DE2350179B2

DE2350179B2 - Verfahren zur fluorometrischen bestimmung von sekundaeren alpha-aminosaeuren und mittel zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE2350179B2
Application number: DE19732350179
Authority: DE
Inventors: Willy Montclair; Weigele Manfred North Caldwell; N.J. Leimgruber (V.St.A.)
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1972-10-18
Filing date: 1973-10-05
Publication date: 1976-01-22
Also published as: FR2204303A5; CH621875A5; CA1004580A; DK142382C; DE2350179A1; AU461986B2; ZA737204B; JPS4988590A; SE394144B; NL158934B; DK142382B; AU6075073A; BE806180A; IN138599B; US3830629A; IT1014509B; GB1407177A; NL7314087A

Description

(D

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß man die Bestimmung konti nuierlich in einem wäßrigen Probenstrom durch führt.

15. Reagenzien zur Bestimmung einer Sekunda ren α-Aminosäure, mit einem Mittel, welches aktives Chlor oder Brom liefert, und einem fluorogener Reagenz der allgemeinen Formel

worin R Wasserstoff, Halogen, nieder-Alkyl oder nieder-Alkoxy und R' nieder-Alkyl oder Aryl bedeutet, ein fluoreszierendes Material erzeugt, und
(d) die Fluoreszenz mißt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennjzeichnet, dall die Verbindung der Formel I 4-Phe-Hylspiro[furan-2(3 H),l'-phthalan]-3,3'-dion ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel, welches aktives Chlor liefert N-Chlorsuccinimid ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel, welches aktives Brom liefert, N-Bromsuccinimid ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel, welches aktives Brom liefert, Brom ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a) der pH-Wert 2 ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche ' bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur ^wischen 0 und 30⁰C liegt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) der pH-Wert des wäßrigen Mediums zwischen 7,5 U3id 9,5 liegt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (a), im Vergleich zur sekundären α-Aminosäure, ein 100- bis ToOOfacher Überschuß an dem Mittel, welches aktives Chlor oder Brom liefert, verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) ein Überschuß an fluorogenem Reagenz verwendet wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die sekundäre α-Aminosäure cyclisch ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die cyclische sekundäre α-Aminosäure Prolin ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die cyclische sekundäre α-Aminosäure 4-Hydroxyprolin ist.

worin R Wasserstoff, Halogen, nieder-Alkyl oder nieder-Alkoxy und R' nieder-Alkyl oder Aryl ist.

16. Reagenzien nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das fluorogene Reagenz der Formel I 4 - Phenylspiro[furan - 2(3 H)₁I' - phthalan]-3,3'-dion ist.

17. Reagenzien nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel, welches aktives Chlor liefert, N-Chlorsuccinimid ist.

18. Reagenzien nach Anspruch 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel, welches aktives Brom liefert, N-Bromsuccinimid ist.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fluorometrischen Bestimmung von sekundären α-Aminosäuren sowie Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden sekundäre α-Aminosäuren in primäre Amine umgewandelt, woran sich eine Reaktion mit bekannten fluorogenen Reagenzien und die Messung der Fluoreszenz anschließt.

Die qualitative und quantitative Bestimmung von Aminosäuren ist heutzutage ein wichtiges Verfahren unter denjenigen, weiche dem Chemiker oder dem Biochemiker zu Verfügung stehen, um biologische Verfahren besser zu verstehen und unter anderem die Kenntnisse im Bereich der Diagnose und der Behandlung von Krankheiten zu vergrößern. In vielen Laboratorien ist es üblich geworden, Analysatoren zu verwenden, welche die Untersuchung der Menge und der Verteilung von Aminosäuren in Protein oder Polypeptid enthaltenden Proben ermöglichen. Bis vor kurzem war jedoch der Forscher auf Grund der geringen Empfindlichkeit solcher Aminosäurebestimmungen gezwungen, mit relativ großen Mengen an Probe zu arbeiten.

Kürzlich wurde durch M. W e i g e 1 e, et al., J. Am. Chem. Soc, Vol. 94, p. 5927 (1972); S. U d e η f r i e ü d et al., Third Am. Peptide Symposium, 1972, und W. Leimgruber et al., belgisch? Patentschrift 7 93 180 eine neue Art von Reagenzien (fluorogene Reagenzien) beschrieben, welche bei Raumtemperatur schnell mit primäre Aminogruppen enthaltenden Verbindungen, wie z. B. Aminosäuren und Peptiden, reagieren und fluoreszierende Produkte mit einem

sehr hohen FluoreszenzgiSd ergeben. Diese Reagenzien ermöglichen die Bestimmung von Mengen an primäre Aminogruppen enthaltenden Verbindungen, welche unterhalb eines Mikromols liegen.

Die in den obengenannten Literaturstellen beschriebene Bestimmungsmethode hat jedoch den Nachteil, daß sekundäre Aminosäuren wie z. B. Prolin und 4-Hydroxyprolin, welche den in der Natur vorkommenden Aminosäuren angehören, nicht bestimmt werden können, weil die fluorogenen Reagenzien nicht ι ο direkt mit sekundären Aminosäuren reagieren. Dies beschränkt diese Methode auf die Verwendung für die Bestimmung von primären Aminosäuren.

Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens, welches eine schnelle Bestimmung von !5 sekundären Aminosäuren, insbesondere von cyclischen sekundären α-Aminosäuren wie Prolin und 4-Hydroxyprolin, ermöglicht, sowie Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens. Erfindungsgemäß wird eine sekundäre α-Aminosäure unter sehr milden Bedingungen, z.B. bei Raumtemperatur, in ein primäres Amin übergeführt, wobei Reagenzien verwendet werden, welche im Überschuß vorhanden sein können und mit der anschließenden Reaktion zwischen dem entstandenen primären Amin und den fluorogenen Reagenzien oder mit der Bestimmung der gebildeten fluoreszierenden Verbindungen nicht interferieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung einer sekundären α-Aminosäure zeichnet sich dadurch aus, daß man

(a) diese sekundäre α-Aminosäure in einem wäßrigen Medium bei einem pH-Wert zwischen 1 und 4 mit einem Mittel, welches aktives Chlor oder Brom liefert, behandelt,

(b) einen pH-Wert zwischen 6 und 11 einstellt,

(c) mittels einer fluorogenen Verbindung der allgemeinen Formel

-R'

40

(D

über den Abbau von sekundären Aminosäuren durch die Behandlung mit verschiedenen N-Bromimiden gibt es bereits Hinweise in der Literatur (Schönberg et al., J. Chem. Soc. [London], 1951, p. 2504). In dieser Publikation wird gezeigt, daß die Behandlung von verschiedenen cyclischen sekundären α-Aminosäuren mit N-Bromimiden zur Bildung von Aldehyden führt. In der für diese Umsetzung vorgeschlagenen chemischen Gleichung wurde die Bildung eines primären Amins als Nebenprodukt postuliert, ohne daß jedoch dieser Punkt diskutiert oder experimentell bestätigt wurde.

Die Herstellung der Verbindungen der Formel I wird in der belgischen Patentschrift 793 180 be-Die Bezeichnung »nieder-Alkyl« umfaßt einen monovalenten, gesättigten geradkettigen oder verzweigten Kohlenwasserstoffsubstituenten, der bis zu 8 Kohlenstoffatome enthält Der Ausdruck »nieder-AJkoxy« umfaßt eine derartige niedere AJkylgruppe, die über einen Äthersauerstoff an das Molekül gebunden ist. Der Ausdruck »Acyl« bedeutet ein aromatisches Ringsystem, das mit einem oder mehreren der folgenden Substituenten substituiert sein kann: Halogen (Fluor, Chlor, Brom oder Jod), nieder-Alkyl, nieder-Alkoxy, Nitro, Cyan usw. Als Beispiele für ein aromatisches Ringsystem können genannt werden: Phenyl, Naphthyl, Furyl, Thienyl, Pyrrolyl, Imidazolyl, Pyridyl, Pyrimidinyl, Indolyl, Chinolyl, Oxazolyl, Isoxazo-IyI usw. Eine besonders bevorzugte Verbindung der Formel I ist diejenige, worin R Wasserstoff und R' Phenyl ist, d. h. 4 - Phenylspiro[furan - 2(3H), 1 ^f-phthalan]-3,3'-dion

Im ersten Teil des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens wird eine sekundäre α-Aminosäure zu einem primären Amin abgebaut. Dieser Abbau erfolgt durch Halogenierung (Oxydation) mit Hilfe eines Mittels, welches aktives (positives) Chlor oder Brom liefert. Geeignete, aktives Chlor oder Brom liefernde Mittel sind die Halogene selbst, d. h. Chlor und Brom, N-Chlor- oder N-Bromimide und N-Chlor- oder N-Bromamide. Als Beispiele für die letztgenannten Reagenzien können N-Chlorsuccinimid, N-Bromsuccinimid, N-Bromacetamid, N-Bromphthalamid erwälun werden.

Die Halogenierung wird in einem pH-Bereich von 1 bis 4, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 2 durchgeführt. Auf diese Weise erfolgt die Reaktion mit äußerster Schnelligkeit unter milden Bedingungen. Es wird bevorzugt, die Reaktion bei einer Temperatur zwischen 0 und 30⁰C durchzuführen, wobei Zimmertemperatur ganz besonders bevorzugt wird. Dies hat zur Folge, daß das erfindungsgemäße Verfahren sich sehr gut für die automatische Bestimmung von Aminosäuren eignet.

Für die Halogenierung von cyclischen sekundären α-Aminosäuren wie Prolin oder 4-Hydroxyprolin werden mit Vorteil N-Chlorsuccinimid oder N-Bromsuccinimid als Chlor oder Brom lieferndes Mittel verwendet. Für die Halogenierung von acyclischen sekundären α-Aminosäuren wie Sarcosin (N-Methylglycin) wird mit Vorteil das Halogen selbst verwendet, wobei Brom besonders bevorzugt ist.

Die Halogenierungsreaktion wird mit Vorzug in einem wäßrigen Milieu durchgeführt. Dies, weil bei einer Aminosäurebestimmung die sekundären α-Aminosäuren von einer Chromatographiesäule normalerweise in wäßriger Lösung eluiert werden. Weiter sind die Mittel, welche aktives Chlor oder Brom liefern, genügend wasserlöslich, um die Herstellung von Vorratslösungen zur Reaktion mit Aminosäuren zu ermöglichen. Um einen maximalen Abbau der sekundären α-Aminosäure zu erreichen, wird es bevorzugt, das Mittel, welches aktives Chlor oder Brom liefert, im Überschuß zu verwenden. Besonders geeignet ist ein 100- bis lOOOfacher Überschuß. Es wurde überraschend festgestellt, daß ein derartiger Überschuß mit der anschließenden Reaktion und Fluoreszenzmessung nicht interferiert.

In der Oxydation-Decarboxylierung-Hydrolyse-Sequenz wird angenommen, daß die erste Stufe die N-Halogenierung der sekundären α-Aminosäure ist, und anschließend Kohlendioxyd und das Halogen

freigesetzt werden, wobei ein Imin erhalten wird. Die wäßrige Hydrolyse des Imins zum freien primären Amin erfolgt zweckmäßigerweise in einem neutralen oder alkalischen Milieu. Es ist dementsprechend notwendig, um eine optimale Menge an. freiem primären Amin in Lösung zu erhalten, den pH-Wert zwischen 6 und 11, vorzugsweise zynischen 7,5 und 9,5 einzustellen.

Das angenommene Verfahren wird nachstehend am Beispiel von Prolin erläutert.

CO,H

-N
Cl'Br)

CO₁H

In diesem Falle ist ersichtlich, daß das 1min l'-Pyrrolin ist und in Anwesenheit von Wasser mit dem entsprechenden a-Aminoaldehyd im Gleichgewicht steht. I in Falle einer acyclischen Aminosäure ergibt die Rea ktion des erhaltenen Imins mit Wasser zwei verschiedene

CH₃NHCH₂CO₂H

CH₃NCH₂CO₂H
CI(Br)

H₂N(CH₂),CHO

Verbindungen, einen Aldehyd und ein Amin. Dies wird nachstehend am Beispiel von Sarcosin, wo Methylamin und Formaldehyd gebildet werden, illustriert.

Es ist zu bemerken, daß die obenerwähnten Reaktionen auch mit primären u-Aminosäuren erfolgen. In diesem Falle wird jedoch Ammoniak gebildet. Ammoniak reagiert mit den fluorogenen Verbindungen der Formel I unter Bildung von Reaktionsprodukten, die, im Vergleich zu denjenigen, welche mit primären Aminen erhalten werden, einen sehr niedrigen Fluoreszenzgrad aufweisen. Aus diesem Grund können mit der erfindungsgemäßen Methode sekundäre α-Aminosäuren auch in Gegenwart von primären α-Aminosäuren bestimmt werden, und dies ohne wirkliche Störung durch die Letzteren.

In der nächsten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das durch die Oxydation-Decarboxylierung-Hydrolyse-Sequenz gebildete primäre Amin mit der fluorogenen Verbindung der Formel I, vorzugsweise mit 4-Phenylspiro[furan-2(3H),l'-phthalan]-3,3'-di;on, umgesetzt. Wie in der am Anfang der Beschreibung erwähnten Literatur beschrieben, wird die Reaktion von primären Aminen mit den Verbindungen dei; Formel I zur Bildung von fluoreszierenden Produkten, vorzugsweise in einem schwach alkalischen Milieu, durchgeführt. In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, daß in der bereits erwähnten Oxydation-Decarboxvlierung-Hydrolyse-Sequenz der pH-Wert schon zwischen 6 und 11, vorzugsweise zwischen 7,5 und 9,5, gehalten wird, so daß keine oder nur eine geringe Einstellung des pH-Wertes notwendig ist. In der letzten Stufe wird die Fluoreszenz des Reaktionsproduktes des primären Amins mit einem Überschuß an einer Verbindung der Formel I — wie in der Literatur beschrieben — gemessen.

Es wurde überraschend festgestellt, daß die Intensitat der Fluoreszenz dieser Reaktionsprodukte von der Konzentration der ursprünglich vorhandenen sekundären α-Aminosäure linea; abhängig ist, und daß das erfindungsgemäße Verfahren die qualitative und quantitative Bestimmung von sehr kleinen Mengen an sekundären u-Aminosäuren ermöglicht. So konnte z. B., durch die erwähnte Oxydation-Decarboxylierung - Hydrolyse - Methode, die anschließend" Reaktion mit einer fluorogenen Verbindung der Formel I und Fluoreszenzmessung, Prolin in Konzentrationen zwischen 0,1 und 1,0 nanomolen qualitativ und quantitativ bestimmt werden. Die Empfindlichkeit liegt somit in der Größenordnung derjenigen.

CH₃N = CH₂

CH₃NH₂ + CH₂O

welche bei den in der Literatur beschriebenen Bestimmungen von primären Aminen festgestellt wurde.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß weder Nebenprodukte (z. B. Aldehyde) noch ein Überschuß an Reagenzien auf die Messung der Fluoreszenz einwirken.

Es ist ebenfalls zu bemerken, daß das erfindungsgemäße Verfahren auch zur Bestimmung von sekundären α-Aminosäuren, in papierchromatographischen oder dünnschichtchromatographischen Systemen verwendet werden kann. Bei einer solchen Technik wird nicht — wie bereits beschrieben — völlig in Lösung operiert, sondern es werden die verschiedenen Reagenzien nacheinander auf das papier- oder dünnschichtchromatographische System, vorzugsweise als ein Spray, appliziert. Nach der Reaktion mit dem fluorogenen Reagenz wird das Papier- oder Dünnschichtchromatogramm unter einer Fluoreszenzlichtquelle überprüft.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet zur Verwendung bei der automischen Analyse von Mischungen, welche sowohl primäre als sekundäre α-Aminosäuren enthalten. Die Aminosäuren werden in einer chromatographischen Kolonne getrennt, wobei ein kontinuierlich ausfließender Probenstrom erhalten wird, worin die verschiedenen Aminosäuren in einer bekannten Reihenfolge und mit einem fixierten Zeitabstand zum Vorschein kommen. Dieser Probenstrom wird kontinuierlich zur Bildung von fluoreszierenden Produkten reagieren gelassen, und die entstandene Fluoreszenz wird gemessen.

So werden z. B. in einer Ausfuhrungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die primären α-Aminosäuren in dem aus der chromatographischen Kolonne ausfließenden Eluat — wie in der Literatur beschrieben — nach Einstellung des pH-Wertes kontinuierlich mit den fluorogenen Verbindungen der Formel I umgesetzt. Der Teil des ausfließenden Eluats, welcher die sekundäre u-Aminosäuren, insbesondere Prolin und 4-Hydroxyprolin enthält, kann — vorzugsweise automatisch — abgezweigt und unter sauren Bedingungen mit einem Mittel, welches aktives Chlor oder Brom liefert, behandelt werden.' Anschließend wird der abgezweigte Probenstrom wieder in den Hauptstrom geleitet, der pH-Wert eingestellt und die Reaktion mit dem fluorogenen Reagenz der Formel I durchgeführt. Die auf diese Weise entstandene Fluores-

zenz wird kontinuierlich mit Hilfe eines Fluoreszenzphotometers, gemessen.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die sekundären α-Aminosäuren in Gegenwart von primären α-Aminosäuren bestimmt. In diesem Fall werden die primären α-Aminosäuren bei einem ersten Durchströmen der chromatographischen Kolonne und des Fluorometers in üblicher Weise bestimmt, während die sekundären u-Aminosäuren bei diesem ersten Durchströmen nicht erfaßt werden, ι ο Anschließend wird die Kolonne ein zweitesmal durchflossen (als Alternative kann ein vom ersten Durchgang abgezweigter Sircrn verwendet werden) und das Eluat oder ein Teil davon wird kontinuierlich unter sauren Bedingungen mit einem Mittel, welches aktives Chlor oder Brom liefert, behandelt. Anschließend wird der pH-Wert eingestellt und die Reaktion mit dem fluorogenen Reagenz der Formel 1 durchgeführt. Die entstandene Fluoreszenz wird kontinuierlich gemessen. In dieser Methode werden — wie bereits erwähnt — die in dem zweiten Durchgang oder in dem abgezweigten Strom vorhandenen primären «-Aminosäuren zu Ammoniak abgebaut, während die sekundären α-Aminosäuren, wie z. B. Prolin und 4-Hydroxyprolin, zu primären Aminen abgebaut werden, deren Reaktionsprodukte mit Verbindungen der Formel 1 fluorometrisch gemessen werden können.

Mit Hilfe einer der oben beschriebenen oder einer Für den Fachmann naheliegenden Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können sehr kleine Mengen in der Natur vorkommender primärer und sekundärer α-Aminosäuren qualitativ und quantitativ bestimmt werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin Reagenzien zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, mit einem Mittel, welches aktives Chlor oder Brom liefert, und einem fluorogenen Reagenz der allgemeinen Formel

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45 arbiträren, in bezug auf die Blindprobe korrigierten Einheiten angegeben ist (100 entspricht der Fluoreszenz, welche man mit 10nmol/ml Prolin erhält). Die mit »Konzentration von Prolin« bezeichnete Kolonne entspricht dem Viertel der Konzentration von Prolin in der Probe (Korrektur wegen der Zugabe von 3 ml Reagenzien).

Konzentralion	Relative Fluoreszenz.
von Prolin
(nmol/ml)
0,1	1,2
0,2	2,0
0,4	4,0
0,6	6,2
0,8	7,8
1,0	10

Beispiel 2

In Analogie zu Beispiel 1 werden, unter Verwendung von 1-ml-Proben, welche 4,0 bis 40,0 nmol/ml Prolin enthalten, die folgenden Daten erhalten:

Konzentration	Relative Fluoreszenz
von Prolin
(nmol/ml)
1,0	10
2,0	21
4,0	40
5,0	48
6,0	58
8,0	80
10,0	100
	Beispiel 3

Das erfindungsgemäße Verfahren wird an Hand der nachstehenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Zu einer 1-ml-Probe von Prolin (0,4 bis 4.0nmol/ml) in einem Puffer vom pH-Wert 2 werden, in einem Abstand von 10 Sekunden, die folgenden Lösungen nacheinander zugegeben.

(a) 1 ml wäßriges N-Chlorsuccinimid (4 · 10~⁴ M).

(b) 1 ml einer 2%igen Natriumbicarbonatlösung und

(c) 1 ml einer Lösung von 4-Phenvlspiro[furan-2(3 H)₁I' - phthalan] - 3,3' - dion (2 ■ 10~³ M) in Aceton.

Die Fluoreszenz wird 2 Minuten nach Zugabe des letzten Reagenzes gemessen (Anregung 390 nm, Fluoreszenzstrahlung 475 nm). Man erhält die nachstehend aufgeführten Ergebnisse, wobei die Fluoreszenz in In Analogie zu Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von 1-ml-Proben, welche 4,0 bis 40,0 nmol/ml Hydroxyprolin enthalten, werden die folgenden Daten erhalten:

55

60

65

Konzentration von	Relative Fluoreszenz
4-Hydroxyprolin
(nmol/ml)
1,0	4
2,0	9
3,0	13
4,0	17
5,0	21
6,0	26
7,0	31
8,0	35
9,0	39
10,0	43

509584/4

ίο

Beispiel 4

In Analogie zu Beispiel 1, jedoch unter Verwendung von 1-ml-Proben, welche 4,0 bis 40,0 nmol/ml Sarcosin enthalten und 1 ml 2 10"³M Bromwasser anstatt N-Chlo! succinimid, werden die folgenden Daten erhalten:

Konzentration von Sarcosin

(nmol/ml)

Relative Fluoreszenz

1,0 2,0 3,0 4,0 5.0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

5 8 12 17 19 24 29 34 39 42

Beispiel 5

Die im Beispiel 1 bis 4 beschriebenen Bestimmungen können wiederholt werden, indem man das 4-Phenylspiro[furan-2(3H),r-phthalan]-3,3'-dion durch die folgenden Verbindungen der Formel I ersetzt:

R'

Wasserstoff Wasserstoff Wasserstoff Wasserstoff Wasserstoff Wasserstoff Wasserstoff Wasserstoff Wasserstoff

2-Methoxyphenyl

3-Methoxyphenyl

4-Methoxyphenyl

2,4-Dimethoxyphenyl

2,5-Dimethoxyphenyl

3,5-Dimethoxyphenyl

3,4,5-Trimethoxyphenyl

2,4,5-Trimethoxyphenyl

3,4-Methylendioxyphenyl

Wasserstoff Wasserstoff Wasserstoff Wasserstoff Wasserstoff Wasserstoff Wasserstoff

Methyl

Butyl

Methoxy

Chlor

R'

3-ChIorphenyl

4-Chlorphenyl

4-Bromphenyf

3-Indolyl

2-Naphthyl

1-Naphithyl

n-Propyl

Phenyl

B e i s ρ i e I 6

Verschiedene Mengen (2,5 bis 10 μΐ) einer Lösung von Prolin (100 Picomole/μΐ) in 0,01 M HCl (oder in einem Puffer vom pH-Wert 2) werden bei 60° C über eine Kolonne (2,7 mm χ 50 cm) enthaltend Durrum DC-4A-Harz mit 0,2 M Citratpuffer vom pH-Wert 3,28 eluiert. Der Durchfluß ist 7 cc/Stunde. Dem Eluat wird eine Lösung von 10" Mol N-Chlorsuccinimid in 0,025 Mol HCl kontinuierlich zugegeben (Durch fluß 6 cc/Stunde). Nach Durchströmen einer kleinen Mischspule wird dieser Mischung ein 0,1 M Boratpuffer vom pH-Wert 9,7 zugesetzt (Durchfluß 20 cc/ Stunde). Nach Durchlaufen einer kleinen Mischspule wird die Mischung (pH-Wert 8,5) mit einer Lösung von 150mg/l 4-Phenylspiro[furan-2(3H),r-phthalan]-3,3'-dion in Aceton (Durchfluß 20 cc/Stunde) behandelt. Nach Durchlaufen einer kleinen Mischspule wird die Lösung durch eine Durchflußküvette zur kontinuierlichen Messung der Fluoreszenz ge fuhrt (Anregung 390 nm, Fluoreszenzstrahlung 475 nm).

Die gesamte Fluoreszenz, welche mit einer bestimmten Probe erhalten wird, ist direkt zur gesamten Menge an Prolin in dieser Probe proportional.

Die obenerwähnte Methode kann mit Proben, welche 4-Hydroxyprolin enthalten, wiederholt werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung einer sekundären α-Aminosäure, dadurch gekennzeichnet, daß man

(b) einen pH-Wert zwischen 6 und 11 einstellt,

(c) mittels einer fluorogenen Verbindung der allgemeinen Formel

R'