DE102008048605B4

DE102008048605B4 - Verfahren zur Markierung und/oder Identifizierung von Biomolekülen

Info

Publication number: DE102008048605B4
Application number: DE102008048605A
Authority: DE
Inventors: Dr. Klauth Peter
Original assignee: INBIO PROF JUERGEN BUEDDEFELD DR PETER KLAUTH PROF MANFRED RIETZ GbR VERTRETUNGSBERECHTIGTER Gesellschaft; Inbio Profjuergen Bueddefeld Drpeter Klauth Profmanfred Rietz GbR (vertretungsberechtigter Gesellschafter Drpeter Klauth 41189 Monchengladbach)
Current assignee: INBIO PROF JUERGEN BUEDDEFELD DR PETER KLAUTH PROF MANFRED RIETZ GbR VERTRETUNGSBERECHTIGTER Gesellschaft; Inbio Profjuergen Bueddefeld Drpeter Klauth Profmanfred Rietz GbR (vertretungsberechtigter Gesellschafter Drpeter Klauth 41189 Monchengladbach)
Priority date: 2008-09-22
Filing date: 2008-09-23
Publication date: 2012-10-04
Anticipated expiration: 2028-09-24
Also published as: DE102008048605A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Markierung und/oder Identifizierung mindestens eines Biomoleküls, insbesondere eines Proteins, eines Peptids, eines Antikörpers oder einer Nukleinsäure, wobei das Biomolekül mit mindestens einem Komplex, insbesondere Chelatkomplex, mindestens eines Elements der Seltenen Erden ("Seltenerdkomplex") in Kontakt gebracht und hiermit zur Wechselwirkung, insbesondere zur Reaktion, gebracht wird, bevorzugt unter Ausbildung einer Bindung, insbesondere koordinativen und/oder kovalenten Bindung, vorzugsweise koordinativen Bindung, zwischen Biomolekül einerseits und Komplex des Elements der Seltenen Erden andererseits.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Markierung und/oder Identifizierung von Biomolekülen, wie insbesondere Proteinen, Peptiden, Antikörpern und Nukleinsäuren.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Markierung und/oder Identifizierung von Biomolekülen, insbesondere Proteinen, Peptiden, Antikörpern und Nukleinsäuren.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Chelatkomplexen von Elementen der Seltenen Erden zur Markierung und/oder Identifizierung von Biomolekülen, insbesondere Proteinen, Peptiden, Antikörpern und Nukleinsäuren.
Gleichermaßen betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Chelatkomplexen von Elementen der Seltenen Erden zur Fluoreszenzmarkierung und/oder -identifizierung von Proteinen, Peptiden, Antikörpern und Nukleinsäuren.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Kit zur Markierung und/oder Identifizierung mindestens eines Biomoleküls.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Biomolekül/Seltenerdkomplex-Konjugat, welches durch Inkontaktbringen bzw. Umsetzung mindestens eines Biomoleküls einerseits und mindestens eines Seltenerdkomplexes andererseits erhältlich ist.
Die aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Markierung und/oder Identifizierung von Biomolekülen, wie Proteinen, Peptiden, Antikörpern und Nukleinsäuren sind oftmals mit einer Vielzahl von Nachteilen verbunden:
Oftmals kommen sehr kostspielige Chemikalien zum Einsatz, welche die eigentliche Markierungs- bzw. Identifizierungsreaktion bewirken.
Des weiteren sind diese Verfahren oftmals aufwendig durchzuführen, insbesondere im Hinblick auf die Vielzahl und/oder Komplexität der durchzuführenden Verfahrensschritte.
Zudem weist die Markierung von Biomolekülen mittels Fluoreszenzfarbstoffen des Standes der Technik oftmals den gravierenden Nachteil von Aufarbeitungsverlusten durch chromatographische Separationsschritte nach der Markierungsreaktion auf, da überschüssige Farbstoffmoleküle aus dem Ansatz entfernt werden müssen.
Weiterhin liegen oftmals unspezifische Wechselwirkungen zwischen Farbstoffmolekülen des Standes der Technik, welche mitunter große Molekulargewichte aufweisen, wie den sogenannten Tandem-Dyes, und dem zu markierenden Biomolekül bzw. der zu markierenden Zelle vor, was zu Verfälschungen des Ergebnisses führen kann.
Darüber hinaus kann es im Stand der Technik zu einer Maskierung des spezifischen Fluoreszenzsignals des markierten Biomoleküls durch unspezifische Hintergrundfluoreszenz kommen, da oftmals vergleichbare bzw. ähnliche optische Eigenschaften vorliegen.
Fluoreszenzfarbstoffe des Standes der Technik weisen zudem den Nachteil auf, daß mitunter nur eine geringe Separation bzw. Differenzierung zwischen dem Anregungs- und dem Emissionsmaximum – im allgemeinen auch als Stokes-Shift bezeichnet – vorliegt, so daß das spezifische Fluoreszenzsignal oftmals nicht hinreichend von dem Anregungssignal unterschieden und ausgewertet werden kann.
Im Stand der Technik besteht ein Ansatz zur besseren Separation bzw. Differenzierbarkeit zwischen Anregungsmaximum einerseits und Emissionsmaximum andererseits darin, sogenannte Tandem-Dyes einzusetzen. Hierbei handelt es sich um Konstrukte mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen, die über einen Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer von Donor zu Akzeptor eine Aufweitung des Stokes-Shift ermöglichen. Bei den Tandem-Dyes handelt es sich jedoch im allgemein um große Moleküle, was bei Interaktion mit dem zu markierenden Biomolekül oftmals mit sterischen Behinderungen einhergeht. Zudem ist die Herstellung derartiger Farbstoffe vergleichsweise kostenintensiv und aufwendig.
Weitere Nachteile organischer Fluoreszenzfarbstoffe des Standes der Technik sind darin zu sehen, daß oftmals eine sogenannte Selbstabsorption von Photonen vorliegt, was auch als "Self-Quenching" bezeichnet wird, und daß breite Emissionslinien vorliegen, welche in einigen Fällen die korrekte Detektion der Farbstoffsignale erschweren.
Die Publikation gemäß Ye et al., "Novel fluorescent europium chelate-doped silica nanoparticles: preparation, characterization and time-resolved fluorometric application", J. Mater. Chem., 2004, 14, Seiten 851 bis 856, betrifft die Herstellung von Eu(III)-dotierten Siliciumnanopartikeln durch kontrollierte Hydrolyse von Tetraethylorthosilicat (TEOS) in Anwesenheit eines Eu(III)-Chelatkomplexes und Triton-X in einem Zweiphasengemisch, welche nach Funktionalisierung zur Markierung von Streptavidin und somit dessen Bestimmung mittels einem zeitaufgelösten Fluoroimmunoassay verwendet werden können.
Weiterhin betrifft die Publikation gemäß Hurskainen et al., "Preparation of europium-labelled DNA probes and their properties", Nucleic Acids Research, 1991, 19, Seiten 1057 bis 1061, die Markierung von aminfunktionalisierter DNA mit einem Europium-Chelatkomplex auf Basis von Isothiocyanatpolycarboxylat-Liganden, wobei ein Aufreinigungsschritt nach der Markierung beschrieben ist.
Daher besteht ein Bedürfnis nach einem effizient und möglichst einfach durchzuführenden Verfahren zur Markierung und/oder Identifizierung von Biomolekülen, insbesondere Peptiden, Proteinen, Antikörpern und Nukleinsäuren.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung gemäß einem ersten Aspekt ist somit ein Verfahren zur Markierung und/oder Identifizierung mindestens eines Biomoleküls, insbesondere eines Proteins, eines Peptids, eines Antikörpers oder einer Nukleinsäure, gemäß Anspruch 1; weitere, vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Gegenstand der diesbezüglichen Unteransprüche.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Markierung und/oder Identifizierung mindestens eines Biomoleküls, wobei das Biomolekül mit mindestens einem Chelatkomplex mindestens eines Elements der Seltenen Erden ("Seltenerdkomplex") in Kontakt gebracht und hiermit unter Ausbildung einer Bindung zwischen Biomolekül einerseits und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden andererseits zur Wechselwirkung gebracht wird.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung gemäß einem zweiten Aspekt ist die Verwendung mindestens eines Komplexes, insbesondere Chelatkomplexes, mindestens eines Elements der Seltenen Erden gemäß Anspruch 20; weitere, vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung sind Gegenstand des diesbezüglichen Unteranspruchs.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung die Verwendung mindestens eines Komplexes, insbesondere Chelatkomplexes, mindestens eines Elements der Seltenen Erden zur Markierung und/oder Identifizierung mindestens eines Biomoleküls, insbesondere eines Proteins, Peptids, eines Antikörpers oder einer Nukleinsäure.
Wiederum weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung gemäß einem dritten Aspekt ist die Verwendung mindestens eines Komplexes, insbesondere Chelatkomplexes, mindestens eines Elements der Seltenen Erden gemäß Anspruch 21; weitere, vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung sind Gegenstand des diesbezüglichen Unteranspruchs.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit gemäß dem dritten Erfindungsaspekt auch die Verwendung mindestens eines Komplexes, insbesondere Chelatkomplexes, mindestens eines Elements der Seltenen Erden zur Fluoreszenzmarkierung oder -identifizierung mindestens eines Proteins, Peptids, eines Antikörpers oder einer Nukleinsäure.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem vierten Aspekt ein Kit zur Markierung und/oder Identifizierung mindestens eines Biomoleküls gemäß Anspruch 22; weitere, vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung sind Gegenstand des diesbezüglichen Unteranspruchs.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einem fünften Aspekt ein Biomolekül/Seltenerdkomplex-Konjugat, vorzugsweise ein Biomolekül/Lanthanoidkomplex-Konjugat, gemäß Anspruch 23; weitere, vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung sind Gegenstand des diesbezüglichen Unteranspruchs.
Nachfolgend wird die Erfindung im Detail erläutert, insbesondere auch auf der Basis von verschiedenen Ausführungsbeispielen. Es versteht sich von selbst, daß Ausführungen, welche zu einem Aspekt der vorliegenden Erfindung gemacht werden, entsprechend auch für die übrigen Erfindungsaspekte gelten, ohne daß dies einer ausdrücklichen Erwähnung bedarf.
Der Anmelder hat nun in völlig überraschender Weise herausgefunden, daß die zuvor geschilderten Nachteile des Standes der Technik durch Bereitstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Markierung bzw. Identifizierung mindestens eines Biomoleküls, insbesondere eines Proteins, eines Peptids, eines Antikörpers oder einer Nukleinsäure, gelöst werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß das Biomolekül mit mindestens einem Chelatkomplex mindestens eines Elements der Seltenen Erden ("Seltenerdkomplex") in Kontakt gebracht und hiermit unter Ausbildung einer Bindung zwischen Biomolekül einerseits und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden andererseits zur Wechselwirkung gebracht wird, wobei der Komplex des Elements der Seltenen Erden der Formel gemäß der allgemeinen Formel (I)
entspricht, wobei:

• "M" ein Element der Seltenen Erden darstellt, wobei das Element der Seltenen Erden ausgewählt ist aus der Gruppe von Scandium, Yttrium, Lanthan, Cer, Praseodym, Neodym, Promethium, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium und Lutetium,
• "n" eine ganze Zahl von 1 bis 3 bezeichnet,
• "m" eine ganze Zahl von 1 bis 3 bezeichnet und
• "X" einen Liganden der folgenden Formel darstellt:

Das erfindungsgemäße Verfahren weist den entscheidenden Vorteil auf, daß die erfindungsgemäß eingesetzten Seltenerdkomplexe sich als fluoreszente Label bzw. Marker für Biomoleküle von den sonstigen organischen Fluoreszenzfarbstoffen des Standes der Technik durch ihre sehr schmalen Emissionsbanden und den langen Fluoreszenzlebenszeiten der Farbstoffsignale unterscheiden. So ist die Fluoreszenzlebenszeit der erfindungsgemäß eingesetzten Seltenerdkomplexe signifikant länger als die Hintergrundfluoreszenz organischer Verbindungen. Aufgrund der langen Fluoreszenzlebensdauern wird eine zeitliche Diskriminierung der Signale des Seltenerdkomplexes mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzmessung ermöglicht.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist darin zu sehen, daß aufgrund der geringen Molekülgröße bzw. des geringen Molekulargewichtes der erfindungsgemäß eingesetzten Seltenerdkomplexe sterische Hinderungen in bezug auf das zu markierende Biomolekül nicht zu erwarten sind, so daß insgesamt eine optimale Wechselwirkung zwischen Biomolekül einerseits und Seltenerdkomplex andererseits ohne signifikante Beeinflussung der nativen Funktion des zu markierenden Biomoleküls vorliegt.
Weiterhin hat der Anmelder in völlig überraschender Weise herausgefunden, daß sich die erfindungsgemäß eingesetzten Seltenerdkomplexe in hervorragender Weise zur Markierung von in wäßriger Lösung befindlichen Biomolekülen eignen – und dies obwohl die erfindungsgemäß eingesetzten Seltenerdkomplexe als solche im allgemeinen eine relativ geringe Wasserlöslichkeit aufweisen. Insbesondere aus diesem Grund wurde ein Einsatz der erfindungsgemäß verwendeten Seltenerdkomplexe im Bereich der biochemischen Analytik in bezug auf wäßrige Systeme bislang nicht in Betracht gezogen.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird eine praktisch verlustfreie Markierung von Biomolekülen ermöglicht, da eine chromatographische Separation bzw. Abtrennung des überschüssigen Farbstoffs nicht erforderlich ist, da nur äußerst geringe bzw. vernachlässigbare Mengen des freien bzw. nichtgebundenen Seltenerdkomplexes in der Lösung verbleiben.
Zudem beschränkt sich die Interaktion des Seltenerdenkomplexes aufgrund seiner zuvor angesprochenen geringen Größe nur auf die Bindung mit dem Biomolekül als solche, und die Fluoreszenzlebensdauer übersteigt die Lebensdauer der langlebigsten bekannten organischen Komponenten um den Faktor 10, was, wie zuvor angeführt, der zeitlichen Diskriminierung des Emissionssignals zugute kommt.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist zudem insgesamt kostengünstig und umfaßt nur wenige Verfahrensschritte und führt zu einer hervorragenden quantitativen sowie qualitativen Bestimmung von Biomolekülen der zuvor genannten Art in einer Probe.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist somit ein Verfahren zur Markierung und/oder Identifizierung mindestens eines Biomoleküls, wobei das erfindungsgemäße Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß das Biomolekül mit mindestens einem Chelatkomplex mindestens eines Elements der Seltenen Erden ("Seltenerdkomplex") in Kontakt gebracht und hiermit unter Ausbildung einer Bindung zwischen Biomolekül einerseits und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden andererseits zur Wechselwirkung gebracht wird, wobei der Komplex des Elements der Seltenen Erden der Formel gemäß der allgemeinen Formel (I)
entspricht, wobei:

Das grundlegende Prinzip der vorliegenden Erfindung ist somit darin zu sehen, daß im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens ein spezieller Komplex, insbesondere Chelatkomplex, verwendet wird, welcher mindestens einen Kern bzw. ein Element der Seltenen Erden aufweist. Der gezielte Einsatz von Elementen der Seltenen Erden in bezug auf den zur Markierung verwendeten Komplex führt – insbesondere in Verbindung mit den erfindungsgemäß eingesetzten Liganden des Seltenerdkomplexes – in völlig überraschender Weise zu hervorragenden Emissionseigenschaften, wie engen Emissionsbanden, langen Emissions- bzw. Lumineszenzdauern, was zu einer sehr guten Detektierbarkeit einhergehend mit einer qualitativen und quantitativen Bestimmung von Biomolekülen in einer Meßprobe führt.
Aufgrund der spezifischen Eigenschaften der verwendeten Komplexe kann insgesamt eine Vielzahl von Biomolekülen markiert bzw. identifiziert werden. So eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren in nichtbeschränkender Weise zur Markierung bzw. Identifizierung von Biomolekülen, welche aus der Gruppe von Proteinen, Peptiden, Antikörpern und Nukleinsäuren ausgebildet sind.
Was die Wechselwirkung zwischen Biomolekül einerseits und Komplex des Elements der Seltenen Erden andererseits betrifft, so kann es erfindungsgemäß vorgesehen sein, daß das Biomolekül an den Komplex, insbesondere Chelatkomplex, des Elements der Seltenen Erden anbindet, vorzugsweise über eine koordinative und/oder kovalente, bevorzugt koordinative Bindung, gegebenenfalls unter Substitution und/oder Abspaltung und/oder Freisetzung mindestens eines Liganden des Komplexes des Elements der Seltenen Erden.
Weiterhin kann es im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgesehen sein, daß die Bindung des Komplexes, insbesondere Chelatkomplexes, des Elements der Seltenen Erden über mindestens eine funktionelle Gruppe des Biomoleküls erfolgt. Hierbei kommen insbesondere funktionelle Gruppen, wie Carboxyl-, Carbonyl-, Thiol-, Amino- und/oder Hydroxylgruppen des Biomoleküls in Betracht. Die Wechselwirkung bzw. Bindung des Komplexes des Elements der Seltenen Erden ist jedoch nicht auf die vorgenannten funktionellen Gruppen beschränkt. Vielmehr kann die Wechselwirkung auch über andere funktionelle Gruppen erfolgen, sofern die entsprechenden funktionellen Gruppen imstande sind, mit dem Komplex der Seltenen Erden in Wechselwirkung zu treten bzw. mit dem Komplex der Seltenen Erden eine Bindung auszubilden.
Die Bindung des Biomoleküls an den Komplex des Elements der Seltenen Erden kann unter Ausbildung eines Konjugats aus Biomolekül und Komplex des Elements der Seltenen Erden ("Biomolekül/Seltenerdkomplex-Konjugat") erfolgen.
Besonders gute Ergebnisse hinsichtlich der zuvor beschriebenen Eigenschaften des im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Komplexes des Elements der Seltenen Erden werden dadurch erreicht, dass das Element ausgewählt ist aus der Gruppe von Scandium, Yttrium, Lanthan, Cer, Praseodym, Neodym, Promethium, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium und Lutetium, bevorzugt Europium.
Insbesondere kann es im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgesehen sein, daß das Element der Seltenen Erden ausgewählt ist aus den Elementen der Lanthanoide, insbesondere aus der Gruppe von Cer, Praseodym, Neodym, Promethium, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium und Lutetium, bevorzugt Europium.
Die Lanthanoide sind silbrig glänzende, relativ weiche und reaktionsfreudige Metalle, die an der Luft schnell oxidieren und dabei matt werden. In Wasser zersetzen sie sich mehr oder weniger schnell unter Freisetzung von Wasserstoffgas. Bei den Lanthanoiden handelt es sich im allgemeinen um insgesamt vierzehn Elemente der sechsten Periode des Periodensystems, die als Untergruppe der dritten Nebengruppe aufgefaßt werden können. Aufgrund der ähnlichen Struktur der Valenzschale verhalten sich die Lanthanoide chemisch vergleichbar zu den Elementen der dritten Gruppe des Periodensystems, nämlich Skandium und Yttrium. Mit diesen bilden die Lanthanoide die Gruppe der Seltenen Erden.
Besonders gute Ergebnisse hinsichtlich des im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzten Komplexes des Elements der Seltenen Erden werden erhalten, wenn das Element der Seltenen Erden ausgewählt ist aus Europium, bevorzugt in Form von Europium(III).
Weiterhin ist es von Vorteil, wenn der Komplex des Elements der Seltenen Erden ("Seltenerdkomplex") mindestens einkernig ist, vorzugsweise einkernig ausgebildet ist und/oder vorzugsweise ein Element der Seltenen Erden aufweist.
Was den Komplex des Elements der Seltenen Erden weiterhin anbelangt, so weist dieser mindestens einen organischen, insbesondere aromatischen und koordinativ gebundenen Liganden auf. Weiterhin weist der Komplex des Elements der Seltenen Erden mindestens einen organischen und koordinativ gebundenen Liganden auf β-Diketonatbasis, gegebenenfalls zusammen mit mindestens einem Co-Liganden auf Basis von Bipyridinen und/oder Phenanthrolinen, auf. Den Liganden kommt insbesondere eine wichtige Funktion als "Antennenmoleküle" zur Absorption von Anregungsenergie zu.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es von besonderem Vorteil, wenn der Komplex des Elements der Seltenen Erden einen Fluorophor, insbesondere einen Farbstoff, vorzugsweise einen Lumineszenz- und/oder Fluoreszenzfarbstoff, umfaßt und/oder darstellt. Dies wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung insbesondere durch die besondere Abstimmung zwischen dem Kern auf Basis des Elements der Seltenen Erden einerseits und der spezifischen Auswahl von Liganden erreicht, so daß im Rahmen der vorliegenden Erfindung insgesamt ein äußerst leistungsfähiges System zur quantitativen und qualitativen Erfassung von Biomolekülen in einer Meßprobe bereitgestellt wird. Aufgrund des spezifischen Einsatzes eines Komplexes eines Elements der Seltenen Erden in Verbindung mit spezifischen Liganden wird insgesamt ein äußerst leistungsfähiges Verfahren nach der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, welches sich in besonderem Maße zur analytischen Verwendung im Bereich der Biochemie bzw. Molekularbiologie eignet. Dabei kann der Komplex des Elements der Seltenen Erden gewissermaßen als Universalmarker für eine Vielzahl von Biomolekülen eingesetzt werden, so daß aufgrund der vorteilhaften Unspezifität des Komplexes des Elements der Seltenen Erden eine große Anzahl von Biomolekülen quantitativ und qualitativ erfaßt werden kann.
Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform kann der Komplex des Elements der Seltenen Erden der Formel gemäß 1A entsprechen, wobei "Ln" ein Element der Seltenen Erden, insbesondere wie zuvor definiert, vorzugsweise Europium, besonders bevorzugt in der Form von Europium(III), darstellt.
Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann der Komplex des Elements der Seltenen Erden der Formel gemäß 1B entsprechend, wobei "Ln" ein Element der Seltenen Erden, insbesondere wie zuvor definiert, vorzugsweise Europium, besonders bevorzugt in der Form von Europium(III), darstellt.
Für weitere diesbezügliche Ausführungen zu den spezifischen Komplexen des Elements der Seltenen Erden kann auf die nachfolgenden Figurenbeschreibungen zu 1A und 1B verwiesen werden.
Erfindungsgemäß entspricht der Komplex des Elements der Seltenen Erden der Formel gemäß der allgemeinen Formel (I)
wobei:

• "M" ein Element der Seltenen Erden, insbesondere wie zuvor definiert, vorzugsweise Europium, besonders bevorzugt in der Form von Europium(III), darstellt,
• "n" eine ganze Zahl von 1 bis 3, vorzugsweise 2 oder 3, bezeichnet,
• "m" eine ganze Zahl von 1 bis 3, vorzugsweise 1, bezeichnet und
• "X" einen Liganden der folgenden Formel darstellt:

In bezug auf die zuvor dargestellte Formel (I) ist es erfindungsgemäß von Vorteil, wenn n = 2 ist, sofern X einen Rest der Formel (IIa) darstellt. Zudem ist es vorteilhaft, wenn n = 3 ist, sofern X einen Rest der Formel (IIb) darstellt. Der Komplex der allgemeinen Formel (I) kann außerdem vorzugsweise koordinativ gebundenes Wasser, vorzugsweise zwei Wassermoleküle pro Molekül Komplex, aufweisen, insbesondere sofern X einen Rest der Formel (IIa) darstellt.
Was die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Komplexe des Elements der Seltenen Erden anbelangt, so sind diese als solche und deren Herstellung literaturbekannt und durch den Fachmann mit an sich geläufigen Verfahren herstellbar. Diesbezüglich kann beispielsweise verwiesen werden auf die wissenschaftliche Publikation von Shen, Y. und Sullivan, B. P., "A Versatile Preparative Route to 5-Substituted-1,10-Phenanthroline Ligands via 1,10-Phenanthroline 5,6-Epoxide", Inorg. Chem., 1995, 34, Seiten 6235 bis 6236, sowie auf die wissenschaftliche Publikation von Farah, K., Kandil, A.T., "2,2'-Dipyridyl and 1,10-Phenanthroline in the Synergetic Extraction of Eu³⁺", Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry, Articles, Band 157, Nr. 1, 1992, Seiten 177 bis 184, und auf die wissenschaftliche Publikation von Marti, A. et al. "Structural and Photophysical Characterisation of fac-[Tricarbonyl(chloro)-(5,6-epoxy-1,10-phenanthroline)rhenium(I)]", Eur. J. Inorg. Chem. 2005, Seiten 118 bis 124, deren Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme mitsamt den dort angeführten Literaturstellen vollumfänglich eingeschlossen ist.
Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens kann es vorgesehen sein, daß das Reaktionsprodukt aus Biomolekül einerseits und Komplex des Elements der Seltenen Erden andererseits, insbesondere das Konjugat aus Biomolekülen und Komplex des Elements der Seltenen Erden ("Biomolekül/Seltenerdkomplex-Konjugat"), insbesondere unter Einwirkung von Anregungsenergie oder Absorption von Anregungsenergie, luminesziert, insbesondere fluoresziert. Weiterhin sollte das Reaktionsprodukt aus Biomolekül einerseits und Komplex des Elements der Seltenen Erden andererseits, insbesondere das Konjugat aus Biomolekül und Komplex des Elements der Seltenen Erden ("Biomolekül/Seltenerdkomplex-Konjugat"), insbesondere unter Einwirkung von Anregungsenergie und/oder Absorption von Anregungsenergie, detektierbare Energie, insbesondere in Form von Lumineszenz, vorzugsweise Fluoreszenz, freisetzen. In diesem Zusammenhang sollte die freigesetzte und/oder emittierte Energie von der Anregungsenergie differenzierbar und/oder unterscheidbar ausgebildet sein, vorzugsweise die Lumineszenzemissionswellenlänge von der Anregungsenergieabsorptionswellenlänge differenzierbar und/oder unterscheidbar ausgebildet sein. Zudem sollte die Lumineszenz, vorzugsweise Fluoreszenz, im Bereich des sichtbaren Lichts erfolgen. In diesem Zusammenhang sollte die Anregung mit Licht einer Wellenlänge unterhalb von 400 nm, vorzugsweise im Bereich von UV-Licht, erfolgen.
Die freigesetzte und/oder emittierte Energie kann erfindungsgemäß mittels einer Detektionsvorrichtung, insbesondere mittels eines Spektrometers, erfaßt werden, vorzugsweise qualitativ und/oder quantitativ erfaßt werden. Auf diese Weise kann gleichermaßen eine qualitative oder quantitative Erfassung des zu detektierenden Biomoleküls in der Meßprobe erfolgen. Als Detektions- bzw. Meßeinheiten kommen in nichtbeschränkender Weise auch Fluoreszenzmikroskope, Fluorimeter oder dergleichen in Betracht.
Das Inkontaktbringen und/oder die Umsetzung von Biomolekül einerseits und Komplex des Elements der Seltenen Erden andererseits sollte unter Bedingungen erfolgen derart, daß das Biomolekül, insbesondere dessen Struktur, bei der Umsetzung zumindest im wesentlichen erhalten bleibt, insbesondere das Biomolekül nicht denaturiert wird. Die diesbezüglich auszuwählenden Parameter sind insbesondere vor dem Hintergrund des jeweils zu detektierenden Biomoleküls abzustimmen bzw. auszuwählen, was dem Fachmann als solchen bekannt ist, so daß es diesbezüglich keiner weiteren Ausführungen bedarf.
Weiterhin sollte das Inkontaktbringen und/oder die Umsetzung von Biomolekül einerseits und Komplex des Elements der Seltenen Erden andererseits durchgeführt werden, indem zunächst eine Lösung und/oder Dispersion, vorzugsweise eine insbesondere wäßrige Lösung, des Biomoleküls hergestellt wird und die so hergestellte Lösung und/oder Dispersion des Biomoleküls nachfolgend mit dem Komplex des Elements der Seltenen Erden in Kontakt und zur Wechselwirkung, insbesondere Reaktion, gebracht wird, vorzugsweise hiermit umgesetzt wird, insbesondere wobei der Komplex des Elements der Seltenen Erden in fester Phase vorliegt.
Erfindungsgemäß ist es von Vorteil, wenn bei dem Inkontaktbringen und/oder bei der Umsetzung von Biomolekül einerseits und Komplex des Elements der Seltenen Erden andererseits der Komplex des Elements der Seltenen Erden in fester Phase vorliegt, insbesondere als Feststoff in Masse vorliegt oder aber an ein festes Substrat, vorzugsweise an einen hydrophoben Träger, reversibel angebunden und/oder immobilisiert und/oder fixiert ist. In diesem Zusammenhang sollte der Komplex des Elements der Seltenen Erden bedarfsweise vom Substrat bei Kontakt mit dem Biomolekül freigesetzt werden. Zudem kann in diesem Zusammenhang das feste Substrat die Wandung eines Reaktionsgefäßes, ein partikelförmiger Träger, die feste Phase einer Chromatographiereinrichtung ("HPLC-Kügelchen"), oder dergleichen sein.
Das Inkontaktbringen und/oder die Umsetzung von Biomolekül einerseits und Komplex des Elements der Seltenen Erden andererseits sollte bei einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 8, vorzugsweise 5,5 bis 7,5, erfolgen. Gleichermaßen sollte das Inkontaktbringen und/oder die Umsetzung von Biomolekül einerseits und Komplex des Elements der Seltenen Erden andererseits bei einer Temperatur im Bereich von –20 °C bis +40 °C, vorzugsweise 0 °C bis +35 °C, erfolgen. Zudem sollte der Komplex des Elements der Seltenen Erden unter Reaktionsbedingungen nur geringfügig löslich, insbesondere nur geringfügig wasserlöslich, ausgebildet sein. In diesem Zusammenhang sollte die Löslichkeit des Komplexes des Elements der Seltenen Erden geringer als die des Biomoleküls sein, vorzugsweise um den Faktor 100, insbesondere 1.000, besonders bevorzugt 10.000.
Wie zuvor angeführt, kann es erfindungsgemäß vorgesehen sein, daß der Komplex des Elements der Seltenen Erden unspezifisch in bezug auf das Biomolekül ist. Auf diese Weise kann eine große Vielzahl von Biomolekülen bestimmt werden.
Erfindungsgemäß kann es in diesem Zusammenhang vorgesehen sein, daß das Inkontaktbringen und/oder die Umsetzung von Biomolekül einerseits und Komplex des Elements der Seltenen Erden andererseits gemäß der nachfolgenden Reaktionsgleichung erfolgt:
wobei:

• "Eu" einen Europium(III)-Kern bezeichnet,
• "ttfa" einen Rest der obigen Formel (IIa) bezeichnet und/oder "ttfa" einen 1-(2-Thenyl)-4,4,4-trifluorbutan-1,3-dionato-Liganden bezeichnet,
• "Prot" einen Biomolekülabschnitt, insbesondere einen Proteinabschnitt, bezeichnet und
• "R" einen beliebigen organischen Rest oder Wasserstoff darstellt.

Gemäß einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsform kann das Inkontaktbringen und/oder die Umsetzung von Biomolekül einerseits und Komplexes des Elements der Seltenen Erden andererseits gemäß der nachfolgenden Reaktionsgleichung erfolgen:
wobei:

• "Eu" einen Europium(III)-Kern bezeichnet,
• "ttfa" einen Rest der obigen Formel (IIa) bezeichnet und/oder "ttfa" einen 1-(2-Thenyl)-4,4,4-trifluorbutan-1,3-dionato-Liganden bezeichnet und
• "Prot'" einen Biomolekülabschnitt, insbesondere einen Proteinabschnitt, bezeichnet.

Weiterhin kann es im Rahmen der vorliegenden Erfindung vorgesehen sein, daß das Inkontaktbringen und/oder die Umsetzung von Biomolekül einerseits und Komplex des Elements der Seltenen Erden andererseits entsprechend der Reaktionsgleichung gemäß 2A oder 2B erfolgt, wobei die dort angegebenen Bezeichnungen "Prot" und "Prot'" die zuvor angegebene Bedeutung haben.
Wie zuvor angeführt, ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung gelungen, ein äußerst leistungsfähiges System bzw. Verfahren zur Detektion bzw. Markierung bzw. Identifizierung von Biomolekülen bereitzustellen, welches gegenüber dem Stand der Technik über signifikante Vorteile verfügt.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung – gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung – ist die Verwendung eines Komplexes, insbesondere Chelatkomplexes, mindestens eines Elements der Seltenen Erden zur Markierung und/oder Identifizierung mindestens eines Biomoleküls, insbesondere eines Proteins, eines Peptids, eines Antikörpers oder einer Nukleinsäure.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung – gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung – die Verwendung mindestens eines Komplexes, insbesondere Chelatkomplexes, mindestens eines Elements der Seltenen Erden zur Fluoreszenzmarkierung oder -identifizierung mindestens eines Proteins, eines Peptids, eines Antikörpers oder einer Nukleinsäure.
In bezug auf den im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendungen gemäß dem zweiten und dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung eingesetzten Komplex des Elements der Seltenen Erden sowie in bezug auf weitere Ausführungen kann auf die obigen Ausführungen zu dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwiesen werden, welche für die Verwendungen nach der Erfindung entsprechend gelten.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung – gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung – ein Kit zur Markierung und/oder Identifizierung mindestens eines Biomoleküls, umfassend mindestens ein Reaktionsgefäß und/oder einen abgegrenzten Reaktionsraum, wobei in dem Reaktionsgefäß und/oder Reaktionsraum mindestens ein Komplex, insbesondere Chelatkomplex, mindestens eines Elements der Seltenen Erden ("Seltenerdkomplex") befindlich ist, insbesondere wobei der Komplex des Elements der Seltenen Erden in fester Phase vorliegt, insbesondere als Feststoff in Masse vorliegt oder aber an ein festes Substrat, vorzugsweise an einen hydrophoben Träger, reversibel angebunden und/oder immobilisiert und/oder fixiert ist, insbesondere wobei der Komplex des Elements der Seltenen Erden bedarfsweise vom Substrat bei Kontakt mit dem Biomolekül freisetzbar ausgebildet ist und/oder insbesondere wobei das feste Substrat die Wandung des Reaktionsgefäßes und/oder Reaktionsraums, insbesondere dessen Verschlußeinrichtung, ein partikelförmiger Träger, die feste Phase einer Chromatographiereinrichtung ("HPLC-Kügelchen") oder dergleichen ist.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung – gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung – ein Biomolekül/Seltenerdkomplex-Konjugat, insbesondere Biomolekül/Lanthanoidkomplex-Konjugat, erhältlich durch Inkontaktbringen und/oder Umsetzung, insbesondere Reaktion mindestens eines Biomoleküls einerseits und mindestens eines Komplexes, insbesondere Chelatkomplexes, mindestens eines Elements der Seltenen Erden ("Seltenerdkomplex") andererseits.
Für weitere Ausführungen betreffend den vierten und fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung kann auf die obigen Ausführungen zu dem ersten bis dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung verwiesen werden, welche entsprechend gelten.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der Figurendarstellungen rein exemplarisch weiter veranschaulicht, ohne die Erfindung jedoch hierauf zu beschränken:
1A zeigt einen im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Lanthanoidkomplex, wobei es sich hierbei um Ln(ttfa)₃(H₂O)₂ bzw. [Tris(1-(2-thenyl)-4,4,4-trifluorbutan-1,3-dionato)(diaquo)]-Ln handelt, wobei Ln durch ein Lanthanoid, insbesondere durch Europium, vorzugsweise Eu(III), gebildet ist und "ttfa" den zuvor genannten 1-(2-Thenyl)-4,4,4-trifluorbutan-1,3-dionato-Liganden bezeichnet. Der Lanthanoidkomplex gemäß 1A eignet sich insbesondere zur Markierung bzw. Identifizierung von Biomolekülen, vorzugsweise mittels Interaktion bzw. Ausbildung einer vorzugsweise koordinativen Bindung, z. B mit einer Carboxylgruppe des Biomoleküls (z. B. einem Protein = "Prot" bzw. Prot'"), wobei im Rahmen der zugrundeliegenden Reaktion ein Molekül ttfa-Ligand sowie zwei Wassermoleküle von je einem Molekül Lantanoidkomplex abgespalten werden können.
1B zeigt einen weiteren im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Lanthanoidkomplex, wobei es sich hierbei um Ln(ttfa)₃(epoxyphen) bzw. [(5,6-Epoxy-1,10-phenanthrolino)-tris(1-(2-thenyl)-4,4,4-triflorbutan-1,3-dionato)]-Ln handelt, wobei Ln durch ein Lanthanoid, vorzugsweise durch Europium, insbesondere Eu(III), gebildet ist, der Ligand "ttfa" die zuvor angegebene Bezeichnung aufweist und der Ligand "epoxyphen" den in 1B dargestellten 5,6-Epoxy-1,10-phenanthrolino-Liganden bezeichnet. Der Lanthanoidkomplex gemäß 1B eignet sich insbesondere zur Markierung bzw. Identifizierung von Biomolekülen, welche Thiolgruppen (SH-Gruppen) aufweisen, wobei die Interaktion mit der Thiolgruppe des Biomoleküls bzw. die Ausbildung einer Bindung mit der Thiolgruppe des Biomoleküls über die Epoxygruppe des 5,6-Epoxy-1,10-phenanthrolino-Liganden des Lanthanoidkomplexes resultiert.
2A verdeutlicht den der Markierung bzw. Identifizierung von Biomolekülen zugrundeliegenden Reaktionsablauf unter Verwendung des Komplexes Ln(ttfa)₃(H₂O)₂ gemäß 1A als Lanthanoidkomplex, wobei als Reaktionsprodukt ein Biomolekül/Lanthanoidkomplex-Konjugat resultiert. Gemäß 2A bedeutet die Abkürzung "Prot" das zu markierende Biomolekül, insbesondere Protein. Bei der Markierungsreaktion resultiert eine vorzugsweise koordinative Bindung des Lanthanoidkomplexes einerseits mit dem Biomolekül andererseits unter Abspaltung von einem ttfa-Liganden und Freisetzung von zwei Wassermolekülen pro Molekül Lanthanoidkomplex. Der Lanthanoidkomplex interagiert dabei z. B. mit einer Carboxylgruppe des Biomoleküls.
2B veranschaulicht einen weiteren Reaktionsmechanismus, welcher dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Markierung bzw. Identifizierung von Biomolekülen zugrundeliegt. Als Lanthanoidkomplex wird diesbezüglich der gemäß 1B dargestellte Lanthanoidkomplex eingesetzt. Es resultiert ein Biomolekül/Lanthanoidkomplex-Konjugat, wobei der Lanthanoidkomplex unter Öffnung des Epoxidrings des 5,6-Epoxy-1,10-phenanthrolino-Liganden des Lanthanoidkomplexes durch Reaktion mit einer Thiolgruppe des Biomoleküls kovalent an das Biomolekül gebunden ist. Die Bezeichnung "Prot'" gemäß 2B wird entsprechend zu der Bezeichnung "Prot" gemäß 2A verwendet.
3 zeigt das Emissionsspektrum von Biomolekül/Lantanoidkomplex-Konjugaten in Abhängigkeit von der Biomolekülkonzentration der eingesetzten Lösung. Als Biomolekül wird z. B. Bovines Serumalbumin (BSA) eingesetzt. Als Lanthanoidkomplex wird Ln(ttfa)₃(H₂O) gemäß 1A eingesetzt, wobei als Lanthanoid Eu(III) verwendet wird. Die BSA-Konzentration in den jeweiligen Lösungen beträgt 2 × 10^–2 mg/ml (obere Kurve), 2 × 10^–3 mg/ml (mittlere Kurve) bzw. 2 × 10^–5 mg/ml (untere Kurve). 3 verdeutlicht, daß die relative Emissionsintensität mit der BSA-Konzentration in der Lösung steigt. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich somit zur qualitativen wie quantitativen Bestimmung des Proteingehaltes in einer Lösung. Für sämtliche Proteinkonzentrationen resultiert ein scharfes bzw. engbandiges Emissionsmaximum im Bereich von 612 nm, was zu einer hervorragenden Detektierbarkeit der markierten Proteine führt. Neben der hohen Fluoreszenzintensität resultiert eine relativ lange, gut detektierbare Fluoreszenzdauer bzw. -lebenszeit. Die Markierung des in Form von BSA eingesetzten Proteins kann erfolgen, indem der Lanthanoidkomplex mit der Lösung des Proteins in Kontakt gebracht wird. Diesbezüglich kann beispielsweise derart verfahren werden, daß der Lanthanoidkomplex zunächst an einer vorzugsweise hydrophoben Oberfläche z. B. eines Reaktionsgefäßes reversibel fixiert bzw. gebunden wird und anschließend eine Lösung des zu markierenden bzw. zu identifizierenden Proteins in das Reaktionsgefäß gegeben wird. Nachfolgend sollte das Reaktionsgefäß z. B. geschüttelt werden, um ein zumindest teilweises Ablösen des Lanthanoidkomplexes von der Oberfläche des Reaktionsgefäßes zu ermöglichen. Ohne sich auf diese Theorie beschränken zu wollen, können die der Markierungsreaktion zugrundeliegenden Mechanismen bzw. Vorgänge darauf beruhen, daß Spuren des an sich nicht wasserlöslichen Lanthanoidkomplexes in die Lösung überführt werden und mit dem zu markierenden bzw. zu identifizierenden Protein interagieren. Dabei ist die Menge an in der Lösung befindlichen Lanthanoidkomplexen äußerst gering, da nahezu sämtliche in Lösung gelagerte Lanthanoidkomplexe sofort abreagieren, so daß eine nachträgliche Abtrennung des markierten Proteins bzw. von nichtreagiertem Lanthanoidkomplex entfallen kann. Grundsätzlich kann jedoch auch eine Aufreinigung, beispielsweise durch Filtration bzw. Zentrifugation, erfolgen. Der zugrundeliegende Reaktionsmechanismus kann dabei so verstanden werden, daß – ohne sich hierauf festlegen zu wollen – bei der Reaktion eines Moleküls des Lanthanoidkomplexes mit dem Protein je Molekül des Lanthanoidkomplexes ein Molekül Ligand (d. h. unkoordiniertes Htffa) sowie zwei Moleküle Wasser aus dem Lanthanoidkomplex freigesetzt werden und der Lanthanoidkern mit den beiden Sauerstoffatomen der Carboxylgruppe des Proteins ein Protein/Lanthanoidkomplex-Konjugat ausbildet.
4 zeigt das Anregungs- und Lumineszenz- bzw. Emissionsspektrum eines Biomolekül/Lanthanoidkomplex-Konjugats. Als Biomolekül wurde das Tripeptid Glutathion (GSH) eingesetzt, und als Lanthanoidkomplex wurde ein Eu(tffa)₃(epoxyphen) gemäß 1B eingesetzt. Es resultiert ein scharfes bzw. engbandiges Emissionsmaximum bei 612 nm. Die Zeitkonstante τ der Emission des Eu(tffa)₃(phen)/GSH-Konjugats beträgt etwa 450 µs.
5 veranschaulicht einen Vergleich der Anregungs- und Lumineszenz- bzw. Emissionsspektren von GSH/Eu(ttfa)₃-Konjugaten einerseits (jeweils obere Kurve des Anregungsspektrums und des Emissionsspektrums) und von Konjugaten aus BSA und Eu(ttfa)₃-Lanthanoidkomplexen andererseits (jeweils untere Kurve des Anregungsspektrums und des Emissionsspektrums), wobei im letzteren Fall ein BSA/Eu(ttfa)₂-Konjugat resultiert. Als Lanthanoidkomplex wurde in beiden Fällen ein Komplex gemäß 1A eingesetzt, wobei als Lanthanoid Eu(III) eingesetzt wurde. Die Zeitkonstante des Emissionsverhaltens beträgt für die GSH/Eu(ttfa)₃-Konjugate τ = 580 ± 2 µs. Für die BSA/Eu(ttfa)₂-Konjugate beträgt die Zeitkonstante τ = 487 ± 1 µs. Für beide Fälle resultiert ein schmales bzw. engbandiges und gut auflösbares Emissionsmaximum bei etwa 615 nm. Das erfindungsgemäße Verfahren zeigt somit sowohl für Proteine mit relativ großem Molekulargewicht, wie BSA, als auch für kleine Modellpeptide, wie GSH, hervorragende Markierungsergebnisse. Während – ohne sich hierauf beschränken zu wollen – bei der Ausbildung der BSA/Eu(ttfa)₂-Konjugate eine Abspaltung eines ttfa-Liganden ("Httfa") zu beobachten ist, erfolgt bei der Ausbildung der GSH/Eu(ttfa)₃-Konjugate keine solche Ligandenabspaltung.
Weiterhin zeigen 6A und 6B als Vergleichsbeispiel das Emissionsverhalten eines Eu(ttfa)₃(phen)-Komplexes als solchen (mit "phen" = 1,10-Phenanthrolin) (6A) sowie von in Polymethylmethacrylat (PMMA) eingearbeitetes bzw. eingebrachtes Eu(ttfa)₃(phen) (6B). Bei dem eingesetzten Lanthanoidkomplex handelt es sich somit hinsichtlich des Phenanthrolin-Liganden um einen solchen Liganden, welcher keine Epoxygruppe besitzt. Der Eu(ttfa)₃(phen)-Komplex liegt in der PMMA-Matrix somit ohne Ausbildung einer Bindung mit der Matrix vor. Die Beispiele gemäß 6A und 6B fungieren als Referenzbeispiele hinsichtlich der Beurteilung der Leistungsfähigkeit der nachfolgenden erfindungsgemäßen Beispiele.
In diesem Zusammenhang zeigt 7 das Emissionsspektrum eines Konjugats, welches durch Interaktion von Eu(ttfa)₃(epoxyphen) mit Glutathion (GSH) erhalten wird (vgl. 4). Es resultiert eine Emissionsbande, welche klar definiert und engbandig ist. Das Emissionsverhalten des Konjugats gemäß 7 ist vergleichbar zu dem Referenzbeispiel gemäß 6B mit der Folge, daß das erfindungsgemäße Verfahren auf Basis der in 7 eingesetzten Lanthanoidkomplexe äußerst leistungsfähig ist und zu gut detektierbaren und analysierbaren Emissionsbanden führt.
8A zeigt das Emissionsspektrum eines Eu(ttfa)₃(H₂O)₂-Komplexes gemäß 1A als solchen, und 8B zeigt das Emissionsspektrum des Eu(ttfa)₃(H₂O)₂-Komplexes in einer PMMA-Matrix. Während für das Emissionsverhalten des Eu(ttfa)₃(H₂O)₂-Komplexes als solchen eine Zeitkonstante von τ = 198 ± 2 µs bestimmt wird, beträgt die Zeitkonstante für den Eu(ttfa)₃(H₂O)₂-Komplex in der PMMA-Matrix 362 ± 3 µs. Es resultiert somit eine Verlängerung der Emission des Komplexes bei Einbringen in eine Matrix.
9 zeigt das Absorptions- und Lumineszenz- bzw. Emissionsspektrum eines Komplexes, welcher durch Reaktion von Glutathion (GSH) mit Epoxyphenanthrolin (Epoxyphen) erhalten wurde ("GSH-Phen"). Das resultierende Konjugat weist somit keinen Chelatkomplex eines Elements der Seltenen Erden und somit keinen Lanthanoidkern auf. 9 zeigt weiterhin das Absorptions- und Lumineszenz- bzw. Emissionsspektrum von Epoxyphenanthrolin ("Epoxyphen") als solches und damit des erfindungsgemäß für die entsprechenden Lanthanoidkomplexe eingesetzten Liganden, jedoch ohne entsprechenden Lanthanoidkern. In beiden Fällen resultieren relativ unspezifische Emissionsverhalten ohne Ausbildung eines diskreten und engbandigen Emissionsmaximums bzw. Emissionspeaks (Vergleichsbeispiele).
10 zeigt schließlich das Absorptions- und Lumineszenz- bzw. Emissionsspektrum von Konjugaten, wobei als Biomolekül der Zuckeralkohol Chitosan eingesetzt wird. Als Komplex des Elements der Seltenen Erden wurde ein Eu(III)-Komplex, welcher einen wie zuvor beschriebenen Epoxyphenanthrolinliganden (1,5-Epoxy-1,10-Phenanthrolin) aufweist (obere Kurve bzw. Kurve mit Emissionsmaximum bei etwa 615 nm), bzw. ein Tb(III)-Komplex mit einem wie zuvor beschriebenen Epoxyphenathrolin-Liganden (untere Kurve bzw. Kurve mit Emissionspik bei etwa 545 nm) eingesetzt. Die verwendeten Komplexe der Seltenen Erden besitzen jeweils fünf koordinierte Wassermoleküle. Die jeweiligen Lanthanoide werden in Form von LnCl₃ eingesetzt. Es resultieren somit Chitosan/Ln-Phen-Konjugate mit den in 10 dargestellten Emissionsverhalten. In bezug auf das mit dem Eu(III)-Komplex markierte Chitosan resultiert ein Emissionsmaximum bei etwa 615 nm, während in bezug auf das Konjugat mit dem Tb(III)-Komplex ein Emissionsmaximum bei etwa 545 nm vorliegt.
Zusammenfassend fokussiert die vorliegende Erfindung auf ein lumineszenzoptisches Verfahren, die Verwendung spezieller Komplexe von Seltenen Erden und Materialkombinationen, auf dessen Basis eine besonders vereinfachte, empfindliche und kostengünstige Bestimmung von Biomolekülen, insbesondere wie zuvor angeführt, ermöglicht wird. Hierbei kommt gemäß einer Ausführungsform ein aus dem Stand der Technik bekannter Europium/Diketonato-Komplex zum Einsatz, nämlich [Tris(1-(2-thenyl)-4,4,4-trifluorbutan-1,3-dionato)(diaquo)]Eu(+III), welcher auch als Eu(ttfa)₃(H₂O)₂ bezeichnet wird und welcher durch einen partiellen Ligandenaustauch unter gleichzeitiger Verdrängung koordinierten Wassers in der Lage ist, insbesondere mit Carboxyl- bzw. Carboxylatgruppen von Biomolekülen, wie z. B. Proteinen, eine kovalente Bindung einzugehen. Als Modellprotein kann dabei Bovines Serumalbumin (BSA) verwendet werden. Das Protein kann hierbei in wäßriger Lösung bzw. Dispersion mit überschüssigem Komplex in einer heterogenen Reaktion lumineszenzmarkiert werden; nicht mit dem Protein gekoppelter Komplex kann z. B. durch Zentrifugation leicht abgetrennt werden. Die Reaktion kann dabei entsprechend der Reaktionsgleichung Eu(ttfa)₃(H₂O)₂ + H(BSA) → Eu(ttfa)₂-BSA + H(ttfa) + 2H₂O erfolgen.
Die grundsätzlich verwendbaren Komplexe sind dabei nicht auf das Diketon 1-(2-Thenyl)-4,4,4-trifluorbutan-1,3-dion beschränkt ("H(ttfa)") und Eu³⁺ bzw. Eu(III) beschränkt, sondern erstrecken sich auf alle Diketonate und Seltenerdmetalle bzw. Seltenerdionen, welche bei Anregung im UV-Bereich eine spektrale Antwort durch Lumineszenz ermöglichen.
Besondere Vorteile der erfindungsgemäß eingesetzten Komplexe bestehen in ihrer Verfügbarkeit und einfachen Herstellungsmethode, ihren günstigen Lumineszenzeigenschaften (großer Stokes-Shift, lange Lebensdauern der angeregten Zustände, effiziente und breitbandige Anregung durch den sogenannten Antenneneffekt, schmalbandige Emissionslinien) und – im Rahmen der hier beschriebenen Analysenmethodik – in der genannten Wasserunlöslichkeit der Komplexe.
Die langen Lebensdauern der angeregten Zustände können genutzt werden, um eine hervorragende Differenzierbarkeit des Emissionsspektrums gegenüber den Anregungsspektrum und/oder der unspezifischen Fluoreszenz zu realisieren.
Im Rahmen von experimentellen Untersuchungen können die Feststoff-Quantenausbeuten eines aus einer Lösung isolierten Protein/Seltenerdkomplex-Konjugate Eu(ttfa)₂BSA zu 14,5 % bestimmt werden; die zugehörigen Lumineszenzabklingzeiten betragen 487 µs, wohingegen bei einer Vergleichsmessung der Abklingzeit des reinen Eu(ttfa)₃(H₂O)₂ unter gleichen Meßbedingungen lediglich 196 µs ermittelt werden können.
Die Koordinationsänderung am Eu³⁺-Zentrum kann weiterhin durch einen Vergleich der Emissionsspektren des besonders effizienten Komplexes Eu(ttfa)₃phen (Abklingzeit 945 µs, phen = 1,10-Phenanthrolin) und Eu(ttfa)₃(H₂O)₂ mit Eu(ttfa)₂BSA belegt werden, indem sich symmetriebedingt das charakteristische Emissionsmuster des Eu(ttfa)₂BSA im Bereich der ⁵D₀ → ⁷F₂ Emissionen denen des Eu(ttfa)₃phen stark annähert. Die langen Lebensdauern der angeregten Zustände der BSA/Seltenerdkomplex-Konjugate können zudem zu einer Diskriminierung der Autofluoreszenz der organischen Proben ausgenutzt werden.
In diesem Zusammenhang kann auf 6A mit Eu(ttfa)₃phen, 3 mit Eu(ttfa)₂BSA und 8A mit Eu(ttfa)₃(H₂O)₂ verwiesen werden.
Das Prinzip der Markierung mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens auf Basis der Seltenerd(chelat)komplexe fokussiert auf β-Diketonat-Liganden, die hohe Absorptionen und hohe Quantenausbeuten ermöglichen. Als etwaige weitere Liganden ("Co-Liganden"), insbesondere zur Schließung der Koordinationssphäre und/oder zur Beeinflussung des Absorptionsverhaltens, können Bipyridine und Phenanthroline sowie deren substituierte Derivate in Betracht kommen.
Die Liganden dienen einerseits sozusagen als Antennen für die Anregungsstrahlung und andererseits für die Abschirmung des zentralen Seltenerd-Ions zum Schutz vor Quenching, wie es z. B. durch Wasser verursacht werden kann.
Eine Markierungsprozedur auf Basis des erfindungsgemäßen Verfahrens kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:

– Der Feststoff Eu(ttfa)₃ wird in einem organischen Lösungsmittel gelöst (z.B. Acetonitril oder Toluol);
– die Lösung wird in ein hydrophobes bzw. hydrophobisiertes Gefäß, z. B. ein hydrophobes bzw. hydrophobisiertes Reaktionsgefäß bzw. -behältnis, gegeben;
– in einer Vakuumzentrifuge oder durch simples Abdampfen wird das Lösungsmittel entfernt und der Feststoff gleichmäßig an der inneren Oberfläche des Reaktionsgefäßes verteilt;
– die Proteinlösung wird in das vorbereitete Gefäß gegeben und bis zu acht Stunden geschüttelt (alternativ können zur Oberflächenvergrößerung auch Eu(ttfa)₃ belegte Mikrosphären oder HPLC-Partikel zugegeben werden, was zu einer Verkürzung der Inkubationszeit führt);
– Zentrifugation, um Mikrokristalle zu entfernen; und schließlich
– Entnahme der markierten Proteinlösung.

Eigenschaften des markierten Proteins:

– Anregung im UV zwischen 300 und 390 nm;
– Emission bei 612 ± 5 nm;
– Fluoreszenzlebensdauer typischerweise 0,5 ms;

Weitere Vorteile und Eigenschaften:

– Europium-Filter sind kommerziell für viele Spektroskope erhältlich;
– optimal funktioniert die Markierung in HEPES- oder MES-Puffer;
– die Nachweisgrenze liegt mit dem erfindungsgemäßen Verfahren im gleichen Bereich wie kommerziell erhältliche Systeme, z. B. Nano Orange^® von Molecular Probes;
– das erfindungsgemäße Verfahren funktioniert mit Antikörpern und rohen Proteinlösungen;
– die Toxizität von Seltenen Erden ist sehr gering, Verfütterung an Ratten ergab über drei Generationen hinweg keine Schäden (Haley, T. J., "Handbook on the Physics and Chemistry of Rare Earths", ed. K.A. Gschneider Jr., L. Eyering, Chapter 40, North-Holland Publishing Company, 1979).

Weitergehende Ausgestaltungen, Abwandlungen und Variationen der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann beim Lesen der Beschreibung ohne weiteres erkennbar und realisierbar, ohne daß er dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verläßt.

Claims

Verfahren zur Markierung und/oder Identifizierung mindestens eines Biomoleküls, wobei das Biomolekül mit mindestens einem Chelatkomplex mindestens eines Elements der Seltenen Erden ("Seltenerdkomplex") in Kontakt gebracht und hiermit unter Ausbildung einer Bindung zwischen Biomolekül einerseits und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden andererseits zur Wechselwirkung gebracht wird, wobei der Komplex des Elements der Seltenen Erden der Formel gemäß der allgemeinen Formel (I)
entspricht, wobei: • "M" ein Element der Seltenen Erden darstellt, wobei das Element der Seltenen Erden ausgewählt ist aus der Gruppe von Scandium, Yttrium, Lanthan, Cer, Praseodym, Neodym, Promethium, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium und Lutetium, • "n" eine ganze Zahl von 1 bis 3 bezeichnet, • "m" eine ganze Zahl von 1 bis 3 bezeichnet und • "X" einen Liganden der folgenden Formel darstellt:
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) "M" Europium, besonders bevorzugt in der Form von Europium(III), darstellt und/oder daß in der allgemeinen Formel (I) "n" 2 oder 3 bezeichnet und/oder daß in der allgemeinen Formel (I) "m" 1 bezeichnet.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß in der allgemeinen Formel (I) n = 2 ist, sofern X einen Rest der Formel (IIa) darstellt, und/oder daß in der allgemeinen Formel (I) n = 3 ist, sofern X einen Rest der Formel (IIb) darstellt, und/oder daß der Chelatkomplex der allgemeinen Formel (I) außerdem vorzugsweise koordinativ gebundenes Wasser, vorzugsweise zwei Wassermoleküle pro Molekül Komplex, aufweist, insbesondere sofern X einen Rest der Formel (IIa) darstellt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomolekül ausgewählt ist aus der Gruppe von Proteinen, Peptiden, Antikörpern und Nukleinsäuren.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Biomolekül an den Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden anbindet, vorzugsweise über eine koordinative und/oder kovalente, bevorzugt koordinative Bindung, gegebenenfalls unter Substitution und/oder Abspaltung und/oder Freisetzung mindestens eines Liganden des Chelatkomplexes des Elements der Seltenen Erden.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung des Chelatkomplexes des Elements der Seltenen Erden über mindestens eine funktionelle Gruppe des Biomoleküls erfolgt, insbesondere wobei die funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus Carboxyl-, Carbonyl-, Thiol-, Amino- und/oder Hydroxylgruppen.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung des Biomoleküls an den Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden unter Ausbildung eines Konjugats aus Biomolekül und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden erfolgt ist ("Biomolekül/Seltenerdkomplex-Konjugat").
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden einen Fluorophor, insbesondere einen Farbstoff, vorzugsweise einen Lumineszenz- und/oder Fluoreszenzfarbstoff, umfaßt und/oder darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden der Formel gemäß 1A entspricht, wobei "Ln" ein Element der Seltenen Erden, insbesondere wie zuvor definiert, vorzugsweise Europium, besonders bevorzugt in der Form von Europium(III), darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden der Formel gemäß 1B entspricht, wobei "Ln" ein Element der Seltenen Erden, insbesondere wie zuvor definiert, vorzugsweise Europium, besonders bevorzugt in der Form von Europium(III), darstellt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktionsprodukt aus Biomolekül einerseits und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden andererseits, insbesondere das Konjugat aus Biomolekül und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden ("Biomolekül/Seltenerdkomplex-Konjugat"), insbesondere unter Einwirkung von Anregungsenergie und/oder Absorption von Anregungsenergie, luminesziert, insbesondere fluoresziert, und/oder daß das Reaktionsprodukt aus Biomolekül einerseits und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden andererseits, insbesondere das Konjugat aus Biomolekül und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden ("Biomolekül/Seltenerdkomplex-Konjugat"), insbesondere unter Einwirkung von Anregungsenergie und/oder Absorption von Anregungsenergie, detektierbare Energie, insbesondere in Form von Lumineszenz, vorzugsweise Fluoreszenz, freisetzt, insbesondere wobei die freigesetzte und/oder emittierte Energie von der Anregungsenergie differenzierbar und/oder unterscheidbar ausgebildet ist, vorzugsweise die Lumineszenzemissionswellenlänge von der Anregungsenergieabsorptionswellenlänge differenzierbar und/oder unterscheidbar ausgebildet ist, und/oder insbesondere wobei die Lumineszenz, vorzugsweise Fluoreszenz, im Bereich des sichtbaren Lichts erfolgt und/oder insbesondere wobei die Anregung mit Licht einer Wellenlänge unterhalb von 400 nm, vorzugsweise im Bereich von UV-Licht, erfolgt und/oder insbesondere wobei die freigesetzte und/oder emittierte Energie mittels einer Detektionsvorrichtung, insbesondere mittels eines Spektrometers, erfaßt wird, vorzugsweise qualitativ und/oder quantitativ erfaßt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen und/oder die Umsetzung von Biomolekül einerseits und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden andererseits unter Bedingungen erfolgt derart, daß das Biomolekül, insbesondere dessen Struktur, bei der Umsetzung zumindest im wesentlichen erhalten bleibt, insbesondere das Biomolekül nicht denaturiert wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen und/oder die Umsetzung von Biomolekül einerseits und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden andererseits durchgeführt wird, indem zunächst eine Lösung und/oder Dispersion, vorzugsweise eine insbesondere wäßrige Lösung, des Biomoleküls hergestellt wird und die so hergestellte Lösung und/oder Dispersion des Biomoleküls nachfolgend mit dem Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden in Kontakt und zur Wechselwirkung, insbesondere Reaktion, gebracht wird, vorzugsweise hiermit umgesetzt wird, insbesondere wobei der Komplex des Elements der Seltenen Erden in fester Phase vorliegt.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei dem Inkontaktbringen und/oder bei der Umsetzung von Biomolekül einerseits und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden andererseits der Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden in fester Phase vorliegt, insbesondere als Feststoff in Masse vorliegt oder aber an ein festes Substrat, vorzugsweise an einen hydrophoben Träger, reversibel angebunden und/oder immobilisiert und/oder fixiert ist, insbesondere wobei der Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden bedarfsweise vom Substrat bei Kontakt mit dem Biomolekül freigesetzt wird und/oder insbesondere wobei das feste Substrat die Wandung eines Reaktionsgefäßes, ein partikelförmiger Träger, die feste Phase einer Chromatographiereinrichtung ("HPLC-Kügelchen") oder dergleichen ist.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen und/oder die Umsetzung von Biomolekül einerseits und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden andererseits bei einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 8, vorzugsweise 5,5 bis 7,5, erfolgt und/oder daß das Inkontaktbringen und/oder die Umsetzung von Biomolekül einerseits und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden andererseits bei einer Temperatur im Bereich von –20 °C bis +40 °C, vorzugsweise 0 °C bis +35 °C, erfolgt und/oder daß der Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden unter Reaktionsbedingungen nur geringfügig löslich, insbesondere nur geringfügig wasserlöslich, ausgebildet ist, insbesondere wobei die Löslichkeit geringer als die des Biomoleküls ist, vorzugsweise um den Faktor 100, insbesondere 1.000, besonders bevorzugt 10.000.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden unspezifisch in bezug auf das Biomolekül ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen und/oder die Umsetzung von Biomolekül einerseits und Chelatkomplex des Elements der Seltenen Erden andererseits gemäß der nachfolgenden Reaktionsgleichung erfolgt:
wobei: • "Eu" einen Europium(III)-Kern bezeichnet, • "ttfa" einen Rest der obigen Formel (IIa) bezeichnet und/oder "ttfa" einen 1-(2-Thenyl)-4,4,4-trifluorbutan-1,3-dionato-Liganden bezeichnet, • "Prot" einen Biomolekülabschnitt, insbesondere einen Proteinabschnitt, bezeichnet und • "R" einen beliebigen organischen Rest oder Wasserstoff darstellt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen und/oder die Umsetzung von Biomolekül einerseits und Komplex des Elements der Seltenen Erden andererseits gemäß der nachfolgenden Reaktionsgleichung erfolgt:
wobei: • "Eu" einen Europium(III)-Kern bezeichnet, • "ttfa" einen Rest der obigen Formel (IIa) bezeichnet und/oder "ttfa" einen 1-(2-Thenyl)-4,4,4-trifluorbutan-1,3-dionato-Liganden bezeichnet und • "Prot'" einen Biomolekülabschnitt, insbesondere einen Proteinabschnitt, bezeichnet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Inkontaktbringen und/oder die Umsetzung von Biomolekül einerseits und Chelatkomplex der Seltenen Erden andererseits entsprechend der Reaktionsgleichung gemäß 2A oder 2B erfolgt, wobei die dort angegebenen Bezeichnungen "Prot" und "Prot'" die zuvor angegebene Bedeutung haben.
Verwendung mindestens eines Chelatkomplexes mindestens eines Elements der Seltenen Erden, wie zuvor definiert, zur Markierung und/oder Identifizierung mindestens eines eines Proteins, eines Peptids, eines Antikörpers oder einer Nukleinsäure.
Verwendung mindestens eines Chelatkomplexes mindestens eines Elements der Seltenen Erden, wie zuvor definiert, zur Fluoreszenzmarkierung oder -identifizierung, mindestens eines Proteins, eines Peptids, eines Antikörpers oder einer Nukleinsäure.
Kit zur Markierung und/oder Identifizierung mindestens eines Biomoleküls, umfassend mindestens ein Reaktionsgefäß und/oder einen abgegrenzten Reaktionsraum, wobei in dem Reaktionsgefäß und/oder Reaktionsraum mindestens ein Chelatkomplex – mindestens eines Elements der Seltenen Erden ("Seltenerdkomplex"), wie zuvor definiert, befindlich ist.
Biomolekül/Seltenerdkomplex-Konjugat erhältlich durch Inkontaktbringen und/oder Umsetzung mindestens eines Biomoleküls einerseits und mindestens eines Chelatkomplexes mindestens eines Elements der Seltenen Erden ("Seltenerdkomplex"), wie zuvor definiert, andererseits.
Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, Kit nach Anspruch 22 oder Konjugat nach Anspruch 23, gekennzeichnet durch eines oder mehrere der Merkmale des kennzeichnenden Teils der Ansprüche 1 bis 19.