DE60313894T2

DE60313894T2 - Verfahren zum nachweis eines analyten in einer probe

Info

Publication number: DE60313894T2
Application number: DE60313894T
Authority: DE
Inventors: Silke Hinnah; Dagmar LAMBRÜ; Sonja Dröge; Stefan JÄGER; Karsten Gall; Werner STÜRMER; Michaela SCHÄFER
Original assignee: Evotec OAI AG
Current assignee: Evotec OAI AG
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-12-19
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2023-12-20
Also published as: EP1585829A1; EP1431398A1; WO2004057023A1; ATE362549T1; EP1585829B1; US8580577B2; US20110105348A1; US20060188880A1; AU2003290106A1; DE60313894D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, wobei Sonden verwendet werden, die mit den Analyten in Wechselwirkung treten.
Der Nachweis und vorzugsweise die quantitative Analyse von Nucleinsäuren ist ein wichtiges Werkzeug im molekularbiologischen Labor. Beispiele sind genetische Tests, die Virusdiagnose und die Analyse von Polymorphismus. Bisher ist eine Reihe von DNA/RNA-Quantifizierungssystemen entwickelt worden. Typischerweise beruhen solche Quantifizierungssyteme auf einem Amplifizierungsschritt, der exponentiell (realisiert mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die auf einer speziellen Replikation mit mehrfachem Umsatz des zu identifizierenden Nucleinsäureabschnitts beruht) oder linear (realisiert mittels eines enzymatischen Umsatzes) erfolgt. Viele Nachweis- und Quantifizierungssysteme beruhen auf dem Nachweis von Analyten durch markierte Sonden, die im Überschuss zur Probe gegeben werden. Ein Teil der markierten Sonden bindet an den Analyten. Wenn die Bindungsreaktion abgeschlossen ist, wird die ungebundene markierte Sonde weggewaschen, und die Menge des Analyten wird anhand der Menge der gebundenen markierten Sonde quantifiziert. Typischerweise sind solche Waschschritte unverzichtbar, um die Hintergrundsignale zu vermindern, die von ungebundenen Sonden stammen. Waschschritte sind jedoch schwierig automatisch handzuhaben, wenn sie überhaupt automatisch handhabbar sind. Andererseits ist eine Automatisierung eine Voraussetzung für Anwendungen mit einem hohen Durchsatz, der bei der Massendiagnose, Medikamententests und der Entwicklung und in ähnlichen Fällen typisch ist.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines empfindlichen Verfahrens zum Nachweis von niedrigen Konzentrationen von Analyten wie Nucleinsäuren. Das Verfahren sollte insbesondere (i) ohne zusätzliche Amplifizierungssschritte, wodurch ein direkter Nachweis des Analyten ermöglicht wird, und (ii) in einem homogenen Format, ohne dass Wasch- oder andere Trennschritte erforderlich sind, durchführbar sein.
WO 90/01564 (ehrt ein Verfahren zum Nachweisen von Ziel-Nucleinsäuren, umfassend das In-Kontakt-Bringen der Ziel-Nucleinsäuren (Analyt) mit einem festen Träger mit verschiedenen markierten Nucleinsäuren, die kovalent daran gebunden sind (Capture-Oligos), die komplementär zu den Zielsequenzen sind. Das Verfahren umfasst weiterhin das In-Kontakt-Bringen des obigen Komplexes (Analyt-Capture-Oligos auf dem festen Träger) mit einer markierten, nachweisbaren Nucleinsäure-Sonde (Nachweis-Oligos), die komplementär zu Sequenzen der Ziel-Nucleinsäure ist, die von den Sequenzen verschieden sind, für die die immobilisierte Nucleinsäure komplementär ist.
In einem ersten Aspekt wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren zum Nachweis eine Analyten in einer Probe gelöst, umfassend die Schritte des:

• Bereitstellens von Nachweissonden, die mit einem ersten Reporter markiert sind, wobei die Nachweissonden dazu fähig sind, am Analyten zu binden,
• Bereitstellens eines festen Trägers,
• Bereitstellens von Capture-Sonden, die an den festen Träger gebunden oder dazu fähig sind, daran zu binden, wobei die Capture-Sonden dazu fähig sind, am Analyten zu binden, wodurch der Analyt auf dem festen Träger konzentriert wird,
• In-Kontakt-Bringens der Probe mit den Nachweissonden, dem festen Träger und den Capture-Sonden, und
• Nachweisens der Nachweissonden, wobei • der Nachweis der Nachweissonden in Gegenwart von Quenchsonden erfolgt, die an überflüssige, nicht an den Analyten gebundene Nachweissonden gebunden werden und dadurch wenigstens teilweise eine Emission des ersten Reporters der überschüssigen Nachweissonden quenchen, und/oder • der feste Träger mit einem zweiten, vom ersten Reporter verschiedenen Reporter markiert wird, ein Bild der Probe bei einer Emissionswellenlänge des zweiten Reporters erzeugt wird, eine Maske erzeugt wird, die durch die Erzeugung eines Bildes der Probe bei der Emissionswellenlänge des zweiten Reporters erhalten wird, und diese Maske auf ein Bild der Probe angewandt wird, das zum Nachweis der Nachweissonden verwendet wird.

In einem zweiten Aspekt, der zum Nachweis von Nucleinsäure-Analyten besonders geeignet ist, wird die Aufgabe der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren bewerkstelligt, umfassend die Schritte des:

• Bereitstellens von Nachweis-Oligonucleotiden, die mit einem ersten Reporter markiert sind, wobei die Nachweis-Oligonucleotide dazu fähig sind, am Analyten zu binden,
• Bereitstellens eines festen Trägers,
• Bereitstellens von Capture-Oligonucleotiden, die an den festen Träger gebunden oder dazu fähig sind, daran zu binden, wobei die Capture-Oligonucleotide dazu fähig sind, am Analyten zu binden, wodurch der Analyt auf dem festen Träger konzentriert wird,
• In-Kontakt-Bringens der Probe mit den Nachweis-Oligonucleotiden, dem festen Träger und den Capture-Oligonucleotiden, und
• Nachweisens der Nachweis-Oligonucleotide, wobei • der Nachweis der Nachweis-Oligonucleotide in Gegenwart von Quench-Oligonucleotiden erfolgt, die mit überflüssigen, nicht an den Analyten gebundenen Nachweis-Oligonucleotiden hybridisieren und dadurch wenigstens teilweise eine Emission des ersten Reporters der überschüssigen Nachweis-Oligonucleotide quenchen, und/oder • der feste Träger mit einem zweiten, vom ersten Reporter verschiedenen Reporter markiert wird, ein Bild der Probe bei einer Emissionswellenlänge des zweiten Reporters erzeugt wird, eine Maske erzeugt wird, die durch die Erzeugung eines Bildes der Probe bei der Emissionswellenlänge des zweiten Reporters erhalten wird, und diese Maske auf ein Bild der Probe angewandt wird, das zum Nachweis der Nachweis-Oligonucleotide verwendet wird.

Es gilt als vereinbart, dass die oben erwähnten Verfahrensschritte der Bereitstellung der Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide, des festen Trägers und von Capture-Sonden/Capture-Oligonucleotiden nicht notwendigerweise die sequentielle Reihenfolge veranschaulichen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist vorteilhaft, weil keine Waschschritte und keine Amplifizierung des Signals erforderlich sind. Folglich wird das Verfahren in einer bevorzugten Ausführungsform tatsächlich in einem homogenen Format durchgeführt. Im Fall des Nachweises von Nucleinsäure-Analyten wird ein direkter. Nachweis der Analyten durch die Verwendung von Nachweis-Oligonucleotiden möglich. Weiterhin werden etablierte konfokale Nachweissysteme und -vorrichtungen anwendbar. Die Signalintensität des ersten Reporters, der die an den Analyten gebundene Nachweissonde markiert, bei dem es sich beispielsweise um Fluoreszenzlicht handelt, ist mit der Menge an Analyten direkt gekoppelt, wodurch ein amplifizierender Turnover-Schritt entfällt. Folglich ermöglicht die vorliegende Erfindung eine Quantifizierung des Analyten. Dadurch wird das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren leicht handhabbar, extrem robust und für Anwendungen mit hohem Durchsatz geeignet. Zusätzliche Merkmale sind ein dynamischer Bereich von 3 Größenordnungen, eine Variabilität von weniger als 15 % und Eignung, die Reaktionsvolumina auf etwa 25 μl zu miniaturisieren, wobei eine Platte mit 384 Proben innerhalb von etwa 10 min ausgelesen und ausgewertet wird.
Gemäß der Erfindung wird es möglich, Analyten wie Proteine und Nucleinsäuren zu bestimmen. Insbesondere umfasst der Analyt wenigstens zwei bindende Stellen, eine für die Capture-Sonde und eine andere für die Nachweissonde.
Es ist bevorzugt, dass der erste und/oder zweite Reporter luminesziert, insbesondere fluoresziert. In einer zusätzlichen Ausführungsform ist der erste und/oder zweite Reporter ein Farbstoff. Die Nachweissonden, insbesondere die Nachweis-Oligonucleotide, werden mit einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert, und/oder der feste Träger wird mit einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert. Typische Farbstoffe umfassen Rhodamin-Farbstoffe wie Rhodamin-6-G, Tetramethylrhodamin oder Rhodamingrün, Oxazin-Farbstoffe, Fluorescein und dergleichen.
Wenn Nucleinsäure-Analyten nachgewiesen werden, ist es bevorzugt, dass in einem ersten Schritt ein Hybrid zwischen Nachweis-Oligonucleotiden und Analyten gebildet wird. Dieser Komplex ist über die Hybridisierung des Analyten an Capture-Oligonucleotide an den festen Träger gebunden. Die Konzentration der Nachweis-Oligonucleotide sollte bei dieser ersten Hybridisierungsreaktion nicht der einschränkende Faktor sein. Daher werden die Nachweis-Oligonucleotide typischerweise in hohen Mengen zur Probe gegeben, weil die tatsächliche Menge des Analyten üblicherweise unbekannt ist. Nachdem die Hybridisierungsreaktion zwischen Nachweis-Oligonucleotiden und Analyten abgeschlossen ist, sind üblicherweise überschüssige, nicht an den Analyten gebundene Nachweis-Oligonucleotide vorhanden. Die Emission des ersten Reporters dieser ungebundenen Nachweis-Oligonucleotide ist die Hauptursache für das Hintergrundsignal, wodurch die Zuverlässigkeit der Analyse verschlechtert wird. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Nachweis von Nachweis-Oligonucleotiden in Gegenwart von Quench-Oligonucleotiden durchgeführt, die an überschüssigen, nicht am Analyten gebundenen Nachweis-Oligonucleotiden hybridisieren und dadurch wenigstens teilweise eine Emission des ersten Reporters der überschüssigen Nachweis-Oligonucleotide quenchen. Vorzugsweise hat das Hybrid aus den Nachweis-Oligonucleotiden und dem Analyten eine höhere Schmelztemperatur als ein Hybrid aus Nachweis-Oligonucleotiden und Quench-Oligonucleotiden. Daher kann das vollständige Verfahren bei zwei verschiedenen Temperaturen durchgeführt werden, so dass eine Kompetition von Quench-Oligonucleotiden mit dem Analyten vermieden werden kann. Die Schmelztemperatur des Hybrids aus den Nachweis-Oligonucleotiden und dem Analyten ist um wenigstens 1 °C, noch mehr bevorzugt wenigstens 2 °C, sogar noch mehr bevorzugt wenigstens 5 °C und am meisten bevorzugt wenigstens 10 °C höher als die Schmelztemperatur des Hybrids aus Nachweis-Oligonucleotiden und Quench-Oligonucleotiden unter Testbedingungen. Allgemein gesagt wird das In-Kontakt-Bringen der Probe mit den Nachweis-Oligonucleotiden unter ersten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt, wodurch die Bildung eines stabilen Hybrids aus Nachweis-Oligonucleotiden und dem Analyten ermöglicht wird. Das In-Kontakt-Bringen der Probe mit Quench-Oligonucleotiden wird unter zweiten Hybridisierungsbedingungen durchgeführt, wodurch die Bildung eines stabilen Hybrids aus überschüssigen, nicht am Analyten gebundenen Nachweis-Oligonucleotiden und Quench-Oligonucleotiden ermöglicht wird. Die zweiten Hybridisierungsbedingungen destabilisieren das Hybrid aus Nachweis-Oligonucleotiden und dem Analyten, die unter den ersten Hybridisierungsbedingungen gebildet sind, nicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Capture-Sonden, insbesondere die Capture-Oligonucleotide, kovalent an den festen Träger gebunden. Es ist aber alternativ auch möglich, Capture-Sonden, insbesondere Capture- Oligonucleotide, zu verwenden, die dazu fähig sind, über eine Affinitätswechselwirkung am festen Träger zu binden. In diesem Fall umfassen die Capture-Sonden/Capture-Oligonucleotide eine erste Affinitätseinheit, die dazu fähig ist, an einer zweiten, am festen Träger gebundenen Affinitätseinheit zu binden. Als typisches Beispiel könnte die erste Affinitätseinheit Biotin sein, und die zweite Affinitätseinheit könnte Streptavidin oder Avidin sein.
Ein typischer fester Träger könnte eine Kugel, eine Zelle, ein Pollen oder eine Mehrzahl davon sein. In einer zweckmäßigen Ausführungsform der Erfindung werden mit Streptavidin beschichtete Polystyrolkügelchen (von Sphereotech, Libertyville, IL 60048) mit einem Durchmesser von etwa 6 μm verwendet. Gemäß der Erfindung ist der Analyt über eine Capture-Sonde am Träger gebunden. Die Capture-Sonde der Erfindung kann einen ersten, am Träger gebundenen Teil und einen zweiten Teil umfassen, der dazu fähig ist, den Analyten zu binden. Jeder Träger kann eine Mehrzahl von Capture-Sonden umfassen.
Es ist jedoch auch möglich, den Boden eines Probenträgers wie eines Objektträgers oder einer Titerplatte als festen Träger zu verwenden. In diesem Fall ist es bevorzugt, die Capture-Sonden an diskreten Punkten auf einem solchen Träger kovalent zu binden oder die oben erwähnte zweite Affinitätseinheit daran zu binden.
Typischerweise unterscheidet sich der erste Reporter, der die Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide markiert, vom zweiten Reporter, der den festen Träger markiert, hinsichtlich seiner Anregungswellenlänge und/oder seiner Emissionswellenlänge. Wenn die Reporter so ausgewählt werden, dass sie verschiedene Emissionswellenlängen haben (z.B. Farbstoffe, die Licht bei einer Wellenlänge von 565 nm für den ersten Reporter und 690 nm für den zweiten Reporter emittieren; siehe die Beispiele unten), können diese während des Nachweises leicht unterschieden werden. Es ist aber auch möglich, Reporter mit verschiedenen Anregungswellenlängen, aber mit derselben Emissionswellenlänge zu verwenden. In diesem Fall werden der erste Reporter und der zweite Reporter zu verschiedenen Zeitpunkten angeregt, und ihre Emission wird entsprechend aufgezeichnet. Aufgrund der Zeitdifferenz kann das nachgewiesene Signal den verschiedenen Reportern zugeordnet werden. Der Unterschied der Anregungswellenlänge und/oder der Emissionswellenlänge zwischen dem ersten und dem zweiten Reporter beträgt typischerweise wenigstens 10 nm, vorzugsweise wenigstens 20 nm, sogar noch mehr bevorzugt wenigstens 50 nm und am meisten bevorzugt wenigstens 100 nm.
Es ist auch bevorzugt, dass die Nachweis-Oligonucleotide eine Linkersequenz umfassen. Diese Linkersequenz verbindet die Sequenz des Nachweis-Oligonucleotids komplementär zum Analyten mit dem ersten Reporter. Die Capture-Oligonucleotide können auch eine Linkersequenz umfassen, die die Sequenz des Capture-Oligonucleotids komplementär zum Analyten mit der Affinitätseinheit oder dem festen Träger verbindet (siehe beispielsweise den Linker T15, der in den Beispielen unten erwähnt ist). Die Verwendung der Linkersequenzen dient zur räumlichen Trennung des ersten und des zweiten Reporters voneinander (im Komplex aus Nachweis-Oligonucleotiden/Analyt/Capture-Oligonucleotiden/festem, mit dem zweiten Reporter markierten Träger). Ansonsten können unerwünschte Wechselwirkungen zwischen diesen Reportern auftreten (z.B. FRET), die das Signal vermindern können, das vom ersten Reporter emittiert wird und zum Nachweis und zur Quantifizierung des Analyten verwendet wird.
In einer zusätzlichen Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung in einem Multiplex-Format verwendet. Wenigstens zwei verschiedene Analyten können nachgewiesen werden, indem wenigstens zwei verschiedene Sätze von Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotiden und wenigstens zwei verschiedene Sätze von Capture-Sonden/Capture-Oligonucleotiden bereitgestellt werden. Der erste Satz von Nachweis-Oligonucleotiden ist komplementär zum ersten Analyten, und der zweite Satz von Nachweis-Oligonucleotiden ist komplementär zum zweiten Analyten. Dasselbe gilt demgemäß für die Capture-Oligonucleotide. Die verschiedenen Sätze von Nachweisson den/Nachweis-Oligonucleotiden sind vorzugsweise mit verschiedenen Reportern markiert. Die Reporter eines Satzes sind identisch, haben dieselbe Anregungswellenlänge und/oder dieselbe Emissionswellenlänge. Alternativ sind die Reporter der Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide in den verschiedenen Sätzen identisch. In diesem Fall ist es bevorzugt, zwei verschiedene Typen von festen Trägern zu verwenden. Der erste Analyt kann mittels einer ersten Affinitätswechselwirkung auf dem ersten festen Träger (wie einem kleinen Kügelchen) abgefangen werden. Der zweite Analyt kann mittels einer zweiten Affinitätswechselwirkung auf dem zweiten festen Träger (wie einem großen Kügelchen) abgefangen werden. Die festen Träger können voneinander unterschieden werden, indem Bildanalyse-Werkzeuge angewandt werden. Der Nachweis der an den ersten Analyten gebundenen Nachweis-Oligonucleotide kann durchgeführt werden, indem eine Maske der kleinen Kügelchen verwendet wird, während der Nachweis der an den zweiten Analyten gebundenen Nachweis-Oligonucleotide durchgeführt werden kann, indem eine Maske der großen Kügelchen verwendet wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der Nachweis der Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide durchgeführt werden, indem eine Bilderzeugung in Kombination mit der Erzeugung einer Maske angewandt werden. Der feste Träger wird mit einem zweiten Reporter markiert, der von demjenigen verschieden ist, der zum Markieren der Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide verwendet wird. Ein Bild wird bei der Emissionswellenlänge des zweiten Reporters aufgezeichnet. Danach wird eine Maske erzeugt und auf ein Bild der Probe angewandt, das für den oben erwähnten Nachweis verwendet wird. Es ist bevorzugt, dass das bei der Emissionswellenlänge des zweiten Reporters aufgezeichnete Bild gleichzeitig mit dem Bild aufgezeichnet wird, das zum Nachweis der Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide verwendet wird, indem zwei Detektoren verwendet werden. Dieses letztere Bild wird typischerweise bei einer Wellenlänge aufgezeichnet, die von der Emissionswellenlänge des zweiten Reporters verschieden ist (siehe 5 unten). Das Bild der Probe, die zum Nachweis der Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide verwendet wird, wird typischerweise bei der Emissionswellen länge des ersten Reporters erfasst. Es ist bevorzugt, das bei der Emissionswellenlänge des zweiten Reporters aufgezeichnete Bild so zu korrigieren, dass es mit dem Bild, das zum Nachweis der Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide verwendet wurde, räumlich übereinstimmt. Alternativ kann das letztere Bild so korrigiert werden, dass es auf das erste Bild abgestimmt ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Quenchsonden/Quench-Oligonucleotide eine Quencheinheit, wobei die Quencheinheit vorzugsweise ein Farbstoff ist. Insbesondere ist der erste Reporter ein Donor eines Förster-Resonanzenergieübertragungs- (FRET-)Donor-Akzeptor-Paars, und die Quencheinheit ist ein Akzeptor des Donor-Akzeptor-Paars. Alternativ ist die Quencheinheit ein Dark Quencher, der die Emission des ersten Reporters wenigstens teilweise quencht, indem er Energie eines angeregten Zustandes des ersten Reporters in die Umgebung dissipiert.
Wenn der Analyt quantifiziert wird, kann eine solche Quantifizierung durchgeführt werden, indem die Menge der am Analyten gebundenen Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide bestimmt wird. Das vom ersten Reporter stammende Signal, das solche gebundenen Sonden (im Komplex aus Nachweissonde/Analyt/Capturesonde/festem Träger) markiert, steht mit der Menge des Analyten in Beziehung. Die Menge der Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide, die an den Analyten gebunden ist, kann als vom ersten Reporter emittierte Emissionsintensität ausgedrückt werden.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise den zusätzlichen Schritt der Bestimmung der Intensität einer Hintergrundemission in der Nähe des festen Trägers und die Berücksichtigung dieser Intensität bei der Bestimmung der Menge an Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide.
Im Allgemeinen können die Nachweissonden Aptamere, Oligonucleotide oder Antikörper sein. Analyten können Proteine oder Nucleinsäuren, insbesondere mRNA sein. Die Probe, die möglicherweise den Analyten umfasst, kann ein Zelllysat, insbesondere ein rohes Zelllysat, oder eine in vitro hergestellte Probe sein. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist beim Screening auf potentiell pharmazeutische Wirkstoffe, bei der Diagnose oder bei der Bestimmung möglicher Nebenwirkungen von Medikamenten besonders brauchbar.
Wie oben bereits ausgeführt wurde, ist in demjenigen Fall, in dem die Sonde mit dem ersten Reporter eine fluoreszierende Sonde ist und nur wenige Analyten vorhanden sind, die Sonde normalerweise im Überschuss vorhanden. Dann emittiert nicht gebundene Sonde Fluoreszenzlicht, das eine Erniedrigung der Empfindlichkeit der Messung bewirken kann. Die Bilderzeugung kann vorzugsweise unter Verwendung einer konfokalen Optik erfolgen. Eine konfokale Optik bewirkt eine räumliche Begrenzung des Messvolumens auf eine sehr schmale, wohldefinierte Brennebene, wodurch Hintergrundsignale vermindert werden. Darüber hinaus ist es vorteilhaft, einen Quencher mit einer Fluoreszenz zur ersten Reportereinheit zu geben und dadurch den Hintergrund zu vermindern. Aufgrund der Verwendung von Quench-Oligonucleotiden, die komplementär zu den Nachweis-Oligonucleotiden sind, und der Anwendung der oben beschriebenen speziellen Hybridisierungsbedingungen ist es möglich, die Hintergrund-Fluoreszenz der ungebundenen Nachweis-Oligonucleotide spezifisch zu quenchen. Dies erfolgt, ohne die Signal-Fluoreszenz der an den Analyten gebundenen Nachweis-Oligonucleotide zu quenchen.
Darüber hinaus kann das Hintergrundsignal durch mathematische Methoden eliminiert werden. Beispielsweise wird das Hintergrundsignal in der Nähe des festen Trägers quantifiziert (obwohl es einen ausreichenden Abstand dazu hat) und vom Signal des ersten Reporters abgezogen.
Die Sonde mit dem ersten Reporter wird zur Verwendung des Nachweises des tatsächlichen Analyten verwendet, während der zweite Reporter als Marker für den festen Träger selbst dient, an den der Analyt, falls vorhanden, gebunden ist. Somit ermöglicht der zweite Reporter die Lokalisierung des festen Trägers und die anschließende Erzeugung einer Maske, welche die Messgenauigkeit verbessert. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Reporter Farbstoffe mit verschiedenen Absorptionsmaxima, und/oder, wenn sie Fluoreszenzfarbstoffe sind, verschiedenen Emissionsspektren. Der Fachmann versteht leicht, wie die Farbstoffe gemäß den Fluoreszenzfiltern in der Messvorrichtung, welche die Anregungs- und/oder Emissionsbanden der beiden Farbstoffe filtert, auszuwählen sind.
Nachfolgend ist eine Kurzbeschreibung der Figuren aufgeführt.
1 veranschaulicht das Ergebnis einer Hybridisierungsreaktion, bei der Nachweis-Oligonucleotide (DO), Capture-Oligonucleotide (CO) und Kügelchen zum Nachweis einer Nucleinsäure verwendet werden.
2 veranschaulicht die von der vorliegenden Erfindung gelehrten Maßnahmen zur Verbesserung der Empfindlichkeit des in 1 veranschaulichten Assayprinzips.
3 zeigt eine Ausführungsform des verbesserten Assayprinzips, bei dem mit Rhodamin-6G markierte Nachweis-Oligonucleotide, FRET-Quench-Oligonucleotide und mit einem roten Oxazin-Farbstoff markierte Kügelchen angewandt werden.
4 veranschaulicht Einzelheiten des von der vorliegenden Erfindung gelehrten Assayprinzips zum Nachweis von c-fos-mRNA.
5 zeigt Signalbilder und Bezugsbilder von Kügelchen mit verschiedenen Konzentrationen des Ziel-RNA-Analyten. Das Signalbild wurde bei der Emissionswellenlänge des ersten Reporters zum Markieren der Detektions-Oligonucleotide (565 nm) aufgezeichnet, während das Bezugsbild bei der Emissionswellenlänge des zweiten, die Kügelchen markierenden Reporters (690 nm) aufgezeichnet wurde.
6 zeigt eine Strategie für eine Bildanalyse gemäß der vorliegenden Erfindung.
7 veranschaulicht die Ergebnisse der c-fos-RNA-Titration. Aufgrund des logarithmischen Maßstabs ist die Kontrolle als 1 × 10³ Kopien veranschaulicht (obwohl sie in Wirklichkeit keine in vitro hergestellte c-fos-RNA enthält). Die mittlere Fluoreszenzintensität pro Kügelchen-Pixel steht in Relation zur Menge des c-fos-RNA-Analyten, der mit Nachweis-Oligonucleotiden markiert und über die Capture-Oligonucleotide an die Kügelchen gebunden ist.
8 zeigt die mittlere Fluoreszenzintensität pro Kügelchen-Pixel bei verschiedenen PMA-Konzentrationen (c-fos-Experimente). Die in dieser 8 veranschaulichte Fluoreszenzintensität stammt von der Emission der indirekt an das Kügelchen gebundenen Nachweis-Oligonucleotide (über das Analyt-/Capture-Oligonucleotid; siehe auch die 1 und 2).
9 zeigt die mittlere Fluoreszenzintensität pro Kügelchen-Pixel bei verschiedenen Konzentrationen an 3-Methylcholanthren (cyp1A1-Experimente). Die in dieser 9 veranschaulichte Fluoreszenzintensität stammt von der Emission der Nachweis-Oligonucleotide, die indirekt (über das Analyt-/Capture-Oligonucleotid) an das Kügelchen gebunden waren; siehe auch die 1 und 2). Veranschaulicht sind die Ergebnisse des Vermessens von drei Probenplatten (siehe auch Beispiel 2).
10 betrifft Beispiel 1a. Sie zeigt die mittlere Fluoreszenzintensität der Emission des Reporters zur Markierung der Nachweis-Oligonucleotide pro Kügelchen-Pixel als Funktion der RNA-Kopien pro Vertiefung (durchschnittlich 4 Vertiefungen pro Konzentration). Aufgrund der logarithmischen Skala ist die Kontrolle als 1e + 03 Kopien/Vertiefung veranschaulicht. Zwei verschiedene Arten von Bildanalyse sind durchgeführt worden. Bei der ersten Analyse wurde die Erkennung von Kügelchen am Signalbild durchgeführt, das bei der Emissionswellenlänge des Farbstoffs zur Markierung der Nachweis-Oligonucleotide erhalten wurde. Bei der zweiten Analyse wurde die Erkennung von Kügelchen am dazugehörigen Bezugsbild durchgeführt, das bei der Emissionswellenlänge des Farbstoffs zum Markieren der Kügelchen erhalten wurde. Die Signalemission ist auf die Konzentration des mRNA-Analyten bezogen und nimmt somit mit abnehmender mRNA-Konzentration ab. Dies führt zu einer verschlechterten Erkennung von Kügelchen ab einer Konzentration von 5 × 10⁶ Kopien/RNA (wobei auf die hohe Standardabweichung hingewiesen sei), und darunter erfolgt überhaupt keine Erkennung von Kügelchen. Dadurch werden die untere Nachweisgrenze und die Empfindlichkeit des Assays signifikant verschlechtert. Die entsprechenden, dieser Figur zugrundeliegenden Bilder sind in 11 veranschaulicht.
11 betrifft Beispiel 1a. Repräsentative Bilder der Bildanalyse der in den 7 und 10 dargestellten Experimente sind dargestellt. 11 zeigt die Ergebnisse einer Erkennung von Kügelchen, die (i) an Signalbildern, die bei der Emissionswellenlänge des Farbstoffs zur Markierung der Nachweis-Oligonucleotide erhalten wurden, und (ii) an Bezugsbildern, die bei der Emissionswellenlänge des die Kügelchen markierenden Farbstoffs bei verschiedenen Konzentrationen des Ziel-c-fos-RNA-Analyten durchgeführt wurden. Die linke Spalte demonstriert, dass eine zuverlässige Erkennung von Kügelchen, die an Signalbildern durchgeführt wurde, nur im Fall von hohen Analytkonzentrationen möglich ist. Bei niedrigeren Konzentrationen in der Größenordnung von 2,5 × 10⁶ RNA-Kopien/Vertiefung sind Kügelchen nicht mehr erkennbar. Diese Art der Erkennung von Kügelchen entspricht einer experimentellen Anordnung, die ohne die Verwendung des zweiten Farbstoffs zum Markieren der Kügelchen (unabhängig von der Analytkonzentration) durchgeführt wird. Die rechte Spalte demonstriert, dass die an Bezugsbildern durchgeführte Erkennung von Kügelchen unabhängig von der Analytkonzentration funktioniert.
12 zeigt die Ergebnisse einer c-fos-RNA-Titration mit und ohne FQO (siehe auch Beispiel 4). Aufgrund des logarithmischen Maßstabs ist die Kontrolle als 1 × 10³ Kopien veranschaulicht (obwohl sie in Wirklichkeit keine in vitro hergestellte c-fos-RNA enthält). Die mittlere Fluoreszenzintensität bei der Emissionswellenlänge des ersten Reporters pro Kügelchen-Pixel steht in Beziehung zur Menge des c-fos-RNA-Analyten, der mit Nachweis-Oligonucleotiden markiert und über die Capture-Oligonucleotide an die Kügelchen gebunden ist. Die Figur demonstriert, dass der dynamische Bereich der Fluoreszenzintensität des Signals in Gegenwart von FQO signifikant breiter als bei dessen Fehlen ist. Folglich wird die untere Nachweisgrenze für den Analyten in Gegenwart von FQO verbessert.
Die verschiedenen Experimente, die gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, und die Figuren werden nachfolgend ausführlicher beschrieben.
1 veranschaulicht schematisch, dass mit einem ersten Farbstoff markierte Nachweis-Oligonucleotide (DO) zur Markierung der Nucleinsäure des Analyten verwendet werden. Der resultierende markierte Komplex wird an mit Streptavidin beschichteten Kügelchen mittels einer Hybridisierung von biotinylierten Capture-Oligonucleotiden (CO) abgefangen. Die Verwendung eines Kügelchen oder eines anderen festen Trägers ist vorteilhaft, weil der Analyt darauf konzentriert ist.
2 veranschaulicht Maßnahmen gemäß der vorliegenden Erfindung, die allein oder in Kombination ergriffen werden, um eine verbesserte Empfindlichkeit des Assays zu erreichen. Die mit Streptavidin beschichteten Kügelchen können mit biotinylierten zweiten Farbstoffen markiert sein, um ihren zuverlässigen Nachweis unabhängig von der Analytkonzentration zu ermöglichen. Sogenannte Zweikanalmessungen können durchgeführt werden, indem sowohl das Signal der markierten Nachweis-Oligonucleotide, die an den Analyt-CO-Kügelchen-Komplex gebunden sind, als auch die Bezugsemission des biotinylierten zweiten Farbstoffs gemessen werden. Zusätzlich oder alternativ kann das Hintergrundsignal, das von ungebundenen Fluoreszenz-Nachweis-Oligonucleotiden verursacht wird, mit Quench-Oligonucleotiden, die an den freien, überschüssigen Nachweis-Oligonucleotiden hybridisieren, minimiert werden.
Eine spezielle Ausführungsform des Assayprinzips gemäß der vorliegenden Erfindung ist ausführlicher in 3 veranschaulicht. Eine Anzahl von etwa 20 Nachweis-Oligonucleotiden (DO), die mit dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin-6G markiert sind, wird zur speziellen Markierung der Ziel-mRNA, d.h. des Analyten, verwendet. Der resultierende fluoreszierende Komplex wird auf mit Streptavidin beschichteten Kügelchen mittels einer Hybridisierung von biotinylierten sogenannten Capture-Oligonucleotiden (CO) abgefangen. Die Fluoreszenzintensität auf den Kügelchen kann unter Verwendung einer konfokalen Hochgeschwindigkeits-Zweikanal-Bilderzeugung aufgezeichnet werden. Die Fluoreszenzintensität der indirekt (mittels des Analyt/CO-Komplexes) an den Kügelchen gebundenen Nachweis-Oligonucleotide weist eine lineare Beziehung zur mRNA-Konzentration auf. Um eine verbesserte Empfindlichkeit des Assays zu erreichen, können zusätzliche Schritte gemäß der vorliegenden Erfindung ergriffen werden, nämlich ein unspezifisches Markieren der Kügelchen mit einer zweiten Farbe (wie einem biotinyliertem roten Oxazin-Farbstoff), um ihren zuverlässigen Nachweis unabhängig von der RNA-Konzentration zu ermöglichen. Weiterhin kann die Hintergrund-Fluoreszenz, die von freien, überschüssigen Nachweis-Oligonucleotiden bewirkt wird, durch die Verwendung von FRET-Quench-Oligonucleotiden (FQO) minimiert werden.
Ein sogar noch ausführlicheres Beispiel ist in 4 aufgeführt: Die c-fos-mRNA ist mit zwei Nachweis-Oligonucleotiden (19 cF-DO und 20 cF-DO; zur Nummerierung von c-Fos-Oligonucleotiden siehe Tabelle 1) markiert. Ein biotinyliertes Capture-Oligonucleotid (6 cF-CO) dient zum Binden am Kügelchen (wobei das Kügelchen nicht dargestellt ist). Darüber hinaus (untere rechte Ecke) ist das Quenchen von überschüssigem DO (19 cF-DO) durch sein spezifisches FQO (19 cF-FQO) demonstriert.
Nachfolgend wird die Erfindung durch die folgenden Beispiele ausführlicher erläutert. Die im nachfolgenden Abschnitt "Materialien und Verfahren" beschriebenen allgemeinen Verfahren sind auf alle Beispiele anwendbar.
Materialien und Verfahren
Zellkultur
Hepatomzellen HepG2 wurden in DMEM-F12 (Gibco, Katalognr. 31331-028), ergänzt um 10 % FCS (Gibco, Katalognr. 10500-064) bei 37 °C und 5 % CO₂ gehalten. A549-Zellen wurden in DMEM-F12 (Gibco, Katalognr. 31331-028), ergänzt um 5 % FCS (Gibco, Katalognr. 10500-064) bei 37 °C und 5 % CO₂ gehalten.
Herstellung von Lysepuffer
Der Lysepuffer enthielt mit DEPC behandeltes Wasser (RNase-frei) mit 100 mM Tris/HCl, pH-Wert 8,0, 10 mM EDTA, pH-Wert 8,0, 0,5 M LiCl, 5 mM DTT, 1 % (w/v) LiDS und 1 mg/ml Proteinase K (Roche Diagnostics, Katalognr. 1000144). Eine Vorratslösung des Lysepuffers ohne Proteinase K wurde hergestellt und bei –20 °C aufbewahrt, wobei frisch hergestellte Proteinase K vor jedem Experiment zugegeben wurde. Alle Chemikalien wurden mit der höchsten Qualität ("für die Molekularbiologie") von Sigma-Aldrich bezogen.
Mit Streptavidin beschichtete Kügelchen
Mit Streptavidin beschichtete Polystyrol-Kügelchen (SA-Kügelchen) mit einem Durchmesser von 6,7 μm und einer Konzentration von 3,8·10⁴ Kügelchen/μl wurden von Spherotech bestellt (Kat.Nr. SVP-60-5).
Herstellung von biotinyliertem roten Oxazin-Farbstoff
Ein roter Oxazin-Farbstoff wurde unter Anwendung von Standardverfahren biotinyliert. Eine 50-μM-Vorratslösung des biotinylierten roten Oxazin-Farbstoffs in DMSO wurde hergestellt.
Nachweis
Eine vollautomatische konfokale Zweikanal-Bilderzeugung wurde mit zwei unabhängigen gekühlten CCD-Detektoren durchgeführt. Anregungswellenlängen waren 532 nm und 633 nm, ein dichroitischer Strahlenteiler mit 630 nm wurde verwendet, und die Emissionsfilter waren 565/50 nm und 690/40 nm. Die Laserenergie betrug ~500 μW für beide Wellenlängen, gemessen am Eingang des Objektivs. Die Bestrahlungszeiten waren gewöhnlich im Bereich von 500–1000 ms. 1–5 Bildpaare/Vertiefung einer standardmäßigen Titerplatte, die die Probe aufnahm, wurden aufgezeichnet, wobei jedes Bild eine Größe von 445 × 336 μm hatte.
Darüber hinaus wurden Korrekturbilder mit zweckmäßigen Farbstofflösungen, vorgefärbten Kügelchen und dunkle Bilder (Detektorrauschen) aufgenommen. In Kombination mit zweckmäßigen Algorithmen wurden diese Bilder zur Korrektur von Assaybildern hinsichtlich des Kamerarauschens und Unregelmäßigkeiten der Beleuchtung verwendet. Weiterhin wurden die Bildpaare von den Detektoren 1 und 2 räumlich so eingestellt, dass eine optimale Überlappung erhalten wurde.
Auswertung
Ein Bild der Probe wurde mit dem ersten CCD-Detektor bei 565 nm aufgenommen. Dieses Bild wird als Signalbild bezeichnet. Bei dieser Wellenlänge ist die Emission der Nachweis-Oligonucleotide zu sehen. Daher kann man im Prinzip die Fluoreszenzemission sowohl von ungebundenen Nachweis-Oligonucleotiden als auch von spezifisch an den Analyten (und folglich über die Capture-Oligonucleotide an den Kügelchen) gebundenen Nachweis-Oligonucleotiden sehen. Um diese Signale voneinander zu unterscheiden, lehrt die vorliegende Erfindung, die Emission der ungebundenen Nachweis-Oligonucleotide durch die Verwendung von komplementären Quench-Oligonucleotiden zu minimieren. Die Signalintensität auf den Kügelchen ist von der Analytkonzentration, d.h. im vorliegenden Beispiel von der mRNA-Konzentration, linear abhängig.
Darüber hinaus wurde mit dem zweiten CCD-Detektor ein Bild der Probe bei 690 nm aufgenommen. Dieses Bild wird als Bezugsbild bezeichnet. Bei dieser Wellenlänge ist die Emission des biotinylierten roten Oxazin-Farbstoffs zu sehen. Die Fluoreszenz des an die Kügelchen gebundenen biotinylierten roten Oxazin-Farbstoffs ist auf dem Bezugsbild (siehe 6, linkes Bild) als roter Ring zu sehen. Diese Emission der an die Kügelchen gebundenen Farbstoffe kann von der Hintergrundemission des ungebundenen roten Oxazin-Farbstoffs durch Ansprechwert-Techniken unterschieden werden. Diese Fluoreszenzintensität ist konstant und nicht von der Konzentration des mRNA-Analyten abhängig, siehe zur Veranschaulichung 5. Bei extrem hohen mRNA-Konzentrationen kann sie aufgrund der beschränkten Streptavidin-Bindungsstellen eine inverse Beziehung zu den mRNA-Konzentrationen annehmen, wobei dies unter physiologischen Bedingungen und in den hier aufgeführten Experimenten nicht der Fall war.
Die Analyse der Bilder wurde mit einer Bildanalysesoftware wie folgt durchgeführt. Eine Segmentierung der Kügelchen vom Hintergrund wurde auf der Grundlage von Pixeln im Bezugsbild durchgeführt. Wie aus 6 (linkes Bild) hervorgeht, sind erfasste Kügelchen mit einem Ring markiert. Eine Maske dieser Ringe, die erfassten Kügelchen entsprach, wurde aus dem Bezugsbild erzeugt. Diese Maske wurde auf das Signalbild (siehe 6, rechtes Bild) angewandt. Bereiche mit der äußeren Grenze des Rings wurden auf die Fluoreszenzintensität untersucht, die von dem am Kügelchen gebundenen DO-Analyt-CO-Komplex stammte. Es war besonders vorteilhaft, störende Hintergrundsignale von freiem, nicht vollständig gequenchtem DO durch eine Bestimmung der lokalen Intensität des Hintergrundes in einem kreisrunden Bereich neben jedem einzelnen Kügelchen im Signalbild weiter zu vermindern. Eine solche lokale Hintergrundintensität wurde dann von der Signalintensität subtrahiert.
Das endgültige Ergebnis bestand in der mittleren Fluoreszenzintensität/im Kügelchen-Pixel des Signalbildes. Im Allgemeinen wurde die Intensität über alle korrekt erfassten Kügelchen des Bildes gemittelt. Die Kügelchen waren üblicherweise in Vertiefungen von Mikro- oder Nanotiterplatten enthalten, und in einigen Fällen wurden mehrere Bilder von einer jeden Vertiefung genommen. In diesem Fall wurde die Intensität über alle Bilder einer Vertiefung gemittelt.
Beispiel 1: Nachweis von c-fos-mRNA
Herstellung von Oligonucleotiden (DO, CO, UO und FQO)
Ein Satz von 19 Nachweis-Oligonucleotiden (DO) und 8 Capture-Oligonucleotiden (CO) wurde gewählt. Die DO waren mit Rhodamin-6G am 5'-Terminus markiert. Das CO umfasste eine Nucleotidsequenz, die komplementär zu einer Sequenz des Analyten war, einen T15-Linker am 5'-Terminus und Biotin. Die Oligonucleotide waren komplementär zu Teilen der Nucleotidsequenz der c-fos-mRNA, hatten eine minimale Schmelztemperatur Tm von 63 °C, wobei die Länge zwischen 17–26 Nucleotiden (nt) in Abhängigkeit vom GC-Gehalt variierte. Sie deckten einen 676 nt langen Teil der c-fos-mRNA (Gesamtlänge 1143 nt) zwischen den Nucleotiden 161 und 837 ohne dazwischenliegende Lücken ab. Die DO und CO wurden so gewählt, dass sie nicht komplementär zueinander waren (wenn das DO und das CO komplementär zueinander wären, würde dies aufgrund ihrer direkten Bindung am CO zu einer unspezifischen Bindung von DO an den Kügelchen führen). 6 zusätzliche Oligonucleotide hatten einen zu hohen Komplementaritätsgrad gegenüber anderen und wurden nicht markiert. Diese unmarkierten Oligonucleotide (UO) wurden dennoch hergestellt und zur Hybridisierungslösung gegeben, um zu gewährleisten, dass der jeweilige Teil der c-fos-mRNA vollständig abgedeckt war und somit ein einer doppelsträngigen, stabileren Konformation vorlag. Die CO wurden so ausgewählt, dass sie in relativ gleichmäßigen Abständen zwischen den DO vorlagen. Weiterhin wurde jedes DO so ausgewählt, dass es das Nucleotid A, C oder T am 5'-Terminus hatte, weil G ein bekannter Quencher der Fluoreszenz von Rhodamin-6G ist.
Darüber hinaus wurde ein Satz von 19 FREI (Förster-Resonanzenergieübertragungs-Quenchern (FQO) hergestellt. Diese waren zum 5'-terminalen Teil des jeweiligen DO komplementär, aber nur 15 nt lang, was zu einer niedrigeren minimalen Schmelztemperatur Tm von ~42 °C führte. Sie waren mit einem roten Oxazinfarbstoff am 3'-Terminus markiert. Alle Oligonucleoside wurden nach Standardverfahren synthetisiert.
Vorratslösungen von Oligonucleotiden wurden in TE-Puffer (mit DEPC behandeltes Wasser mit 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 8,0) mit einer Konzentration von 100 μM hergestellt und bei –80 °C gefroren. DO-, CO-, UO- und FQO-Mischungen wurden (indem gleiche Mengen einer jeden Oligonucleotid-Lösung zugegeben wurden) mit einer Konzentration von 100 μM hergestellt. Die DG-Mischung umfasste 19 verschiedene Nachweis-Oligonucleotide, wobei jedes einzelne Oligonucleotid in dieser Mischung mit einer Konzentration von 5,26 μM vorhanden war. Für die FQO-Mischung betrug die Konzentration eines jeden einzelnen Oligonucleotids (FQO) auch 5,26 μM, während die einzelne Konzentration eines jeden CO für die CO-Mischung 12,5 μM und die einzelne Konzentration eines jeden UO für die UO-Mischung 16,66 μM betrug.

In der folgenden Tabelle 1 ist eine vollständige Liste aller zum Nachweis des c-fos-mRNA-Analyten verwendeten Oligonucleotide aufgeführt. Die unten für das CO, das DO und das UO aufgeführte Position bezieht sich auf die Position in einem DNA-Strang, der komplementär zum mRNA-Analyten ist. Tabelle 1: Liste der zum Nachweis von c-fos-mRNA verwendeten Oligonucleotide

Position	Bezeichnung	Sequenz
8 CO (Capture-Oligonucleotide), umfassend einen Linker aus 15 T-Nucleotiden (T15) und am 5'-Terminus gebundenes Biotin
258–276	1 cF-CO	Biotin-5'-T15-ggctctggtctgcgatggg-3'
277–296	2 cF-CO	Biotin-5'-T15-gggactccgaaagggtgagg-3'
394–420	3 cF-CO	Biotin-5'-T15-ccttttctcttcttcttctggagataa-3'
421–441	4 cF-CO	Biotin-5'-T15-attcctttcccttcggattct-3'
528–548	5 cF-CO	Biotin-5'-T15-atctcggtctgcaaagcagac-3'
549–568	6 cF-CO	Biotin-5'-T15-tctccttcagcaggttggca-3'
633–655	7 cF-CO	Biotin-5'-T15-ccacagacatctcttctgggaag-3'
656–676	8 cF-CO	Biotin-5'-T15-ccccagtcagatcaagggaag-3'
19 DO (Nachweis-Oligos), 5'-markiert mit Rhodamin-6G (Rh6G)
161–182	9 cF-DO	Rh6G-5'-atgaagttggcactggagacgg-3'
183–200	10 cF-DO	Rh6G-5'-atggcagtgaccgtggga-3'
201–219	11 cF-DO	Rh6G-5'-caggtccggactggtcgag-3'
220–238	12 cF-DO	Rh6G-5'-cgggctgcaccagccactg-3'
312–329	13 cF-DO	Rh6G-5'-ccagccctggagtaagcc-3'

330–352	14 cF-DO	Rh6G-5'-ctcctgtcatggtcttcacaacg-3'
353–371	15 cF-DO	Rh6G-5'-ccaatgctctgcgctcggc-3'
372–393	16 cF-DO	Rh6G-5'-ctgttccaccttgcccctcctg-3'
462–478	17 cF-DO	Rh6G-5'-ccctcctccggttgcgg-3'
479–501	18 cF-DO	Rh6G-5'-cgcttggagtgtatcagtcagct-3'
569–592	19 cF-DO	Rh6G-5'-ccaggatgaactctagtttttcct-3'
593–611	20 cF-DO	Rh6G- 5'-caggcaggtcggtgagctg-3'
612–632	21 cF-DO	Rh6G-5'-cccaggtcatcagggatcttg-3'
696–715	22 cF-DO	Rh6G-5'-aggcctcctcagactccggg-3'
716–733	23 cF-DO	Rh6G-5'-tgaggagaggcagggtga-3'
734–754	24 cF-DO	Rh6G-5'-agggcttgggctcagggtcat-3'
755–775	25 cF-DO	Rh6G-5'-tgctcttgacaggttccactg-3'
796–815	26 cF-DO	Rh6G-5'-aagtcatcaaagggctcggt-3'
816–837	27 cF-DO	Rh6G-5'-cctggatgatgctgggaacagg-3'

6 UO (unmarkierte Oligonucleotide)
239–257	28 cF-UO	5'-gccacagaggagacgaggg-3'
297–311	29 cF-UO	5'-ccagcggagggggcg-3'
442–461	30 cF-UO	5'-catttggctgcagccatctt-3'
502–527	31 cF-UO	5'-ttctcatcttctagttggtctgtctc-3'
677–695	32 cF-UO	5'-gtggcaacctctggcaggc-3'
776–795	33 cF-UO	5'-cttcagctccatgctgctga-3'
19 FQO (FRET-Quench-Oligos) 3'-markiertmit rotem Oxazin-Farbstoff (RO)
9 cF-DO	9 cF-FQO	5'-cag tgc caa ctt cat-3'-RO
10 cF-DO	10 cF-FQO	5'-cac ggt cac tgc cat-3'-RO
11 cF-DO	11 cF-FQO	5'-acc agt ccg gac ctg-3'-RO
12 cF-DO	12 cF-FQO	5'-ggc tgg tgc agc ccg-3'-RO
13 cF-DO	13 cF-FQO	5'-tta ctc cag ggc tgg-3'-RO
14 cF-DO	14 cF-FQO	5'-aga cca tga cag gag-3'-RD
15 cF-DO	15 cF-FQO	5'-agc gca gag cat tgg-3'-RD
16 cF-DO	16 cF-FQO	5'-ggc aag gtg gaa cag-3'-RO
17 cF-DO	17 cF-FQO	5'-gca acc gga gga ggg-3'-RO
18 cF-DO	18 cF-FQO	5'-gat aca ctc caa gcg-3'-RO
19 cF-DO	19 cF-FQO	5'-tag agt tca tcc tgg-3'-RD
20 cF-DO	20 cF-FQO	5'-tca ccg acc tgc ctg-3'-RD
21 cF-DO	21 cF-FQO	5'-ccc tga tga cct ggg-3'-RO
22 cF-DO	22 cF-FQO	5'-agt ctg agg agg cct-3'-RO
23 cF-DO	23 cF-FQO	5'-ccc tgc ctc tcc tca-3'-RO
24 cF-DO	24 cF-FQO	5'-ctg agc cca agc cct-3'-RD
25 cF-DO	25 cF-FQO	5'-aac ctg tca aga gca-3'-RD
26 cF-DO	26 cF-FQO	5'-gcc ctt tga tga ctt-3'-RD
27 cF-DO	27 cF-FQO	5'-cca gca tca tcc agg-3'-RO

Beispiel 1a) Titration von c-fos-RNA
In-vitro-Herstellung von c-fos-RNA
A549-Zellen wurden mit einer Cytokin-Mischung (16,5 ng/ml IFN-γ, 41,7 ng/ml IL-1β und 25 ng/ml TNF-α) stimuliert, um eine Expression von c-fos-mRNA zu induzieren. Nach 1 h wurde die gesamte RNA isoliert (QIAGEN, RNeasy Mini Protocol for RNA Cleanup). Dann wurde die 1143 Nucleotide lange Codierungssequenz von c-fos (Genbank-Hinterlegungsnummer K00650) mittels RT-PCR mit zwei spezifischen Primern (Vorwärts-Primer: 5' GCG AAT TCC TCG GGC TTC AAC GCA GA 3', Rückwärts-Primer: 5' ATG GAT CCC AGC GTG GGT GAG CTG A 3') hergestellt. Diese Primer enthielten eine zusätzliche BamHI- bzw. EcoRI-Restriktionsstelle. Der Erfolg der PCR wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese verifiziert, und das PCR-Produkt wurde gereinigt (QIAquick PCR Purification Kit). Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung der BamHI- und der EcoRI-Restriktionsstelle in den Vektor pBluescript II (KS(+/–) geklont. Das resultierende Produkt wurde zur Transformation von E.- coli-Top10 F'-Zellen verwendet, mehrere Klone wurden aufgenommen und amplifiziert. Die Konstrukte wurden durch eine vollständige Sequenzierung verifiziert und in E.- coli-Top 10 F'-Zellen amplifiziert, gereinigt (QIAquick PCR Purification Kit) und dann mit BamHI linearisiert. Die linearisierte Sonde wurde zur in-vitro-Transcription von RNA (Promega, Riboprobe System-T3/T7 Kit) unter Verwendung von T3-RNA-Polymerase verwendet. Das resultierende Produkt wurde einem DNAse-Aufschluss unterzogen und danach gereinigt (QIAGEN, RNeasy Mini Protocol for RNA Cleanup). Es wurde bestimmt, dass die RNA-Menge (Agilent 2001 Bioanalyzer) 901 ng/μl = 2,2 μM = 1,35·10¹² Kopien RNA/μl (Mittelwert von fünf unabhängigen Messungen) betrug. Die Molmasse der c-fos-RNA beträgt 401280 g/mol.
Herstellung von c-fos-Kontrolllysat
Eine 10-cm-Gewebekulturplatte (Greiner bio-one, Katalognr. 664160) wurde mit 3·10⁶ HepG2-Zellen in 10 ml DMEM-F12 (Gibco, Katalognr. 31331-028), ergänzt um 10 % FCS (Gibco, Katalognr. 10500-064), beimpft und bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. Nach 48 h wurde das Medium zu DMEM (Sigma, Katolognr. D 5921) gewechselt, das um 0,1 % steriles, filtriertes HSA (Sigma, Katalognr. A 1653) ergänzt war. Nach einer 24-stündigen Inkubation wurde das Medium zu DMEM gewechselt, das um 0,1 % HSA und 0,02 % DMSO ergänzt war. Kein PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) wurde zugegeben, so dass keine c-fos-Expression induziert wurde. Die Zellen wurden 1 h lang bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert. Dann wurde das Medium entfernt, und 5 ml Lysepuffer wurden zugegeben, es wurde 15 min lang bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert und dann durch wiederholtes Pipettieren gemischt. Dieses Kontrolllysat wurde bei –20 °C aufbewahrt.
Assayverfahren

Die in vitro hergestellte RNA wurde mit Kontrolllysat verdünnt, wodurch die 8 verschiedenen Anzahlen von Kopien/24 μl gemäß der Angaben in Tabelle 2 unten erhalten wurden. Eine Hybridisierungslösung wurde unter Verwendung der oben beschriebenen CO-, DO- und UO-Mischlösungen hergestellt. Zweckmäßige Volumina wurden zum Lysepuffer gegeben, wodurch eine Endkonzentration von 7 nM jeweils von CO, DO und UO erhalten wurden. Weiterhin enthielt die Hybridisierungslösung 3,7·10³ SA-Kügelchen/ml. Tabelle 2: Anzahl der c-fos-RNA-Kopien/Vertiefung

Anzahl der Kopien/24 μl (= Anzahl der Kopien/-Vertiefung)	Endgültige RNA-Konzentration
1·10⁸	6.9 pM
1·10⁷	692 fM
5·10⁶	346 fM
2.5·10⁶	173 fM
1·10⁶	69 fM
5·10⁵	34.6 fM
2.5·10⁵	17.3 fM
1·10⁵	6.9 fM

Vier 24-μl-Aliquote einer jeden RNA-Verdünnung wurden jeweils in die Vertiefungen einer wärmebeständigen Messplatte mit Glasboden (NanoCarrier^TM 96/30, Evotec Technologies) überführt. 4 zusätzliche Vertiefungen wurden mit 24 μl Kontrolllysat befüllt. Zu jeder Vertiefung wurde 1 μl Hybridisierungslösung gegeben, was zu einer Endkonzentration von 0,28 nM jeweils an DO, CO und UO führte. Die endgültige Anzahl an SA-Kügelchen pro Vertiefung betrug 3700. Die Messplatte wurde in einen Feuchtinkubator (Kendro, HERACELL 150/70 CO2 INKUBATOR VA 230V) gestellt und über Nacht (etwa 17 h lang) bei 53 °C inkubiert. Nach dieser ersten Hybridisierung wurde ein DO-Analyt-CO-Kügelchen-Komplex gebildet (siehe auch die schematische Zeichnung von 1).
Am nächsten Tag wurde eine Quenchlösung unter Verwendung der FQO-Gemisch-Lösung und der oben beschriebenen Vorratslösung von biotinyliertem rotem Oxazin-Farbstoff hergestellt. Zweckmäßige Volumina wurden zum Lysepuffer gegeben, wodurch eine Endkonzentration von 1,3 μM des biotinylierten roten Oxazin-Farbstoffs erhalten wurde. 1 μl der Quench-Lösung wurde zu jeder Vertiefung der Messplatte gegeben, was zu einer Endkonzentration von 2,8 nM für jedes FQO und 50 nM des biotinylierten roten Oxazin- Farbstoffs führte. Die Messplatte wurde nochmals in einen Feuchtinkubator gestellt und 1 h lang bei 35 °C inkubiert. Nach dieser zweiten Hybridisierung wurde die in 3 veranschaulichte Situation erreicht. Die Emission der freien (ungebundenen) Nachweis-Oligonucleotide wurde bei der Hybridisierung an die FRET-Quench-Oligonucleotide gequencht. Der biotinylierte rote Oxazin-Farbstoff diente zur Erzeugung einer Bezugsemission zum zuverlässigen Nachweis der Kügelchen. Dann wurde die Platte wie oben beschrieben vermessen.
Ergebnisse

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt und in 7 veranschaulicht. Die Anzahl der RNA-Kopien weist eine lineare Beziehung zur Intensität des Fluoreszenzsignals der Nachweis-Oligonucleotide auf, die über Analyt/Capture-Oligonucleotide über einen Bereich von drei Größenordnungen, nämlich zwischen 10⁵–10⁸ Kopien RNA/Vertiefung, an die Kügelchen gebunden sind. (Tatsächlich beträgt die Obergrenze des linearen Bereichs 10⁹ Kopien RNA/Vertiefung, wobei die Daten in 7 nicht dargestellt sind; siehe 12). Die untere Nachweisgrenze ist für typische Anwendungen aber relevanter und liegt im Bereich von 5·10⁵ Kopien c-fos-RNA oder sogar darunter, die zuverlässig von der Kontrolle unterschieden werden können. Eine lineare Übereinstimmung der in 7 veranschaulichten Daten führte zur Gleichung y = 1,06·10⁶ × –3,444. Diese Kalibrierung wurde in Beispiel 1b zur Berechnung der Anzahl von mRNA-Kopien/Zelle verwendet. Tabelle 3: Ergebnisse der c-fos-RNA-Titration

	Mittlere Intensität des Fluoreszenzsignals/Kügelchen-Pixel
RNA-Kopien/Vertiefung	Vertiefung 1	Vertiefung 2	Vertiefung 3	Vertiefung 4	Mittelwert	Standardabweichung
1,0·10⁸	912,8	1271,2	1010,1	943,9	1034,5	162,9
1,0·10⁷	95,3	86,3	84,0	81,1	86,7	6,1
5,0·10⁶	36,2	47,0	35,5	47,1	41,5	6,5
2,5·10⁶	24,5	24,2	22,1	20,6	22,8	1,8
1,0·10⁶	8,6	10,2	7,5	11,8	9,5	1,9
5,0·10⁵	5,1	4,5	6,4	6,9	5,7	1,1
2,5·10⁵	3,4	3,1	2,7	3,0	3,1	0,3
1,25·10⁵	2,3	1,4	1,5	1,8	1–7,	0,4
Kontrolle ("1·10³")	2,1	1,7	0,5	0,5	1,2	0,8

Beispiel 1b) Expression von c-fos-mRNA in HepG2-Zellen
Neun 10-cm-Gewebekulturplatten (Greiner bio-one, Katalognr. 664160) in DMEM-F12 (Gibco, Katalognr. 31331-028), ergänzt um 10 % FCS (Gibco, Katalognr. 10500-064), wurden mit HepG2-Zellen mit einer Dichte von 2·10⁶ Zellen in 10 ml Medium/Platte (entspricht 2·10⁵ Zellen/ml) beimpft. Die Zellen wurden 48 h lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert. Dann wurde das Medium zu DMEM (Sigma, Katalognr. D 5921), das um 0,1 % sterilem, filtriertem HSA ergänzt war, geändert, und die Inkubation wurde 24 h lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ fortgesetzt. Dann wurden die Zellen mit PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat, Sigma, Katalognr. P1585) 1 h lang bei 37 °C und 5 % CO₂ inkubiert, um eine Expression von c-fos zu induzieren. 500 μl zweckmäßiger PMA-Verdünnungen in DMEM mit 0,1 % HSA wurden zugegeben, wobei die Endkonzentrationen aus Tabelle 4 unten hervorgehen. Tabelle 4: PMA-Konzentrationen

Plattennummer PMA-Konzentration

1 0 nM (Kontrolle)

2 0 nM, 0,1 % DMSO (DMSO-Kontrolle)

3 0,5 nM

4 1 nM

5 10 nM

6 100 nM

7 500 nM

8 1 μM
Eine Kontrollplatte wurde zur Zellzählung verwendet, wobei die endgültige Anzahl von Zellen 1,5·10⁷ Zellen/Platte betrug. Nach 1 h wurde die Stimulationsmischung entfernt, und die Zellen wurden durch die Zugabe von 5 ml Lysepuffer/Platte lysiert, was zu einer Zellenzahl von 3·10⁶ Zellen/ml führte. Sofort nach der Zugabe des Lysepuffers wurden die Platten auf Eis gelegt und nach 15 min 24 h lang bei –20 °C aufbewahrt.
Assayverfahren
Acht 24-μl-Aliquote (jeweils 7,2·10⁴ lysierten Zellen entsprechend) des Zelllysats einer jeden PMA-Konzentration wurden jeweils in die Vertiefungen einer wärmebeständigen Platte mit Glasboden (Nanocarrier TM 384/30, Evotec Technologies) gegeben. Eine Hybridisierungslösung wurde hergestellt, bei der die oben beschriebenen CO-, DO- und UO-Mischlösungen verwendet wurden. Zweckmäßige Volumina wurden zum Lysepuffer gegeben, wodurch eine Endkonzentration von 7 nM jeweils von CO, DO und UO erhalten wurden. Weiterhin enthielt die Hybridisierungslösung 3,7·10³ SA-Kügelchen/ml.
Zu jeder Vertiefung wurde 1 μl Hybridisierungslösung gegeben, was zu einer Endkonzentration von 0,28 nM jeweils von DO, CO und UO führte. Die endgültige Anzahl von SA-Kügelchen pro Vertiefung betrug 3700. Die Messplatte wurde in einen Feuchtinkubator (Kendro, HERACELL 150/70 CO2 INKUBATOR VA 230V) gelegt und über Nacht (etwa 17 h lang) bei 53 °C inkubiert.
Am nächsten Tag wurde eine Quenchlösung hergestellt, wobei die FQO-Mischlösung und die oben beschriebene Vorratslösung des biotinylierten roten Oxazin-Farbstoffs verwendet wurden. Zweckmäßige Volumina wurden zum Lysepuffer gegeben, wodurch eine Endkonzentration von 72,8 nM für jedes FQO und eine Endkonzentration von 1,3 μM des biotinylierten roten Oxazin-Farbstoffs erhalten wurden. 1 μl der Quenchlösung wurden zu jeder Vertiefung der Messplatte gegeben, was in einer Endkonzentration von 2,8 nM für jedes FQO und 50 nM des biotinylierten roten Oxazin-Farbstoffs resultierte. Die Messplatte wurde wiederum in einen Feuchtinkubator gelegt und 1 h lang bei 35 °C inkubiert. Dann wurde die Platte wie oben beschrieben gemessen.
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgeführt und in 8 veranschaulicht.
Mit steigender PMA-Konzentration (die zur Stimulierung der Expression von c-fos-mRNA verwendet wurde) kann eine Erhöhung der mittleren Fluoreszenzintensität/Kügelchen-Pixel, der von dem an Kügelchen gebundenen Nachweis-Oligonucleotid-mRNA-Analyt-Capture-Oligonucleotid-Komplex stammt, beobachtet werden. Somit induzierte PMA eine starke Erhöhung der Expression von c-fos mit einer EC₅₀ von 484 nM. Dies liegt in derselben Größenordnung wie die EC₅₀, die aus veröffentlichten Ergebnissen bestimmt werden kann (Northern Blot) (J. Arts, J. Grimbergen, P. J. Bosma, H. J. Rahmsdorf und T. Kooistra (1996). Role of c-Jun and proximal phorbol 12-myristate-13-acetate-(PMA-) responsive elements in the regulation of basal and PMA-stimulated plasminogen-activator inhibitor-1 gene expression in HepG2. Eur. J. Biochem. 241, 393–402). Die z'-Werte (J. H. Zhang, T. D. Chung, K. R. Oldenburg: A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol Screen 1999; 4: 67–73) sind bis zu 100 nM PMA positiv, wodurch eine zuverlässige Unterscheidung zwischen der Kontrolle und der stimulierten Probe bis zu einer Konzentration von nur 100 nM PMA beim Screening mit hohem Durchsatz (HTS) möglich ist.

Unter Verwendung der Kalibrierung von Beispiel 1a ist die gemessene Intensität der Fluoreszenz bei 100 nM PMA gleich einer Kopienzahl von 3,03·10⁶ Kopien mRNA/Vertiefung (entsprechend 24 μl Lysat). Wenn berücksichtigt wird, dass 24 μl Lysat 7,2·10⁴ lysierte Zellen (siehe oben) enthielten (siehe oben), wurde auf eine mittlere Expressionsgeschwindigkeit von 42 Kopien mRNA/Zelle geschlossen. Tabelle 5: Ergebnisse der Expression von c-fos-mRNA in HepG2-Zellen

PMA-Konzentration [nM]	Mittelwert	Standard	CV %	z'
PMA-Konzentration [nM]	mittlere Intensität des Fluoreszenzsignals/Kügelchen-Pixel		CV %	z'
0 (Kontrolle)	2,15	1,31	60,68
0 (Kontrolle DMSO)	1,09	0,51	47,17
0,5	1,51	0,97	64,14	–9,58
1	1,53	0,63	41,05	–6,75
10	4,84	1,74	35,97	–0,80
100	14,29	2,46	17,24	0,32
500	24,44	6,48	26,52	0,10
1000	30,03	5,97	19,89	0,33

Beispiel 2: Expression von cyp1A1-mRNA in HepG2-Zellen
Herstellung von Oligonucleotiden (DO, CO und FQO)
Ein Satz von 20 Nachweis-Oligonucleotiden (DO) und 8 Capture-Oligonucleotiden (CO) wurde ausgewählt. Die DO waren am 5'-Terminus mit Rhodamin-6G markiert. Das CO umfasste eine Nucleotidsequenz, die zu einer Sequenz des Analyten komplementär war, einen T15-Linker am 5'-Terminus und Biotin. Die Oligonucleotide waren zu Teilen der Nucleotidsequenz von cap1A1-mRNA komplementär, hatten eine minimale Schmelztemperatur Tm von 63 °C (mit Ausnahme der beiden unmarkierten Oligonucleotide mit einer Tm von 55 °C), wobei die Länge zwischen 18–25 nt (mit Ausnahme eines UO mit weniger als 18 nt) in Abhängigkeit vom GC-Gehalt variierte. Sie deckten einen 686 nt langen Teil der cyp1A1-mRNA (Gesamtlänge 1539 nt) zwischen den Nukleotiden 405 und 1091 ohne dazwischenliegende Zwischenräume ab. Diese Region wurde ausgewählt, um Regionen mit einer hohen Homologie für cyp3A4 (z.B. nt 325–363) zu vermeiden. Eine kurze homologe Region konnte nicht vermieden werden und wurde daher von einem unmarkierten Oligonucleotid abgedeckt (siehe unten).
Das DO und das CO wurden so ausgewählt, dass sie nicht komplementär zueinander waren (wenn das DO und das CO komplementär zueinander wären, würde dies aufgrund ihrer direkten Bindung am CO zu einer unspezifischen Bindung von DO an den Kügelchen führen). 3 Oligonucleotide hatten einen zu hohen Grad an Komplementarität zu anderen und wurden nicht markiert. Diese unmarkierten Oligonucleotide (UO) wurden dennoch hergestellt und zur Hybridisierungslösung gegeben, um zu gewährleisten, dass der betreffende Teil der cyp1A1-mRNA vollständig bedeckt war und somit in einer doppelsträngigen, stabileren Konformation vorlag. Ein viertes unmarkiertes Oligonucleotid (31 C1-UO) wurde hergestellt, um eine Region mit einem hohen Grad an Homologie zu cyp3A4 abzudecken.
Die CO wurden so ausgewählt, dass sie in relativ gleichmäßigen Abständen zwischen den DO vorlagen. Weiterhin wurde jedes DO so ausgewählt, dass es das Nucleotid A, C oder T am 5'-Terminus hatte, weil G ein bekannter Quencher der Fluoreszenz von Rhodamin-6G ist.
Darüber hinaus wurde ein Satz von 20 FRET-Quench-Oligonucleotiden (FQO) hergestellt. Diese waren zum 5'-terminalen Teil des DO komplementär, aber nur 15 nt lang, was zu einer niedrigeren minimalen Schmelztemperatur Tm von 38 °C führte. Sie waren mit einem roten Oxazin-Farbstoff am 3'-Terminus markiert. Alle Oligonucleotide wurden nach Standardverfahren synthetisiert.
Vorratslösungen von Oligonucleotiden wurden in TE-Puffer (mit DEPC behandeltes Wasser mit 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 8,0) mit einer Konzentration von 100 μM hergestellt und bei –80 °C gefroren. DO-, CO-, UO- und FQO-Mischungen wurden mit einer Konzentration von 100 μM hergestellt (indem gleiche Mengen einer jeden Oligonucleotid-Lösung zugegeben wurden). Die Konzentration eines jeden einzelnen Oligonucleotids in diesen Mischungen betrug 5 μM für die DG-Mischung und die FQO-Mischung, 12,5 μM für die CO-Mischung und 25 μM für die UO-Mischung.

In der folgenden Tabelle 6 ist eine vollständige Liste aller zum Nachweis des cap1A1-mRNA-Analyten verwendeten Oligonucleotide aufgeführt. Die unten für das CO, DO und UO aufgeführte Position bezieht sich auf eine Position an einem Strang, der komplementär zum mRNA-Analyten ist. Tabelle 6: Liste aller zum Nachweis von cyp1A1-mRNA verwendeten Oligonucleotide

Position	Bezeichnung	Sequenz
8 CO (Capture-Oligonucleotide), umfassend einen Linker aus 15 T-Nucleotiden (T15) und am 5'-Terminus gebundenes Biotin
505–525	1 Cy1-CO	Biotin-5'-T15-ctgcaacgtgcttatcaggac-3'
526–544	2 Cy1-CO	Biotin-5'-T15-caggccctgccatcagctc-3'

633–656	3 Cy1-CO	Biotin-5'-T15-ttgactaggctaagcagttcttgg-3'
657–679	4 Cy1-CO	Biotin-5'-T15-cctccccgaaattattattcagg-3'
745–766	5 Cy1-CO	Biotin-5'-T15-cattcaggtccttgaaggcatt-3'
767–791	6 Cy1-CO	Biotin-5'-T15-ttctgcatgaagctgtagaacttct-3'
987–1008	7 Cy1-CO	Biotin-5'-T15-gttcatcaccaaatacatgagg-3'
1033–1055	8 Cy1-CO	Biotin-5'-T15-ccaatcactgtgtctagctcctc-3'
20 DO (Nachweis-Oligos), 5'-markiert mit Rhodamin-6G (Rh6G)
405–422	9 Cy1-DO	Rh6G-5'-ccattctgggccaggcgc-3'
423–445	10 Cy1-DO	Rh6G-5'-aggcaatggagaaacttttcagg-3'
446–463	11 Cy1-DO	Rh6G-5'-ttgaggaggctgggtcag-3'
464–485	12 Cy1-DO	Rh6G-5'-tgctcttccaggtagcaggagg-3'
570–592	13 Cy1-DO	Rh6G-5'-tgacattggtcactgataccacc-3'
593–611	14 Cy1-DO	Rh6G-5'-ccaaagcaaatggcacaga-3'
612–632	15 Cy1-DO	Rh6G-5'-tggttgtggtcatagcgccgg-3'
680–699	16 Cy1-DO	Rh6G-5'-tgggtttccagagccaacca-3'
700–722	17 Cy1-DO	Rh6G-5'-cgaagaatagggatgaactcagc-3'

723–744	18 Cy1-DO	Rh6G-5'-cagggaagggttgggtaggtag-3'
792–814	19 Cy1-DO	Rh6G-5'-ttttgtagtgctccttgaccatc-3'
815–833	20 Cy1-DO	Rh6G-5'-atgtggcccttctcaaagg-3'
834–856	21 Cy1-DO	Rh6G-5'-tcaggctgtctgtgatgtcccgg-3'
857–878	22 Cy1-DO	Rh6G-5'-tgcttctcctgacagtgctcaa-3'
879–898	23 Cy1-DO	Rh6G-5'-cattggcgttctcatccagc-3'
899–922	24 Cy1-DO	Rh6G-5'-tgatcttctcatctgacagctgga-3'
923–946	25 Cy1-DO	Rh6G-5'-caaagaggtccaagacgatgttaa-3'
947–967	26 Cy1-DO	Rh6G-5'-tgactgtgtcaaacccagctc-3'
1009–1032	27 Cy1-DO	Rh6G-5'-ttggatctttctctgtaccctggg-3'
1070–1091	28 Cy1-DO	Rh6G-5'-tgggatctgtcagagagccggg-3'
4 UO (unmarkierte Oligonucleotide)
486–504	29 Cy1-UO	5'-ctcagcctccttgctcaca-3'
545–569	30 Cy1-UO	5'-acatacctgtaggggttaaagtgcc-3'
968–986	31 Cy1-UO	5'-ctccaggagatagcagttg-3'
1056–1069	32 Cy1-UO	5'-gccgccgtgacctg-3'
20 FQO (FRET-Quench-Oligos) 3'-markiert mit rotem Oxazin-Farbstoff (RO)
9 Cy1-DO	9 Cy1-FQO	5'-cct ggc cca gaa tgg-3'-RO

10 Cy1-DO	10 Cy1-FQO	5'-gtt tct cca ttg cct-3'-RO
11 Cy1-DO	11 Cy1-FQO	5'-acc cag cct cct caa-3'-RO
12 Cy1-DO	12 Cy1-FQO	5'-cta cct gga aga gca-3'-RO
13 Cy1-DO	13 Cy1-FQO	5'-cag tga cca atg tca-3'-RO
14 Cy1-DO	14 Cy1-FQO	5'-tgc cat ttg ctt tgg-3'-RO
15 Cy1-DO	15 Cy1-FQO	5'-cta tga cca caa cca-3'-RO
16 Cy1-DO	16 Cy1-FQO	5'-ggc tct gga aac cca-3'-RO
17 Cy1-DO	17 Cy1-FQO	5'-cat ccc tat tct tcg-3'-RO
18 Cy1-DO	18 Cy1-FQO	5'-ccc aac cct tcc ctg-3'-RO
19 Cy1-DO	19 Cy1-FQO	5'-agg agc act aca aaa-3'-RO
20 Cy1-DO	20 Cy1-FQO	5'-tga gaa ggg cca cat-3'-RO
21 Cy1-DO	21 Cy1-FQO	5'-tca cag aca gcc tga-3'-RO
22 Cy1-DO	22 Cy1-FQO	5'-ctg tca gga gaa gca-3'-RO
23 Cy1-DO	23 Cy1-FQO	5'-atg aga acg cca atg-3'-RO
24 Cy1-DO	24 Cy1-FQO	5'-cag atg aga aga tca-3'-RO
25 Cy1-DO	25 Cy1-FQO	5'-tct tgg acc tct ttg-3'-RO
26 Cy1-DO	26 Cy1-FQO	5'-ggt ttg aca cag tca-3'-RO
27 Cy1-DO	27 Cy1-FQO	5'-cag aga aag atc caa-3'-RO
28 Cy1-DO	28 Cy1-FQO	5'-ctc tga cag atc cca-3'-RO

Expression von cyp1A1-mRNA in HepG2-Zellen
Für das Experiment wurden drei 384-Titerplatten (Greiner, Katalognummer 781091) mit Zellen mit 1·10⁴ Zellen/50 μl pro Vertiefung in DMEM-F12 beimpft, das um 10 % FCS ergänzt war. Nach einer Inkubation von 24 h bei 37 °C und 5 % CO₂ wurden 10 μl 3-Methylcholanthren (3-MC) in verschiedenen Konzentrationen zugegeben, wodurch die Expression von cyp1A1 24 h lang bei 37 °C und 5 % CO₂ stimuliert wurde. Die endgültigen 3-MC-Konzentrationen betrugen 0 μM (Kontrolle), 0 μM + 0,02 % DMSO (DMSO-Kontrolle), 0,1 μM, 0,3 μM, 0,7 μM, 1 μM, 1,3 μM, 1,7 μM, 2 μM, 2,5 μM, 3 μM und 3,5 μM. Auf jeder Platte war jede Konzentration 32 Mal vorhanden.
Eine 3-MC-Vorratslösung wurde mit DMSO hergestellt und mit DMEM-F12 + 10 % FCS verdünnt, wobei die endgültige DMSO-Konzentration in den Vertiefungen nie 0,02 % überstieg. Nach 24 h wurde die Stimulationsmischung entfernt, 50 μl Lysepuffer wurden zu jeder Vertiefung gegeben, und eine Inkubation erfolgte 15 min lang bei 37 °C, 5 % CO₂. Dann wurde die Platte 3 Tage lang bei –20 °C gefroren, bis das Assayverfahren durchgeführt wurde.
Assayverfahren
24 μl des Zelllysats von jeder Vertiefung der Zellkulturplatten wurde in eine Vertiefung einer der drei Messplatten mit Glasboden (Nanocarrier^TM 384/30, Evotec Technologies) überführt. Eine Hybridisierungslösung wurde hergestellt, wobei die oben beschriebenen CO-, DO- und UO-Mischlösungen verwendet wurden. Zweckmäßige Volumina wurden zum Lysepuffer gegeben, wodurch eine endgültige Konzentration von 7 nM jeweils an CO, DO und UO erhalten wurde. Weiterhin enthielt die Hybridisierungslösung 3,7·10³ SA-Kügelchen/ml.
Zu jeder Vertiefung wurde 1 μl Hybridisierungslösung gegeben, was in einer Endkonzentration von 0,28 nM jeweils für das DO, CO und UO resultierte. Die endgültige Anzahl von SA-Kügelchen pro Vertiefung betrug 3700. Die Messplatte wurde in einen Feuchtinkubator gelegt und über Nacht (etwa 17 h lang) bei 53 °C inkubiert.
Am nächsten Tag wurde eine Quenchlösung hergestellt, wobei die FQO-Mischlösung und die Vorratslösung des biotinylierten roten Oxazin-Farbstoffs verwendet wurden, die oben beschrieben sind. Zweckmäßige Volumina wurden zum Lysepuffer gegeben, um eine Endkonzentration von 72,8 nM eines jeden FQO und eine Endkonzentration von 1,3 μM des biotinylierten roten Oxazin-Farbstoffs zu erhalten. 1 μl der Quenchlösung wurde in jede Vertiefung der Messplatte gegeben, was zu einer Endkonzentration von 2,8 nM für jedes FQO und 50 nM des biotinylierten roten Oxazin-Farbstoffs führte. Die Messplatte wurde wieder in einen Feuchtinkubator gelegt und 1 h lang bei 35 °C inkubiert. Dann wurde die Platte wie oben beschrieben gemessen.
Ergebnis
Das Ergebnis ist in 9 veranschaulicht. Mit steigender 3-MC-Konzentration (die zur Stimulierung der Expression von cyp1A1-mRNA verwendet wurde) kann eine Erhöhung der mittleren Fluoreszenzintensität/Kügelchen-Pixel, die von dem an Kügelchen gebundenen Nachweis-Oligonucleotid-mRNA-Analyten-Capture-Oligonucleotid-Komplex beobachtet werden. Die für jede Platte bestimmte EC₅₀ betrug 0,8 μM mit einer Standardabweichung von 0,05 μM zwischen den drei Platten. Somit zeigen die Ergebnisse eine hervorragende Reproduzierbarkeit, obwohl die absoluten Werte der drei Platten sich unterscheiden. Dieses Ergebnis ähnelt veröffentlichten Ergebnissen (siehe z.B. C. Delescluse, N. Ledirac, G. de Sousa, M. Pralavorio, D. Botta-Fridlund, Y. Letreut und R. Rahmani (1997), Comparative Study of Cyp1A1 induction by 3-methylcholanthrene in varous human hepatic and epidermal cell types. Toxicology in Vitro 11, 443–450). Aus einem Norhern Blot in dieser Veröffentlichung kann eine EC₅₀ von ~0,5 μM grob bestimmt werden, was mit den vorliegenden Ergebnissen hervorragend übereinstimmt.
Beispiel 3: Einfluss der Verwendung der Bezugsemission des biotinylierten zweiten Farbstoffs auf die Assayempfindlichkeit
Dieses Beispiel basiert auf den Bildern, die gemäß Beispiel 1a erhalten wurden, und bezieht sich auf die 10 und 11. In einem ersten Fall wurde eine Bildanalyse durchgeführt, bei der die Emission des Reporters zum Markieren der Kügelchen (siehe die Bezugsbilder) verwendet wurde. In einem zweiten Fall wurde die Bildanalyse durchgeführt, ohne solche Bezugsbilder zu verwenden, und beruhte allein auf der Emission des Reporters, mit dem die Nachweis-Oligonucleotide markiert sind, die über den Analyt-CO-Komplex an die Kügelchen gebunden sind. Die Empfindlichkeit des Assays wird um wenigstens eine Größenordnung signifikant vermindert, wenn man nur die Emission des Reporters zur Markierung der Nachweis-Oligonucleotide nutzt, der über den Analyt-CO-Komplex an die Kügelchen gebunden ist (siehe 10). Eine Erkennung von Kügelchen unter Verwendung eines Reporters zur Markierung des Kügelchens (zweiter Reporter) ist vorteilhaft, weil sonst Kontaminationen der Probe oder ausreichend große DG-Aggregate fehlerhaft als ein vom ersten Reporter des Nachweis-Oligonucleotid-Analyt-Komplex stammendes Signal erkannt würden.
Beispiel 4: Einfluss der Zugabe von FQO auf die Assayempfindlichkeit
Assayverfahren

Dieser Assay wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 1a oben durchgeführt. Es wurden aber neun (statt 8) c-fos-RNA-Verdünnungen hergestellt, siehe Tabelle 7 unten. Weiterhin wurden acht (statt vier) 24-μl-Proben einer jeden Konzentration zu den Vertiefungen der Messplatte (Nanocarrier^TM 96/30, Evotec Technologies) gegeben. Im Gegensatz zu Beispiel 1a wurde nur zu vier Vertiefungen einer jeden Konzentration die übliche Quenchlösung (FQO und biotinylierten roten Oxazin-Farbstoff enthaltend) gegeben. Zu den anderen vier Vertiefungen wurde eine modifizierte Lösung ohne FQO, die nur den biotinylierten roten Oxazin-Farbstoff enthielt, gegeben. Tabelle 7: Anzahl der RNA-Kopien/Vertiefung c-fos

Anzahl der Kopien/24 μl (= Anzahl der Kopien/Vertiefung	Endgültige RNA-Konzentration
1·10⁹	69 pM
1·10⁸	6,9 pM
1·10⁷	692 fM
5·10⁶	346 fM
2,5·10⁵	173 fM
1·10⁶	69 fM
5·10⁵	34,6 fM
2,5·10⁵	17,3 fM
1·10⁵	6,9 fM

Ergebnis
Das spezielle Quenchen von freiem DO über die Hybridisierung von FQO an diese DO vermindert die Fluoreszenzintensität des Hintergrundes signifikant auf ~25 % der Werte ohne FQO: 116 Intensitätszählungen/Hintergrund-Pixel im Vergleich zu 444 Intensitätszählungen/Hintergrund-Pixel ohne FQO. Die von der vorliegenden Erfindung vorgeschlagene Strategie verbessert daher signifikant die Empfindlichkeit des Assays (im vorliegenden Beispiel um etwa eine Größenordnung). Dies wird in 12 sichtbar. Im Gegensatz zu der oben allgemein beschriebenen Bildanalyse wurde in der Nähe der Kügelchen die Intensität des Hintergrundsignals nicht bestimmt und von der pro Kügelchen-Pixel bestimmten Signalintensität subtrahiert. Dieses Verfahren wurde gewählt, um den Einfluss der Verwendung von FQO gemäß der vorliegenden Erfindung zu demonstrieren. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, umfassend die Schritte des • Bereitstellens von Nachweissonden, die mit einem ersten Reporter markiert sind, wobei die Nachweissonden dazu fähig sind, am Analyten zu binden, • Bereitstellens eines festen Trägers, • Bereitstellens von Capture-Sonden, die an den festen Träger gebunden oder dazu fähig sind, daran zu binden, wobei die Capture-Sonden dazu fähig sind, am Analyten zu binden, wodurch der Analyt auf dem festen Träger konzentriert wird, • In-Kontakt-Bringens der Probe mit den Nachweissonden, dem festen Träger und den Capture-Sonden, und • Nachweisens der Nachweissonden, wobei • der Nachweis der Nachweissonden in Gegenwart von Quenchsonden erfolgt, die an überflüssige, nicht an den Analyten gebundene Nachweissonden gebunden werden und dadurch wenigstens teilweise eine Emission des ersten Reporters der überschüssigen Nachweissonden quenchen, und/oder • der feste Träger mit einem zweiten, vom ersten Reporter verschiedenen Reporter markiert wird, ein Bild der Probe bei einer Emissionswellenlänge des zweiten Reporters erzeugt wird, eine Maske erzeugt wird, die durch die Erzeugung eines Bildes der Probe bei der Emissionswellenlänge des zweiten Reporters erhalten wird, und diese Maske auf ein Bild der Probe angewandt wird, das zum Nachweis der Nachweissonden verwendet wird.
Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Probe, umfassend die Schritte des: • Bereitstellens von Nachweis-Oligonucleotiden, die mit einem ersten Reporter markiert sind, wobei die Nachweis-Oligonucleotide dazu fähig sind, am Analyten zu binden, • Bereitstellens eines festen Trägers, • Bereitstellens von Capture-Oligonucleotiden, die an den festen Träger gebunden oder dazu fähig sind, daran zu binden, wobei die Capture-Oligonucleotide dazu fähig sind, am Analyten zu binden, wodurch der Analyt auf dem festen Träger konzentriert wird, • In-Kontakt-Bringens der Probe mit den Nachweis-Oligonucleotiden, dem festen Träger und den Capture-Oligonucleotiden, und • Nachweisens der Nachweis-Oligonucleotide, wobei • der Nachweis der Nachweis-Oligonucleotide in Gegenwart von Quench-Oligonucleotiden erfolgt, die mit überflüssigen, nicht an den Analyten gebundenen Nachweis-Oligonucleotiden hybridisieren und dadurch wenigstens teilweise eine Emission des ersten Reporters der überschüssigen Nachweis-Oligonucleotide quenchen, und/oder der feste Träger mit einem zweiten, vom ersten Reporter verschiedenen Reporter markiert wird, ein Bild der Probe bei einer Emissionswellenlänge des zweiten Reporters erzeugt wird, eine Maske erzeugt wird, die durch die Erzeugung eines Bildes der Probe bei der Emissionswellenlänge des zweiten Reporters erhalten wird, und diese Maske auf ein Bild der Probe angewandt wird, das zum Nachweis der Nachweis-Oligonucleotide verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das in einem homogenen Format durchgeführt wird.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der erste und/oder zweite Reporter lumineszierend, insbesondere fluoreszierend ist.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der erste und/oder zweite Reporter ein Farbstoff ist.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Nachweissonden, insbesondere die Nachweis-Oligonucleotide, mit einem ersten Fluoreszenzfarbstoff markiert sind und/oder der feste Träger mit einem zweiten Fluoreszenzfarbstoff markiert ist.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei ein Hybrid zwischen Nachweis-Oligonucleotiden und einem Analyten eine höhere Schmelztemperatur als ein Hybrid zwischen Nachweis-Oligonucleotiden und Quench-Oligonucleotiden hat.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei unter Testbedingungen die Schmelztemperatur eines Hybrids zwischen den Nachweis-Oligonucleotiden und dem Analyten wenigstens 1 °C, noch mehr bevorzugt wenigstens 2 °C, sogar noch mehr bevorzugt wenigstens 5 °C und am meisten bevorzugt wenigstens 10 °C höher als die Schmelztemperatur eines Hybrids zwischen Nachweis-Oligonucleotiden und Quench-Oligonucleotiden ist.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 2 bis 8, wobei das In-Kontakt-Bringen der Probe mit den Nachweis-Oligonucleotiden unter ersten Hybridisierungsbedingungen erfolgt, die die Bildung eines stabilen Hybrids zwischen den Nachweis-Oligonucleotiden und dem Analyten ermöglichen.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei das In-Kontakt-Bringen der Probe mit den Nachweis-Oligonucleotiden unter zweiten Hybridisierungsbedingungen erfolgt, die die Bildung eines stabilen Hybrids zwischen überschüssigen, nicht an den Analyten gebundenen Oligonucleotiden und Quench-Oligonucleotiden ermöglicht.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die zweiten Hybridisierungsbedingungen ein zwischen Nachweis-Oligonucleotiden und dem Analyten unter den ersten Hybridisierungsbedingungen gebildetes Hybrid nicht destabilisieren.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Capture-Sonden, insbesondere die Capture-Oligonucleotide, an den festen Träger kovalent gebunden sind.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Capture-Sonden, insbesondere die Capture-Oligonucleotide, dazu fähig sind, über eine Affinitäts-Wechselwirkung am festen Träger zu binden.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Capture-Sonden/Capture-Oligonucleotide eine erste Affinitätseinheit umfassen, die dazu fähig, an einer zweiten, am festen Träger gebundenen Affinitätseinheit zu binden.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die erste Affinitätseinheit Biotin und die zweite Affinitätseinheit Streptavidin oder Avidin ist.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei der feste Träger eine Kugel, eine Zelle, ein Pollen oder eine Mehrzahl davon ist.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der erste Reporter zur Markierung der Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide sich hinsichtlich seiner Anregungswellenlänge und/oder seiner Emissionswellenlänge vom zweiten, den festen Träger markierenden Reporter unterscheidet.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Differenz bei der Anregungswellenlänge und/oder Emissionswellenlänge zwischen dem ersten und dem zweiten Reporter wenigstens 10 nm, vorzugsweise wenigstens 20 nm, noch mehr bevorzugt wenigstens 50 nm und am meisten bevorzugt wenigstens 100 nm beträgt.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 2 bis 17, wobei die Nachweis-Oligonucleotide eine Linkersequenz umfassen, die die Sequenz des Nachweis-Oligonucleotids komplementär zum Analyten mit dem ersten Reporter bindet.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 2 bis 19, wobei die Capture-Oligonucleotide eine Linkersequenz umfassen, die die Sequenz des Capture-Oligonucleotids komplementär zum Analyten mit der Affinitätseinheit oder dem festen Träger binden.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei wenigstens zwei verschiedene Analyten nachgewiesen werden, indem wenigstens zwei verschiedene Sätze von Nachweissonden/Nachweis- Oligonucleotiden und wenigstens zwei verschiedene Sätze von Capture-Sonden/Capture-Oligonucleotiden bereitgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die verschiedenen Sätze von Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotiden mit verschiedenen Reportern markiert werden.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Reporter des einen Satzes identisch sind, dieselbe Anregungswellenlänge und/oder dieselbe Emissionswellenlänge haben.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei das bei der Emissionswellenlänge des zweiten Reporters aufgezeichnete Bild gleichzeitig mit dem Bild aufgezeichnet wird, das zum Nachweis der Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das bei der Emissionswellenlänge des zweiten Reporters aufgezeichnete Bild so korrigiert wird, dass es mit dem Bild, das zum Nachweis der Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide verwendet wird, räumlich übereinstimmt, oder umgekehrt.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 25, wobei die Quenchsonden/Quench-Oligonucleotide eine Quencheinheit haben, wobei die Quencheinheit vorzugsweise ein Farbstoff ist.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei der erste Reporter ein Donor eines Förster-Resonanzenergieübertragungs-(FRET-)Donor-Akzeptor-Paars ist und die Quencheinheit ein Akzeptor des Donor-Akzeptor-Paars ist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Quencheinheit ein Dark Quencher ist, der die Emission des ersten Reporters wenigstens teilwei se quencht, indem er Energie eines angeregten Zustandes des ersten Reporters in die Umgebung dissipiert.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 28, umfassend den Schritt der Quantifizierung des Analyten.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei die Quantifizierung durchgeführt wird, indem die Menge der an den Analyten gebundenen Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Menge der an den Analyten gebundenen Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide als die vom ersten Reporter emittierte Emissionsintensität ausgedrückt wird.
Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, umfassend den Schritt einer Bestimmung einer Intensität einer Hintergrundemission in der Nähe des festen Trägers und der Berücksichtigung dieser Intensität bei der Bestimmung der Menge der Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide.
Verfahren nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 32, wobei das Bild der Probe, das zum Nachweis der Nachweissonden/Nachweis-Oligonucleotide verwendet wird, bei der Emissionswellenlänge des ersten Reporters erfasst wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nachweissonden Aptamere, Oligonucleotide oder Antikörper sind.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Analyt ein Protein oder eine Nucleinsäure ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe ein Zelllysat, insbesondere ein rohes Zelllysat oder eine in vitro hergestellte Probe ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Capture-Sonden/Capture-Oligonucleotide von verschiedenen Sätzen an verschiedene feste Träger gebunden werden oder zur Bindung befähigt sind.
Verfahren nach Anspruch 37, wobei die festen Träger sich hinsichtlich der daran gebundenen Affinitätseinheiten unterscheiden, wobei die Affinitätseinheiten mit Affinitätseinheiten der Capture-Sonden/Capture-Oligonucleotide in Wechselwirkung treten.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die Zugabe eines potenziellen pharmazeutisch aktiven Wirkstoffs oder eines bekannten Medikaments zu einer zellulären Probe und die Analyse, ob ein solcher Stoff die Erzeugung des Analyten induziert, hemmt oder anders moduliert.
Verwendung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche zum Screenen auf potenzielle pharmazeutisch aktive Wirkstoffe, bei der Diagnose oder bei der Bestimmung möglicher Nebenwirkungen von Medikamenten.