DE2230743B2 - Verfahren zur Herstellung-wäBriger Ampholytlösungen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung-wäBriger AmpholytlösungenInfo
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-
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Description
3 ■!
8 -
1 ι '
5
5
~ 1
15
15
ι ι
cm
»Schlecht«: Wenige I rägcrampholyte bilden breite Zonen
im Stack. Zwei im pl ähnliche Komponenten einer l'rolen.
probe iiegcn daher aufeinander und werden nichi gcireiuii.
rf!
iii
Γ-Ι ί i
I ! i
ii 1 i
:■ .UlLLJ
O 5 10 15 cm
O 5 10 15 cm
F i g. 2
»Gut«: Viele Trägerampholyle bilden einen reichhaltigen Stack. Auch zwischen die beiden Proteinkomponenten
haben sich noch Trägerampholyt-Koinponenten geschoben.
Die vorliegende Erfindung hat es sich zur Aufgabe gemacht, Ampholytgemische herzustellen, welche eine
große Anzahl Einzelkomponenten und eine breite Streuung ihrer isoclektrischen Punkte aufweisen.
Es wird dabei von Polyaminosulfonsäuren ausgegangen, welche gemäß Patent 21 37 617.0 aus Polyäthylenpolyaminen
durch Umsetzung mit Propansulton, oder Bromäthansulfonsäuren bzw. auch durch die Umsetzung
von Pentaälhylenhexamin, welches mit Dimethylsulfat oder in methanolischer Lösung mit Alkylhalogcnidcn teilweise
quatemisiert und anschließend mit Hilfe eines Anionaustauschcrs
von sauren Umsetzungsprodüklen befreit worden ist, erhallen worden sind. Dieses Ausgangsmaicrial
wird, wie am Beispiel Pcntaäthylenhexamin gezeigt wird, mit Acrylsäure und Chlormethanphosphonsäurc
nach folgendem Schema (s. Sp. 5 u. 6) umgesetzt.
Aus dem Reaktionsschema ersieht man, daß mit den vorgegebenen Partnern bei Variieren der Mengenverhältnisse
eine große Zahl von Reaktionsprodukten zu erwarten ist. Die erfindungsgemäße Herstellung von
Ampholytlösungcn, welche sowohl Sulfonsäure- als auch Phosphonsäurc- und Carbonsäuregruppen enthalten,
wird nachfolgend anhand einiger Beispiele beschrieben. Der Einfachheit halber beziehen sich diese
Beispiele auf die Weiterverarbeitung eines einfachen Umsetzungsproduktes zwischen Pcntaäthylenhexamin
und Propansullon. Mit den methyliertcn Derivaten wird
analog gearbeitet. Die Methodik lehnt sich eng an diejenige an, welche im Patent 21 37 617.0 ausführlich
beschrieben worden ist. Die dabei verwendeten Umsetzungen von Polyäthyknpolyaminen mit Chlormelhanphosphonsäure
sind aus US-PS 28 41611 bekannt. Umsetzungen von Polyäthylcnpolyaminen mit
Acrylsäure und ihren Homologen sind ebenfalls mehrfach beschrieben worden: Polyäthylcnpolyamine
mit Acrylsäure und Methacrylsäure: US-PS 21 95 974; Diäthylentriamin mit Acrylsäure und Crotonsäure: DBP
7 30 360; Tetraäthylcnpentamin mit Maleinsäure:
US-PS 30 77 407.
Den anwendungstechnischen Fortschritt, welche
nabe
genüber einfacheren Aminosulfonsäure-Ampholytgemischen
bringen, kann man demonstrieren, indem man Vergleichsversuche mit verschiedenen Ampholyt-Typen
unter sonst möglichst gleichen Versuchsbedingun-
·-. gen ablaufen läßt Als Demonstrationsobjekt wurde
Myoglobin aus Walfischmuskel ausgewählt, ein dem
Blutfarbstoff verwandtes Protein, welches früher als einheitlich angesehen worden war, bei der isoelektrischen
Fokussierung aber je nach Leistungsfähigkeit der
ίο angewandten Trennmethode eine Mikro-Heterogenität
von vier scharf getrennten Komponenten aufweist. Im Patent 21 37 617 wurde die Versuchsanordnung pp 3/60
— 5/15 ausführlich beschrieben. Zur maximalen Ausnützung der Trennleistung wurde aber das von
ι > Davies, B. J. & Ornstein. L (1964) Ann. New York Acad.
Sei. 121,350 eingeführte Po.'yacrylamid-Gel verwendet,
um Konvektion im Elekirolyten zu verhindern.
Es wurden vier Versuche ausgewählt und das Trennergebnis nach Anfärben der Proteinfraktionen
-'ii durch Densitometrie dokumentiert. Die Fig. 3—6
zeigen den Verlauf der Lichtabsorption bei 560 nm gegen den mittels einer Mikroelektrode gemessenen
pH-Verlauf im Gel.
r> Vergleichsversuch A
(F ig- 3)
Reaktionspartner:
Triäthylentetramin + 0,5 Mol/N Propansulton
Theoret. Zahl der Reaktionsprodukte:
Theoret. Zahl der Reaktionsprodukte:
2" · 0,5 = 8
Ergebnis:
Ergebnis:
Trennung in 2 Komponenten nur angedculet.
Kommentar:
Kommentar:
Das »arme« Gemisch, im Prinzip nach dem Verfahren des Patents 21 37 617 hergestellt, leistet
nicht genug.
Verglcichsversuch B
(F ig. 4)
(F ig. 4)
Reaktionspartner:
Pentaäthylcnhexamin + 0,5 Mol/N Propansulton
Theoret. Zahl der Reaktionsprodukte:
Theoret. Zahl der Reaktionsprodukte:
2" 0,5 = 32
Ergebnis:
Ergebnis:
Die zwei Hauptkomponenten sind klar getrennt, die Gipfel sind auseinandergerückt, die beiden
Nebcnkoniponcnlen deuten sich an.
Kommentar:
Kommentar:
Die Trcnnlcistung entspricht dem bisherigen Stand der Technik.
Verglciehsversuch C
(Fig· 5)
(Fig· 5)
Reaktionspartner:
Penlaäthylenhexamin + 0,34 Mol Propansulton +
0,17 ValChlormethaiiphosphonsäiiie
0,17 ValChlormethaiiphosphonsäiiie
Theoret. Zahl der Reaktionsprodukte:
3" ■ 0,5 = 364
3" ■ 0,5 = 364
Ergebnis:
Die Hauptkomponenten noch weiter auseinandergerückt, die Nebenkomponenten deutlich abgcsetzt.
Kommentar:
Durch Hinzunahmc der zweiten Reaktionskomponerue
wird die Trennung dnntlich verbessert.
+NH,
CH2
CH2 +HN-CH2-CH2-CH2-SOi
CH2
CH,
NH CH, CH,
+ HN —CH, CH,
CH;
NH
+ CICH, — PO,H,
+ CHj1=CH-COiH
CH,
CH,
H,C CH,
CH,
Vergleichsversuch D (F ig. 6)
Reaktionspartner: Pentaäthylenhexamin + 0,17 Mol Propansulton +
0,17 Mol Acrylsäure + 0,17 ValChlormethanphosphonsäure.
Theoret. Zahl der Reaktionsprodukte: · 0,5 = 2048.
Ergebnis:
Scharfe Darstellung aller vier Komponenten.
Kommentar:
Im Einklang mit der Theorie bringt die erfindungsgemäße
Ausweitung in Zahl und Bereich der Trägerampholyt-Komponenten eindeutig schärfere
Substanztrennungen in der isoelektrischen Fokussierungstechnik.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele beschrieben:
(Herstellung des Ausgangsstoffes)
In einem 5-Liter-Dreihalskolben, der mit Rückflußkühler, Rührer und geheiztem Tropftrichler ausgerüstet
ist, werden 44b g (2 Mol = 12 Atom N) Pentaäthylenhexamin
mit 1850 g Wasser verdünnt. Dazu werden 244 g (2 Mol = 0,17 Mol/N) geschmolzenes Propansulton unter
Rühren zulaufen gelassen. Der Inhalt des Reaktionsgcf.ißes wird 1 Stunde lang bei 65° gerührt. Das pH liegt
bei 10.5.
+NH,
CH,
CH,
+ HN —CH2-CH2-CH2-SOr
+ HN —CH2-CH2-CH2-SOr
CH2
CH,
N-CH, — ΡΟΓ + HCI
CH,
CH2
CH2
CHj
N-CH.,— CH2-CO2
CH,
1N
/ I '
/ I '
H,C
CW,
CH-,
Beispiel 2 (erfindungsgemäß)
Zu dem nach Beispiel 1 hergestellten Gemisch aus Aminosulfonsäuren kommen 126 g (1 Mol = 0,17 Val/N)
Chlonnethanphosphonsäure unter Rühren hinzu. Das Reaktionsgemisch bleibt 15 Stunden bei 65' stehen.
Nunmehr werden 144 g (2 Mol = 0,17 Mol/N) Acrylsäure
zugesetzt und weitere 2 Stunden bei 65° gehalten. Das Reaktionsgemisch enthält jetzt insgesamt 900g
Ampholylgemisch und wird mit Wasser auf 45 Liter einer 2%igen Lösung verdünnt.
Beispiel 3 (eriindungsgemäß)
Zu dem nach Beispiel 1 hergestellten Gemisch aus wi Aminosulfonsäure kommen 126g (1 Mol = 0,17 Val/N)
Chlormethanphosphonsäure unter Rühren hinzu. Das Reaktionsgemisch bleibt 15 Stunden bei 65° stehen.
Nunmehr werden 108 g (1.5 Mol = 0,13 Mol/N) Acrylsäure
und 129 g (1.5 Mol =0,13 Mol/N) Crotonsäure ti", zugesetzt und das Gemisch weitere 2 Stunden bei 65°
gehalten. Das Reaktionsgemisch enthält jetzt insgesamt 1000 g Ampholytgemisch, welches zu 50 Liter in Wasser
gelöst wurde.
(Elektrophorese)
a) allgemeine Methodik
60 Liter eines verdünnten Reaktionsgemisches, welches nach Beispiel 2 hergestellt wurde, kam zur
Reinigung desselben von nichtamphoteren Substanzen und besonders von Chlorid-Ionen in ein mehrkammriges
Elektrophoresegerät mit 21 Kammern, welche durch Platten aus porösem Keramikmaterial voneinan-
Tabeile I
der abgetrennt sind. Weitere Einzelheiten sind in Beispiel 5 des Patents 21 37 617 beschrieben.
b) Elektrophorese
Nunmehr wird eine Gleichspannung von 200 Volt angelegt, die während 15 Stunden beibehalten wird.
Nach dieser Zeit ist in den Kammern 4 — 18 kein Chlorid-Ion mehr nachzuweisen. Die Spannung wird
dann im Laufe von 3 Stunden auf 1000 Volt erhöht. Die Messung des pH in den einzelnen Kammern ergibt eine
Verteilung, die in Tabelle 1 wiedergegeben ist.
Kammer-Nr.
3 4 5
3 4 5
11
12
13
14
16 17
18
pH des
Inhaltes
Inhaltes
11
10,1 9,3 8.8 8,3 7,9 7,5 7,3 6,9 6,6 6,2 5,9 5,5 5,1 4,8 4,2 3,0
Die Kammern werden gleich nach der Elektrolyse entleert und in 7 Fraktionen vereinigt, die sich aus dem
pH derselben ergeben, so wie dies in Tabelle II angegeben ist.
Tabelle II | pH | Vol-Prozent |
Fraktion-Nr. | 2-3.4 | 4 |
1 | 3.5-6.9 | 24 |
2 | 7-7,9 | 20 |
3 | 8-8,9 | 20 |
4 | 9-9,9 | 15 |
5 | 10-10,9 | 13 |
6 | 11-11.9 | 4 |
7 | ||
Die Vereinigung von Fraktion 2 und Fraktion 3 ergibt ein Material, welches unmittelbar für viele Versuche
herangezogen werden kann. Mit dieser Fraktion wurde auch der Vergleichsversuch 5 ausgeführt.
Wünscht man Ampholytgemische zu erhalten, welche sich durch einen engeren pH-Bereich auszeichnen, so
müssen die in Tabelle Il aufgelisteten Fraktionen nach Beispiel 5c des Patents 21 37 617 einer Zweitelcktrophorese
unterworfen werden. Man findet dabei generell gegenüber den einfachen Aminosulfonsäure-Ampholyten
einen flacheren Verlauf der pH-Kurve im gesamten Elektrophoresegerät, so daß man mehr individuelle
Reaktionsansätze herstellen muß. um auch im stark sauren und alkalischen Bereich gute Ausbeuten zu
bekommen. Andererseits hat man mit dem Vierkomponentensystem viel besser in der Hand, wie man das
Ausbeute-Maximum erhalten kann.
2r> Beispiel5
(Vergleichsversuch)
a) 44,0 g Triäthylentetraniin mit 1850 g Wasser (12 Atom N) wurden mit 732 g (6 Mol) Propansulton
3d gemäß Beispiel 1 umgesetzt und die auf 2%
verdünnte Lösung der Elektrophorese gemäß Beispiele 4a und 4b unterworfen. Die pH-Fraktionen
zwischen 3, 5 und 8,0 wurden gesammelt und für den nachfolgenden Vergleichsversuch A ver-
Γ) wendet.
b) 446 g Pentaäthyienhexamin mit 1850 g Wasser (12 Atom N) wurden mit 732 g Propansulton (6 Mol)
ganz analog umgesetzt und durch einfache Elektrophorese aufgearbeitet. Die pH-Fraktion
4(i zwischen 3,5 und 8.0 wurde zur Ausführung des Vergleichsversuches B verwendet.
c) 446 g Pentaäthyienhexamin mit 1850 g Wasser (12 Atom/N) wurden 588 g Propansulton
(4 Mol = 0,34 Mol/N) nach Beispiel 1 umgesetzt und dann wurde nach einer Stunde 126 g Chlormethansulfonsäure(1
Mol = 0,17 Val/N) zugegeben und die Reaktion bei 65° 15 Stunden lang fortgesetzt. Zur
Aufarbeitung durch Elektrophorese wurde wie in den vorangegangenen Beispielen 4a und 4b
3d verfahren. Die pH-Fraktionen 3,5—8,0 wurden für
den Vergleichsversuch C verwendet.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (1)
- Patentanspruch:Weitere Ausbildung des Verfahrens zur Herstel- > lung wäßriger Ampholytlösungen oder deren Gemischen aus den Umsetzungsprodukten a) einer wäßrigen Lösung von Pentaäthylenhexamin oder b) einer wäßrigen Lösung von Pentaäthylenhexamin, die mit Dimethylsulfat oder in methanolischer to Lösung mit Alkylhalogeniden teilweise quaterniert und anschließend mit Hilfe eines Anionaustausches von sauren Umsetzungsprodukten befreit worden ist mit Propansulton oder Bromäthansulfohsäure und Auftrennung durch Elektrophorese gemäß Patent r, 21 37 617.0, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Umsetzungsprodukte zusätzlich mit Chlormethanphosphonsäure und einer ungesättigten Carbonsäure in an sich bekannter Weise in ein entsprechendes Derivate-Gemisch überführt.Gegenstand des Patents 21 37 617.0 ist ein Verfahren zur Herstellung wäßriger Ampholytlösungen oder deren Gemischen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine wäßrige Lösung von Pentaäthylenhexamin oder eine wäßrige Lösung von Pentaäthylenhexamin, die mit Dimethylsulfat oder in methanolischer Lösung mit Alkylhalogeniden leilweise quaternisiert und anschließend mittels eines Anionenaustauschcrs von sauren Umsetzungsprodukten befreit worden ist, mit Propansulton oder Bromäthansulfonsäure in an sich bekannter Weise umsetzt und in üblicher Weise mittels Elektrophorese auftrennt.In der Literatur, z. B. Swcnsson, H. (1962) Acta Chcm. Scand. 16.456-466;derselbe (1968) Protides of the Biol. Fluids 15, 515—522 ist gezeigt worden, daß die mit dem Verfahren der isoelektrischen Fokussierung erzielten Subslanztrennungen um so schärfer werden, je größer die Anzahl der individuellen Ampholylkomponenten ist, von welcher der pH-Gradient getragen wird. Die Begi ündung hierfür ergibt sich wohl am anschaulichsten aus den Arbeiten von Leonard Ornstcin (1964) Ann. New York, Acad. Sei. 121, 321—44, welche im wesentlichen besagen, daß in reinem Wasser gelöste Elektrolyte mit verschiedenen Wanderungsgeschwindigkeiten in einem elektrischen Feld eine Kette von scharf voneinander abgesetzten Zonen bilden, welche kontinuierlich in der Reihenfolge der Wanderungsgeschwindigkeiten aufeinander folgen und nirgends eine Lücke von reinem Lösungsmittel lassen. Die langsameren Zonen bremsen die schnellen ab, die schnelleren beschleunigen die langsamen. Würde zwischen den Zonen eine Stelle mit reinem Wasser auftreten, so hätte diese im Vergleich zur Umgebung einen sehr hohen ohmschen Widersland und es würde dadurch eine hohe Potentialdil'feronz zwischen den benachbarten Zonen deren gegenseitige Anziehung bewirken. Diese Überlegungen gehen schon auf I-. Kohlrausch zurück: (1897) über Conzentrations-Verschiebungen von Lösungen und Lösungsgemisehcn Ann. Phy. 62, 2Ö9 —23. wird ciie führende Zone abgebremst oder kommt sie zum Stillstand (durch pH-Verschiebung oder durch Siebwirkung des Mediums) so laufen die anderer; Zonen unter Erhöhung ihrer Konzentration dicht auf und bilden einen »Stack«, einen Stapel von scharfen »disks«. Auch die hier beschriebenen Trägerampholyte ordnen sich zu einem »Stack«, weil die führende Komponente am konzentrierten alkalischen Puffermilieu des Kathodenbereiches aufläuft. In jeder Zone wird das pH des isoelektrischen Punktes derselben meßbar.Amphotere Substanzen, die man auseinandertrennen möchte, etwa Proteine, sind damit nur Spezialfälle von Ampholyten, die sich im Stack einordnen. Mehrere Proteine mit dicht beieinanderliegenden pl's werden eine gemeinschaftliche Zone bilden, es sei denn es finden sich einige Trägerampholyte mit noch dazwischen liegenden pl's, welche als »spacer« oder Abstandszonen wirken können. Hierauf kommt für hohe Trennleistungen alles an.In der letztzitierten Arbeit von H. Swensson wird festgestellt, daß es wünschenswert wäre, wen'" die pl's einzelner Trägerampholyte um nicht mehr als 0,05 pH-Einheiten voneinander differieren würden. Für den Hauptbereich zwischen pH 3 bis pH 10 wäre also schon eine Zahl von 140 verschiedenen Ampholyten gefordert unter der Voraussetzung, daß deren pi's säuberlich nebeneinander gereiht wären, was natürlich nicht der Fall ist. Will man sicher sein, daß für jeden Teil des genannten Bereichs eine ausreicnende Dichte an Einzelampholyten zur Verfügung steht, so wird man deren Anzahl um ein Vielfaches erhöhen müssen, ja diese Zahl kann gar nicht groß genug sein. Außerdem wird man dafür sorgen müssen, daß die pl's auch wirklich über den gesamten interessierenden Bereich gestreut sind, indem man Gruppen mit stark verschiedenen Dissoziationskonr.tanten in die Ampholyte einführt.Die geschilderten Verhältnisse sind in den F i g. 1 und 2 veranschaulicht.
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