DE60116124T2

DE60116124T2 - Elektrochemilumineszenz von acridanzusammensetzungen

Info

Publication number: DE60116124T2
Application number: DE60116124T
Authority: DE
Inventors: Hashem Akhavan-Tafti; Robert Wilson; Jorge David SCHIFFRIN
Original assignee: Lumigen Inc
Current assignee: Lumigen Inc
Priority date: 2000-06-26
Filing date: 2001-06-26
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2021-06-27
Also published as: EP1322670B1; AU1561002A; AU2002215610B2; WO2002000726A1; EP1322670A1; ATE313563T1; JP2004502148A; EP1322670A4; JP4733334B2; DE60116124D1

Description

Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der US-Provisional-Anmeldung Nr. 60/214,178, die am 26. Juni 2000 angemeldet worden ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Elektrochemilumineszenz, wobei es sich um die Erzeugung einer Lumineszenz durch eine elektrochemische Reaktion handelt. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Erzeugung von Elektrochemilumineszenz von Acridanverbindungen. Die vorliegende Elektrochemilumineszenz-Reaktion kann in Testverfahren zum Nachweisen von Analyten eingesetzt werden. Die Acridanverbindungen können mit einer Markierungsgruppe zum Verbinden mit einem Analyten oder einem Analyt-Bindungspartner versehen werden.
Eine Elektrochemilumineszenz (ECL) hat während des letzten Jahrzehnts insbesondere auf dem Gebiet der chemischen Analyse verbreitet Aufmerksamkeit erlangt. Sie kombiniert die bekannte Empfindlichkeit einer Chemilumineszenz (CL) mit der genauen Kontrolle bzw. Steuerung bezüglich der Zeit und der Position lichtemittierender Reaktionen, die durch die Elektrochemie bereitgestellt wird. Als alternativer Ansatz zur Durchführung von Immuntests und Nucleotidtests bietet sie Vorteile wie z.B. eine erhöhte Empfindlichkeit und Genauigkeit, eine Verminderung der Zeit und des Arbeitsaufwands und den Ausschluss von Radioisotopen. Um das volle Potenzial dieser Technologie auszuschöpfen, besteht ein Bedarf für neue chemilumineszierende Verbindungen, die elektrochemisch initiiert werden können. Es wird erstmals gezeigt, wie eine CL durch eine elektrochemische Oxidation von Acridanverbindungen ausgelöst werden kann.
Vor der vorliegenden Erfindung waren Rutheniumchelate und Luminolderivate die einzigen Verbindungen, die in einer signifikanten Anzahl analytischer Anwendungen verwendet wurden, bei denen eine ECL beteiligt war (J.K. Leland und M.J. Powell, J. Electrochem. Soc., 1990, 137, 3127; S. Sakura, Anal. Chim. Acta, 1992, 262, 49). Rutheniumchelate wurden für Enzymtests verwendet, jedoch bestand ihre signifikanteste Anwendung darin, dass sie als Marker für Immuntests und Nucleotidtests verwendet wurden. Bei diesen Anwendungen wurde eine Kombination aus einer ECL und einer Magnetkügelchentechnologie zunehmend in pharmazeutischen Labors für ein High Throughput-Screening verwendet. Luminol wurde ebenfalls für Enzymtests und Immuntests verwendet. Licht wird emittiert, wenn elektrochemisch oxidiertes Luminol mit Wasserstoffperoxid reagiert, was ermöglicht, dass die Reaktion mit Oxidaseenzymen, wie z.B. Glukoseoxidase, gekoppelt wird (R. Wilson und A.P.F. Turner, Biosensors, 1997, 12, 277). Die Chemilumineszenzreaktion von Luminol wird auch durch elektrochemisch oxidierte Ferrocene katalysiert (R. Wilson und D.J. Schiffrin, J. Electroanal. Chem., 1998, 448, 125), was nahe legt, dass diese Verbindungen als Marker in einem ECL-System verwendet werden könnten, das demjenigen ähnelt, das auf Rutheniumchelaten beruht.
Acridiniumester wurden 1964 entdeckt und anschließend als Marker für Immuntests und Nucleotidtests entwickelt. Der Chemilumineszenzreaktionsmechanismus dieser Verbindungen umfasst einen nukleophilen Angriff eines Peroxidanions (HOO-) in alkalischer Lösung auf die 9-Position des Acridiniumkerns und eine anschließende interne Cyclisierung, die zur Bildung eines metastabilen Dioxetanon-Zwischenprodukts führt. Dieses decarboxyliert spontan, wodurch der angeregte Singulettzustand von N-Methylacridon erhalten wird, der blaues Licht bei 430 nm emittiert, wenn er in den Grundzustand relaxiert. Die Chemilumineszenzquantenausbeute liegt typischerweise zwischen 1 und 10 %. Die Reaktion ist extrem schnell, jedoch können beim Fehlen von Peroxid andere Nukleophile, wie z.B. Hydroxidionen, mit der 9-Position des Acridiniumkerns ein Addukt (Pseudobase) bilden. Die Bildung dieses Zwischenprodukts schließt die Bildung eines Dioxetanon-Zwischenprodukts aus und daher wird kein Licht emittiert, so lange die Bildung der Pseudobase nicht durch eine saure Lösung von Wasserstoffperoxid rückgängig gemacht wird, bevor eine Natriumhydroxidlösung zugesetzt wird.
Es wurde eine elektrochemische Auslösung der Chemilumineszenzreaktion eines Acridiniumesters bei pH 5,0 in einem Versuch entwickelt, das herkömmliche Initiierungsverfahren zu vereinfachen (J.S. Littig und T.A. Neeman, Anal. Chem., 1992, 64, 1140–1144). Dieser pH-Wert ist für Immuntests und Nucleotidtests nicht besonders geeignet. Eine Lösung eines Acridiniumesters wurde in einen fließenden Strom eines Phosphatpuffers mit pH 12 injiziert und in eine Durchflusszelle gepumpt. Eine Chemilumineszenz wurde in der Zelle durch elektrochemisches Reduzieren von Sauerstoff ausgelöst. Die Bedingungen sind ein Kompromiss zwischen denjenigen, die für eine Chemilumineszenz und eine Sauerstoffreduktion erforderlich sind, und denjenigen, die zur Vermeidung der Bildung einer Pseudobase erforderlich sind. Es wäre auch erforderlich, die Konzentration an gelöstem Sauerstoff zu kontrollieren, um genaue Ergebnisse zu erhalten, wodurch die Einfachheit verloren geht, die durch das elektrochemische Initiieren der Chemilumineszenzreaktion erhalten wird. Diese Nachteile werden vermieden, wenn ein Acridanester verwendet wird, da der Acridiniumester in situ aus einer passiven Vorstufe erzeugt wird.
Kürzlich wurde eine große Anzahl von Acridanen (reduzierte Acridiniumester, -thioester und -amide) auf der Basis des N-Alkylacridancarboxylatkerns, einschließlich DMC, hergestellt (H. Akhavan-Tafti et al., J. Org. Chem. 1998, 63, 930–937; N. Akhavan-Tafti et al., Clin. Chem. 1995, 41, 1368–1369). Diese Acridanverbindungen sind in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid stabil und bilden keine inaktive Pseudobase. Eine Lichtemission kann durch enzymatisches Oxidieren des Acridans mit dem Enzym Meerrettichperoxidase (HRP) in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid und einem Verstärker, wie z.B. p-Iodphenol, ausgelöst werden. HRP oxidiert das Acridan zu dem entsprechenden Acridiniumester, der in den meisten Fällen einem sofortigen Angriff durch das Peroxidanion (HOO-) an der 9-Position des Acridiniumkerns ausgesetzt ist, wobei die Möglichkeit der Bildung einer Pseudobase nicht auftritt, da das Peroxid um mehrere Größenordnungen nukleophiler ist als Hydroxid. Ein nukleophiler Angriff auf den Acridiniumester führt zur Bildung eines Dioxetanons, das sich unter Bildung des angeregten Singulettzustands von N-Methylacridon zersetzt. Dieser wiederum relaxiert in den Grundzustand, was von der Emission von intensiv blauem Licht mit einer maximalen Wellenlänge von 430 nm begleitet ist. Durch die Verwendung dieser Verbindungen als Substrat für HRP war es möglich, eine so geringe Menge dieses Enzyms wie 0,1 amol in einem 15 min-Test nachzuweisen.
Bisherige Arbeiten bezüglich der Elektrochemie von Acridan, das an der 9-Position keine Carbonylgruppe aufweist, zeigten die Oxidation durch einen Mechanismus, bei dem der zweite Oxidationsschritt in Lösung als Ergebnis einer Disproportionierung zwischen protonierten und nicht-protonierten Radikal-Zwischenprodukten stattfindet (P. Hapiot, J. Moiroux und J.M. Saveant, J. Am. Chem. Soc., 1990, 112, 1337). Bei dieser Reaktion wurde keine Chemilumineszenz erzeugt.
Acridanverbindungen, die mit einer oxidierbaren exocyclischen Doppelbindung substituiert sind, sind in dem US-Patent 5,922,558 des Anmelders der vorliegenden Erfindung beschrieben. Diese Verbindungen werden durch ein Peroxidaseenzym enzymatisch oxidiert, so dass sichtbares Licht erzeugt wird. Das entgegengesetzte Ende der Doppelbindung trägt zwei Substituenten, wobei einer davon eine Gruppe des Ether- oder Thioether-Typs ist und der andere irgendeine von verschiedenen Gruppen ist, wie z.B. Gruppen des Ether- oder Thioethertyps, Alkoxy-, Aryloxy-, Alkylthio-, Arylthio-, Trialkylsilyloxy-, Phosphoryloxy-, Acyloxyund Acyl-thiogruppen. Verbindungen dieses Typs, die eine Phosphatsalzgruppe aufweisen, sind auch in dem US-Patent 6,045,727 des Anmelders der vorliegenden Erfindung beschrieben, worin deren enzymatische Reaktion mit Phosphataseenzymen zur Erzeugung einer Chemilumineszenz beschrieben ist.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Erzeugen von Chemilumineszenz durch eine elektrochemische Reaktion bereitzustellen. Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Erzeugen von Chemilumineszenz durch die elektrochemische Reaktion von Acridanverbindungen in der Gegenwart eines Peroxids, insbesondere von Wasserstoffperoxid, bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Durchführen eines Tests eines Analyten unter Verwendung einer Elektrochemilumineszenzreaktion zur Erzeugung von Licht zum Nachweisen des Analyten.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Elektrochemilumineszenzoxidation von Acridanderivaten. Es wurde gefunden, dass die elektrochemische Oxidation von Acridanverbindungen in der Gegenwart eines Peroxids bei neutralem bis alkalischem pH-Wert zur Erzeugung einer sichtbaren Lumineszenz oberhalb eines bestimmten minimalen Potenzials führt. Die Reaktion ist der kleinen Anzahl analytisch geeigneter Elektrolumineszenzreaktionen zuzurechnen und kann in Testverfahren zum Nachweisen von Analyten verwendet werden. Beispielsweise kann die Acridanverbindung mit einer Markierungsgruppe zum Verbinden mit einem Analyten oder einem Analytbindungspartner versehen werden.
Eine erste Gruppe von Acridanverbindungen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist, umfasst Acridancarbonsäurederivate der allgemeinen Formel:
worin R¹ bis R⁴ jedwede Gruppen von verschiedenen Gruppen sein können, mit der Maßgabe, dass sie die Erzeugung einer Chemilumineszenz nicht beeinträchtigen. Die Z-Gruppe ist O, S oder NR, worin R jedwede Gruppe von verschiedenen Gruppen sein kann, vorzugsweise jedoch eine Sulfonylgruppe ist.
Anders als bekannte Verfahren zum elektrochemischen Erzeugen von Lumineszenz unter Verwendung eines Acridiniumesters, wie es in der EP-A-522677 beschrieben ist, umfasst die Reaktion nicht die elektrochemische Erzeugung von H₂O₂ oder Superoxid. Die Acridanverbindungen, die in den vorliegenden Verfahren verwendet werden, sind signifikant stabiler als die entsprechenden Acridiniumverbindungen und sollten widerstandsfähigere Marker bereitstellen.
Die Elektrochemilumineszenz wird dadurch erzeugt, dass eine Lösung aus der Acridanverbindung und einem Peroxid einem positiven Potenzial oberhalb einer bestimmten Schwelle ausgesetzt wird. Der Schwellenwert wird einfach durch eine voltammetrische Abtastung oder durch Messen der Lumineszenz während des Durchfahrens einer Spannung bestimmt, wie es nachstehend beschrieben ist.
Eine zweite Gruppe von Acridanverbindungen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist, umfasst Verbindungen der allgemeinen Formel:
worin Z¹ und Z² unabhängig aus O-, S- und NR-Atomen ausgewählt sind, worin R jedwede Gruppe von verschiedenen Gruppen sein kann, jedoch vorzugsweise eine Sulfonylgruppe ist, und worin R¹ bis R⁴ und X jedwede Gruppen von verschiedenen Gruppen sein können, mit der Maßgabe, dass sie die Erzeugung einer Chemilumineszenz nicht beeinträchtigen.
1 zeigt eine laminare Durchflusszelle, die zum Elektrochemilumineszenznachweis von Acridanen verwendet wird.
2 zeigt zwei aufeinander folgende Cyclovoltammogramme von 50 μM DMC in 10 mM Tris-Puffer mit 0,1 M NaCl, 10 mM Wasserstoffperoxid und 0,025 % Tween-20. Abtastrate 100 mV/s, die erste Abtastung enthält die Peaks A und B; die zweite Abtastung enthält die Peaks A, B und C.
3 ist ein Graph, der die Abhängigkeit der Elektrochemilumineszenz vom Potenzial für 50 μM DMC bei pH 8,0 in 10 mM Tris-Puffer mit 0,1 M NaCl, 10 mM Wasserstoffperoxid, 1 mM EDTA und 0,025 % Tween-20 bei einer Abtastrate von 10 mV/s zeigt.
4. (A) Licht- und (B) Strom-Übergänge für eine Potenzialstufe von 0 bis 1 V für 5 nm DMC bei pH 8,0 in 10 mM Tris-Puffer mit 0,1 M NaCl, 10 mM Wasserstoffperoxid, 1 mM EDTA und 0,025 % Tween-20.
5. Abhängigkeit der Elektrochemilumineszenz von der Wasserstoffperoxidkonzentration für 10 nm DMC bei pH 8,0 in 10 mM Tris-Puffer mit 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA und 0,025 Tween-20. Fünf Messungen in Intervallen von 7 min wurden bei jeder Konzentration durch Integrieren der Lichtintensität für 30 s nach einer Potenzialstufe von 0 bis 1 V durchgeführt.
6. Abhängigkeit der Elektrochemilumineszenz vom pH-Wert für 10 nm DMC bei pH 8,0 in 10 mM Tris/AMP-Puffer mit 0,1 M NaCl, 10 mM Wasserstoffperoxid, 1 mM EDTA und 0,025 % Tween-20. Fünf Messungen in Intervallen von 7 min wurden bei jeder Konzentration durch Integrieren der Lichtintensität für 30 s nach einer Potenzialstufe von 0 bis 1 V durchgeführt.
7 zeigt zwei aufeinander folgende Cyclovoltammogramme von APS-2 in 1 mit Wasserstoffperoxid. Abtastrate 10 mV/s.
Nunmehr wurde erstmals gezeigt, dass die Chemilumineszenz (CL) bestimmter Acridanverbindungen durch eine elektrochemische Oxidation in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid ausgelöst werden kann. Dadurch, dass die Acridanverbindung an der Anode einer elektrochemischen Zelle, die eine Lösung der Acridanverbindung und ein Peroxid, wie z.B. H₂O₂, enthält, einem geeigneten Potenzial unterworfen wird, wird sichtbares Licht erzeugt, das für eine längere Zeit aufrechterhalten wird, wenn das Potenzial bei einem geeigneten Wert gehalten wird. Das Umkehren des Potenzials führt zu einer schnellen Auslöschung der Lichtemission. Das Verfahren kann schnell zyklusartig durchgeführt werden, so dass die Lichtemission reversibel ein- und ausgeschaltet wird, bis das Acridan oder das Peroxid erschöpft ist.
Eine Chemilumineszenz ist die Emission von Licht durch das elektronisch angeregte Produkt einer chemischen Reaktion, wenn es in den Grundzustand relaxiert. Die Effizienz einer Chemilumineszenzreaktion wird durch die Quantenausbeute (Φ_CL) angegeben, wobei es sich um ein Maß für den Bruchteil reagierender Moleküle handelt, die tatsächlich Licht erzeugen. Für analytische Chemiker besteht die Hauptattraktivität von CL in der Möglichkeit, empfindliche Tests über einen breiten Bereich von Konzentrationen unter Verwendung relativ kostengünstiger Geräte durchzuführen. In der Praxis wird die Chemilumineszenz üblicherweise mit einer komplementären Technik kombiniert, die der CL-Reaktion eine Spezifität verleiht. Das mit der größten Verbreitung verwendete Beispiel einer solchen Technik ist ein Immuntest, bei dem CL-Marker, wie z.B. Acridiniumester, verwendet werden, um Analyten in picomolaren Konzentrationen nachzuweisen. Durch die Entwicklung von CL-Verbindungen, die als Sub strate für die Enzymmarker verwendet werden können, kann die Geschwindigkeit von CL-Immuntests ohne Beeinträchtigung der Empfindlichkeit erhöht werden.
Eine Elektrochemilumineszenz (ECL) ist eine Form der CL, bei welcher der Chemilumineszenzreaktion eine elektrochemische Reaktion vorausgeht (G.M. Greenway, Trends Anal. Chem. 1990, 9, 200–203; A.W. Knight, G.M. Greenway, Analyst, 1994, 119, 879–890; A.W. Knight, Trac Trends Anal. Chem, 1999, 18, 47–62). Die Vorteile einer CL werden beibehalten und die Elektrochemie ermöglicht die Kontrolle bzw. Steuerung der Zeit und der Position der Lichtemissionsreaktion. Durch die Kontrolle der Zeit der Reaktion kann die Lichtemission verzögert werden, bis Ereignisse, wie z.B. eine Immunreaktion oder eine enzymkatalysierte Reaktion, stattgefunden haben. Obwohl eine entsprechende Kontrolle bezüglich alternativer Nachweisverfahren, wie z.B. Fluoreszenz, durchgeführt werden kann, sind die Geräte beträchtlich komplizierter und teurer. Die Kontrolle der Position kann genutzt werden, um die Lichtemission auf einen Bereich zu beschränken, der bezüglich des Detektors genau lokalisiert ist, wodurch die Empfindlichkeit durch Erhöhen des Signal-Rausch-Verhältnisses verbessert wird. Ein gutes Beispiel dafür ist die Kombination von ECL mit einer Magnetkügelchentechnologie, wodurch ein gebundener Marker von einem nicht-gebundenen Marker ohne Trennschritt unterschieden werden kann, wie es in D.R. Deaver, Nature, 1995, 377, 758–760, und G.F. Blackburn et al., Clin. Chem. 1991, 37, 1534–1539 beschrieben worden ist. Die Kontrolle der Position könnte auch zur Bestimmung der Ergebnisse von mehr als einer analytischen Reaktion in der gleichen Probe verwendet werden, und zwar durch Abfragen jeder Elektrode in einem Array, und zwar entweder aufeinander folgend oder gleichzeitig unter Verwendung eines positionsempfindlichen Detektors.
2',6'-Difluorphenyl-10-methylacridan-9-carboxylat (DMC) und 2',3',6'-Trifluorphenyl-10-methylacridan-9-carboxylat (PS-3) gehören zu einer Klasse von Acridancarbonsäurederivaten, die mit Peroxidaseenzymen in der Gegenwart eines Peroxids einer Chemilumineszenzreaktion unterliegen. Beispiele für Verbindungen sind in den US-Patenten 5,491,072, 5,523,212, 5,593,845, 5,670,644, 5,723,395 und 6,030,803 beschrieben. Diese Patente beschreiben Verfahren zur Herstellung geeigneter Acridanverbindungen. Eine erste Gruppe von Acridanverbindungen, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet ist, umfasst Acridancarbonsäurederivate der Formel:
wobei R¹ bis R⁴ unabhängig aus Wasserstoff und organischen Gruppen, welche von 1 bis 50 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, welche die Erzeugung einer Chemilumineszenz nicht beeinträchtigen, enthalten, ausgewählt sind, wobei mindestens eine der Gruppen R¹ bis R⁴ ein Markierungssubstituent der Formel -L-RG sein kann. L ist eine Verbindungsgruppe, die eine Bindung oder eine andere zweiwertige oder mehrwertige Gruppe sein kann, RG ist eine reaktive Gruppe, welche die Bindung der Chemilumineszenzmarkierungsverbindung an eine andere Verbindung ermöglicht, und Z ist aus O, S und NR⁵ ausgewählt, wobei R⁵ aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl-, Alkylsulfonyl- und Arylsulfonylgruppen ausgewählt ist. Repräsentative orgArylsche Gruppen für R¹ bis R⁴ umfassen ohne Beschränkung Alkyl, Aryl, Alkenyl, Alkinyl oder Aralkyl, von denen jede substituiert sein kann, Halogen, Hydroxy, Alkoxy, Amino, Alkylamino, Carbonyl-enthaltende Gruppen, wie z.B. Keto, Carboxy, Carboxamid und Carboalkoxy, Thio, Alkylthio, Cyano, Nitro, Trialkylsilyloxy, Alkylsulfonyl, Arylsulfonyl und positiv oder negativ geladene ionische Gruppen, welche die Wasserlöslichkeit verbessern. Der Acridanring kann mit 0 bis 8 Substituenten substituiert sein, die von Wasserstoff verschieden sind, wobei diese mit R² und R³ bezeichnet werden.
Die Verbindungsgruppe L kann eine Bindung, ein Atom oder eine gerade oder verzweigte Kette von Atomen sein, von denen einige Teil einer Ringstruktur sein können. Der Substituent enthält üblicherweise 1 bis etwa 50 Nicht-Wasserstoffatome, mehr bevorzugt 1 bis etwa 30 Nicht-Wasserstoffatome. Atome, welche die Kette umfasst, werden aus C-, O-, N-, S-, P-, Si-, B- und Se-Atomen, vorzugsweise aus C-, O-, N-, P- und S-Atomen ausgewählt. Halogenatome können als Substituenten an der Kette oder dem Ring vorliegen. Typische funktionelle Gruppen, die den Verbindungssubstituenten umfassen, umfassen Alkylen-, Arylen-, Alkenylen-, Ether-, Peroxid-, Carbonyl als Keton-, Ester-, Carbonatester-, Thioester- oder Amidgruppe, Amin-, Amidin-, Carbamat-, Harnstoff-, Imin-, Imid-, Imidat-, Carbodiimid-, Hydrazin-, Diazo-, Phosphodiester-, Phosphotriester-, Phosphonatester-, Thioether-, Disulfid-, Sulfoxid-, Sulfon-, Sulfonatester-, Sulfatester- und Thioharnstoffgruppen.
Die reaktive Gruppe RG ist ein Atom oder eine Gruppe, dessen bzw. deren Gegenwart die Bindung an ein anderes Molekül durch eine kovalente Bindung oder physikalische Kräfte erleichtert. In manchen Ausführungsformen wird die Bindung einer Chemilumineszenzmarkierungsverbindung der vorliegenden Erfindung an eine andere Verbindung den Verlust von einem oder mehreren Atom(en) von der reaktiven Gruppe umfassen, z.B. wenn die reaktive Gruppe eine Abgangsgruppe, wie z.B. ein Halogenatom oder eine Tosylatgruppe, ist, und die Chemilumineszenzmarkierungsverbindung durch eine nukleophile Substitutionsreaktion kovalent an eine andere Verbindung gebunden wird. In anderen Ausführungsformen wird die Bindung einer Chemilumineszenzmarkierungsverbindung an eine andere Verbindung durch die Bildung einer kovalenten Bindung die Umlagerung von Bindungen innerhalb der reaktiven Gruppe umfassen, wie es bei einer Additionsreaktion, wie z.B. einer Michael-Addition, stattfindet, oder wenn die reaktive Gruppe eine Isocyanat- oder Isothiocyanatgruppe ist. In weiteren Ausführungsformen wird die Bindung keine Bildung einer kovalenten Bindung umfassen, sondern vielmehr physikalische Kräfte, wobei in diesem Fall die reaktive Gruppe unverändert bleibt. Mit physikalischen Kräften sind Anziehungskräfte wie z.B. Wasserstoffbrückenbindungen, eine elektrostatische oder ionische Anziehung, eine hydrophobe Anziehung, wie z.B. eine Basenstapelung, und spezifische Affinitätswechselwirkungen, wie z.B. Biotin-Streptavidin, Antigen-Antikörper und Nucleotid-Nucleotid-Wechselwirkungen, gemeint.
Es wurde gefunden, dass zahlreiche Acridanverbindungen bei positiven Potenzialen (bezogen auf Ag/AgCl) in der Gegenwart eines Peroxids eine Elektrolumineszenz zeigen. Beispiele umfassen:
Eine zweite Gruppe von Acridanverbindungen, die in den vorliegenden Elektrochemilumineszenzverfahren geeignet ist, umfasst eine Gruppe von Acridanverbindungen, die eine exocyclische Doppelbindung an der 9-Position aufweisen und die Formel
haben, worin Z¹ und Z² unabhängig aus O, S und NR⁵ ausgewählt sind, R⁵ aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl-, Alkylsulfonyl- und Arylsulfonylgruppen ausgewählt ist, und wobei R¹ bis R⁴ die vorstehend angegebene Bedeutung haben. Die Gruppe X ist aus Wasserstoff und orgArylschen Gruppen ausgewählt, die 1 bis 50 Nicht-Wasserstoffatome, die aus C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, welche die Erzeugung einer Chemilumineszenz nicht beeinträchtigen, ausgewählt sind, enthalten, wobei es sich vorzugsweise um eine Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen handelt, von denen jedes substituiert sein kann, oder aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl- oder Arylcarbonylgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Tri(C_1- ₈-alkyl)silylgruppen, einer SO₃ ^–-Gruppe, Glycosylgruppen und Phosphorylgruppen der For mel PO(OR')(OR''), worin R' und R'' unabhängig aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl- und substituierten oder unsubstituierten Aralkylgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen ausgewählt sind, Trialkylsilylgruppen, Alkalimetallkationen, Erdalkalimetallkationen, Ammonium- und Phosphoniumkationen ausgewählt. Substituierte Alkylgruppen werden mindestens eine von einem Wasserstoffatom verschiedene Gruppe enthalten, wie z.B. ionische Gruppen oder polare Gruppen. Die Gruppe X kann gegebenenfalls eine Gruppe -L-RG umfassen, die vorstehend definiert worden ist.
Ein bevorzugter Satz von Verbindungen dieses Typs weist eine Phosphatgruppe als Gruppe Z²X² auf und wird durch die Formel
dargestellt, worin M ein Kation, vorzugsweise ein Alkalimetallion oder ein Ammonium-, quartäres Ammonium- oder quartäres Phosphoniumion ist. Eine weitere Gruppe von Verbindungen weist eine Estergruppe auf und wird durch die Formel
dargestellt, worin Z¹ und R¹ bis R⁴ die vorstehend angegebene Bedeutung haben und R⁶ eine Alkyl- oder Arylgruppe ist, die weiter substituiert sein kann.
Es wurde gefunden, dass zahlreiche Acridanverbindungen dieses Typs in der Gegenwart eines Peroxids eine Elektrochemilumineszenz bei positiven Potenzialen (bezogen auf Ag/AgCl) aufweisen. Beispiele umfassen die nachstehenden Verbindungen.
Geeignete Geräte zur Durchführung der elektrochemischen Messungen und Lumineszenzmessungen sind in den vorstehend beschriebenen Veröffentlichungen von Deaver und Blackburn, in der US 5,786,141 und in den nachstehend detallliert beschriebenen Beispielen beschrieben. Eine Vorrichtung, die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet ist, ist in der 1 gezeigt. Verschiedene Arten von Elektrodenmaterialien, die in dem Gebiet der Elektrochemie bekannt sind, können verwendet werden, einschließlich Graphitstäbe, Platindrähte oder -netze. Die physische Form, Größe und Konfiguration können nach den Wünschen des Anwenders festgelegt werden und diese sollen die Erfindung nicht beschränken. Transparente Indium-Zinnoxid-Elektroden (ITO-Elektroden) sind zur Verwendung bei der Elektrochemilumineszenz (ECL) attraktiv, da die Intensität von Licht, das an der Grenzfläche zwischen der Elektrode und der Lösung emittiert wird, durch Anordnen eines Detektors hinter der Elektrode bestimmt werden kann. Dies vermeidet eine Störung von absorbierenden Molekülen in Lösung. ITO wurde bei vielen Gelegenheiten als Elektrode verwendet. Es weist eine große optische Bandlücke auf und ist daher für Licht im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums transparent. Dies macht es für ECL-Anwendungen attraktiv, da Licht, das an der ITO-Oberfläche emittiert wird, ohne Störung durch absorbierende Moleküle in Lösung durch die Elektrode zu dem Detektor übertragen werden kann. Gegen diese Vorteile müssen die Nachteile abgewogen werden, die durch den korrosiven Effekt von Anodenpotenzialen von mehr als 1 V und durch die Elektrolumineszenz, die festgestellt wird, wenn Wasserstoffperoxid oxidiert (oder reduziert) wird, verursacht werden. Der korrosive Effekt von Anodenpotenzialen aufgrund einer Zunahme von Zinnoxid an der Oberfläche der Elektrode führt zu einem Verlust an Leitfähigkeit. Eine anodische Elektrolumineszenz war eine Quelle für ein Hintergrundrauschen bei Acridan- und Luminol-ECL, das zu einer Abnahme der Empfindlichkeit führte.
Die elektrochemischen Eigenschaften und die Chemilumineszenzeigenschaften von DMC und PS-3 wurden detallliert untersucht, jedoch sollte beachtet werden, dass eine große Anzahl verwandter Acridane für Elektrochemilumineszenztests geeignet ist. Acridane sind in fester Form ohne nachweisbare Veränderung der Chemilumineszenzaktivität bei Umgebungstemperatur für mehr als zwei Jahre stabil, mit der Maßgabe, dass Licht ausgeschlossen wird. DMC war in PBS 8 Stunden stabil und anders als der entsprechende Acridiniumester neigt DMC nicht zur Bildung einer Pseudobase. Daher würden Marker während des Zeitraums aktiv bleiben, in dem Antikörper- oder Nucleotid-Bindungsreaktionen stattfinden. Am Ende dieses Zeitraums würde die Probe in eine Durchflusszelle gepumpt werden, wo der Acridanmarker, der an eine feste Phase in einer Suspension gebunden ist, von dem Rest der Probe getrennt und an einer Elektrode konzentriert wird. Dann würde die Durchflusszelle mit einer gepufferten Wasserstoffperoxidlösung gefüllt werden, die EDTA enthält, um eine durch Spuren einer Metallionenverunreinigung katalysierte Oxidation des Acridans einzuschränken, und ein nichtionisches grenzflächenaktives Mittel (Tween-20) enthält, um die Lichtemission zu verstärken.
Eine Cyclovoltammetrie und eine Voltammetrie mit linearem Durchfahren mit luminometrischem Nachweis wurden mit einer Ag/AgCl-Bezugselektrode durchgeführt. In einem typischen Experiment betrug die Konzentration von DMC und des entsprechenden Acridiniumesters 50 μM bzw. 5 μM. Das zweite Cyclovoltammogramm (CV) von DMC, das in der 2 gezeigt ist, weist drei Peaks auf, die sich bei 0,76 V (Peak A), –0,25 (Peak B) und –0,11 V (Peak C) befinden. Eine Auftragung der Lichtintensität bei 430 nm gegen das angelegte Potenzial für DMC in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid (3) weist einen einzelnen Peak bei 0,75 V auf, was der Position des Peaks in der 2 entspricht.
Dies legt nahe, dass der Peak A die Zweielektronen-Oxidation von DMC zu dem entsprechenden Acridiniumester darstellt, wie es vorstehend gezeigt worden ist. Der Acridiniumester reagiert dann mit Wasserstoffperoxid, wobei in der nachstehend gezeigten Weise eine Chemilumineszenz erzeugt wird.
Die Peaks B und C in der 2 treten in dem CV nur nach der Oxidation von DMC auf und daher muss der Peak B die Reduktion eines Oxidationsprodukts darstellen. Die Lichtemission in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid zeigt, dass ein Acridiniumester erzeugt wird, wenn DMC oxidiert wird, und die einfachste Erklärung für den Peak B besteht darin, dass er die Reduktion dieses Produkts in der nachstehend gezeigten Weise repräsentiert.
Dies wird durch die Beobachtung gestützt, dass der Peak B nahezu abwesend ist, wenn ein CV in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid aufgenommen wird, wie es erwartet werden würde, wenn die verantwortliche Verbindung mit einem Peroxid reagiert. Eine weitere Untersuchung dieser Hypothese mit einer authentischen Probe des Acridiniumesters, der DMC entspricht, ergab ein CV mit zwei Peaks, die mit den Peaks B und C in der 2 identisch waren.
Es wurde berichtet, dass eine enzymatische Oxidation von DMC durch HRP in zwei Einelektron-Oxidationsschritten stattfindet, die durch eine nicht-enzymatische Deprotonierung getrennt sind. Der entsprechende elektrochemische Weg wäre ein klassischer ECE-Mechanismus, bei dem die zwei enzymatischen Schritte durch elektrochemische Oxidationen ersetzt sind. Bisherige Arbeiten bezüglich Acridanen haben jedoch einen alternativen MechArylsmus nahegelegt, bei dem der zweite Oxidationsschritt in Lösung als Ergebnis einer Disproportionierung zwischen protonierten und nicht-protonierten Radikal-Zwischenprodukten stattfindet (Hapiot et al., ebd.). Es sind weitere Arbeiten erforderlich, um zu zeigen, welcher MechArylsmus für DMC gilt.
Die Untersuchung des Effekts, den der pH-Wert (5) und die Wasserstoffperoxidkonzentration (6) auf die Elektrochemilumineszenz von DMC aufwiesen, zeigte, dass es bei pH 8,0 in der Gegenwart von 10 mM Wasserstoffperoxid mindestens 40 min stabil war. Dies war beträchtlich länger als die Zeit, die für das Füllen der Durchflusszelle mit Lösung erforderlich ist, und sogar länger als die Zeit, die für die meisten Bindungsreaktionen erforderlich ist, was nahe legt, dass es möglich ist, trennungsfreie Tests durchzuführen, mit der Maßgabe, dass andere Reagenzien und der Analyt von dem 10 mM Wasserstoffperoxid nicht beeinträchtigt werden. Der pH-Wert der Elektrochemilumineszenzlösung (8,0) liegt nahe an dem pH-Wert, bei dem Bindungsreaktionen durchgeführt werden (typischerweise 7,5) und daher ist es unwahrscheinlich, dass eine Dissoziation von gebundenen Antikörpern oder Nucleotid-Duplexen stattfindet, während die Durchflusszelle gefüllt wird. Eine Auftragung der integrierten Lichtintensität gegen die Konzentration von DMC in einem Bereich von 0 bis 10 nM war linear. Die Nachweisgrenze, die als Konzentrationsäquivalent zu Mittelwert + 2,5 × SD (Standardabweichung) des Null-Kalibrators (n = 9) berechnet worden ist, betrug 54 pM. Diese Zahl erfüllt die Anforderungen vieler analytischer Reaktionen, die unter Verwendung von Immuntests selbst ohne vorherige Konzentrierung des Acridans auf einer Elektrode durchgeführt werden. Diese Zahl ist bezüglich der Untergrenze von 100 pM, die für eine Luminol-Elektrochemilumineszenz beschrieben worden ist, besser, und nahe genug an der 0,2 pM-Nachweisgrenze, die für Rutheniumchelate beschrieben worden ist, was nahe legt, dass verwandte Acridane, die eine intensivere Elektrochemilumineszenz erzeugen, praktische Alternativen für vorhandene Marker sind.
Die ECL eines anderen Acridanesters, 2',3',6'-Trifluorphenyl-10-methylacridan-9-carboxylat (PS-3), und von Luminol wurde unter Verwendung von ITO-Elektroden gemessen. Die Elektrochemie und die ECL aller Verbindungen wurden durch eine Cyclovoltammetrie und eine Voltammetrie mit linearem Durchfahren mit luminometrischem Nachweis untersucht. Die elektrochemische Oxidation des Acridanesters wandelt diesen in den entsprechenden Acridiniumester um, der einer Chemilumineszenzreaktion mit H₂O₂ unterliegt. Die elektrochemische Oxidation von Luminol ergibt auch ein Produkt, das einer Chemilumineszenzreaktion mit H₂O₂ unterliegt. Die Effekte des pH-Werts und der H₂O₂-Konzentration auf die ECL des Acridanesters und von Luminol wurden in einer planaren Durchflusszelle untersucht. Der Acridanester war in der Gegenwart von H₂O₂ mindestens 40 min bei pH 8,0 stabil. Die Nachweisgrenzen des Acridanesters und des Luminols unter diesen Bedingungen betrugen 65 pM bzw. 72 pM.
Tests
Obwohl Elektrochemilumineszenzreaktionen seit vielen Jahren bekannt sind, haben Bemühungen bezüglich einer Nutzung ihres Potenzials als analytische Technik erst neuerdings begonnen. Gegenwärtig ist die erfolgreichste Entwicklung eine Kombination aus einer ECL und einer Technologie mit paramagnetischen Kügelchen, die es möglich machte, High Throughput-Immuntests (D.L. Gatto-Menking, H. Yu, J.G. Bruno, M.T. Goode, M. Miller, A.W. Zulich, Biosensors and Bioelectronics 1995, 10, 501–507; H. Yu, J. Immunol. Methods 1996, 192, 163–171) und -Nucleotidtests (S. Zhao, U. Consoli, R. Arceci, J. Pfeifer, W.S. Dalton, M. Andreeff, BioTechniques 1996, 21, 726–731; C.D. O'Connel, A. Juhasz, C. Kuo, D.J. Reeder, D.S.B. Hoon, Clin. Chem. 1998, 44, 1161–1169) durchzuführen. Die Immuntests werden durch Mischen der Probe mit Haptenen oder Antikörpern, die mit einer Elektrochemilumineszenzverbindung markiert sind, und paramagnetischen Kügelchen, die mit komplementären Antikörpern beschichtet sind, durchgeführt. Nachdem die Antikörperreaktion einige Zeit ablaufen gelassen wurde, wird die Lösung in eine Durchflusszelle gepumpt, wo Material, das an die paramagnetischen Kügelchen gebunden ist, magnetisch auf einer Elektrode konzentriert wird. Die Elektrochemilumineszenz wird durch Anlegen eines positiven Potenzials an die Elektrode entweder vor oder nach dem Wegwaschen von nicht-gebundenem Material initiiert. Diese Tests veranschaulichen die Vorteile der Elektrochemilumineszenz als analytische Technik, einschließlich Geschwindigkeit, Empfindlichkeit, Automatisierung und Nachweis über einen breiten Bereich von Konzentrationen.
Wie Luminol können Acridanverbindungen enzymatisch oder elektrochemisch oxidiert werden, und in beiden Fällen reagiert das Oxidationsprodukt mit H₂O₂, so dass eine Chemilumineszenz erzeugt wird. Die Nachweisgrenzen beider Verbindungen waren unter den spezifischen verwendeten Bedingungen ähnlich und lagen in dem Konzentrationsbereich, der für Immuntests und Nukleotidtests geeignet ist. Um Immuntests oder Hybridisierungstests mit einer Acridanverbindung durchzuführen, ist es erforderlich, eine Verbindungs- oder Markierungsgruppe für eine kovalente Bindung an eine Markerverbindung, wie z.B. einen Antikörper oder eine Nukleinsäuresonde, bereitzustellen. Die Bindung von Elektrochemilumineszenzmarkierungsverbindungen an Analyten und spezifische Bindungsverbindungen kann mit jedweder bekannten Reaktion durchgeführt werden, die dem Fachmann der orgArylschen Chemie und der Testentwicklung allgemein bekannt ist.
Es wird davon ausgegangen, dass eine Interkalation eines Acridans in eine Nucleotid-Doppelhelix das Acridan vor einer Oxidation durch eine Elektrode in einer Weise abschirmt, die der Abschirmung vor einer Acridiniumesterhydrolyse durch Interkalation entspricht. Dies würde ein zusätzliches Testformat bereitstellen. Eine ECL von Acridanen in Matrizen, bei denen die Lichtemission von Verbindungen wie z.B. Luminol gequencht wird, ist ebenfalls vorgesehen.
Beispiele
2',6'-Difluorphenyl-10-methylacridan-9-carboxylat (DMC) wurde mit dem in dem US-Patent 5,593,845 beschriebenen Verfahren hergestellt. Vorratslösungen von DMC wurden in 1:1 Ethanol-Dioxan hergestellt. Alle Arbeiten wurden in 10 mM Tris-Puffer, pH 8,0, der 0,1 M NaCl, 10 mM, 1 mM EDTA und 0,025 % Tween-20 enthielt, durchgeführt, falls nichts anderes angegeben ist. Vorratslösungen von DMC wurden in Puffer gelöst, so dass eine Lösungsmittelendkonzentration von 0,25 % erhalten wurde. Aus allen DMC-Lösungen wurde Licht ausgeschlossen.
Eine zweite Acridanverbindung, 2',3',6'-Trifluorphenyl-10-methylacridan-9-carboxylat (Lumigen PS-3), wurde so hergestellt, wie es in dem US-Patent 5,593,845 beschrieben ist. Vorratslösungen wurden in 1:1 Ethanol:1,4-Dioxan hergestellt. Die Acridanphosphatverbindung 9-(Phenylthiophosphoryloxymethyliden)-10-methylacridan-Dinatriumsalz (APS-2) wurde so hergestellt, wie es in dem US-Patent 6,045,727 beschrieben ist.
Ausrüstung bzw. Geräte. Transparente Elektroden wurden aus ITO-beschichtetem Glas von Balzer Ltd. (Buckinghamshire, GB) hergestellt, das einen Flächenwiderstand von 200 W/® (Ohm pro Quadrat) aufwies. Messungen mit linearem Durchfahren wurden in einer Dreielektrodenzelle durchgeführt, die aus einer Küvette hergestellt worden ist, die in einem Perkin-Elmer MPF-43 Spektrofluorometer angeordnet wurde. Die Bezugselektrode war ein Silberchlorid-beschichteter Silberdraht, der in die untersuchte Lösung eingetaucht wurde, und die Gegenelektrode war ein Platindraht. Diese Elektroden wurden in der Zelle hinter einer Arbeitselektrode aus ITO-beschichtetem Glas angeordnet. Die ITO-Oberfläche war auf den Detektor gerichtet, der auf 430 nm mit einer Schlitzbreite von 20 nm eingestellt war. Potenziale wurden mit einem im Hause entwickelten Potenziostaten und einem Wellenformgenerator (PPR1, Hi-Tek-Instruments, Buckinghamshire, England) kontrolliert bzw. gesteuert. Eine Cyclovoltammetrie wurde in der gleichen Zelle, falls nichts anderes angegeben ist, mit einem Eco Chemie Autolab PGSTAT20-Potenziostaten (Eco Chemie, Urtrecht, Holland) durchgeführt. Flussinjektionsmessungen wurden in der Dünnschichtdurchflusszelle mit einer ITO-Arbeitselektrode und einer Ag/AgCl-Gegen/Bezugselektrode durchgeführt. Die PMT-Spannung betrug 1000 V, mit Ausnahme der Messungen der Nachweisgrenze, bei denen die Spannung 1500 V betrug. Die laminare Durchflusszelle ist in der 1 gezeigt. Der Körper dieser Zelle war aus PTFE hergestellt. Sie wurde an die ITO-Arbeitselektrode mit einem feuchtigkeitsbeständigen doppelseitigen Klebeband versiegelnd angebracht. Alle Potenziale beziehen sich auf Ag/AgCl.
Elektrolumineszenz von DMC
Messungen mit linearem Durchfahren. DMC wurde zu einer Endkonzentration von 50 μM in Puffer gelöst, der 10 mM H₂O₂ enthielt. Die Lichtintensität bei 430 nm und der Strom wurden aufgezeichnet, während das Potenzial in einer anodischen Richtung mit 10 mV·s^–1 durchfahren wurde.
Echtzeit-ECL-Übergänge. DMC wurde zu einer Endkonzentration von 5 nM in Puffer gelöst, der 10 mM H₂O₂ enthielt. Übergänge wurden durch Pumpen der Lösung in die Dünnschichtdurchflusszelle und Aufzeichnen der Lichtintensität für insgesamt 180 s erhalten: von 0 bis 30 s betrug das angelegte Potenzial 0 V, von 30 bis 60 s betrug das angelegte Potenzial 1 V und von 60 bis 180 s betrug das angelegte Potenzial 0 V. Ein zweiter Satz von Übergängen wurde in der gleichen Weise erhalten, jedoch wurde die Zeit, für die ein Potenzial von 1 V angelegt wurde, auf insgesamt 180 s verlängert.
Effekt von Wasserstoffperoxid und des pH-Werts auf die ECL. Der Effekt von Wasserstoffperoxid wurde durch Lösen von DMC zu einer Endkonzentration von 10 nM in Puffer, der H₂O₂ im Konzentrationsbereich von 0 bis 50 mM enthielt, untersucht. Der Effekt des pH-Werts wurde durch Lösen von DMC zu einer Endkonzentration von 10 nM in Puffer, der 10 mM AMP und 10 mM H₂O₂ enthielt, im pH-Bereich von 7 bis 10 untersucht. Messungen wurden in der Dünnschichtzelle durch Integrieren der Lichtintensität für 30 s, wenn das angelegte Potenzial 0 V betrug, und Subtrahieren der Lichtintensität von dem erhaltenen Integral, wenn das angelegte Potenzial 1 V für 30 s betrug, durchgeführt. Bei jeder bzw. jedem Konzentrations/pH-Wert wurden fünf Messungen während einer Gesamtzeit von 40 min durchgeführt.
Stabilitätsmessungen. DMC (10 μM) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 1 mM EDTA und 0,025 % Tween-20 enthielt, wurde während einer Gesamtzeit von 8 Stunden bezüglich der Aktivität getestet, und zwar durch Verdünnen des DMC auf eine Endkonzentration von 100 nM mit Tris-Puffer, der 10 mM H₂O₂ enthielt, und Messen des Elektrochemilumineszenzsignals wie bei der Wasserstoffperoxidkonzentration und dem pH-Wert.
Nachweisgrenzen. DMC im Konzentrationsbereich von 0 bis 10 nM wurde Puffer zugesetzt, der 10 mM H₂O₂ enthielt. Bei jeder Konzentration wurden in der gleichen Weise fünf Messungen wie bei der Untersuchung der Wasserstoffperoxidkonzentration und des pH-Werts durchgeführt.
Die Voltammetrie mit linearem Durchfahren zeigte (3), dass die Peak-Elektrochemilumineszenz bei einem Potenzial von 0,75 V auftrat, was der Zweielektronen-Oxidation von DMC zu dem Acridiniumester und der anschließenden Chemilumineszenzreaktion des Acridiniumesters mit Wasserstoffperoxid entspricht. Dies impliziert, dass ein Potenzial über 0,75 V für ein analytisches Arbeiten geeignet wäre, und die in der 4 gezeigten Echtzeitübergänge zeigen, wie die Lichtintensität mit der Zeit variierte, wenn ein Potenzial von 1,0 V an nanomolare Konzentrationen von DMC in der laminaren Durchflusszelle angelegt wurde. Der größte Teil des Stroms ist auf die Oxidation von EDTA zurückzuführen, die keinen Effekt auf die Lichtemissionsreaktion hat. Eine Pseudobase bildet sich nicht, da der Acridiniumester in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid erzeugt wird, das sofort mit einer Geschwindigkeit damit reagiert, die etwa 10⁴-mal höher ist als die Geschwindigkeit, mit der Hydroxidionen ein Addukt bilden.
Elektrochemilumineszenz von PS-3
Messungen mit linearem Durchfahren. PS-3 und Luminol wurden zu einer Endkonzentration von 50 μM in Puffer 1 gelöst, der 10 mM H₂O₂ enthielt. Die Lichtintensität und der Strom wurden aufgezeichnet, während das Potenzial in einer anodischen Richtung mit 10 mV·s^–1 durchfahren wurde. Lösungen: Puffer 1: 10 mM Tris-Puffer, pH 8,0, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,025 % Tween-20. Puffer 2: 0,15 M-Phosphatpuffer, pH 7,0, 10 mM NaCl, 0,05 % Tween-20.
Cyclovoltammetrie. Zwei aufeinander folgende Cyclovoltammogramme (CV's) von PS-3 (50 μM) in Puffer 1 wurden aufgenommen. EDTA wurde nicht in den Puffer einbezogen, da es in dem gleichen Potenzialbereich wie PS-3 elektroaktiv ist und dessen Elektrochemie unklar macht. Die Cyclovoltammetrie von PS-3 wurde in der Gegenwart von 10 mM H₂O₂ wiederholt. Ein CV von Luminol (50 μM) in Puffer 1 wurde aufgenommen. Auch hier wurde EDTA nicht in den Puffer einbezogen, da es elektroaktiv ist.
Echtzeit-ECL-Übergänge. PS-3 und Luminol wurden zu einer Endkonzentration von 5 nM in Puffer 1 gelöst, der 2,5 mM H₂O₂ (10 mM für Luminol) enthielt. Übergänge wurden durch Pumpen der Lösung in die Dünnschichtdurchflusszelle und Aufzeichnen der Lichtintensität für insgesamt 180 s erhalten: von 0 bis 30 s betrug das angelegte Potenzial 0 V, von 30 bis 210 s betrug das angelegte Potenzial 1 V und von 210 bis 330 s betrug das angelegte Potenzial 0 V.
Effekt der H₂O₂-Konzentration und des pH-Werts auf die ECL von PS-3 und Luminol. Der Effekt von H₂O₂ wurde durch Lösen von PS-3 oder Luminol zu einer Endkonzentration von 10 nM in Puffer 1, der H₂O₂ im Konzentrationsbereich von 0 bis 10 nM (0 bis 50 nM für Luminol) enthielt, untersucht. Der Effekt des pH-Werts im Bereich von 7 bis 10 wurde durch Lösen von PS-3 oder Luminol zu einer Endkonzentration von 10 nM in Puffer 1, der 10 mM 2-Amino-2-methyl-1-propanol und 2,5 mM H₂O₂ (10 mM H₂O₂ für Luminol) enthielt, untersucht. Messungen wurden in der Dünnschichtzelle durch Integrieren der Lichtintensität für 30 s, wenn das angelegte Potenzial 0 V betrug, und Subtrahieren der Lichtintensität von dem erhaltenen Integral, wenn das angelegte Potenzial 1 V für 30 s betrug, durchgeführt. Bei jeder bzw. jedem H₂O₂-Konzentrations/pH-Wert wurden fünf Messungen während einer Gesamtzeit von 40 min durchgeführt. Der Effekt der H₂O₂-Konzentration und des pH-Werts auf die ECL von PS-3 war demjenigen auf die DMC-Chemilumineszenz ähnlich.
Nachweisgrenzen. PS-3 und Luminol im Konzentrationsbereich von 0 bis 1250 pM wurden in Puffer 1 gelöst, der 2,5 mM H₂O₂ (10 mM H₂O₂ für Luminol) enthielt. Messungen wurden in der Dünnschichtdurchflusszelle wie bezüglich des Effekts von H₂O₂ und des pH-Werts auf PS-3 und Luminol durchgeführt.
Messungen mit linearem Durchfahren und Effekt des an ITO angelegten Potenzials. Die Potenzialabhängigkeit der ECL für PS-3 und Luminol wurde untersucht. Die Peakpotenziale sind 0,750 V (PS-3) und 0,685 V (Luminol). Diese Ergebnisse legen nahe, dass ein angelegtes Potenzial von 1 V für den ECL-Nachweis von PS-3 und Luminol ausreichend ist. Potenzialzyklusexperimente stützen die Annahme anderer Forscher, dass Potenziale, die anodischer als 1 V sind, eine irreversible Korrosion von ITO-Elektroden verursachen. Um dies zu vermeiden, wurde für alle Arbeiten, die in der Dünnschichtdurchflusszelle durchgeführt wurden, ein maximales Potenzial von 1,0 V verwendet.
Elektrochemie und ECL von PS-3. Die Elektrochemie und die ECL von PS-3 sind denjenigen von DMC ähnlich. Die Ergebnisse stützen einen Prozess, bei dem eine elektrochemische Oxidation des Acridans den entsprechenden Acridiniumester erzeugt, der mit H₂O₂ reagiert, was zu einer Lichtemission bei 430 nm führt. Wie es für DMC festgestellt worden ist, zeigen die CV's ein Muster von drei Peaks. Ein Peak fällt etwa mit der maximalen ECL-Intensität zusammen und entspricht netto einer Zweielektronen-Oxidation des Acridans zu dem Acridiniumester. Der zweite und der dritte Peak repräsentieren die Einelektron-Reduktion des Acridiniumesters zu einem Acridanylradikal bzw. dessen Reoxidation zu dem Ester. Diese Peaks treten nicht auf, wenn die Cyclovoltammetrie in der Gegenwart von H₂O₂ durchgeführt wird.
Echtzeit-ECL-Übergänge. In ECL-Übergängen von PS-3 und Luminol erreicht die Lichtintensität wenige Sekunden nach dem Anlegen eines positiven Potenzials ein Maximum, was zeigt, dass die anschließende Chemilumineszenzreaktion schnell ist. Bei dem Acridanester wird die Geschwindigkeit der anschließenden Reaktion von dem pKa der phenolischen Abgangsgruppe beherrscht und es ist interessant, die schnellere Lumineszenzabklingkinetik von PS-3 mit derjenigen von DMC zu vergleichen, das eine weniger effiziente Abgangsgruppe aufweist. In Lösungen, bei denen Störungen von einer Hintergrund-ECL oder -Elektrolumineszenz ein Problem sind, könnte eine MArylpulation der Reaktionskinetik verwendet werden, um eine verlängerte Lichterzeugung zu bewirken, die integriert werden könnte, nachdem das Potenzial auf Null zurückgeführt worden ist.
Effekt von Wasserstoffperoxid und pH-Wert auf die PS-3- und Luminol-ECL. Bei pH 8,0 war PS-3 für eine längere Zeit stabil, wenn die H₂O₂-Konzentrationen 2,5 mM nicht überstiegen. Diese Instabilität nahm mit steigendem pH-Wert zu. Eine weitere Untersuchung zeigte, dass PS-3 bei pH 9,0 bei einem Fehlen von H₂O₂ mindestens 40 min stabil war und dass gelöster Sauerstoff die Inaktivierungsrate, die in der Gegenwart von H₂O₂ festgestellt worden ist, nicht erhöhte. Weitere Arbeiten mit PS-3 wurden bei pH 8,0 und einer H₂O₂-Konzentration von 2,5 mM durchgeführt, wo es mindestens 40 min stabil war.
Nachweisgrenzen. Auftragungen der integrierten Lichtintensität gegen die Konzentration von PS-3 waren in dem Konzentrationsbereich von 0 bis 1250 pM linear. Die Nachweisgrenzen (2 × Standardabweichung. Blind (n = 9)) waren 67 pM für PS-3 und 72 pM für Luminol. In beiden. Fällen verlief die Auftragung der integrierten Lichtintensität gegen die Konzentration bei einer Konzentration von Null nicht durch den Ursprung, und zwar aufgrund der Hintergrund-Elektrolumineszenz, die mit der H₂O₂-Oxidation auf ITO-Elektroden einhergeht.
Elektrochemilumineszenz eines Acridanphosphats
Es wurde gefunden, dass die als APS-2 bezeichnete Acridanphosphatverbindung
unter oxidativen Bedingungen bei den vorstehend beschriebenen Bedingungen unter Verwendung von PS-3 eine Elektrochemilumineszenz zeigte. APS-2 wurde zu einer Endkonzentration von 50 μM in Puffer 1 gelöst, der 10 mM H₂O₂ enthielt. Die Lichtintensität und der Strom wurden aufgezeichnet, während das Potenzial in einer anodischen Richtung mit 10 mV·s^–1 durchfahren wurde. Lösungen: Puffer 1: 10 mM Tris-Puffer, pH 8,0, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,025 % Tween-20. Puffer 2: 0,15 M-Phosphatpuffer, pH 7,0, 10 mM NaCl, 0,05 % Tween-20.
Cyclovoltammetrie. Zwei aufeinander folgende Cyclovoltammogramme (CV's) von APS-2 (50 μM) in Puffer 1 wurden in der Gegenwart von 10 mM H₂O₂ aufgenommen. EDTA wurde nicht in den Puffer einbezogen, da es in dem gleichen Potenzialbereich wie APS-2 elektroaktiv ist und dessen Elektrochemie unklar macht. Die Cyclovoltammetrie von APS-2 bei einem Fehlen von H₂O₂ erzeugte kein Licht.

Claims

Verfahren zum Erzeugen von Elektrochemilumineszenz, welches das elektrochemische Oxidieren einer Acridanverbindung an einer Elektrode in der Gegenwart eines Peroxides umfasst, wobei die Acridanverbindung die Formel aufweist:
wobei R¹ bis R⁴ unabhängig aus Wasserstoff und orgArylschen Gruppen, welche von 1 bis 50 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, enthalten, ausgewählt sind, Z aus O, S und NR⁵ ausgewählt ist, R⁵ aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl-, Alkysulfonyl- und Arylsulfonyl-Gruppen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R¹ bis R⁴ aus Alkyl-, Aryl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Aralkyl-, von denen jedes substituiert sein kann, Halogen-, Hydroxy-, Alkoxy-, Amino-, Alkylamino-, Carbonyl-haltigen Gruppen wie Keto-, Carboxy-, Carboxamid- und Carbalkoxy-, Thio-, Alkylthio-, Cyano-, Nitro-, Trialkylsilyloxy-, Alkylsulfonyl-, Arylsulfonyl- und positiv oder negativ geladenen ionischen Gruppen, welche die Wasserlöslichkeit erhöhen, ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Acridanverbindung als eine Elektrochemilumineszenz-markierende Verbindung dient und wobei mindestens einer der Gruppen R¹ bis R⁴ in der Acridanverbindung ein Markierungssubstituent der Formel -L-RG ist, wobei L eine Verbindungsgruppe ist, welche eine Bindung oder eine andere zweiwertige oder mehrwertige Gruppe sein kann, RG eine reaktive Gruppe ist, welche es der Acridanverbindung ermöglicht, an eine andere Verbindung gebunden zu werden.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei L aus einer Bindung, einem Atom, einer geradkettigen Gruppe, einer verzweigtkettigen Gruppe oder einer Ringgruppe ausgewählt ist, wobei die Ketten- oder Ringgruppe von 2 bis etwa 50 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus C-, O-, N-, S-, P-, Si-, B- und Se-Atomen, enthält und mit Halogenatomen an der Kette oder dem Ring substituiert sein kann.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei L aus Alkylen-, Arylen-, Alkenylen-, Ether-, Peroxid-, Keton-, Ester-, Carbonatester-, Thioester-, Amid-, Amin-, Amidin-, Carbamat-, Harnstoff-, Imin-, Imid-, Imidat-, Carbodiimid-, Hydrazin-, Diazo-, Phosphodiester-, Phosphotriester-, Phosphonatester-, Thioether-, Disulfid-, Sulfoxid-, Sulfon-, Sulfonatester-, Sulfatester- und Thioharnstoff-Gruppen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei RG aus Halogenatom oder einer Tosylatgruppe, einer Isocyanat- oder Isothiocyanat-Gruppe, einer Maleimid-Gruppe, einer Gruppe, welche durch eine Michael-Additionsreaktion reagieren kann, und einer Gruppe, welche durch eine nucleophile Substitutionsreaktion reagieren kann, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Acridanverbindung ausgewählt ist aus
Verfahren zum Erzeugen von Elektrochemilumineszenz, welches das elektrochemische Oxidieren einer Acridanverbindung an einer Elektrode in der Gegenwart von Wasserstoffperoxid umfasst, wobei die Acridanverbindung die Formel aufweist:
wobei Z¹ und Z² unabhängig aus O, S und NR⁵ ausgewählt sind, R⁵ aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl-, Alkysulfonyl- und Arylsulfonyl-Gruppen ausgewählt ist, R¹ bis R⁴ unabhängig aus Wasserstoff und orgArylschen Gruppen, welche von 1 bis 50 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus C-, N-, O-, S-, P- und Halogenatomen, enthalten, ausgewählt sind und X aus Wasserstoff und orgArylschen Gruppen, welche von 1 bis 50 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus C-, N-, O-, S-, P- und Halogen-Atomen, enthalten, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei R¹ bis R⁴ aus Alkyl-, Aryl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Aralkyl-, von denen jedes substituiert sein kann, Halogen-, Hydroxy-, Alkoxy-, Amino-, Alkylamino-, Carbonyl-haltigen Gruppen wie Keto-, Carboxy-, Carboxamid- und Carbalkoxy-, Thio-, Alkylthio-, Cyano-, Nitro-, Trialkylsilyloxy-, Alkylsulfonyl-, Arylsulfonyl- und positiv oder negativ geladenen ionischen Gruppen, welche die Wasserlöslichkeit erhöhen, ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei X aus einer Alkyl-, Aryl, Aralkyl-, Alkenyl- oder Alkinyl-Gruppe mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, von denen jedes substituiert sein kann, ausgewählt ist, oder aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl- oder Arylcarbonylgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Tri(C₁-C₈-alkyl)silylgruppen, einer SO₃ ^–-Gruppe, Glycosylgruppen und Phosphorylgruppen der Formel PO(OR')(OR'') ausgewählt ist, wobei R' und R'' unabhängig aus substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, substituierten oder unsubstituierten Aryl- und substituierten oder unsubstituierten Aralkyl-Gruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen, Trialkylsilylgruppen, Alkalimetallkationen, Erdalkalikationen, Ammonium- und Phosphoniumkationen ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Acridanverbindung als eine Elektrochemilumineszenz-markierende Verbindung dient und wobei mindestens einer der Gruppen R¹ bis R⁴ in der Acridanverbindung ein Markierungssubstituent der Formel -L-RG ist, wobei L eine Verbindungsgruppe ist, welche eine Bindung oder eine andere zweiwertige oder mehrwertige Gruppe sein kann, RG eine reaktive Gruppe ist, welche es der Acridanverbindung ermöglicht, an eine andere Verbindung gebunden zu werden.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei L aus einer Bindung, einem Atom, einer geradkettigen Gruppe, einer verzweigtkettigen Gruppe oder einer Ringgruppe ausgewählt ist, wobei die Ketten- oder Ringgruppe von 2 bis etwa 50 Nicht-Wasserstoffatome, ausgewählt aus C-, O-, N-, S-, P-, Si-, B- und Se-Atomen, enthält und mit Halogenatomen an der Kette oder dem Ring substituiert sein kann.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei L aus Alkylen-, Arylen-, Alkenylen-, Ether-, Peroxid-, Keton-, Ester-, Carbonatester-, Thioester-, Amid-, Amin-, Amidin-, Carbamat-, Harnstoff-, Imin-, Imid-, Imidat-, Carbodiimid-, Hydrazin-, Diazo-, Phosphodiester-, Phosphotriester-, Phosphonatester-, Thioether-, Disulfid-, Sulfoxid-, Sulfon-, Sulfonatester-, Sulfatester- und Thioharnstoff-Gruppen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei RG aus Halogenatom oder einer Tosylatgruppe, einer Isocyanat- oder Isothiocyanat-Gruppe, einer Maleimid-Gruppe, einer Gruppe, welche durch eine Michael-Additionsreaktion reagieren kann, und einer Gruppe, welche durch eine nucleophile Substitutionsreaktion reagieren kann, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Acridanverbindung die Formel aufweist:
wobei M ein Kation ist, welches aus einem Alkalimetallion oder einem Ammonium-, quartären Ammonium- oder quartären Phosphoniumion ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Acridanverbindung die Formel aufweist:
wobei R⁶ eine Alkyl- oder Arylgruppe ist, welche weiter substituiert sein kann.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Acridanverbindung ausgewählt ist aus
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peroxid Wasserstoffperoxid ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 8, wobei die elektrochemische Oxidation der Acridanverbindung bei einem positiven Potenzial, bezogen auf eine Ag/AgCl-Elektrode, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 8, wobei die Elektrode, an welcher die elektrochemische Oxidation durchgeführt wird, aus einem Graphitstab, einem Platindraht, einem Platingeflecht oder einer transparenten Indiumzinnoxid-Elektrode ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 8, wobei Elektrochemilumineszenz durch Durchfahren einer Spannung an der Anode einer elektrochemischen Zelle auf ein erstes, positives Potenzial erzeugt wird und anschließend die Spannung auf ein zweites, niedrigeres Potenzial umgekehrt wird, um die Elektrochemilumineszenz auszulöschen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 8, wobei die Acridanverbindung als eine Markierung auf einer Markerverbindung, welche aus einer Hapten-, einer Antikörper- oder einer Nucleinsäure-Probe ausgewählt ist, bereitgestellt wird.