im Labor hergestellten TR-Fluorometer unter Anwendung eines Stickstofflasers (Modell 79111, Oriel, < 10 ns-Puls, 45 Hz), einer Fotovervielfacherröhre (Hamamatsu) und einem Turbo MCS-Vielkanalmessgerät (EG&G) mit einer Zeitauflösung von 0,1 μs durchgeführt. Die auf Energietransfer beruhende Emission wurde durch einen 665 nm-Emissionsfilter aufgenommen (Omega Optical, Bandbreite 7 nm).
Die Fluoreszenzzerfälle positiver Proben (Sonde + Zielobjekt, Kurve 1) und negative Kontrolle (nur Sonde, Kurve 2) sind in 3 gezeigt. Die negative Kontrolle besitzt einen einfachen exponentiellen Zerfall mit einer Lebensdauer von 1,7 μs. Die positive Probe besitzt einen zweifach exponentiellen Zerfall mit Lebensdauerkomponenten von 1,7 μs und 165 μs. Die Komponenten mit langer Lebensdauer wird durch die hybridisierte Sondenpopulation hervorgerufen, in der der D-A-Abstand aufgrund der steifen Doppel-Helix-Struktur zwischen den Markierungen vergrößert wird, siehe 4A. In der nicht reagierten Sonde ist die starke Wechselwirkung (natürlich), die zwischen dem Donator Eu und Alexa Fluor 647 auftritt, in der Lage, die Markierungen in unmittelbarer Nähe zueinander aufgrund der Flexibilität der Einzelstrang-DNA-Kette zu bringen, siehe 4B. Das Energietransfersignal der reagierten Sonde kann in einfacher Weise von dem Energietransfersignal der nicht reagierten Sonde getrennt bzw. aufgelöst werden, indem eine Intensitätsmessung mit Zeitfenster (1A) mit einer geeigneten Verzögerungszeit (beispielsweise 15 μs für diese Sonde) verwendet wird.
Beispiel 2
Nukleinsäureanalyse unter Anwendung des detektierbaren Zerfalls einer DNA-Hybridisierungssonde und einer Intensitätsmessung mit Zeitfenster
Diese Beispiel zeigt den Beweis des Prinzips einer DNA-Untersuchung unter Anwendung der zerfallsunterscheidbaren DNA-Hybridisierungssonde. Die Sonde wird mit einem komplementären Zielobjekt hybridisiert, woraufhin die Menge der hybridisierten Sonde, die der Menge des Zielobjekts entspricht, in einer zeitaufgelösten Weise gemessen werden kann. Es zeigt sich, dass die Erkennungstechnologie für die Detektion einer Zielnukleinsäure eingesetzt werden kann.
Die Hybridisierungsreaktion wurde in einem Gesamtvolumen von 50 μl mit 75 mM Tris-Cl (pH 8,5), 50 mM KCl, 20 mM (NH₄)₂SO₄, 3 mM MgCl₂, 0,1% Triton X-100, unterschiedlichen Mengen an DQB!*0302-Target (5' CTC GGC GGC AGG CGG CCC CAC GTC GCT GTC GAA GCG CAC GAT CTC TTC T 3') und 10 nM DQB1*0302 einer speziellen Sonde (5' TTT CCG CCT GCC GC 3') ausgeführt, die an ihrem 5'-Ende mit einem stabilen fluoreszierenden W8194 Eu-Chelat (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac) und mit ihrem 3'-Ende mit einem organischen Fluorophore Alexa Fluor 647 (molekulare Sonden) markiert war. Die Hybridisierungsreaktionen wurden zunächst bei 40°C 30 min lang und anschließend bei 22°C 30 min lang ausgeführt, woraufhin die Fluoreszenz mit einem Victor^TMV 1420 Multimarkierungszähler (PerkinElmer Life and Analytical Sciences) gemessen wurde. Die Messparameter sind wie folgt.

Parameter VictorV

Anregung (nm) 340

Emission (nm) 665

Verzögerungszeit (μs) 50

Fensterzeit (μs) 50

Zykluszeit (μs) 1000
Die mittlere Akzeptorfluoreszenz und die Standardabweichung dreier Teile jeder Probe sind in 5 gezeigt. Die Untersuchung besitzt eine lineare Antwort für unterschiedliche Mengen des Nukleinsäuretargets und zeigt, dass das Erkennungsprinzip für die Detektion von Nukleinsäuren verwendet werden kann. Die Untersuchung ergab ein Signal-zu-Hinter grund-Verhältnis von 3,3 für 0,2 nM der Zielobjekt-DNA. In diesem Beispiel verringert die spezielle Reaktion zwischen der Sonde und dem Zielobjekt die Energietransfereffizienz. Ferner kann die Messung mit den vorliegenden Instrumenten ausgeführt werden (d. h. einem Victor^TM-Multimarkierungszähler).
Beispiel 3
Nukleinsäureanalyse und Anwendung einer zerfallsauflösbaren DNA-Hybridisierungssonde und einer Lumineszenzlebensdauermessung
Beide Untersuchungen gemäß dem Beispiel 2 wurde unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen TR-Fluorometers gemessen. Die gemessenen Fluoreszenzzerfallskurven der Proben wurden gemäß der Gleichung angepasst:
wobei I(t) die Intensität der Probe zu einem gewissen Zeitpunkt ist und wobei A₁ und A₂ Faktoren sind, die proportional zur Größe der fluoreszenten Populationen mit jeweils den Zerfallszeiten τ₁ und τ₂ sind. Die Daten wurden Anwendung der Zerfallszeitparameter 1,7 μs und 165 μs, die in Beispiel 1 bestimmt wurden, angepasst bzw. gefittet. Der Durchschnittswert der Komponenten mit einer Zerfallszeit von 165 μs (A₂) jeder Probe ist in 6 gezeigt. Die Analyse auf Basis einer Lebensdauermessung der Daten besitzt eine lineare Antwort für unterschiedliche Mengen des Nukleinsäuretargets und ergab ein Signal-Hintergrund-Verhältnis von 5,4 für 0,2 nM der Zielobjekt-DNA. Das Ergebnis zeigt, dass die Analyse auf Lebensdauerbasis der Daten ähnliche Ergebnisse erzeugen wie die Intensitätsdetektion mit Zeitfenster und ein alternatives Verfahren zum Messen bei der Untersuchung ist.
Beispiel 4
Nukleinsäureanalyse mit zweifachem Analyten und Anwendung von durch Zerfall erkennbare Hybridisierungssonden
Dieses Beispiel zeigt das Prinzip einer DNA-Untersuchung mit zweifachen Analyten unter Anwendung von Hybridisierungssonden, deren Zerfall trennbar bzw. auflösbar ist. Es wird gezeigt, dass die zwei durch Zerfall unterscheidbaren Sonden, die mit dem gleichen Donator, aber mit unterschiedlichen Akzeptoren markiert sind, für die zweifache Analytenerkennung verwendet werden können.
Die Hybridisierungsreaktion wurde ausgeführt, wie dies in dem Beispiel 2 beschrieben ist, mit 10 nM der ersten Hybridisierungssonde mit erkennbarem Zerfall (DQB1*0302-Sonde 5' TTT CCG CCT GCC GC 3'), die an ihrem 5'-Ende mit einem stabilen fluoreszierenden W8194 Eu-Chelat (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac) und an ihrem 3'-Ende mit einem organischen Fluorophor Alexa Fluor 647 (molekulare Sonden) markiert waren, und mit 10 nM der zweiten Hybridisierungssonde mit erkennbarem Zerfall (DQA1*-Kontrollsonde 5' TCT CCA TCA AAT TCA T 3'), die an ihrem 5'-Ende mit einem stabilen fluoreszierenden W8194 Eu-Chelat (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Wallac) und an ihrem 3'-Ende mit organischem Fluorophor Alexa Fluor 700 (molekulare Sonden) markiert war. Die erste und die zweite Sonde waren so gestaltet, dass sie mit ihren eigenen speziellen komplementären Zielobjekten (DQB1*0302-Zielobjekt (5' CTC GGC GGC AGG CGG CCC CAC GTC GCT GTC GAA GCG CAC GAT CTC TTC T 3') und DQA1*Kontrollzielobjekt (5' CCATGAATTTGATGGAGATGTCTGGAAGTTGCC 3') hybridisierten, und nach der Hybridisierung wurde die Fluoreszenz mit einem Victor^TMV 1420-Multimarkierungszähler (PerkinElmer Life and Analytical Sciences) gemessen. Die zu der hybridisierten ersten und zweiten Sonde proportionalen Fluoreszenzsignale wurden unter Anwendung der folgenden Messparameter ermittelt:
Die 7A und 7B zeigen den Mittelwert und die Standardabweichung der Akzeptorfluoreszenzzählwerte der drei Probenentnahmen aus den Einzelanalyten-(1)- und Doppelanalyten-(2)-Hybridisierungsuntersuchungen. Schwarze, graue und weiße Balken zeigen die Fluoreszenzsignale, die aus Reaktionen ohne Zielobjekt-DNA (leer) 1 nM Zielobjekt-DNA und 5 nM Zielobjekt-DNA erhalten wurden. 7A repräsentiert die Ergebnisse, die mit der Alexa Fluor 647-markierten Sonde in einer Einzelanalytenuntersuchung (1) mit lediglich der DQB1*0302-Sonde und dem DQB1*0302-DNA-Ziel erhalten wurden, und in der Doppelanalytenuntersuchung (2) mit DQB1*0302- und DQA1*Kontrollsonden und DQB1*0302- und DQA1*-Kontroll-DNA-Zielobjekten erhalten wurden. 7B repräsentiert die Ergebnisse, die mit einer Alexa Fluor 700-markierten Sonde in dem Einzelanalytenuntersuchungss chema (1) mit nur der DQA1*-Kontrollsonde und dem DQA1*-Kontroll-DNA-Ziel erhalten wurden, und in einem Doppelanalytenuntersuchungsschema (2) mit DQB1*0302- und DQA1*-Kontrollsonden und DQB1*0302- und DQA1*-Kontroll-DNA-Zielobjekten erhalten wurden. In diesem Falle verringern die speziellen Reaktionen zwischen der Sonde und dem Zielobjekt die Energietransfereffizienz. Beide Sonden ergaben ähnliche Ergebnisse sowohl in der Einzelanalytenuntersuchung als auch in der Doppelanalytenuntersuchung und es kann somit geschlossen werden, dass die im Zerfall unterscheidbaren Sonden auch für die Doppelanalytenkennung verwendet werden können.
Beispiel 5
Peptidsonde mit unterscheidbarem Zerfall
Dieses Beispiel dient zur Darstellung, dass die im Zerfall unterscheidbare bzw. auflösbare Sonde eine markierte Polypeptidsonde und insbesondere eine markierte Peptidsonde sein kann. Hier dient die Peptidsonde als ein Antigen mit einem Epitop für die Antikörperbindung. Die Antikörperbindung an die Sonde führt eine angleichende Änderung in der markierten Sonde aus, wodurch die Trennung der reagierten und nicht reagierten Sonde möglich ist.
Eine Peptidsonde mit einem Phosphotyrosinrest (pY) diente als ein Antigen für einen Anti-Phosphotyrosin-Antikörper. Das Peptid, Ac-CGGGGpYGGGG-NH2, wird mit einem Iodacetamino-aktivierten fluoreszierenden Europiumchelat und mit Alexa Fluor 647-Carboxylsäuresuccinimidyl-Ester zu einer Cysteingruppe und zu einer freien Aminogruppe des Peptids markiert. 50 Mikroliter der Reaktionsstoffe in 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,75 mit 10 nM markiertem Peptid mit oder ohne 1 nM Anti-Phosphotyrosin-Antikörper wurden bei Raumtemperatur 30 min lang bei leichtem Schütteln behandelt. Nach der Inkubation wurde das Energietransfersignal gemessen.
Die Bindung des Anti-Phosphotyrosin-Antikörpers mit dem Phosphotyrosin in der Peptidsonde ändert die Anpassung der Sonde und somit können die reagierte und nicht reagierte Form der Sonde auf der Grundlage der unterschiedlichen Emissionslebensdauern der Akzeptorfluoreszenzen dieser beiden Formen separiert werden. In diesem Falle verringert die Bindungsreaktion die Energietransfereffizienz. Peptidsonden können beispielsweise in Enzymaktivitätsuntersuchungen (beispielsweise Kinase-Untersuchung) oder in konkurrierenden homogenen Immunountersuchungen (beispielsweise Peptidhormonuntersuchungen) ausgenutzt werden.
Beispiel 6
Helicase-Untersuchung mit durch Zerfall unterscheidbarer Einzelstrang-DNA-Einfangsonde
Dieses Beispiel verwendet ein Doppelstrang-DNA-Substrat mit einer Struktur, die von dem Helicase-Enzym erkannt wird und mit einer Einzelstrang-Einfangsonde, die markiert ist und in ihrem Zerfall erkennbar ist, die an dem 5'-Ende mit einer Donatormarkierung und an ihrem 3'-Ende mit einer Akzeptormarkierung markiert ist. Das Doppelstrang-Helicase-Substrat enthält zwei komplementäre Oligonukleotidstränge, wobei der Sinnstrang bzw. der codierende Strang 44 (sense) Basen enthält, und wobei der kodogene bzw. Anti-Sinnstrang 26 (anti sense) Basen aufweist. Der markierte Einfangstrang mit 16 Basen ist komplementär zu dem Anti-Sinnstrang des Substrats.
Die Prinzipien der Untersuchung sind in 8 gezeigt. Bei Fehlen einer Enzymaktivität (8A) bleibt das Substrat (S) in der Doppelstrangform, und die Einzelstrang-Einfangsonde, die markiert ist und deren Zerfall nachweisbar ist (C), ist in der Lösung frei und besitzt die Anpassung bzw. die Konformation 1. In der Konformation 1 sind die Donator-(D)- und die Akzeptor-(A)-Markierungen in unmittelbarer Nähe zueinander angeordnet, wodurch sich ein effizienter Energietransfer und eine kurze Lumineszenzlebensdauer ergeben. Bei Vorhandensein einer Enzymaktivität (8B) entschraubt die Helicase (E) das Doppelstrangsubstrat (S) und ergibt Einzelstrangzwischenprodukte. Beim Entschrauben des Doppelstrang-DNAs nimmt die markierte Einfangsonde die Konformation 2 an, indem sie mit dem einstrangigen 26-mer-Anti-Sinnstrang hybridisiert. Bei der Konformation 2 ist der D-A-Abstand länger und somit ist auch die Lumineszenzlebensdauer des Energietransfersignals länger als im Falle der nicht reagierten Einfangsonde (Konformation 1).
Beispiel 7
Helicase-Untersuchung mit einer Doppelstrang-DNA-Sonde mit unterscheidbarem Zerfall als ein Enzymsubstrat
Diese Beispiel verwendet ein markiertes Doppelstrang-DNA-Substrat mit einer Struktur, die von dem Helicase-Enzym erkannt wird und verwendet eine Einzelstrang-Einfangsonde. Das Doppelstrang-Helicase-Substrat enthält zwei komplementäre Oligonukleotidstränge, wobei der markierte Sinnstrang aus 44 Basen und der Anti-Sinnstrang aus 26 Basen aufgebaut ist. Der Einfangstrang enthält 16 Basen und ist komplementär zu dem Anti-Sinnstrang des Substrats. Der 44-mer-Sinnstrang des Substrats ist an seinem 5'-Ende mit einem fluoreszierenden Europium-Chelat (Donator) und 10 Basen unterhalb von dem 5'-Ende mit einer Akzeptormarkierung markiert. Die Akzeptormarkierung wird in einen Amino-Verbinder einer modifizierten Base eingeführt, die dessen Fähigkeit zur Ausbildung von Wasserstoffverbindungen mit einer komplementären Base bewahrt.
Prinzipien der Untersuchung sind in 9 gezeigt. Bei Fehlen einer Enzymaktivität (9A) bleibt das Substrat (S) in der Konformation 1, d. h. in der Doppelstrangform, wobei die Donatormarkierung (D) und die Akzeptormarkierung (A) 10 Basen voneinander getrennt bleiben. Bei Vorhandensein der Helicase-Aktivität (9B) entschraubt das Enzym (E) das Doppelstrangsubstrat und ergibt zwei einzelne Stränge. Der Einfangstrang (C) hybridisiert mit dem einstrangigen Anti-Sinnstrang des Substrats, und der markierte einstrangige 44-mer-Sinnstrang bleibt in der Lösung bei Konformation 2 frei. Bei der Konformation 2 des Sinnstrangs werden die Donatormarkierung und die Akzeptormarkierung nahe aneinander angeordnet, woraus sich ein effizienterer Energietransfer und damit eine geringere Lumineszenzlebensdauer als im Falle der Konformation 1 ergeben.
Es ist zu beachten, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung in Form einer Vielzahl von Ausführungsformen verwirklicht werden können, wobei lediglich wenigstens einige hierin beschrieben sind. Der Fachmann erkennt, dass andere Ausführungsformen existieren und nicht vom Grundgedanken der Erfindung abweichen. Daher sind die beschriebenen Ausführungsformen anschaulicher Natur und sollen nicht als einschränkend erachtet werden.
Zusammenfassung
Eine neue Sonde und deren Verwendung in Bioaffinitäts-Analysen
Die Erfindung betrifft eine markierte Sonde zur Verwendung in Bioaffinitäts-Untersuchungen auf der Grundlage eines zeitlich auflösbaren Fluoreszenzresonanzenergietransfers, wobei die Sonde einen Energiedonator sowie einen Energieakzeptor aufweist, und wobei das Energietransfersignal des Akzeptors zu messen ist. Die Erfindung betrifft auch eine homogene Bioaffinitäts-Untersuchung mit zeitlich aufgelöstem Fluoreszenzresonanzenergieübertrag auf der Grundlage der Verwendung der Sonde.

Claims

Homogene Bioaffinitäts-Untersuchung mit den Schritten: a) Bereitstellen einer markierten Sonde mit (i) einem TR-FRET-Markierungspaar mit einem lumineszenten Energiedonator mit angeregtem Zustand mit langer Lebensdauer und einem Lumineszenzakzeptor mit angeregtem Zustand mit geringer Lebensdauer; und (ii) einem reaktiven Gebiet, das in der Lage ist, eine zu bestimmende Bioaffinitäts-Komponente zu erkennen; b) Inkontaktbringen der markierten Sonde mit einer Probe, von der erwartet wird, dass diese die Bioaffinitäts-Komponente aufweist; c) Ermöglichen, dass die Sonde und die Bioaffinitäts-Komponente eine Erkennungsreaktion vollziehen; wobei die Sonde eine unterschiedliche Energietransfereffizienz in Bezug auf den Donator und den Akzeptor aufweist, wenn eine Reaktion mit der Bioaffinitäts-Komponente stattfindet, im Vergleich zu einer nicht reagierenden Sonde; d) Messen eines Energietransfer-basierten Signals von dem Akzeptor der reagierten Probe; e) Messen eines Energietransfer-basierten Signals von dem Akzeptor einer nicht reagierten Sonde in einer Referenzuntersuchung; f) Vergleichen der in den Schritten d) und e) gewonnenen Signalen; und g) Bestimmen des Vorhandenseins oder des Fehlens der Bioaffinitäts-Komponente und der Probe auf der Grundlage einer Differenz der im Schritt f) gewonnenen Akzeptorsignale.
Untersuchung nach Anspruch 1, wobei die Messung in den Schritten d) und e) auf der Grundlage einer Messung der Lebensdauern von gewonnenen Fluoreszenzsignalen ausgeführt wird.
Untersuchung nach Anspruch 1, wobei die Messung in den Schritten d) und e) als eine Intensitätsmessung mit Zeitfenster ausgeführt wird.
Untersuchung nach Anspruch 3, wobei die Intensitätsmessung mit Zeitfenster des Energietransfer-basierten Signals von dem Akzeptor in einem Zeitfenster ausgeführt wird, das nach einer Verzögerung von mindestens 1 Mikrosekunde ab der Donatoranregung geöffnet ist.
Untersuchung nach Anspruch 4, wobei die Erkennungsreaktion zwischen der Sonde und der Bioaffinitäts-Komponente im Schritt c) zu einer Verringerung der Energietransfereffzienz zwischen dem Donator und dem Akzeptor führt; wobei die Intensitätsmessung mit Zeitfenster während eines Zeitfensters ausgeführt wird, das geöffnet wird, nachdem das Energietransfer-basierte Signal, das von dem Akzeptor in einer Referenzuntersuchung, die an der nicht reagierten Sonde ausgeführt wird, erhalten wird, im Wesentlichen zerfallen ist, und wobei der Schritt g) unter Anwendung eines erhöhten Akzeptorsignals im Vergleich zu dem Referenzsignal in dem gleichen Fenster als Indikation für das Vorhandensein der Bioaffinitäts-Komponente in der Probe ausgeführt wird.
Untersuchung nach Anspruch 4, wobei die Erkennungsreaktion zwischen der Sonde und der Bioaffinitäts-Komponente im Schritt c) zu einer Verringerung der Energieeffizienz zwischen dem Donator und dem Akzeptor führt; wobei die Intensitätsmessung mit Zeitfenster in einem Zeitfenster ausgeführt wird, das nach einer kurzen Verzögerung geöffnet wird, bevor das aus der Referenzuntersuchung, die an der nicht reagierten Sonde ausgeführt wird, gemessene Akzeptorsignal zerfallen ist; und wobei der Schritt g) unter Anwendung eines kleineren Akzeptorsignals im Vergleich zu dem Referenzsignal in dem gleichen Fenster als Indikation des Vorhandenseins der Bioaffinitäts-Komponente in der Probe ausgeführt wird.
Untersuchung nach Anspruch 4, wobei die Erkennungsreaktion zwischen der Sonde und der Bioaffinitäts-Komponente im Schritt c) zu einem Anstieg der Energietransfereffizienz zwischen dem Donator und dem Akzeptor führt; wobei die Intensitätsmessung mit Zeitfenster in einem Zeitfenster ausgeführt wird, das geöffnet wird, nachdem das Energietransfer-basierte Signal mit kurzer Lebensdauer, das sich von den reagierten Sonden ergibt, im Wesentlichen zerfallen ist; und wobei der Schritt g) unter Anwendung eines geringeren Akzeptorsignals im Vergleich zu dem Referenzuntersuchungssignal in dem gleichen Fenster als Indikation des Vorhandenseins der Bioaffinitäts-Komponente in der Probe ausgeführt wird.
Untersuchung nach Anspruch 4, wobei die Erkennungsreaktion zwischen der Sonde und der Bioaffinitäts-Komponente im Schritt c) zu einem Anstieg der Energietransfereffizienz zwischen dem Donator und dem Akzeptor führt; wobei die Intensitätsmessung mit Zeitfenster in einem Zeitfenster ausgeführt wird, das nach einer kurzen Verzögerung geöffnet wird, bevor die Komponente mit kurzer Lebensdauer des Akzeptorsignals, das aus der reagierten Sonde gemessen wird, zerfallen ist; und wobei der Schritt g) ausgeführt wird, wobei ein erhöhtes Akzeptorsignal im Vergleich mit dem Referenzuntersuchungssignal in dem gleichen Fenster als Indikation des Vorhandenseins der Bioaffinitäts-Komponente in der Probe verwendet wird.
Untersuchung nach Anspruch 2, wobei die Zerfallsdaten des Energietransfer-basierten Signals mit Zeitauflösung im Akzeptor gemessen werden; wobei die Zerfallsdaten an eine Lumineszenzlebensdauergleichung angepasst werden, um die Zerfallszeitparameter des Probensignals zu ermitteln; wobei die Zerfallszeitparameter mit Zerfallszeitparameter verglichen werden, die aus einer Referenzuntersuchung gewonnen werden, die an der nicht reagierten Sonde ausgeführt wird; und wobei das Vorhandensein oder das Fehlen der Bioaffinitäts-Komponente in der Probe auf der Grundlage von Differenzen in den Zerfallsparametern bestimmt wird.
Untersuchung nach einem der Ansprüche 1–9, wobei das Bioaffinitäts-Untersuchungsformat ausgewählt wird aus: einer Nukleinsäurehybridisierung, einer Antikörper-Antigen-Untersuchung und einer Enzymaktivitätsuntersuchung.
Markierte Sonde zur Verwendung in einer Bioaffinitäts-Untersuchung, wobei die Sonde umfasst: a) ein Markierungspaar mit zeitlich auflösbarem Fluoreszenzresonanzenergietransfer (TR-FRET) mit einem Energiedonator und einem Energieakzeptor; und b) ein reaktives Gebiet, das in der Lage ist, eine zu bestimmende Bioaffinitäts-Komponente zu erkennen, wobei die Sonde eine unterschiedliche Energietransfereffizienz zwischen dem Donator und dem Akzeptor aufweist, wenn eine Re aktion mit der Bioaffinitäts-Komponente stattfindet im Vergleich zu einer nicht reagierten Sonde, wobei der Donator eine lumineszente Markierung mit angeregtem Zustand mit langer Lebensdauer und der Akzeptor eine lumineszente Markierung mit angeregtem Zustand mit kurzer Lebensdauer ist; wobei die Sonde aus der Gruppe ausgewählt wird: einer Nukleinsäure, einem Polypeptid mit 2 bis 70 Aminosäuren, einem Antikörper, einem Antikörperfragment; und wobei der Donator eine lumineszente Markierung mit einer Lebensdauer im angeregtem Zustand von mindestens 1 Mikrosekunde ist.
Sonde nach Anspruch 11, wobei die Differenz in der Energietransfereffizienz zwischen dem Donator und dem Akzeptor bei Reaktion der Sonde mit der Bioaffinitäts-Komponente im Vergleich zu einer nicht reagierten Sonde durch eine Änderung der sekundären Struktur der Sonde hervorgerufen wird.
Sonde nach Anspruch 12, wobei die Energietransfereffizienz kleiner wird, wenn die Sonde mit der Bioaffinitäts-Komponente reagiert.
Sonde nach Anspruch 12, wobei die Energietransfereffizienz ansteigt, wenn die Sonde mit der Bioaffinitäts-Komponente reagiert.
Sonde nach Anspruch 11, wobei die Sonde eine Nukleinsäure ist mit einem reaktiven Gebiet, das eine Nukleotidsequenz ist, die komplementär zu einer Nukleotidsequenz eines Zielobjektgebiets in der Bioaffinitäts-Komponente ist.
Sonde nach Anspruch 11, wobei die Sonde eine Nukleinsäure ist, die ein Substrat der Bioaffinitäts-Untersuchung ist.
Sonde nach Anspruch 11, wobei die Sonde ein Polypeptid ist, das in der Lage ist, als ein Zielobjekt für enzymatische Modifizierungen oder als ein Antigen zu reagieren.
Sonde nach Anspruch 19, wobei die Sonde ein Antikörper oder ein Antikörperfragment ist, das in der Lage ist, eine Bindung mit einem Epitop eines Antigens einzugehen.