DE4135516A1

DE4135516A1 - Unterdrueckung der elektroosmose mit hydrolytisch stabilen beschichtungen

Info

Publication number: DE4135516A1
Application number: DE4135516A
Authority: DE
Inventors: Milos V Novotny; Vladislav Dolnik; Kelly A Cobb
Original assignee: Indiana University Foundation
Current assignee: Indiana University Foundation
Priority date: 1990-10-26
Filing date: 1991-10-28
Publication date: 1992-05-07
Also published as: JPH05180801A; AU639873B2; IT1249721B; GB9122565D0; ITRM910813A1; NL9101773A; GB9122644D0; FR2668473A1; US5074982A; GB2251245A; GB2251245B; ITRM910813A0; AU8590191A

Description

Die US-Regierung besitzt eine vollbezahlte Lizenz an dieser Erfindung und das Recht bei begrenzten Sachverhalten vom Patent inhaber zu verlangen anderen unter angemessenen Bedingungen eine Lizenz einzuräumen, wie es von den Bedingungen des Grant No. PHS R01 CM 24349 vorgesehen ist, das durch das National Institute of General Medical Sciences, U.S. Public Health Service, verliehen wurde.

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet beschichteter Siliziumdioxid- Materialien, mit einem Schwerpunkt bei Gefäßen, Kammern und anderen Bauarten, die bei der Elektrophorese verwendet werden.

Der Erfindung zugrundeliegender allgemeiner Stand der Technik

Feste Elemente dienen einer Vielzahl von Funktionen bei elek trophoretischen und chromatographischen Systemen. Bei einigen Systemen dienen feste Elemente als Orte für die Trennung gelö ster Stoffe, wohingegen sie bei anderen als Stauwände für Ge rüsttrennungsmedien dienen. Somit treten feste Elemente als Par tikel, Rohre und Platten auf, in Abhängigkeit vom verwendeten Trennungsmechanismus und von der Anordnung, Größe und Form des Trennungsmediums. Beispiele für Trennungssysteme, die feste Elemente verwenden, sind die Affinitätschromatographie, Phasen umkehr-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, Parti kelgrößen-Chromatographie und verschiedene Formen der Elektro phorese, einschließlich der Plattengelelektrophorese, Rohrgel elektrophorese, Kapillarelektrophorese (sowohl Gel-, als auch Lösungstypen), Isotachophorese und isoelektrische Fokusierung.

Bei einigen Fällen spielt das feste Element eine aktive Rolle, bei der Trennung und in anderen Fällen eine passive Rolle.

Ein Phänomen, das bei vielen dieser Systeme auftritt, besonders dort, wo das feste Element ein Siliziumdioxid enthaltendes Mate rial ist, ist Elektroendosmose, was auch auf den elektroosmoti schen Fluß zurückzuführen ist, der aus einem elektrokinetischen Potential entsteht, das zwischen der Wand des festen Elements und dem flüssigen oder Geltrennungmedium, das der Wand benach bart ist, besteht. Der Fluß, der durch dieses Potential verur sacht wird, ist ein Massenfluß, der auftritt, wenn ein elektri sches Feld tangential zu der festen Oberfläche auf dem Tren nungsmedium angelegt wird. Bei vielen Systemen betrachtet man diesen Massenfluß als eine Störung beim Trennungsverfahren.

Während der elektroosmotische Fluß bei jeder dieser Gestaltungen auftreten kann, ist er besonders störend bei Kapillaren wegen ihres hohen Wandoberflächenbereich/innerem Volumen-Verhält nisses und wegen der engen Nähe der Wand zu den Probenkomponen ten, die getrennt werden. Kapillaren sind besonders bedeutsam, da sie die Analyse von extrem kleinen Proben mit einer one-line- Spektroskopiebestimmung und die Verwendung hoher Spannungen erlauben, wodurch man Trennungen mit hoher Geschwindigkeit er reicht.

Entsprechend ist die Unterdrückung des elektroosmotischen Flus ses in chromatographischen und insbesondere elektrophoretischen Systemen eines der Ziele vorliegender Erfindung.

Diese Erfindung richtet sich auf ein Phänomen, auf das man bei der Trennung von Eiweißen durch solche Techniken stößt. Proteine haben eine inhärente Tendenz sich an Siliziumdioxidoberflächen zu adsorbieren. Bei den meisten Trennungsverfahren ist diese Adsorption unerwünscht, da sie zu einer Peakverbreiterung und Asymmetrie führt und dadurch für die Auflösung nachteilig ist und die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Analysen ernied rigt.

Die Proteinadsorbtion ist von besonderem Interesse bei Systemen, die gegen elektroosmotischen Fluß empfindlich sind, da das ad sorbierte Protein die Wandcharakteristiken beeinflußt, ein schließlich des Zetapotentials. Veränderungen bei der Menge oder Verteilung des adsorbierten Proteins an der Wand bewirken, daß sich die elektroosmotische Verteilung des Flusses verändert, sowohl bei einem einzigen Durchlauf als auch zwischen aufeinand erfolgenden Durchläufen, und des weiteren die Schwierigkeiten beim Durchführen von verläßlichen und aussagefähigen Vergleichen und Bestimmungen vergrößert. Dies wiederum ist besonders akut bei Kapillarsystemen wegen der Kapillargeometrie und dem hohen Einfluß auf die Kapillarwand.

In der Literatur wird von verschiedenen Verfahren zur Reduzie rung oder Eliminierung der Proteinadsorption durch Siliziumdi oxid-Oberflächen berichtet. Allgemein umfassen diese Verfahren eine oder zwei Methoden:

1) Schaffung einer Coulomb-Abstoßung zwischen den Proteinen und Siliziumdioxid durch eine geeignete Auswahl des Puffer pHs und der Ionenstärke und
2) chemische Bindung eines neutralen Stoffes an die Silizium dioxid-Oberfläche um die Oberflächenladungen zu eliminie ren, die als Adsorptionsstellen wirken.

Mc Cormick, R.M., Anal. Chem. 60 : 2322-2328 (1988), berichtet von Beispielen der ersten Methode, wobei die Verwendung eines nied rigen pH-Phosphat-Puffers beschrieben wird, um die negativen Ladungen des Hartglases zu reduzieren und die Phosphatgruppen über die Siliziumdioxid-Oberfläche zu verteilen als eine Form von Schutzschild. Die Verwendung von hohen pH-Puffern mit bei gefügten ionischen Modifizierungsmitteln wird von Lauer, H.H. et al., Anal. Chem. 58 : 166-170 (1986) und Walbroehl, Y. et al., J. Mirocolumn Sep. 1 : 4-45 (1989) berichtet. Wie von diesen Autoren berichtet wird, wandeln die Puffer die Proteine in negativ ge ladene Spezien um, die von den negativ geladenen Kapillarwänden abgestoßen werden.

Die zweite Methode wurde sich von Jorgenson, J.W. et al., Science 222 : 266-272 (1983) zu eigen gemacht, der Glycol enthal tende Materialien an Hartglas gebunden hat. Hjerten, 5.3., u. Chromatogr. 347 : 191-198 (1985) berichtete von der Verwendung von Methylcellulose und nichtvernetztem Polyacrylamid, das durch ein Organosilanreagens gebunden ist. Die Verwendung einer Polyvinyl pyrrolidinon-Beschichtung, aufgebracht durch eine Organosilan oberflächenderivatisierung, beschrieb McCormick, wie oben ange geben. Die Verwendung einer Polyethylenglycol-Beschichtung be richtet Bruin, G.J.M. et al., J. Chromatogr. 471 : 429-436 (1989).

Während jede dieser Methoden bestimmte Vorzüge aufweist, haben sie auch Nachteile, insbesondere wegen der Beschränkungen ihrer Anwendungsbereiche. Die Methoden, die eine Beeinflussung des Puffer-pHs und der Ionenstärke einschließen, sind im pH-Bereich beschränkt bei dem die Trennung durchgeführt werden kann und deshalb sind die Proteine beschränkt, die getrennt werden kön nen. Die Verfahren, die eine Beschichtung der Siliziumdioxid- Oberfläche einschließen, stoßen auf Probleme hinsichtlich der Langzeitstabilität, insbesondere unter alkalischen Bedingungen. Die weit verbreitete Technik der Bindung durch Siloxanbindungen (Si-O-Si-C) zum Beispiel ist anfällig für eine nukleophile Spal tung unter basischen Bedingungen.

Für die Proteintrennung ist es wichtig, daß man aus einem weiten Bereich an Puffern und pH-Werten wählen kann, wegen der riesigen Unterschiede zwischen den Eiweißen und dem starken Einfluß des pH auf die Ladungen der Eiweißmoleküle und deshalb auf ihre Wanderungscharakteristiken. Bestimmte Mischungen werden am be sten bei niedrigem pH getrennt (unterhalb des isoelektrischen Punktes der Proteine), während andere bessere Trennungen liefern bei pH-Werten oberhalb der isoelektrischen Punkte des Proteins. Das ideale System ist deshalb ein solches, das stabil ist und sowohl bei hohen als auch bei niedrigen pH-Bereichen verwendet werden kann.

Übersicht über die Erfindung

Es wurde jetzt ein neues Verfahren zur Unterdrückung oder Elimi nierung von elektrostatischen Ladungen auf der Oberfläche eines Siliziumdioxid enthaltenden Materials entdeckt, das wirksam und stabil über einen weiten Bereich von Verfahrensbedingungen und über eine ausgedehnte Zeitdauer verbleibt. Gemäß diesem Verfah ren wird eine Polymerbeschichtung über die Siliziumdioxid-Ober fläche gegeben, wobei die Beschichtung an die Oberfläche durch Si-C-Bindungen gebunden wird, ohne den Zwischen-Siloxanteil des Standes der Technik. Das Verfahren schließt die Plazierung von zugänglichen Ethenylbindungen an Stellen ein, die ursprünglich von Silanolgruppen besetzt waren, gefolgt von einer Additions reaktion über die Ethenylbindung durch eine geeignete Spezies zur Bildung und kovalenten Bindung der Polymerschicht. Der Aus druck "Ethenylbindung" wird in dieser Beschreibung verwendet, um das folgende zu bezeichnen:

Das Festmachen der zugänglichen Ethenylbindung wird durch den Einsatz eines organometallischen Reagenzes erreicht, das einen endständigen Ethenylteil trägt.

Die Bindungen, die die Verbindung zwischen Polymer und der Sili ziumdioxid-Oberfläche sicherstellen, sind über einen weiten pH- Bereich stabil, der sich von einer starken Säure bis zu starken Base erstreckt, und sie bleiben für eine ausgedehnte Zeitdauer stabil. Die resultierende Beschichtung reduziert oder eliminiert sowohl den elektroosmotischen Fluß und die Adsorptionsstellen auf der Siliziumdioxid-Oberfläche, wobei das Siliziumdioxid eine breite Vielseitigkeit erhält hinsichtlich seiner Anwendung auf verschiedene Proteintypen, hoher Peakauflösung und wirksamen Trennungen.

Weitere Merkmale, Gegenstände und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung deutlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Fig. 1a und 1b sind Nachweisspuren, die elektropho retische Trennungen darstellen, die in beschichteten und unbe schichteten Kapillaren gemäß der Erfindung unter hohen pH-Bedin gungen durchgeführt wurden.

Die Fig. 2a und 2b sind Nachweisspuren, ähnlich denjenigen der Fig. 1a und 1b, jedoch unter Verwendung einer anderen Pro teinmischung und unter niedrigen pH-Bedingungen.

Genaue Beschreibung der Erfindung und ihrer bevorzugten Ausführungsformen

Gemäß der Erfindung werden zuerst Silanolgruppen auf der Ober fläche des Siliziumdioxid enthaltenden Materials in Siliziumha logenidgruppen umgewandelt um sie für die Reaktion mit Grignard- Reagenzien vorzubereiten. Dies erreicht man durch übliche Ver fahren, die dem Fachmann bekannt sind. Allgemein können Haloge nidatome verwendet werden. Chlor und Brom werden bevorzugt, wobei Chlor besonders bevorzugt ist.

Ein bevorzugtes Chlorierungsverfahren geschieht durch die Ver wendung von Thionylchlorid. Diese Reaktion wird allgemein in einer inerten Atmosphäre in der flüssigen Phase bei erhöhter Temperatur durchgeführt, vorzugsweise über 50°C. Während man ein Lösungsmittel verwenden kann, kann die Reaktion auch in Abwesen heit eines Lösungsmittels durchgeführt werden.

Anschließend werden die halogenierten Oberflächenstellen mit einem organometallischen Agens behandelt, das eine aliphatische Gruppe mit einem endständigen Ethenylteil trägt. Bevorzugte organometallische Verbindungen sind Organolithium-, Organomagne sium- und Organonatrium-Verbindungen. Organolithium- und Organo magnesium-Verbindungen sind besonders bevorzugt und haben die allgemeinen Formel R-Li bzw. R-Mg-X. In diesen Formeln ist R eine aliphatische Gruppe, die einen endständigen Ethenylteil enthält und X ist ein Halogen. Bevorzugte R-Gruppen sind Gruppen gerader Ketten von 5 Kohlenstoffatomen oder weniger, wobei Allyl und Vinyl-Gruppen besonders bevorzugt sind und die Vinylgruppe ganz besonders bevorzugt ist. Das X-Atom in der Organomagnesium- Formel stellt allgemein Halogene dar. Chlorid, Bromid und Jodid sind die bevorzugten Halogene, wobei Chlorid und Bromid beson ders bevorzugt sind und Bromid ganz besonders bevorzugt ist.

Beispiele für bevorzugte organometallische Reagenzien sind Vi nyllithium, Allyllithium, Vinylmagnesiumbromid, Vinylmagnesium chlorid, Allylmagnesiumbromid und Allylmagnesiumchlorid.

Die Reaktion mit der organometallischen Verbindung wird gleich falls allgemein unter einer inerten trockenen Atmosphäre ge führt. Das organometallische Reagens wird allgemein in flüssiger Lösung in einem polaren Lösungsmittel verwendet, insbesondere ein Ether wie Diethylether oder Tetrahydrofuran. Die Reaktion wird allgemein bei erhöhten Temperaturen, vorzugsweise etwa 50°C oder darüber geführt.

Die Reaktion mit dem organometallischen Reagens wandelt die Siliziumhalogenidgruppen in Si-R-Gruppen um, wobei die endstän digen Ethenylbindung der R-Gruppe verbleibt. Anschließend läßt man die Oberfläche mit einer Spezies reagieren, die mit der Ethenylgruppe additionspolymerisieren kann um eine monomolekula re Polymerschicht über die Oberfläche des Siliziumdioxids zu bilden und um an den Stellen, die früher von den Silanolgruppen besetzt waren, kovalent gebunden zu werden. Die in dieser Phase des Verfahrens eingesetzten Spezien können weit variieren. Bei spiele sind Acrylate, Acrylamid, substituierte Acrylamide und Alkyl-, Aryl- und halo-substituierte Ethylene. Von diesen sind die Acrylate, Acrylamid und die substituierten Acrylamide bevor zugt, wobei Acrylamid besonders bevorzugt ist. Im Falle des Acrylamids, ist das Ergebnis eine monomolekulare Schicht aus nichtvernetztem Polyacrylamid.

Die Additionsreaktion wird entsprechend den konventionellen Techniken durchgeführt, wobei Reaktionsbedingungen und weitere Reagenzien verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Reaktion wird allgemein in Anwesenheit eines Polymerisations katalysators durchgeführt, der im Falle des Polyacrylamids ein Basenkatalysator ist. Hauptbeispiele sind Aminbasen wie z. B. N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin ("TEMED" oder "TMEDA"), β-Dimethylaminopropionitril und Triethanolamin. Zusätzlich zu dem Katalysator ist allgemein ein Polymerisationsinitiator anwesend. Besondere Beispiele für die Polymerisationsinitiatoren sind freie Radikalinitiatoren wie z. B. Peroxide, Persulfate oder Azo verbindungen. Beispiele sind Benzoylperoxid, tert. -Butylperoxid, tert.-Butylhydroperoxid, tert.-Butylperbenzoat, Cumylperoxid, Acetylperoxid, Lauroylperoxid, 2,2′-Azobisisobutyronitril, Phe nylazotriphenylmethan und Persulfate, wie z. B. Kaliumpersulfat und Ammoniumpersulfat. Die Auswahl des optimalen Katalysators und Initiators hängt in jedem Fall von den Spezien ab die rea gieren und ggf. von den Reaktionsbedingungen. Die Bedingungen, unter denen diese Reaktionen auftreten, sind dem Fachmann all gemein bekannt und sind gleichermaßen in diesem Verfahren an wendbar.

Die vorliegende Erfindung ist allgemein auf Siliziumdioxid ent haltende Oberflächen anwendbar. Beispiele sind Hartglas, Glas und Quarz. Die Erfindung ist weiterhin anwendbar auf einen wei ten Bereich von Geometrien, einschließlich Platten, Rohre, Kü gelchen und andere Umrisse, Formen und Größenmaßstäbe. Wie oben erwähnt, ist die Erfindung von besonderem Interesse für eine Anwendung bei Kapillaren, wobei die Beschichtung auf der Innen wand der Kapillare aufgebracht ist. Die Dimensionen der Kapilla re variieren entsprechend der Wahl ihres Einsatzgebietes in Abhängigkeit von der Anwendung des Trennverfahrens selbst. In den meisten Fällen hat die Kapillare einen Innendurchmesser von etwa 5 Mikron bis etwa 250 Mikron, vorzugsweise von etwa 20 Mikron bis etwa 100 Mikron. Die Länge der Kapillare bewegt sich in den meisten Fällen ebenfalls von etwa 5 cm bis etwa 500 cm, vorzugsweise von etwa 10 cm bis etwa 100 cm.

Trennverfahren, die unter Verwendung der behandelten Oberfläche geführt werden können, können auch weit variieren. Kapillaren, die gemäß der Erfindung behandelt wurden, sind für elektrophore tische Prozesse allgemein nützlich, einschließlich sowohl der Gel- als auch der Flüssigphasen-Elektrophorese und sie sind besonders brauchbar bei der Trennung von Proteingemischen.

Die folgenden Beispiele werden zum Zwecke der Illustration dar gestellt und es ist nicht beabsichtigt, daß sie die Erfindung genau festlegen oder in irgendeiner Weise begrenzen.

Beispiel 1 Verfahren zur Kapillarbehandlung

Reagenzien, Lösungsmittel und Kapillaren:
Proteine und Pufferkomponenten sowie das N,N,N′,H′-Tetramethyl ethylendiamin (TEMED) und das Acrylamid zur Elektrophorese wur den von Sigma Chemical Co. (St. Louis, Missouri, U.S.A.) ge kauft. Die übrigen Reagenzien und Lösungsmittel stammten von:
Ammoniumpersulfat als Reagens geeignet wurde von Mallinkrodt Inc. (Paris, Kentucky, U.S.A.) gekauft. Vinylmagnesiumbromid (1,0 M in Tetrahydrofuran) wurde von Aldrich Chemical Co. (Mil waukee, Wisconsin, U.S.A.) gekauft. Thionylchlorid (99%ig) wurde von EM Science (Cherry Hill, Hew Jersey, U.S.A.) gekauft und vor dem Gebrauch destilliert. Tetrahydrofuran (THF) wurde von J.T. Baker, Inc. (Phillipsburg, New Jersey, U. S.A.) gekauft und über einem Molekularsieb getrocknet.

Es wurde destilliertes Wasser bei der Herstellung der Puffer verwendet und alle Puffer wurden durch 0,2 µm Nylon 66 Membran filter (Alltech Associates, Deefield, Illinois, U.S.A.) gefil tert. Die Probenlösungen wurden durch Auflösung der Proteine im Wasser bei Konzentrationen von 0,2 mg/ml hergestellt.

Kapillaren aus Hartglas (50 µm im Durchmesser, ungefähr 1 m in der Länge) wurden zuerst mit 1 M NaOH 30 Minuten lang gespült und anschließend 30 Minuten lang mit destilliertem Wasser. Die Ka pillaren wurden bei 110°C über Nacht mit Stickstoff gereinigt.

A. Oberflächenchlorierung

Eine 2 ml Ampulle mit Thionylchlorid wurde in eine kleine Druck kammer gestellt, die anschließend 15 Minuten mit Stickstoff gespült wurde um allen Sauerstoff zu entfernen. Dann wurde ein Ende der Kapillare in die Kammer gelegt und Stickstoff durch die Kapillare mehrere Minuten lang geführt. Das eingelegte Kapillar ende wurde dann in das Thionylchlorid hinuntergelassen und ein konstanter Stickstofffluß durch die Kammer geführt, die in einem abgeschlossenen und unter Druck stehendem Zustand gehalten wur de, wodurch das Thionylchlorid in die Kapillare gedrückt wurde. Wenn die Kapillare mit Thionylchlorid gefüllt war, wurde sie an einer Stelle nahe der Druckkammer verschlossen durch Einsatz eines kleinen Propanbrenners. Das andere Ende der Kapillare wurde dann schnell an einem Vakuumgerät befestigt und die Kapil lare wurde evakuiert und bei einem Vakuum von 60 Millitorr oder weniger ungefähr 20 Minuten lang gehalten. Während dieser Zeit wurde die Kapillare bei 60°C durch Eintauchen in ein Heizbad gehalten. Das Ende der Kapillare nahe der Vakuumzuleitungsver bindung wurde dann mit einem Propanbrenner verschlossen und die verschlossene Kapillare in ein Heizbad mit 70°C 12 Stunden lang gestellt.

B. Behandlung mit einem Grignard-Reagenz

Eine 10 ml Ampulle unter einer Stickstoffreinigung und ausgestat tet mit einer Gummitrennwand wurde mit 5 ml trockenem THF bela den. Man ließ Stickstoff durch das THF in der Ampulle mehrere Minuten lang blubbern. Anschließend wurde Vinylmagnesiumbromid (1 ml) zu dem THF mit einer trockenen Spritze gegeben und die resultierende Lösung wurde mit Stickstoff gereinigt.

Ein Ende der versiegelten, chlorierten Kapillare aus Teil A dieses Beispiels wurde mit einer Zange angebrochen, während die Kapillare in trockenes THF eingetaucht war. Das so entstandene offene Ende wurde schnell in die Vinylmagnesiumbromid/THF-Lösung gestellt. Das andere Ende der Kapillare wurde dann abgebrochen und sofort mit einer Vakuumzuleitung verbunden. So wurde das Vinylmagnesiumbromid/THF in die Kapillare durch das Vakuum gezo gen. Die Lösung wurde durch die Kapillare mehrere Minuten lang gezogen, anschließend wurde das Kapillarende in der Lösung, nahe der Ampullentrennwand mit einem Propanbrenner verschlossen. Dann wurde die Kapillare in ein Heizbad mit 50°C gestellt und das Vakuum (60 Millitorr oder weniger) 30 Minuten lang aufrechter halten. Das andere Ende der Kapillare nahe der Vakuumzuleitungs verbindung wurde verschlossen und die verschlossene Kapillare in ein Heizbad mit 70°C 12 Stunden lang gestellt.

C. Bildung der Polyacrylamid-Beschichtung

Die Enden der verschlossenen Kapillare aus Teil B dieses Bei spiels wurde abgebrochen und die so geöffnete Kapillare mit THF mehrere Minuten gespült. Dann wurde das THF entfernt und die Kapillare mit destilliertem Wasser mehrere Minuten gespült, daraufhin wurde das Wasser entfernt.

Man stellte eine Acrylamidlösung her durch Mischen von 0,3 ml 10%iges Acrylamid, 0,7 ml Wasser, 1 µl TEMED und 10 µl 10%iges Ammoniumpersulfat und Entlüftung der resultierenden Mischung. Dann füllte man die Kapillare mit der Lösung. Nach 30 Minuten spülte man das überschüssige Acrylamid aus der Kapillare mit Wasser, wobei eine chemisch gebundene Schicht aus Acrylamid (polymerisiert, jedoch nicht vernetzt) auf den inneren Wänden der Kapillare zurückblieb.

D. Reproduzierbarkeit der Behandlung

Man beschichtete in der oben beschriebenen Weise 5 Kapillaren. Dann untersuchte man jede mit α-Lactalbumin unter den folgenden Bedingungen:

Puffer: 0,05 M Glutamin, Triethylamin (pH 9,5);
Kapillare: 50 µm im Durchmesser ×60 cm (45 cm zum Detektor);
Injektion: hydrodynamisch; 5 Sekunden mit 20 cm Differentialhöhe;
angelegtes Feld: 20 kV, 15µA, negative Polarität (Kathode am Injektionsende).

Die Anzahl theoretischer Schichten wurde für jeden Durchlauf unter Verwendung der Formel

bestimmt, worin N die Anzahl der theoretischen Schichten bedeu tet. Dann wurden die relativen Standardabweichungen für beide Wanderungszeiten und die Anzahl der theoretischen Schichten bestimmt, wobei beide weniger als 5% für die beschichteten Ka pillaren betrugen. Für die unbeschichteten Kapillaren betrugen die relativen Standardabweichungen in beiden Fällen unter 3%.

Die Beispiele 2 und 3 zeigen die Verwendung von Kapillaren, die nach den Verfahren des Beispiels 1 herstellt wurden und Verglei che dieser Kapillaren mit unbeschichteten Kapillaren. Die Aus rüstung und Verfahren, die in den Beispielen 2 und 3 verwendet wurden, sind die folgenden.

Es wurde eine Hochspannungstromversorgung (0-30 kV) eingesetzt, die von Spellman High Electronics Corporation (Plainview, Hew Jersey, U.S.A.) gekauft wurde. Die Bestimmung wurde mit einem UV-Absorbtionsdetektor mit variabler Wellenlänge (UVIDEC-100-V, Jasco, Tokyo, Japan) durchgeführt, der bei 214 nm arbeitete. Die eingesetzten Kapillaren waren Kapillaren aus Hartglas (Polymicro Technologies, Phoenix Arizona, U.S.A.) mit einem Innendurchmes ser von 50 µm und einem Außendurchmesser von 187 µm. In jeder Kapillare wurde ein optisches Fenster gebildet in dem man einen kleinen Bereich der Polyacrylamidbeschichtung entfernte. Die Proben hatten etwa ein Volumen von 1,2 ml, was mit angenähert 240 pg eines individuellen Proteins korrespondierte. Die Proben wurden durch hydrodynamischen Fluß eingeführt und die Probenvo lumen wurden berechnet unter Verwendung der bekannten Injek tionszeiten und der gemessenen Geschwindigkeit des hydrodynami schen Flusses wie von Rose, D.J. et al., J. Chromatogr. 438 : 23-34 (1988) beschrieben.

Unbeschichtete Kapillaren wurden aufeinanderfolgend mit 0,1 M NaOH und Puffer jeweils ungefähr 2 Minuten zwischen den Durch läufen gespült, während die beschichteten Kapillaren nur mit dem Puffer zwischen den Durchläufen gespült wurde. Untersuchungen zum elektroosmotischen Fluß wurden durch Verwendung von Aceton (2%ige wäßrige Lösung) als neutrales Markierungsmittel durchge führt. Diese Untersuchungen wurden wenigsten zweimal pro Tag durchgeführt oder dann, wenn die Wirkungen verschiedener Puffer systeme auf die Kapillarbeschichtung folgten, da dies notwendig erschien. Die Datensammlung und Durchführung erfolgte an einem IBM Personal-Computer.

Beispiel 2 Proteintrennungen bei hohem pH A. Wirkung der Wandbehandlung auf die Auflösung

Es wurden Trennungen mit der folgenden Proteinmischung bei pH 9,5 unter Verwendung sowohl unbeschichteter Kapillaren als auch gemäß der Erfindung beschichteter Kapillaren durchgeführt:

Tabelle 1

Probenmischung für Fig. 1

Die Trennungsbedingungen waren die folgenden:

Puffer: 0,05 M Glutamin, Triethylamin (pH 9,5);
Kapillare: 50 µm im Durchmesser ×60 cm (45 cm zum Detektor);
Injektion: hydrodynamisch; 5 Sekunden mit 20 cm Differentialhöhe;
angelegtes Feld: beschichtete Kapillaren: 20 kV, 15µA, negative Polarität (Kathode am Injektionsende).
unbeschichtete Kapillaren: 10 kV, 7 µA, positive Polarität (Anode beim Injektionsende).

Es ist zu beachten, daß die angelegten Spannungen, die bei den Durchläufen mit den beschichteten Kapillaren verwendet wurden, signifikant höher waren als diejenigen, die bei unbeschichteten Kapillaren verwendet wurden. Da es keinen elektroosmotischen Fluß bei den beschichteten Kapillar-Durchläufen gab, diente die höhere Spannung dazu, eine schnellere Wanderung der Proteine durch die Kapillare auf die Kathode hin zu fördern. Bei den unbeschichteten Kapillaren trat ein starker elektroosmotischer Fluß in Richtung der Kathode auf und stellte die vorherrschende Wanderungskraft auf die Ionen der Probe dar, während die elek trophoretische Kraft in entgegengesetzter Richtung wirkte, was dazu diente die Ionen zu trennen und die beschränkte Peakauflö sung, die erhalten werden konnte, zu erreichen. In dem Fall war das Ergebnis eine optimierte Trennung.

Fig. 1 zeigt die Ergebnisse, die eine typische Nachweisspur zeigt, die man erhielt bei Verwendung bei einer beschichteten Kapillare in Fig. 1a, und die man erhielt bei Verwendung einer unbeschichteten Kapillare in Fig. 1b unter den oben beschriebe nen Bedingungen. Die Identität des Proteins, das durch jeden Peak dargestellt wird, ist mit einer Zahl bezeichnet, in Über einstimmung mit obiger Tabelle 1. Aus einem Vergleich der zwei Spuren ist es klar, daß die beschichtete Kapillare eine signifi kant verbesserte Trennung liefert.

B. Wirkung der Wandbehandlung auf die Reproduzierbarkeit der Wanderungszeit

Unter Einsatz von jeweils fünf Durchläufen sowohl für die be schichtete als auch für die unbeschichteten Kapillaren wurde die relative Standardabweichung der Wanderungszeit von jedem der Proteine bestimmt. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 2 aufge führt.

Tabelle 2

Standardabweichungen der Wanderungszeit

Wie die Daten in Tabelle 2 zeigen, liefert die Beschichtung der Kapillare gemäß der Erfindung eine Verbesserung der Reproduzier barkeit von nahezu einer Größenordnung, was den Effekten zuzu schreiben ist, die der elektroosmotische Fluß und die Analytad sorption auf die Wanderungszeiten haben.

Um das Fehlen eines elektroosmotischen Flusses in den beschich teten Kapillaren zu bestätigen, wurden Untersuchungen des elek troosmotischen Flusses unter Verwendung von Aceton als ein neu trales Markierungsmittel, wie in Beispiel 1 oben beschrieben, durchgeführt. In einer Untersuchung nach 3-stündigen alkalischen Bedingungen, mit der Stromversorgung mit einer positiven Polari tät von 20 kV, erschien das neutrale Markierungsmittel nicht auf dem Detektor. Der Koeffizient des elektroosmotischen Flusses in m²/V-sec kann durch die folgende Gleichung bestimmt werden, per Jorgenson, J.W. et al., J. Chromatogr. 53 : 1298-1302 (1981):

worin

µ_e0 = Koeffizient des elektroosmotischen Flusses
L_tot = Gesamt-Kapillarlänge
L_sep = Kapillarlänge vom Injektionsende bis zum Detektor
V = angelegte Spannung und
t₀ = Wanderungszeit des neutralen Markierungsmittels

bedeutet.

Unter Anwendung dieser Gleichung, betrug der elektroosmotische Fluß, der in der beschichteten Kapillare nach drei Stunden ge messen wurde, weniger als 1,25×10^-9m²/V-sec, während der in der unbeschichteten Kapillare 5,4×10^-8m²/V-sec betrug.

C. Wirkung der Wandbehandlung auf die Trennungswirksam keit und die Peakform

Die Zahl theoretischer Schichten und die Peakasymmetrie sowohl für die beschichteten als auch für die unbeschichteten Kapilla ren wurden unter Verwendung von α-Lactalbumin und Rinderalbumin bestimmt. Die Berechnungen für diese Parameter wurden gemäß den Methoden, die von Kirkland, J.J. et al., 3. Chromatogr. Sci. 15 : 303-316 (1977) beschrieben wurde, wie folgt durchgeführt (H= Zahl der theoretischen Schichten):

Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt:

Tabelle 3

Zahl der theoretischen Schichten und Peakasymmetrie für Proteine, die bei pH 9,5 getrennt wurden

Die Daten in Tabelle 3 zeigen, daß die beschichtete Kapillare der unbeschichteten Kapillare sowohl in der Anzahl der theoreti schen Schichten als auch der Peakasymmetrie überlegen ist. Ganz besonders zeigen die Werte für die Peakasymmetrie in der be schichteten Kapillare ein sehr geringes Abfallen. Das zeigt, daß jede auftretende Proteinadsorption reversibel ist und die Äqui librierung mit schneller Geschwindigkeit geschieht.

Der bei der Gewinnung der in Fig. 2 aufgeführten Daten einge setzte Puffer war der obenerwähnte Glutamin/Triethylamin-Puf fer. Um mögliche Wirkungen der Pufferkomponenten auf die Wirk samkeit zu untersuchen, wurde ein Boratpuffer (0,05 M Natriumbo rat, pH 9,5) anstelle des Glutamin/Triethylamin-Puffers bei par allelen Untersuchungen verwendet. Der Boratpuffer ergab N- und Peakasymmetrie-Werte, die sehr ähnlich oder leicht verbessert gegenüber denjenigen waren, die man mit dem Glutamin/Triethyla min-Puffer erhielt, obwohl die Auflösung bei dem Boratpuffer weniger zufriedenstellend war. Die Ähnlichkeit in H und der Pea kasymmetrie sind ein Hinweis darauf, daß die Proteinwechselwir kungen mit den Pufferkomponenten keine wahrscheinliche Ursache der Peakverbreiterung sind. Sie zeigt auch, daß das Triethylamin nicht die restlichen Silanolgruppen der beschichteten Kapillare maskiert und daß die Reduktion der Ladung der Kapillaroberfläche tatsächlich ein Ergebnis der Polymerbeschichtung ist.

D. Langzeitstabilität

Nach vier Wochen kontinuierlichen Einsatzes mit einem pH 9,5 Puffer (der Puffer wurde über Nacht durch Wasser ersetzt), ein schließlich von mehr als 150 Injektionen, zeigten die Untersu chungen des elektroosmotischen Flusses, daß der elektroosmoti sche Fluß nicht auf ein meßbares Ausmaß zurückgekehrt war, und die Proteinwanderungszeiten blieben von Tag zu Tag übereinstim mend, mit einer relativen Standardabweichung von weniger als 2% für eine Zeitdauer von fünf Tagen. Das zeigt an, daß das Be schichtungsmaterial intakt geblieben war und die Kapillarwände ihren neutralen Charakter über die Zeit behielten.

Des weiteren wurden die Kapillarwände pH 10,5-Puffern fünf Tage lang ausgesetzt ohne daß sich ein Anzeichen einer Verschlechte rung der Kapillarbeschichtung ergab. Eine Verschlechterung der Beschichtung wurde jedoch durch eine zweitägige Beibehaltung eines pH 11-Puffers in der Kapillare ausgelöst, wonach eine Untersuchung des elektroosmotischen Flusses einen elektroosmoti schen Flußkoeffizient von 6,8×10^-9m²/V-sec ergab. Dieser Wert, obgleich er noch beträchtlich geringer ist als der für eine unbeschichtete Kapillare gemessene Wert, ist ein Hinweis darauf, daß die Polyacrylamidbeschichtung teilweise entfernt wurde um freie Silanolgruppen auf der Kapillaroberfläche freizulegen.

Beispiel 3 Eiweißtrennungen bei niedrigem pH A. Wirkung der Wandbehandlung auf die Auflösung

Trennungen bei niedrigem pH sind besonders nützlich beim Arbei ten mit sehr basischen Proteinen wie diejenigen mit isoelektri schen Punkten von mehr als 10,0. Die Trennung solcher Proteine als Anionen würde einen Puffer bei einem pH im Bereich von 11 bis 12 erfordern. Das ist nicht praktisch im Sinn der Kapillarstabili tät oder in vielen Fällen auch im Sinn der Stabilität der Pro benkomponenten. Bei niedrigem pH jedoch können die Proteine eine positive Ladung bekommen und auf die Kathode zuwandern.

Für die Trennungen bei der Untersuchung der basischen Proteine bei niedrigem pH, wurde die folgende Proteinmischung verwendet:

Tabelle 4

Probenmischung für Fig. 2

Die Bedingungen für die Trennung waren die folgenden:

Puffer: 0,03 M Zitronensäure (pH 2,7); mit 1 M NaOH eingestellt);
Kapillare: 50 µm im Durchmesser ×60 cm (45 cm zum Detektor);
Injektion: hydrodynamisch; 5 Sekunden mit 20 cm Differentialhöhe;
angelegtes Feld: beschichtete Kapillaren: 20 kV, 15µA, unbeschichtete Kapillaren: 12 kV, 5 µA, negative Polarität in beiden Fällen.

Wie bei den Experimenten mit hohem pH, wurde eine höhere Span nung für die beschichteten Kapillaren verwendet um die Trennung zu beschleunigen.

Fig. 2 zeigt die Ergebnisse, die eine typische Nachweisspur zeigt, die man erhielt bei Verwendung bei einer beschichteten Kapillare in Fig. 2a, und die man erhielt bei Verwendung einer unbeschichteten Kapillar in Fig. 2b unter den oben beschriebenen Bedingungen. Die Identität des Proteins, das durch jeden Peak dargestellt wird, ist mit einer Zahl bezeichnet in Übereinstim mung mit obiger Tabelle 4.

Aus einem Vergleich der zwei Spuren ergibt sich klar, daß die beschichtete Kapillare eine signifikant verbesserte Trennung bei niedrigen und hohen pH-Bedingungen liefert. Wiederum war kein osmotischer Fluß in den beschichteten Kapillaren zu entdecken.

Der Koeffizient des elektroosmotischen Flusses bei der unbe schichteten Kapillare, berechnet gemäß oben angegebener Formel, betrug 2,4·10^-8m²/V-sec, was ungefähr zweimal langsamer war als der, der bei der unbeschichteten Kapillare des obigen Beispiels 2 bei pH 9,5 auftrat. Trotz dieses reduzierten elektroosmoti schen Flusses und einer längeren Trennungszeit war die Auflösung in der unbeschichteten Kapillare noch schlechter gegenüber der, die man bei der beschichteten Kapillare erhielt. Ferner zeigte die verbesserte Form des Peaks, die man bei der beschichteten Kapillare erhielt, eine reduzierte elektrostatische Wechselwir kung der Proteine mit den beschichteten Kapillarwänden.

B. Wirkung der Wandbehandlung auf die Reproduzierbarkeit der Wanderungszeit

Unter Einsatz von jeweils fünf Durchläufen sowohl für die be schichteten als auch unbeschichteten Kapillaren wurde die rela tive Standardabweichung der Wanderungszeit von jeder der Pro teine bestimmt. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 5 aufge führt.

Tabelle 5

Standardabweichungen der Wanderungszeit

Die Daten in der Tabelle zeigen hier wiederum, daß die Beschich tung der Kapillare gemäß der Erfindung eine Verbesserung der Reproduzierbarkeit um ungefähr eine Größenordnung ergibt.

C. Wirkung der Wandbehandlung auf die Wirksamkeit der Trennung und auf die Peakform

Die Anzahl der theoretischen Schichten und die Peakasymmetrie sowohl für die beschichteten als auch für die unbeschichteten Kapillaren wurden unter Verwendung von Cytochrom c und Trypsi nogen bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgeführt:

Tabelle 6

Anzahl theoretischer Schichten und Peakasymmetrie für Eiweiße, die bei pH 9,5 getrennt wurden

Die Daten in Tabelle 6 zeigen hier wiederum, daß eine viel grö ßere Anzahl theoretischer Schichten bei den beschichteten Kapil laren als bei den unbeschichteten Kapillaren beobachtet werden und die Werte für die Peakasymmetrie bei der beschichteten Ka pillare nur ein leichtes Abfallen anzeigen im Vergleich zu dem signifikanten Abfallen bei der unbeschichteten Kapillare.

D. Langzeitstabilität

Zwei Wochen lang wurde eine beschichtete Kapillare bei pH 2,7 verwendet ohne Anzeichen einer Verschlechterung, wie sie bei den täglichen Untersuchungen des elektroosmotischen Flusses erkenn bar sind. Die Kapillare wurde dann bei pH 2,0 eine Woche lang verwendet ohne meßbaren elektroosmotischen Fluß. Die besten Trennungen wurden bei pH 2,7 erhalten.

Die vorstehenden Ausführungen dienen primär dem Zweck der Illu stration. Für den Fachmann ist es schnell erkennbar, daß Varia tionen, Substitutionen und Modifikationen allgemein sowohl bei den Materialien als auch bei den Verfahren durchgeführt werden können, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Verfahren zur Behandlung einer festen Oberfläche, die expo nierte Silanolgruppen trägt um das Vorliegen elektrostati scher Ladungen an den Gruppen zu reduzieren, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfaßt:

a) Behandlung der Oberflächen, um die exponierten Silanolgrup pen in Siliziumhalogenidgruppen umzuwandeln,
b) Reaktion der so behandelten Oberfläche mit einer organome tallischen Verbindung, die eine aliphatische Gruppe R einschließt, die einen endständigen Ethenylteil enthält, um die Siliziumhalogenidgruppen in Si-R-Gruppen umzuwandeln, die die endständige Ethenylbindung behalten und
c) Reaktion der Si-R-Gruppen mit einer neutralen organischen Spezies, die zu einer Additionspolymerisation an der end ständigen Ethenylgruppe befähigt ist um eine Polymerschicht zu bilden, die an die Oberfläche kovalent gebunden ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die neutrale Spezie der Stufe (c) eine monomere Spezies ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Acrylaten, Acrylamiden, substituierten Acrylamiden und Alkyl-, Aryl- und halosubstitu ierten Ethylenen besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die neutrale Spezie der Stufe (c) Acrylamid ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die organometallische Verbindung ein Element ist, ausge wählt aus der Gruppe, die aus R-Li und R-Mg-X besteht, worin X Halogen und R Ethenyl darstellt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die organometallische Verbindung die Formel R-Mg-X auf weist, worin R Ethenyl ist und X ein Element ist, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Chlorid und Bromid besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Halogenid der Siliziumhalogenidgruppen der Stufe (a) ein Element darstellt, ausgewählt aus der Gruppe die aus Chlorid und Bromid besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Stufe (a) die Behandlung der Oberfläche mit Thionyl chlorid umfaßt um die exponierten Silanolgruppen in Silizium chloridgruppen umzuwandeln.

8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die feste Oberfläche eine Oberfläche aus Hartglas ist.

9. Kapillare aus Siliziumdioxid-enthaltendem Material, dessen innere Oberfläche mit einem organischen Polymer durch das Ver fahren des Anspruchs 1 beschichtet wird.

10. Verfahren zur Trennung eines Proteingemisches in einer flüssigen Probe in Komponenten, wobei das Verfahren das Führen der Probe durch eine Kapillare aus Siliziumdioxid-enthaltendem Material umfaßt, unter Bedingungen, die eine elektrophoretische Trennung der Proteine in der Kapillare fördern, wobei die Innen wand der Kapillare mit einer Polyacrylamidschicht beschichtet ist, die an das Siliziumdioxid-enthaltende Material durch Bin dungen kovalent gebunden ist, die Si-Atome der Kapillare direkt mit den C-Atomen des Polyacrylamids verknüpfen.