DE2656162C3

DE2656162C3 - Verfahren zur Erzeugung einer stabilen pH-Funktion auf einem Träger für die elektrophoretische Trennung

Info

Publication number: DE2656162C3
Application number: DE2656162A
Authority: DE
Inventors: Bengt Stockholm Bjellqvist
Original assignee: Aminkemi AB
Current assignee: Aminkemi AB
Priority date: 1975-12-12
Filing date: 1976-12-10
Publication date: 1982-02-25
Also published as: US4130470A; SE7514049L; JPS5910492B2; JPS5273088A; GB1570698A; FR2334951A1; DE2656162B2; FR2334951B1; SE422371B; DE2656162A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung einer stabilen pH'Funktion auf einem Träger für die elektrophoretische Trennung, Ein derartiges Verfahren ist aus der US-PS 36 64 939 bekannt

Bei verschiedenen Trenn- und Analysevüffahreh, insbesondere bei elektrophoretischen Verfahren ist es notwendig, daß die pH-Werte und die Temperaturwerte entlang eines Trennweges bei stabilisierter Konvektion gesteuert werden. Bisher hat man die pH-Funktionen für elektrophoretische Verfahren mit Hilfe unterschiedlicher Typen von niedermolekularen Pufferlösungen mit einer Konzentration von wenigstens 10-²M und gewöhnlich beträchtlich höher, erhalten. Diese Konzentrationen ergeben eine beträchtliche elektrische Leitfähigkeit und dementsprechende Ströme, so daß man eine relativ niedrige Feldstärke verwendet hat, wenn die Temperatur auf einem konstanten Wert gehalten wurde. Da die Zeit, weiche für die Trennung benötigt wird, umgekehrt proportional zur Feldstärke ist, ergibt sich hieraus ein beträchtlicher Nachteil. IJm den pH-Wert entlang des Trennweges während des Versuches infolge von Elektrodenreaktionen in den Pufferlösungsbehältern nicht zu verändern, hat man Anoden- und Kathodenlösungen mit relativ großen Volumen verwendet Diese Behälter enthalten die gleichen Puffersubstanzen wie sie entlang des Trennweges verwendet werden.

Die Elektrofokussierung ist ein elektrophoretisches Trennverfahren für Proteine und andere Ampholyte, welches darauf beruht, daß amphoterische Substanzen in einem elektrischen Feld in Richtung eines pH-Gradienten zu einem sogenannten isoelektrischen Punkt wandern, wo ihre Bf weglichkeit zu Null wird. Es sind verschiedene Verfahren zur Erzeugung des pH-Gradienten, welcher für die Elektrofokussierung notwendig ist, bekannt. Das am meisten gebräuchliche Verfahren verwendet eine Ampholytmischung von sogenannten Trägerampholyten, weiche eine große Anzahl an Komponenten mit unterschiedlichen pH-Werten (dies sind die pH-Werte an den isoelektrischen Punkten) innerhalb des interessierenden pH-Bereiches enthalten. Infolge des durch ein angelegtes elektrisches Feld erzeugten lonentransports erzeugen diese Träge^ampholyte die pH-Funktion bzw. -Wirkung, welche die Trennung hervorruft.

Bei allen elektrophoretischen Verfahren ist man daran interessiert, die Trennzeit bei der Elektrofokussierung zu verringern. Bei elektrofokussierenden Versuchen, bei denen der pH-Gradient durch Trägerampholyte erzeugt wird, werden die Probensubstanzen nach Errichtung pH-Gradienten in Richtung auf ihre entsprechenden isoelektrischen Punkte transportiert. Die Bildung eines pH-Gradienten und der Transport der Probensubstanzen zu ihren isoelektrischen Punkten läßt sich schneller durchführen, wenn die angelegte Spannung und damit die Feldstärke erhöht wird. Das Anlegen hoher Spannungen ist jedoch dadurch begrenzt, daß im System Energie erzeugt wird und daher das System gekühlt werden muß. Der größte Teil des Stromtransportes während der Bildung des pH-Gradienten und während der späteren Verfahrensstufen erfolgt durch die Trägerampholyte und nur ein Bruchteil des Stromtransportes ist aud die Probe bezogen Wenn daher ein pH-Gradient die Bildung desselben und die Aufrechterhaltung desselben keinen Stromtransport benötigen würde, könnte man die Zeit für die Elektrofokussierung beträchtlich Verringern. Darüber hinaus läßt sich die Ünterscheidbarkeit der Zonengren^ zen, welche man bei der Elektrofokussierung erhält, mit der Feldstärke erhöhen. Eine erhöhte angelegte Spannung Würde daher zu einer Vergrößerung des Auflösungsvermögens führen.

Die pH-Gradienten, Welche auf Trägerampholyten

beruhen, besitzen noch andere Nachteile. Es gibt Verfahren zur Herstellung synthetischer Trägerampholyte für den allgemeinen analytischen Gebrauch und zum Trennen. Diese Verfahren ergeben jedoch Ampholytmischungen mit beträchtlichen Änderungen der Leitfähigkeit und Konzentration im gebildeten pH-Gradienten.

Das Auftreten eines pH-Gradienten ändert sich ebenfalls in Abhängigkeit von der Zeit Außerdem ergibt eine Strömungsverzerrung des pH-Gradienten ι ο eine Bewegung der Probenzonen.

Wenn man pH-Gradienten erzeugt, um einen begrenzten pH-Bereich zu umfassen, besteht das Bestreben, daß die Anzahl der einzelnen Ampholyte innerhalb dieses Bereiches bei diesen Typ von Ampholytmischungen gering ist

Um schwere Störungen in den pH-Gradienten, welche auf Trägerampholyte gegründet sind, zu vermeiden, darf die Probe keine allzu großen Salzmengen enthalten. Bei der präparativen Elektrofokussierung folgt auf die Elektrofokussierung eine Präparierstufe, während welcher die Probenkomponenten von den Trägerampholyten gelöst werden.

Aus der eingangs erwähnten US-PS 36 64 939 ist es bekannt auf Trägern stabile pH-Gradienten in kurzer Zeit dadurch zu gewinnen, daß man mit Hilfe einer den Träger umgebenden Flüssigkeit einen Temperaturgradienten längs des Trägers erzeugt, wobei es notwendig ist die umgebende Flüssigkeit in einem speziellen Behälter unterzubringen, was einen zusätzlichen apparativen Aufwand erforderlich macht Ferner ist es aus der US-PS 35 23 863, der DE-OS 23 36 414 und der DE-OS 22 34 000 bekannt, daß man bestimmte Eigenschaften von als Trennmedien dienenden Gelen durch Beimischung von Zusätzen und durch Polymerisierung bestimmter Monomere ändert, wobei jedoch eine Erhöhung des elektrischen Feldes nicht angesprochen ist

Demgegenüber ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, bei dem ohne uisätzlichen apparativen Aufwand die pH-Funktion erzielt wird und die Anwendung eines erhöhten elektrischen Feldes Deim Trennvorgang möglich ist.

Diese Aufgabe wird beim Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die pH·Funktion aus den Proteolysegltichgewichten mit dem Trennmedium aus geladenen und/oder aufladbaren, in einer Matrix unbeweglich gemachten Gruppen, welche eines oder mehrere der Elemente Kohlenstoff, Schwefel. Phosphor, Bo: oder Stickstoff enthalten, gewonnen wird.

Bei der Erfindung wi,d die pH-Funktion bzw. -Wirkung durch nicht bewegliche geladene oder aufladbare Gruppen gewonnen. Die aufladbaren Gruppen enthalten dabei solche Gruppen, welche durch A'ospaltungs- bzw. Proteolysegleichgewichte in bezug auf das verwendete Trennmedium positive oder negative Ladungen abgeben können. Beispiele negativ aufladbarer Gruppen sind Kohlensäure-, Schwefelsäure-. Borsäure- oder Phosphorsäuregruppen. Hierunter zählen auch Säureester Und mehrwertige Säuren, Positiv aufladbare Gruppen können beispielsweise verschiedene Arten von Aminogruppen oder anderen aufladbaren Stickstoffverbindungen sein.

Die Unbeweglickkeit kann dadurch erreicht werden, daß die Gruppen auf oder in eine Matrix gesetzt Werden. Dieses kann auch das die Konvektion stabilisierende Medium bei der Trennung sein. Die Matrix kann bevorzugt aus einem Material bestehen, welches in Verbindung mit dem Trennmedium ein Gel bildet. Dat, Unbeweglichmachen bedeutet, daß keh, Transport der geladenen bzw. aufladbaren Gruppen erfolgt, wenn ein äußeres elektrisches Feld angelegt wird. Die Beweglichkeit, welche die Gruppen aufgrund der Flexibilität der verwendeten Matrixstruktur aufweisen, beeinträchtigt das vorbeschriebene Prinzip nicht Bei Verwendung verschiedener geladener und/oder aufladbarer Gruppen ändert sich die Konzentration derselben entlang des Trennweges bzw. Feldes. Diese Gruppen können selbst oder in Verbindung mit Ampholyten eine pH-Funktion erzeugen. Diese ist in bezug auf Zeit stabil und kann in zweierlei Hinsicht entlang des Trennweges verändert werden. Hierzu kann die pH-Funktion in Abhängigkeit vom gerade herrschenden Trennproblem bezüglich der pH-Änderung in Feldrichtung und bezüglich der Leitfähigkeit und Pufferkapaz'täten optimiert werden.

Als Trennmedium kann man Wasser oder Wasser in Verbindung mit Substanzen verwenden, weiche in Wasser lösbar od=:r mit Wasser misciibar sind Als Matrix kann ein bekanntes, die Konvektion stabilisierendes System verwendet werden. Dieses kann zusammen mit der pH-Funktion bzw. -Wirkung nach der Erfindung verwendet bzw. kombiniert werden. Das die Konvektion stabilisierende System kann beispielsweise gekörnt oder faserig ausgebildet sein. Auch durch Kapillarwirkung läßt sich eine Stabilisierung der Konvektion herbeiführen. Ein Gel ist ebenfalls geeignet. Geeignete Stoffe sind beispielsweise Polyacrylamid, Zellulose, Agarose, Dextran, Polyvinylalkohol, Stärke. Siliziumgel oder Polymere des Sty-ols. Divinylbenzols oder Kombinationen derselben. Die Matrix kann sich dabei kontinuierlich von der Anode bis zur Kathode erstrecken oder Me kann unterbrochen sein, beispielsweise durch Membranen in Mehrfachkammer-Elektrolyseeinrichtungen. Letzteres ist bei der Elektrofokussierung von Interesse. Es ist jedoch notwendig, daß die Ampholyte, welche getrennt werden sollen, und/oder zugegebene Ampholyte eine ausreichende Leitfähigkeit in den Zonen zwischen den Elektroden bewirken, welche nicht durch eine nichtbewegliche geladene und/oder aufladbare Gruppen enthaltende Matrix angefüllt sind.

Nichtbewegliche, aufladbare oder geladene Gruppen in einer Menge von 10 -² bzw. 10⁴M pro Liter reichen aus, um die pH-Funktion bzw. -Wirkung gemäß der Erfindung zu erzeugen. Um scharfe Grenzen zwischen den Zonen bei der Trennung zu erhalten, ist eine bestimmte Pufferkapazität jedoch von Vorteil. Die Konzentration der nichtbeweglichen geladenen bzv,. aufladbaren Gruppen wird daher bevorzugt nicht unter 1Ir²M pro Liter ausgewählt, wenn die pH-Funktion bzw. -Wirkung bei der Elektrophorese oder Elektrofokussierung ohne Trägerampholyte verwendet wird. Jeder Abschnitt der Matrix, welche zur Konvektionsstabilisierung dient, kann durch die Anwesenheit von nichtbeweglichen ; jfladbaren bzw. aufgeladenen Gruppen einen bestimmten vorgegebenen pH-Wert aufweisen. Um eine optimale Pufferleistungsfähigkeit zu erhalten, besitzen die nichtbeweglichen Gruppen in einem bestimmten Abschnitt der Matrix pKs-Werte, welche nahe dem pH-Wert des Matrixabschnittes sind. Die obere Grenze ihr Konzentration der geladenen bzw. aufladbaren Gruppen wird durch praktische Gegebenheiten vorbestimmt Diese sind beispielsweise

die Anzahl der Gruppen, welche chemisch an die Matrix gebunden werden können oder die Anzahl an Gruppen, welche die Matrix aufnehmen kann unter Beibehaltung der Eigenschaften, welche eine Konvektionsstabilisierung bei der Trennung noch hervorrufen.

Es können verschiedene Verfahren zum Einbau der geladenen bzw. aufladbaren Gruppen in der Matrix durchgeführt werden. Geeignete Derivate von PoIy^ acrylamid können durch Copolymerisation hergestellt werden. Fast alle konjugierten polaren Vinylmonomere bilden mit Acrylamid Copolymerisate. Auf diese Weise erhält man schon eine große Auswahl an Möglichkeiten des Einbaus von geladenen und/oder aufladbaren Gruppen in der Matrix, so daß diese unbeweglich gemacht werden können. Ein Beispiel eines funktioneilen Monomers, welches durch Reaktion zu einem Acrylamid enthaltenden Gel gebracht werden kann, ist Vinylsulfonat. Acrylsäure. Vinylphosphorsäure. Maleinsäure, Fumarursäure, Itakonsäure, Aconitsäure, Vinylpyridin, Vinylimidazol. Allylamin und Diallylamin. Alle funktionalen Derivate dieser Verbindungen, beispielsweise Ester der Säuren, welche eine geeignete funktionale Gruppe enthalten, beispielsweise Aminoalcylacrylat, können mit Acrylamid copolymerisieren.

Einige der vorstehend erwähnten Monomere können bei Verwendung von Bisacrylamid oder anderen Vernetzungsmitteln Gele erzeugen, ohne daß Acrylamid als Komponente im Polymer enthalten ist. Um beispielsweise eine pH-Funktion in Polyacrylamid zu erzeugen, kann die Polymerisation beispielsweise auf herkömmlichem Weg in einer Wasserlösung durchgeführt werden. Zum Ingangsetzen der Reaktion können Peroxide, Azoverbindungen, Redoxsysteme. fotochemische Systeme und/oder Ionenbestrahlung zur Anwendung kommen. Einige Arten an Vernetzungsmitteln können in die Monomermischung eingebracht werden, so daß das Copolymer ein Gel bildet. Eine gesteuerte Änderung der Konzentration der Monomere kann auf herkömmliche Weise erfolgen. Beispielsweise kann man eine vertikale Polymerisationskammer anfüllen, in der Weise, daß der Gradient, welcher bei der Fokussierung verwendet wird, mit einem linearen Dichtegradienten übereinstimmt, welcher zur Konvektionsstabilisierung notwendig ist und welcher einer Vermischung aufgrund der Wärmeentwicklung bei der Polymerisation entgegenwirkt

Wenn die konvektionsstabilisierende Matrix schon vorliegt, was beispielsweise dann der Fall ist wenn als Matrix Papier oder Zelluloseacetat verwendet wird, werden Verbindungen mit geeigneten funktioneilen Gruppen verwendet, welche in die Matrix eindringen und einen Gradienten erzeugen können und welche daraufhin in der Weise zu einer Reaktion veranlaßt werden können, daß in der Matrix unbewegliche geladene bzw. aufladbare Gruppen erhalten werden. Diese können beispielsweise ein Teil eines Polymers sein, welcher von der Matrix umgeben ist oder sie können Teil eines Polymers oder einer anderen Zusammensetzung sein, welche chemisch an der ursprünglich vorliegenden Matrix gebunden sind.

Bei der Durchführung einer elektrophoretischen Analyse oder Trennung unter Verwendung von gemäß der Erfindung erhaltener pH-Funktionen läßt sich die Leitfähigkeit niedrig halten, während man eine gute Püfferkapazhät aufrechterhält Auf diese Weise kann eine hohe Feldstärke verwendet werden, woraus sich kurze Trennzeiten ergeben, ohne daß hierbei eine nennenswerte Wärmeentwicklung entsteht Große Elektrodenpuffervolumen sind bei der Erfindung nicht mehr notwendig. Es genügen geringe Berührungsvolu' mina oder eine Säure oder Base.

Die pH-Funktion kann leicht bei der Elektrophorese in unterbrochenen Systemen verwendet werden. Hierzu ist es lediglich notwendig, die pH-Funktion an einigen Teilen des Trennweges zu ändern. Natürlich ist es auch möglich, sowohl die pH-Funktion als auch die konvektionsstabilisierende Matrix zu ändern, so daß die

ίο geladenen Moleküle unterschiedliche Beweglichkeiten in verschiedenen Teilen des Trennweges haben.

Bei der Durchführung der Elektrofokussierung auf der Grundlage der pH-Funktion bzw. -Wirkung nach der Erfindung erhält man außerdem als Vorteile eine rasche Trennung und eine niedrige Wärmeentwicklung. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, die pH-Funktion in Form eine:? pH-Gradienten zu erhalten mit gleichmäßig verteilter Leitfähigkeit und Pufferleistungsfähigkeit bzw. -kapazität. Dies ist bisher bei Verwendung von Trägerampholyten nicht vollständig möglich gewesen. Die Schwierigkeit der Bewegung des pH-Gradienten ist bei Verwendung der pH-Funktion verhindert. Darüber hinaus kann man eine große Salzmenge in der Probe zulassen, ohne daß die pH-Funktion gestört wird. Die Trennung kann außerdem in einem fortlaufenden Verfahren durchgeführt werden, wobei das elektrische Feld senkrecht zum konvektionsstabilisierten Fluß des Trennmediums ausgerichtet ist. Die Konvektionsstabilisierung kann auf verschiedene Art und Weise erzielt werden. Beispielsweise kann man ein gekörntes oder faseriges System verwenden, in welchem der pH-Gradient unbeweglich gemacht ist. Auch eignen sich einige kapillare stabilisierte Systeme, bei welchen die Flußstabilisierung in einem Spalt bzw. Schlitz zwischen zwei benachbarten Flächen, an welchen die pH-Funktion unbeweglich gemacht ist, erzielt wird.

In den F i g. 1 bis 4 sind die pH-Gradienten für vier Ausführungsbeispiele angegeben.

Die für die Beispiele verwendeten Gele wurden in einer Polymerisationskammer mit Abmessungen von UO χ 70 χ 2 mm gebildet Die pH-Gradienten wurden gebildet durch Auffüllen der Kammer mit 10 verschiedenen Lösungen, deren Zusammensetzungen in den

•ts Figuren angegeben sind. Das Anfüllen wurde mit der schwersten Lösung begonnen und es wurden dann mit abnehmendem Glyceringehalt die restlichen darübergeschichtet Die Auffüllzeit betrug etwa 15 bis 20 Minuten. Zur Erzielung eines glatten Konzentrations- und

so pH-Gradienten wurde die Kammer vier Sturien zur Ermöglichung von Diffusion stehengelassen. Die Polymerisation wurde dann durch Co^-Bestrahlung während 20 Minuten mit einer Gesamtbestrahlungsdosis von 80 Grad durchgeführt Nach der Bestrahlung wurden die Gele aus der Polymerisationskammer entnommen und mit destilliertem Wasser 30 Minuten lang gewaschen. Die Gele wurden dann in einem Elektrofokussierungsgerät verwendet

Zu Fig. 1

Der pH-Gradient wurde durch Copolymerisation von Acrylamid, Vinylsulfonat und N-(2-Dimethylaminoäthyl)acrylamid erhalten. In der Figur bedeuten

(1) den resultierenden pH-Gradienten
• (2) die Konzentration des Vinylsulfonats in mM
(3) die Konzentration des Glycerins in Gew.-%

Konzentrationskonstanten:

Acrylamid

Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid N-(2-Dimethylaminoäthyl)-acrylamid

Zu F i g. 2

4,85 Gew.*% 0,15Gew.-%

I 75 niM

IO

Der pH-Gradient wird erzeugt durch Copolymerisation von Acrylamid, Acrylsäure, UVinylimidazol und N-(2-Dimethylaminoäthyl)acrylamid. in der Figur bedeuten

(1) den resultierenden pH-Gradienten

(2) die Konzentration der Acrylsäure mM

(3) die Konzentration des Glycerins in Ge\v.-%

IConzentrationskonstanien:

Acrylamid	4,85 Ge\v.-%
Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid	0,l5Gew.-%
N-(2-DimethyIaminoäthyl)-
acrylamid	2OmM
1-Vinylimidazol	80 mM

ZuFig.3

Der pH-Gradient wird erzeugt durch Copolymerisation von Acrylamid, Itaconsäure und N-(2-Dimethylaml· noäthyljacrylamid, In der Figur bedeuten

(1) den resultierenden pH-Gradienten

(2) die Konzentration des N-(2-Dimethylaminoäthyl)-acrylamid in mM

(3) die Konzentration des Glycerins in Gew.-%

Konzentrationskonstanten:

Acrylamid 4,85 Gcw.-%

N.N^Methyienbisacrylamid 0,15 Gew.-% Itaconsäure 20 mM

Zu F i g. 4

Der pH-Gradient wird erzeugt durch Copolymerisation von Acrylamid, Acrylsäure und i-Vinyiimidazol. in der Figur bedeuten

(1) den resultierenden pH-Gfadieriteri

(2) die Konzentration des l-Vinylimidazo! in mM

(3) die Konzentration des Glycerins in Gew.-%

Konzenlrationskonstanten:

Acrylamid ' 4,85 Gew.-%

Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid 0,15 Gew.-% Acrylsäure 10OmM

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Erzeugung einer stabilen pH-Funktion auf einem Träger für die elektrophoretische Trennung, dadurch gekennzeichnet, daß die pH-Funktion aus den Proteolysegleichgewichten mit dem Trennmedium aus geladenen und/oder aufladbaren, in einer Matrix unbeweglich gemachten Gruppen, welche eines oder mehrere der ι ο Elemente Kohlenstoff, Schwefel, Phosphor, Bor oder Stickstoff enthalten, gewonnen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Gradient aus dem Zersetzungsgleichgewicht von entweder unbeweglich gemachten oder nicht unbeweglich gemachten geladenen und/oder aufladbaren funktionalen Gruppen mit dem Trennmedium erzeugt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Gradient gleichförmig oder ■icht gleichförmig innerhalb des pH-Intervalls 2—12 •der Teile oieses Bereiches gehalten wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix als konvektionsstabilisielendes Medium verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix durch ein Gel gebildet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel einen Porositätsgradienten »ufweist.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix gekörnte Eigenschaften »ufweist.

8. Verfahi en nach Anspruc.i 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix faserig ausgebildet wird.

9. Verfahren nach Ansprach ., dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix eine oder mehrere Oberflächen in einem kapillaren stabilisierenden System bildet

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn-Zeichnet, daß die elektrophoretische Trennung als Zonenelektrophorese durchgeführt wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrophoretische Trennung als Immunelektrophorese durchgeführt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß die elektrophoretische Trennung als Elektrofokussierung durchgeführt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrofokussierung in Anwesenheit von einem oder mehreren nicht Unbeweglich gemachten Ampholinen durchgeführt Wird.

14. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix, welche die unbeweglich {emachten Gruppen trägt, als permeable Membrane 1 einer Kammerelektrolysiereinrichtung verwendet Werden und daß die pH-Funktion von den Membranen oder den Ampholyten gebildet wird.

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