DE2656801C2

DE2656801C2 - Verfahren zur Herstellung von Trägerampholyten für die isoelektrische Fokussierung von hochmolekularen amphoteren Stoffen

Info

Publication number: DE2656801C2
Application number: DE2656801A
Authority: DE
Inventors: Wilhelm Dr. 6000 Frankfurt Just
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1976-12-15
Filing date: 1976-12-15
Publication date: 1983-11-17
Also published as: DE2656801A1; SE7714211L; US4131534A; SE433265B

Abstract

Die Erfindung umfasst ein neues und verbessertes Verfahren zur Herstellung von Traegerampholyten fuer die isoelektrische Fokussierung. Traegerampholyte stellen allgemein ein geeignetes Hilfsmittel zur Auftrennung von hochmolekularen amphoterischen Stoffen, wie z.B. Proteinen usw. dar. Dabei wird von einem Polyaethylen-Polyamin ausgegangen und dieses in einer Additionsreaktion in geeigneter Weise mit einem beta-ungesaettigten Carbonsaeureester zur Reaktion gebracht. In einem nachfolgenden Schritt erfolgt die Hydrolyse der Carbonsaeureestergruppen. Die Synthese fuehrt zu einem Gemisch einer Vielzahl von Beta-Aminocarbonsaeuren, deren isoelektrische Punkte den pH-Bereich 3,5-10 decken und die bei einer stationaeren Elektrolyse einen linearen pH-Gradienten ergeben. Das vorliegende Verfahren hat gegenueber dem bekannten Verfahren den Vorteil, dass die Carbonsaeureester ueberraschenderweise wesentlich schneller mit dem Amin reagieren als die entsprechenden Carbonsaeuren und das erfindungsgemaesse Verfahren somit eine erhebliche Zeitersparnis mit sich bringt. Darueberhinaus kann das vorliegende Verfahren praktisch bei Zimmertemperatur oder leicht erhoehten Temperaturen durchgefuehrt werden und es tritt dabei allenfalls eine schwache Gelbfaerbung des Endproduktes auf, die in einfacher Weise durch Behandlung des Syntheseproduktes in einer Wasserstoffatmosphaere unter Verwendung eines geeigneten Katalysators, z.B. eines Edelmetallkatalysators, entfernt werden kann. ...U.S.W

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Trägerampholyten für die isoelektrische Fokussierung von hochmolekularen amphoteren Stoffen.

Nach N. Catsimpoolas, Isoelectric Focusing, Academic Press, New York 1976, sollen geeignete Trägeramholyte unter anderem folgende Kriterien erfüllen: Sie müssen ausreichende Pufferkapazität im isoelektrischen Zustand aufweisen und den pH-Wert-Verlauf in Gegenwart von Proteinen bestimmen und sollen eine genaue Leitfähigkeitsverteilung anzeigen können. Weitere wichtige Eigenschaften sind ausreichende Wasserlöslichkeit und eine geringe Lichtabsorption bei Untersuchung mittels kurzwelliger Strahlung. Ferner sollen die Trägerampholyte bei der Elektrolyse einen gleichmäßigen pH-Gradienten erzeugen. Solche Trägerampholyte bestehen vorzugsweise aus einer Vielzahl von verschiedenen chemischen Verbindungen, die sich durch die Art und Anzahl der basischen und sauren Gruppen voneinander unterscheiden und somit unterschiedliche isoelektrische Punkte aufweisen. Bei einem besonders geeigneten System von Trägerampholyten liegen die isoelektrischen Punkte in einem pH-Bereich von etwa 3,5—10, da einerseits die Mehrzahl der zu trennenden Proteine in diesem Bereich isoelektrisch sind und andererseits für pH-Bereiche unter 3,5 bzw. über 10 ein guter pH-Gradient bei der Elektrolyse durch Verwendung eines Systems von Säuren bzw. Basen verschiedener Stärke erhalten werden kann.

Wie schon oben erwähnt, ist die weitgehend gleichmäßige Verteilung der isoelektrischen Pn.ikte der einzelnen Verbindungen über den gewünschten pH-Bereich eine wichtige Bedingung, die an ein geeignetes System von Trägerampholyten gestellt werden muß, da nur dann ein gleichförmig verlaufender pH-Gradient erzeugt werden kann.

Aus der DE-OS 14 93 939 ist nun ein Verfahren zur Herstellung von Polyaminopolycarbonsäuren als Trägerampholyte für die isoelektrische Fokussierung bekannt Dieses Verfahren geht von einem Polyäthylenpolyamin aus, an welches eine «,^-ungesättigte Säure, beispielsweise Acrylsäure, addiert wird in der Art, daß als einfachster Ampholyt ein Polyäthylenpolyamin mit einem addierten Carbonsäuremolekül und in der Folge 0-Aminopolycarbonsäuren mit steigender Anzahl von Carbonsäuregruppen im Molekül entstehen. Die Herstellungsmethode bedient sich dabei eines üblichen Verfahrens, indem zu einer wäßrigen Lösung des Ausgangsamins eine bestimmte, empirisch ermittelte Menge der wäßrigen Lösung der Carbonsäure zugetropft wird.

Dabei werden einige leicht zugängliche Verbindungen in größerer Menge anfallen, während andere schwerer zugängliche Verbindungen in nur geringerer Konzentration entstehen. Die Grundvoraussetzung für ein brauchbares Trägerampholytengemisch, nämlich eine gleichmäßige Verteilung der Pufferkapazität und der Leitfähigkeit im ausgebildeten pH-Gradienten, erfordert nun, daß die verschiedenen Komponenten des Trägerampholyten in etwa gleich großer Konzentration vorliegen. Aus diesem Grund wird nach der Reaktion zur Trennung eine Elektrolyse in einer aufwendigen Multikompartmentanlage durchgeführt, wobei nach beendeter Elektrolyse aus den einzelnen Kompartimenten entsprechende Anteile entnommen werden und aus diesen ein geeignetes Träger«mpholytengemisch gemischt wird.

Da die Reaktion der Carbonsäure mit dem Polyäthylenpolyamin bei Zimmertemperatur praktisch nicht abläuft, muß bei höheren Temperaturen gearbeitet werden, was jedoch zu Nebenreakiionen und letztlich zu einer unerwünschten Braunfärbung des Endproduktes führt. Abgesehen davon geht die Reaktion des Amins mit der Carbonsäure auch bei höheren Temperaturen nur sehr langsam vor sich, so daß das bekannte Verfahren mit einem erheblichen Zeitaufwand verbunden ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung von Trägerampholyten für die isoelektrische Fokussierung von hochmolekularen amphoteren

so Stoffen durch Umsetzung von mindestens einem organischen Polyamin mit wenigstens 2 Amino- und/oder Iminogruppen, die durch 2 oder 3 Kohlenstoffatome voneinander getrennt sind, mit mindestens einer Λ,/J-ungesäuigten Carbonsäureverbindung, dadurch gekennzeichnet, daß man ein organisches Polyamin mit mindestens 4 Stickstoffatomen mit einem Cr bis O-Alkylester der Acrylsäure, Methacrylsäure, Methylenmalonsäure. Äthylenmalonsäure, Crotonsäure, Maleinsäure und/oder Itaconsäure in der Weise umsetzt, daß man zu steigenden Konzentrationen der einen Reaktionskomponente die andere Reaktionskomponente in fallenden Konzentrationen oder zu gleich bleibenden Konzentrationen der einen Reaktionskomponente die andere Reaktionskomponente in steigenden oder fallenden Konzentrationen zugibt und das erhaltene Aminocarbonsäureester-Gemisch anschließend in an sich bekannter Weise hydrolysiert.

Erfindungsgemäß kann ein Amin oder es können auch

Amingemische verwendet werden. Anstelle eines Carbonsäureesters kann man auch Gemische von verschiedenen Carbonsäureestern, wie sie in Anspruch 1 angegeben sind, verwenden.

Das vorliegende Verfahren hat nun gegenüber dem bekannten Verfahren den Vorteil, daß die Carbonsäureester überraschenderweise wesentlich schneller mit dem Amin reagieren als die entsprechenden Carbonsäuren und das erfindungsgemäße Verfahren somit eine erhebliche Zeitersparnis mit sich bringt Darüber hinaus kann das vorliegende Verfahren praktisch bei Zimmertemperatur oder leicht erhöhten Temperaturen durchgeführt werden und es tritt dabei allenfalls eine schwache Gelbfärbung des Endproduktes auf, die in einfacher Weise durch Behandlung des Syntheseproduktes in einer Wasserstoffatmosphäre unter Verwendung eines geeigneten Katalysators, z. B. eines Edelmetallkatalysaiors, entfernt werden kann.

Das Verfahren wird so durchgeführt, daß man zu steigenden Konzentrationen der einen Reaktionskomponente fallende Konzentrationen der anderen Reaktionskomponente oder zu gleich bleibenden Konzentrationen der einen Reaktionskomponente steigende oder fallende Konzentrationen der anderen Reaktionskomponente zugibt, wobei die durch die chemische Reaktion entstehenden verschiedenen Aminocarbonsäureester nach ihrer Hydrolyse zu den entsprechenden Aminocarbonsäuren bei der stationären Elektrolyse einen praktisch linearen pH-Gradienten erzeugen. Diese Art der Durchführung des Verfahrens hat den Vorteil, daß die einzelnen Verbindungen des amphoteren Trägersystems direkt in den richtigen Konzentrationen entstehen und somit eine komplizierte Auftrennung in einzelne Bestandteile vermieden wird.

Als organische Polyamine werden Amine mit 4 oder mehr Stickstoffatomen eingesetzt, an die die Carbonsäureester addiert werden können, da hierdurch das Ampholytgemisch eine größere Anzahl von verschiedenen Verbindungen umfaßt und somit auch die Anzahl der isoelektrisc'ien Punkte entsprechend erhöht wird. Die für das vorliegende Verfahren geeigneten Amine weisen folgende Einheiten auf:

-NH-R-NH-

wobei die Kette nach links und rechts mit ähnlichen ( — R — NH-}-Einheiten verlängert ist, mit der Maßgabe, daß die Verbindung ein Molekulargewicht von etwa 300 bis 500 aufweist. Die zwischen den — NH-Gruppen angeordneten Reste — R— bedeuten z.B. — C3H6 — oder vorzugsweise - C2H* - Vorzugsweise sind diese organischen Stickstoffverbindungen lineare Kettenmoleküle; sie kijnnen jedoch auch verzweigtkettig oder alicyclisch sein. Darüber hinaus können einzelne Stickstoffatome mit Ci- bis Ce-Alkylgruppen, z. B. Methyl oder Äthyl, substituiert sein. Geeignete Amine sind z. B. Triäthylentetramin und Tetraäthylenpentamin. Besonders bevorzugt ist Pentaäthylenhexamin.

Geeignet sind erfindungsgemäß Ci- bis CU-Ester der Acrylsäure, Methacrylsäure, Crotonsäure. Darüber hinaus sind auch entsprechende ungesättigte Dicarbonsäureester geeignet, nämlich Maleinsäureester, Methylenmalonsäureester, Äthylenmalonsäureester und Itaconsäureester, wenn eine Verstärkung der sauren Seite des pH-Gradienten erwünscht ist. Hierin liegt ein weiterer wichtiger Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem bekannten Verfahren, da die freien ungesättigten Dicarbonsäuren noch reaktionsträ-2er sind als die Monocarbonsäuren und ihre Addition an das Amin eins dementsprechend weiter erhöhte Reaktionszeit in Anspruch nimmt, während die ungesättigten Dicarbonsäureester erheblich schneller reagieren. Außerdem wird durch das vorliegende Verfahren die Verwendung von Methylenmalonsäureester ermöglicht, während nach dem Stand der Technik die freie Säure nicht eingesetzt werden kann, da diese unbeständig ist.
Der Esterrest ist ein Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, sek.-Butyl- oder tert-Butylrest Besonders bevorzugt ist der Methylrest.

Die Reaktion Findet vorzugsweise in alkoholischer

Lösung statt Vorzugsweise weixlen Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, sek.-Butyl- oder tert-Butylalkohol verwendet, besonders bevorzugt wird jedoch der Methylalkohol.

Geeignet sind jedoch auch andere wasserfreie organische Lösungsmittel die gegenüber den verwendeten Ausgangsverbindungen inert sind, wie beispielsweise Dioxan, Benzol.

Bei der Durchführung des Verfahr^, d. h. bei der gezielten Synthese eines Trägeramphoiyiengemischs werden Angaben über die portionsweise Vermischung der Ausgangskomponenten benötigt Diese Mischungs-Verhältnisse können mit guter Genauigkeit aufgrund im voraus eraittelter physikalisch-chemischer Parameter berechnet werden. Die Ermittlung dieser Parameter und der daraus zu berechnenden Mischungsverhältnisse wird im nachfolgenden Beispiel näher erläutert Sind nun die Mischungsverhältnisse, die letzten Endes zu den richtigen Konzentrationen der einzelnen Komponenten des Trägerampholytengemisches führen, bekannt so werden die Ausgangsverbindungen vorzugsweise in alkoholischer Lösung entweder per Hand in mehreren Fraktionen z. B. 60 Fraktionen oder kontinuierlich mittels eines Gradientenformers gemischt. Solche Gradientenformer sind auf dem Markt erhältlich und dienen im allgemeinen zur Herstellung von Gradienten zur Elution oder Zentrifugation.

■to Unter Verwendung eines solchen Gradientenformers wird die sich kontinuierlich in ihrer Zusammensetzung ändernde Mischung mittels einer Schlauchpumpe durch einen etwa 10—20 m langen Teflonschlauch gepumpt, der sich in einem thermostatisierten Wasserbad befindet. Die Temperatur ist nicht kritisch und liegt in der Regel zwischen etwa 20° und 50°, vorzugsweise zwischen 30° und 40° C. Auf diese Art verbleiben die kontinuierlich erzeugten Mischungen etwa IV2— 2 Stunden bei einer Temperatur, die eine 80—9O°/oige Reaktion gewährleistet. Nach Durchlaufen des Teflonschlauches können die Mischungen in mehreren Fraktionen aufgefangen und durch Stehen bei 30°— 40°C zur vollständigen Reaktion gebracht werden. Danach werden die Fraktionen vereinigt und das Lösungsmittel vorzugsweise durch Verdampfen im Vakuum entfernt. Geringfügige Mengen von überschüssigem Ester werden dabei ebenfalls abgezogen.

Der erhaltene Rückstand wird anschließend in ausreichend Wasser gelöst und kann dann auf verschiedene Art und Weise der hydrolytischen Spaltung der Estergruppe unterworfen werden. Dies kann beispielsweise in einem Sterilisator bei 1 —2 Atü und 120°-130° C erfolgen, wobei die Reaktion nach etwa 1 —2 Stunden beendet ist. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Lörung über mehrere Stunden bei 40° —50°C zu schütteln. Es hat sich herausgestellt, daß das 2. Verfahren dann vorzuziehen ist, wenn ein Endprodukt mit geringerer UV-Absorption angestrebt

wird.

Wie bereits oben erwähnt wurde, führt das vorliegende Verfahren zu Trägerampholytengemischen, die noch eine schwach gelbliche Färbung aufweisen können. Da Absorptionen des Endproduktes im sichtbaren und UV-Spektralbereich bei der späteren Verwendung stören können, sollte das Ampholytengemisch möglichst farblos sein und auch im UV-Bereich keine Absorption zeigen. Deshalb wird zweckmäßigerweise eine etwa 2stundige Behandlung des Syntheseproduktes in einer Wasserstoffaimosphäre unter Verwendung eines hierfür geeigneten Katalysators durchgeführt. Als Katalysatoren können beispielsweise Raney-Nickel, Platinoxid, Palladium, Palladium-Aktivkohle, Lithiumaluminiumhydrid oder Natriumborhydrid verwendet werden. Diese Reaktion wird vorzugsweise in wäßriger Losung durchgeführt, es kommen jedoch auch geeignete organische Lösungsmittel in Frage.

Die gezielte Synthese eines nach dem vorliegenden Verfahren hergestellten Trägerampholytengemisches dauert je nach Arbeitsweg ca. 1—2 Tage und liefert ein Produkt, welches während einer stationären Elektrolyse einen linearen pH-Gradienten ergibt, der gleichmäßige Pufferkapazität und Leitfähigkeit durch den Gradienten aufweist und minimale Lichtabsorption zeigt. Die Verwendung von Estern und alkoholischen Lösungsmitteln ermöglicht es. die Reaktion von Anfang bis Ende bei gleichbleibendem stark alkalischem pH. d. h. bei gleichbleibendem Ladungsmuster aller Stickstoffatome der Aminkomponente durchzuführen. jo

Außerdem hat das vorliegende Verfahren den Vorteil, daß wie bereits erwähnt die Entfernung von überschüssigem Carbonsäureester sehr leicht durch Abziehen im Vakuum vorgenommen werden kann, während die Entfernung von überschüssiger freier Säure, wie z. B. J5 Acrylsäure, mit erheblichen Schwierigkeiten verbunden i5i.

Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß an Hand der gezielten Synthese die Möglichkeit besteht. pH-Gradienten eingeschränkter pH-Bereiche auf direktem ■<" Wege zu synthetisieren. Es ist z. B. möglich pH-Bereiche von 8— !0 oder 4 — 7 zu synthetisieren, während das maximale Spektrum von pH 3.5—10 reicht. Zur Erzielung besserer Auflösungen schwierig zu trennender Proteine sind eingeengte Bereiche besonders -»5 wichtig.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung näher erläutern.

Beispiel
Als Ausgangskomponenten werden verwendet:

1. Pentaäthylenhexamin (1 molare Lösung in Methanol im folgenden mit A) bezeichnet)

2. Acrylsäuremethyiester (4molare Lösung in Methanol im folgenden mit B) bezeichnet).

Die im folgenden verwendeten Prozentangaben stellen jeweils Volumen-% dar.

Unter Verwendung von Pentaäthylenhexamin als Ausgangsamin stehen 6 Stickstoffatome zur Verfügung die maximal 8 Carbonsäureestermoleküle addieren können. Der einfachste Ampholyi wird daher in einem Amincarbonsäureestergemisch bei einem molaren Verhältnis von 1 :1 gebildet. Bei Verwendung der oben angegebenen Lösungen A) und B) liegt dieses 1 :1-Verhältnis bei einem prozentualen Mischungsverhältnis von Amin- zu Esterlösung von 80 : 20 vor. Damit ist das Mischungsverhältnis am Beginn der Synthese festgelegt. Das Endverhältnis wird folglich erreicht sein, wenn ein molares Verhältnis von i : 8 erreicht wird. Das prozentuale Mischungsverhältnis beträgt daher 35 : 65. Es wurden nun zunächst ausgehend von einem prozentualen Mischungsverhältnis von 80:20 zehn einzelne Fraktionen gemischt, wobei das Mischungsverhältnis schrittweise (75:25, 70:50 usw.) bis zürn Erreichen des Endverhältnisses von 35:65 variiert wurde. Die einzelnen Fraktionen wurden verschlossen und bei etwa 35⁰C aufbewahrt. Nach etwa 10 Stunden war die Reaktion beendet und die Fraktionen wurden nun einzeln aufgearbeitet. Es wurde zunächst das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand mehrmals mit Methanol aufgenommen und wieder eingeengt. Schließlich wurden die Rückstände in Wasser gelöst und für etwa 2 Stunden in einen Sterilisator bei 1 Atü und 130⁰C gegeben. Das Wasser wurde dann am Rotationsverdampfer abgezogen und die Rückstände erneüi in Wasser gelöst. Bei den einzelnen Fraktionen wurden nun pH-Messungen vorgenommen und die Ergebnisse in ein Diagramm, wie es in Fig. 1 gezeigt ist, eingetragen. Die Ordinate stellt die prozentualen Mischungsverhältnisse dar. während die Abszisse die dazugehörigen pH-Werte wiedergibt. Die erhaltene Kurve kann nun in ein weiteres Diagramm übertragen werden, welches dann direkt die für den Gradientenformer notwendige Schablone wiedergibt, wobei jedoch noch berücksichtigt werden muß, daß die Amin-Konzentration zum sauren Bereich des Produktes hin in dem Maße abnimmt, wie die Esteikonzentration ansteigt. Dies würde aber bedeuten, daß bei einer kontinuierlichen Durchführung des Verfahrens in gleichen Zeiteinheiten weniger Verbindungen entstehen. Da die einzelnen Verbindungen des Trägerampholytengemisches jedoch in gleichen Konzentrationen vorhanden sein sollen, muß diese Kurve noch dahingehend korrigiert werden, daß letztlich gleiche Konzentrationen der einzelnen Komponenten erhalten werden.

Bei der Verwendung eines Gradientenformers kommen hierfür zwei Methoden in Betracht.

1. Mittels eines Steuergerätes kann die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe synchron mit dem Abfall der Aminkonzentration erhöht werden.

2. Die aus F i g. 1 erhaltene Kurve, die den Konzentrationsverlauf von Amin und Carbonsäureeste'-bestimmt, wird in der Weise modifiziert, daß mit abnehmender Aminkonzentration synchron längere Zeiten zur Herstellung der Mischungsverhältnisse zur Verfügung stehen.

Im vorliegenden Fall wurde der 2. Weg eingeschlagen. Aus F i g. 1 können jene Mischungsverhältnisse abgelesen werden, die Ampholyte von pH 10, 9, 8 usw. ergeben. Aus der pro pH-Einheit erfolgten Abnahme des Amins ergibt sich in einfacher Weise der Faktor, um den der Mischungsvorgang im jeweiligen pH-Gebiet verlängert werden muß, um zu einer etwa gleichmäßigen Konzentration der einzelnen Ampholyte in den einzelnen pH-Bereichen zu gelangen. Das heißt, hätte beispielsweise die Konzentration des Amins auf die Hälfte abgenommen, so müßte dementsprechend der Mischungsvorgang auf das Doppelte verlängert werden.

&5 Unter Verwendung der ermittelten Faktoren gelangt man zu F i g. 2, deren Abszisse gleichzeitig in 60 gleiche Fraktionen unterteilt wurde.

Zu dem gleichen Ergebnis kann man auch auf einem

anderen Weg gelangen, indem man nämlich zu jeweils gleichen Konzentrationen der Aminkomponente steigende Konzentrationen des Carbonsäureesters hinzufügt. Nach Aufarbeitung der einzelnen Fraktionen auf dem obengenannten Wege und nach Ermittlung der zugehörigen pH-Werte dieser einzelnen Fraktionen kann unmittelbar eine Kurve gezeichnet werden, die der in F i g Z dargestellten Kurve äquivalent ist, d. h. es ergibt sich auf direktem Wege eine Kurve, die keiner weiteren Korrektur bedarf, da ja durch die jeweils gleichbleibenden Mengen der Aminkomponente in gleichen Zeiträumen gleich viele einzelne Ampholytverbindungen entstehen.

Hat man nun die in Fig. 2 dargestellte Kurve ermittelt, so können die einzelnen Fraktionen in den durch die Kurve festgelegten Mischungsverhältnissen per Hand gemischt werden oder diese Kurve kann direkt als Schablone für den Gradientenformer dienen.

Im nachfolgenden ist die Herstellung eines Trägerampholytengemisches unter Verwendung eines Gradientenformers beschrieben:

Die Ausgangslösungen A) und B) befanden sich in jeweils 100-ml-Vorratsgefäßen, die direkt mit einem elektrisch gesteuerten Ventilsystem verbunden waren.

Mittels einer Schlauchpumpe wurden die Lösungen A) und B) in den in F i g. 2 dargestellten Mischungsverhältnissen in eine Mischkammer gesaugt und gründlich vermischt. Die sich kontinuierlich in ihrer Zusammensetzung ändernde Mischung wurde sodann mittels derselben Schlauchpumpe durch einen 20 m langen ca. 1 mm weiten Teflonschlauch gepumpt, der sich in einem auf 40⁰C thermostatisierten Wasserbad befand. Nach Verlassen des Teflonschlauches wurde das Gemisch in

ίο 60 Fraktionen zu je 2 ml aufgefangen. Die Förderleistung der Schlauchpumpe betrug ca. 0,5 ml/min. Dabei wurden etwa 70 ml der Lösung A) und ca. 60—70 ml der Lösung B) verbraucht. Die Fraktionen wurden verschlossen und 10 Stunden bei 35°C belassen. Danach wurden sie vereinigt, das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand mehrmals mit Methanol aufgenommen und wieder eingeengt. Nach üblicher Hydrolyse und Hydrierung verblieben 35—40 g eines farblosen bis äußerst schwach gelblichen, festen Rückstandes, der während der elektrophorese einen linearen pH-Gradienten mit dem pH-Bereich 3,5—10 ergab.

Die Ermittlung der Kurve in Fig. 2, wie sie oben am Beispiel des Pentaäthylenhexamins beschrieben wurde, erfolgt für andere Amine in analoger Weise.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Trägerampholyten für die isoelektrische Fokussierung von hochmolekularen amphoteren Stoffen durch Umsetzung von mindestens einem organischen Polyamin mit wenigstens 2 Amino- und/oder Iminogruppen, die durch 2 oder 3 Kohlenstoffatome voneinander getrennt sind, mit mindestens einer α,/5-ungesättigten Carbonsäureverbindung, dadurch gekennzeichnet, daß man ein organisches Polyamin mit mindestens 4 Stickstoffatomen mit einem Ci- bis Ct-Alkylester der Acrylsäure, Methacrylsäure, Methylenmalonsäure, Äthylenmalonsäure, Crotonsäure, Maleinsäure und/oder Itaconsäure in der Weise umsetzt, daß man zu steigenden Konzentrationen der einen Reaktionskomponente die andere Reaktionskomponente in fallenden Konzentrationen oder zu gleich bleibend^= Konzentrationen der einen Reaktionskomponente die andere Reaktionskomponente in steigenden oder fallenden Konzentrationen zugibt und das erhaltene Aminocarbonsäureester-Gemisch anschließend in an sich bekannter Weise hydrolysiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses mit Pentaäthylenhexamin durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ausgangsstoffe in kontinuierlich hergestellten Mischungen aus dem jeweiligen Polyamin und Carbonsäureester zu 80 bis 90% umsetzt, die Mischungen in mehreren Fraktionen auffängt, zur vollständigen Reaktion bringt, die Fraktionen vereinigt und hydrc .ysiert.