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Hintergrund
der Erfindung
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Elektrophorese ist ein sehr bekanntes
Verfahren zur Trennung von geladenen Spezies, welche unterschiedliche
Mobilitäten
dieser Spezies in einem elektrischen Feld verwendet. Die Mobilitäten hängen von
dem Elektrophoresemedium, der Stärke
des elektrischen Feldes und den Eigenschaften der Ionen selber ab,
einschliesslich Netzoberflächenladung,
Grösse
und Form. Schmale Spezies, wie Metallionen, und auch grosse Spezies,
wie Viren, wurden durch elektrophoretische Techniken getrennt, jedoch
wird Elektrophorese gegenwärtig
meist zur Trennung von biologischen Makromolekülen, einschliesslich Proteinen,
Nukleinsäuren
und ihren Derivaten, verwendet. Das Verfahren wird für gewöhnlich dadurch
ausgeführt,
dass die Moleküle
durch ein wässriges
Gel wandern müssen.
Die Gele, welche bei der Elektrophorese verwendet werden, sind aus
natürlichen
oder synthetischen Polymeren zusammengesetzt. Agarose ist das verbreitetst
verwendete natürliche Material
und Polyacrylamidgele stellen die üblichste synthetische Matrix
dar. Die Gele werden im wesentlichen in zwei Arten von elektrophoretischen
Einheiten verwendet: vertikale und horizontale. Bei horizontalen
Einheiten kann der Kontakt zwischen den Elektroden und dem Gel direkt
oder mittels Dochten hergestellt werden. Alternativ dazu wird das
Gel bei der eingetauchten Gelelektrophorese in Puffer eingetaucht,
welcher als leitfähiges
Medium zwischen Elektroden und dem Gel dient. Diese Ausgestaltung
ist die einfachste und wird zur Analyse von Nukleinsäuren weit
verbreitet verwendet. Agarosegele werden beinahe exklusiv verwendet
für die eingetauchte
Gelelektrophorese von Nukleinsäuren.
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Eine neue synthetische Matrix wurde
durch Kozulic et at (US-Patent Nr. 5,259,943, Analytical Biochemistry
163 (1987) 506–512
und Analytical Biochemistry 170 (1988) 478–484) zur Analyse von Proteinen
und Nukleinsäuren
eingeführt.
Sie basiert auf einem Acrylmonomer, N-Acryloyl-Tris(hydroxymethyl)aminomethan (NAT).
Die Poly(NAT)-Gele stellten sich als poröser heraus als Polyacrylamidgele,
jedoch weniger porös
als Agarosegele. Deshalb boten sie Vorteile zur Trennung von grossen
Proteinen und jenen Nukleinsäuren
an, deren Grösse
ausserhalb des optimalen Trennungsbereiches von Agarose- und Polyacrylamidgelen
liegt. In den zitierten Referenzen wurden die überragenden Eigenschaften der
Poly(NAT)-Gele zur
Analyse von DNA nach dem Fliessen der Gele in einem vertikalen Format
demonstriert. Es wurde jedoch festgestellt, dass die DNA-Auflösung in
den Poly(NAT)-Gelen bei den eingetauchten Standardelektrophoreseeinheiten
niemals so gut war, wie in dem vertikalen System. Der Hauptunterschied
wurde in der unteren Hälfte
des Gels beobachtet, wo die Bänder
viel diffuser wurden. Zudem wanderten die DNA-Fragmente in den mittleren
Bahnen weiter als die entsprechenden Fragmente in den äusseren
Bahnen. Dieses Phänomen
ist als der Smiling-Effekt bekannt. Des weiteren waren die DNA-Bänder sehr
oft nur in der Mitte gerade, in den Ecken jedoch waren sie nach
oben gebogen. Die oben beschriebenen Vorkommnisse wurden beseitigt,
sobald sich die Gele in einer verbesserten Vorrichtung für eingetauchte
Gelelektrophorese (Kozulic und Heimgartner, US-Patent Nr. 5,259,943)
befanden. Bei dieser Vorrichtung steuern Pufferkühlung und Rezirkulation die
Wärme,
welche während
der Elektrophorese produziert wird, und verhindern den Schwund von
Pufferionen in der Elektrodenkammer. Zusätzlich dazu ist das elektrische
Feld homogener als bei den eingetauchten Standardelektrophoreseeinheiten.
Die Kombination dieser drei Verbesserungen ergab eine bessere Auflösung von
DNA-Fragmenten in
Poly(NAT)-Gelen.
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Die Poly(NAT)-Gele in der verbesserten
Vorrichtung sind für
gewöhnlich
drei Millimeter dick. Die Probentaschen wurden mit Kämmen 2,5
mm tief, 1,5 mm breit und 5,5 mm lang ausgebildet. So sollte das
Volumen der Probentasche ungefähr
20 μl betragen,
in der Praxis liegt es jedoch bei ungefähr 15 μl, da die Taschen sich nach
der Entfernung des Kammes leicht verziehen. Wenn das Probenvolumen
zwischen 2 und 5 μl
lag, war die Auflösung
der DNA-Fragmente
ausgezeichnet, aber sie war eher gering, wenn das Probenvolumen
10 μl oder
mehr betrug, was durch eine Photografie des Gels gezeigt wurde.
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Das Ergebnis entsprach vielen Berichten
im Stand der Technik, welche zeigen, dass ein geringes Probenvolumen
für eine
optimale Auflösung
wesentlich war. Deshalb wurde die schwache Auflösung bei eingetauchten Poly(NAT)-Gelen,
bei höheren
Probenvolumen anfänglich
als normal betrachtet. Äthidiumbromid wurde
verwendet, um DNA in Poly(NAT)-Gelen einzufärben und die Fluoreszenz von
DNA-Äthidiumbromid-Komplexen
wurde unter einem UV-Licht visualisiert. Es wurde zufällig beobachtet,
dass bei einem Betrachten des Gels von oben unter einem von der
Vertikalen geneigten Winkel die betrachteten DNA-Bänder in dem
Gel viel schärfer
waren, als sie auf der Photografie dargestellt waren, welche mit
einer Kamera aufgenommen wurde, die über oder weniger vertikal über dem
Gel angeordnet war. Auf der Basis dieser Beobachtung wurde angenommen,
das eine Streuung von Bändern,
welche auf der Photografie zu sehen war, nicht von der wirklichen
Streuung von Bändern
in dem Gel entstand, sondern eher von der vertikalen Position der
Kamera und der Neigung der Bänder
gegen die vertikalen Achsen. Als eine Konsequenz dieser Beobachtung
hat sich das folgende Ziel eine Erfindung herauskristallisiert:
Falls die Bänder
in dem Gel im wesentlichen vertikal hergestellt werden können, dann
würde die
Auflösung,
welche durch die normal angeordnete Kamera aufgenommen wurde, qualitativ
besser werden und ausserdem unabhängig von dem Probenvolumen.
Es ist nun das Hauptziel der folgenden Diskussion, Faktoren zu beschreiben,
welche das Biegen von Bändern
in Gelen während
der Elektrophorese verursachen, und praktische Elemente, um solches
Biegen grösstenteils
zu verringern.
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ZIELE DER ERFINDUNG
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Es ist ein Ziel der vorliegenden
Erfindung, die Ursachen des Biegens von Bändern in Gelen, welche bei
eingetauchter Gelelektrophorese vorhanden sind, herauszufinden und
zu zeigen, wie sie zu verhindern sind.
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Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden
Erfindung, praktische Elemente vorzusehen, welche solches Biegen
grösstenteils
verringern.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1a zeigt
eine schematische Seitenansicht eines Gels in einer Elektrodenkammer,
wobei eine Probe in einer Probentasche auf der linken Seite des
Gels platziert ist. Die beiden Punkte nahe einer jeden Seite der
Kammer stellen Elektroden dar und ein Pufferniveau wird durch eine
gestrichelte Linie dargestellt.
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1b zeigt
eine schematische Seitenansicht eines Gels mit hypothetischen, vollkommen
vertikalen Bändern,
welche Bereiche von separierten Molekülen darstellen.
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2 zeigt
eine schematische Seitenansicht eines 6%igen Poly(NAT)-Gels mit
getrennten DNA-Bändern,
wie in Beispiel 1 beschrieben.
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3 zeigt
eine schematische Seitenansicht eines 6%igen Poly(NAT)-Gels mit
getrennten DNA-Bändern,
wie in Beispiel 2 beschrieben.
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4 zeigt
eine schematische Seitenansicht eines 6%igen Poly(NAT)-Gels mit
getrennten DNA-Bändern,
wie in Beispiel 3 beschrieben.
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5a und 5b zeigen eine schematische
Seitenansicht eines 6%igen Poly(NAT)-Gels mit getrennten DNA-Bändern, wie
in Beispiel 4 beschrieben.
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6 zeigt
eine schematische Seitenansicht eines 6%igen Poly(NAT)-Gels mit
getrennten DNA-Bändern,
wie in Beispiel 5 beschrieben.
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7 zeigt
eine schematische Seitenansicht eines 6%igen Poly(NAT)-Gels mit
getrennten DNA-Bändern,
wie in Beispiel 6 beschrieben.
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8 zeigt
eine schematische Seitenansicht eines 6%igen Poly(NAT)-Gels mit
getrennten DNA-Bändern,
wie in Beispiel 7 beschrieben.
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9 zeigt
eine schematische Seitenansicht eines 6%igen Poly(NAT)-Gels mit
getrennten DNA-Bändern,
wie in Beispiel 8 beschrieben.
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10a und 10b zeigen eine schematische
Seitenansicht eines 5 mm dicken 6%igen Poly(NAT)-Gels mit getrennten
DNA-Bändern,
wie in Beispiel 10 beschrieben.
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11a und 11b zeigen eine schematische Seitenansicht
eines 9%igen Poly(NAT)-Gels mit getrennten DNA-Bändern, wie in Beispiel 11 beschrieben.
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12a und 12b zeigen eine schematische
Seitenansicht eines 5%igen Polyacrylamidgels mit getrennten DNA-Bändern, wie
in Beispiel 12 beschrieben.
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13a und 13b zeigen eine schematische
Seitenansicht eines 4%igen NuSieve-Gels mit getrennten DNA-Bändern, wie
in Beispiel 13 beschrieben.
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14 zeigt
eine schematische Seitenansicht eines 6%igen Poly(NAT)Gels mit getrennten
DNA-Bändern,
wie in Beispiel 15 beschrieben.
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15 zeigt
eine schematische Seitenansicht eines 9%igen Poly(NAT)-Gels mit
getrennten DNA-Bändern,
wie in Beispiel 16 beschrieben.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die Erfindung wird nun mit Bezug
auf 15 Figuren und 16 Beispiele dargestellt, welche detailliertere
Beschreibungen der Figuren enthalten. Jede Figur zeigt eine schematische
Seitenansicht der Elektrodenkammer und einen Gelabschnitt mit DNA-Bändern. Elektroden
sind durch ein oder zwei Punkte angedeutet, mit Anoden jeweils auf
der rechten Seite. Das Niveau des Puffers über dem Gel ist durch eine
gestrichelte Linie gekennzeichnet. Der Gelträger ist nicht gezeigt.
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Bei der eingetauchten Gelelektrophorese
wird ein Gel auf einer Plattform platziert und mit einem Puffer bedeckt,
welcher als ein elektrisch leitfähiges
Medium dient. Eine Probe wird in die Probentasche (1a) eingelegt und geladene Spezies von
der Probe trennen sich, wenn sie in das elektrische Feld migrieren.
Wie in 1 b gezeigt, sollten am Ende
des Laufes die getrennten Bänder
vertikal sein, da der Startbereich vertikal war. Nach dem Schneiden
eines Gelstreifens und seiner Platzierung auf seiner Seite unter
UV-Licht wurde jedoch beobachtet (2),
dass die getrennten Bänder
in dem Poly(NAT)-Gel immer gebogen waren.
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Es gibt fünf Hauptfaktoren, welche diesen
Effekt erzeugen könnten.
Diese sind ein inhomogenes elektrisches Feld, Elektroendosmose,
nicht einheitliche Wärmeableitung,
unterschiedliche Gelstärke
und unterschiedliche Leitfähigkeit
in dem Gel und Elektrophoresepuffer. Jede Kombination dieser Faktoren
ist ebenfalls möglich
und der Beitrag eines jeden von ihnen zu dem Effekt kann von unterschiedlicher
Bedeutung sein.
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Eine Inhomogenität des elektrischen Feldes wurde
als die erste mögliche
Ursache der Bänderbiegung angesehen.
Bei den eingetauchten Standardelektrophoresevorrichtungen sind die
elektrischen Feldlinien in der Gelkammer gekrümmt, da die Elektroden unterhalb
der Gelkammer gelegen sind. Bei der verbesserten Vorrichtung (Kozulic
und Heimgartner, US-Patent Nr. 5,259,943) ist die Homogenität des elektrischen
Feldes besser, da das Feld durch Elektroden erzeugt wird, welche
im wesentlichen auf derselben Ebene wie das Gel angeordnet sind.
Das Biegen der DNA-Bänder
jedoch wurde sowohl bei den Gelen in Standardeinheiten, als auch
in der verbesserten Einheit festgestellt, welche mit einem oder
zwei Platindrähten
für Anode
und Kathode ausgerüstet
war. Wie zuvor angezeigt (Kozulic und Heimgartner, US-Patent Nr. 5,259,943)
ist das elektrische Feld, welches durch Elektroden erzeugt wird,
die zwei Drähte
in einem vertikalen Abstand von 2–20 mm umfassen, wesentlich
homogener, als das Feld, das nur durch einen Draht erzeugt wird.
Poly(NAT)-Gele werden laufen gelassen, nachdem sie in der Mitte
zwischen den Elektrodenpaaren in bestimmten Abständen (5,10 und 35 mm) oder
näher zu
der Anode oder Kathode angeordnet wurden. Zusätzlich dazu wurde der vertikale
Abstand der Platindrähte
von 3 bis 10 mm variiert. Bei allen Gelen blieb das generelle Biegemuster,
welches in 2 gezeigt
ist, bestehen, obwohl es im Ausmass der Biegung Unterschiede gab,
insbesondere bei den die DNA-Fragmente unter 1 kbp darstellenden
Bändern.
Aus diesen Versuchen wurde geschlossen, dass die Verbesserung der
Homogenität
des elektrischen Feldes alleine nicht ausreichend war, um das Biegen
von DNA-Bändern zu überwinden.
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Während
der Elektrophorese kommt es aufgrund der Bewegung der Ionen in dem
Elektrophoresemedium zu Reibung, was in der Erzeugung von Wärme, bekannt
als Joule-Wänne,
resultiert. Die Wärme
wird in dem Gel erzeugt und in dem Puffer, welches es umgibt. Da
das Gel der Wanderung von Ionen mehr Widerstand entgegensetzt, wird
mehr Wärme
in dem Gel erzeugt. Diese Wärme
wird in den Puffer und die Plattform, auf welcher sich das Gel befindet,
abgegeben. Es ist berechtigt, zu vermuten, dass die Wärme effizienter
in den zirkulierenden Puffer als zu der Plattform übertragen
wird. Der Kunststoffträger,
welcher an dem Gelboden befestigt ist, verringert die Wirksamkeit
des Wärmetransfers
zu der Plattform zusätzlich.
Deshalb sollte die Temperatur nahe des Bodens höher sein, falls es einen Temperaturgradienten
in dem Gel gibt. Es ist bekannt, dass die Mobilität eines
Ions in einem elektrischen Feld mit der Temperatur des Mediums ansteigt.
Dementsprechend würde
ein DNA-Band nahe dem Boden des Gels weiter wandern. Jedoch wandern,
wie in 2 gezeigt, DNA-Bänder nahe
der Oberfläche
weiter. Ein Temperaturgradient in dem Gel ist deshalb als ein Hauptgrund
für das
Biegen von DNA-Bänder
in einem 3 mm dicken Poly(NAT)-Gel ausgeschlossen. Diese Schlussfolgerung
wird auch durch die Entdeckung getragen, dass ein ähnliches
Biegemuster in den Gelen existiert, welche in der Standardeinheit
und in der verbesserten Einheit getestet wurden. Die verbesserte
Vorrichtung weist Pufferzirkulation und Kühlung auf. Die Plattform, auf
welcher das Gel liegt, ist ebenfalls gekühlt. So wurde herausgefunden,
dass die Puffertemperatur bei dieser Einheit konstant war (25°), bei der
Standardeinheit jedoch von 22C° auf
34C° anstieg,
nachdem das Gel bei 7 V/cm für
ungefähr
zwei Stunden getestet wurde.
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Zum zweckmässigen Handling wurden die
Poly(NAT)-Gele auf einem Kunststoffträger, welcher in dem US-Patent
4,415,428 beschrieben ist, polymerisiert. Während der Polymerisation wurden
zwischen den Vinylgruppen des Trägers
und den Polymerketten, welche das Gel umfassen, kovalente Bindungen
ausgebildet. Es ist daher zu erwarten, dass das Gel nahe dem Kunststoffträger auf
dem Boden stärker
ist, und, falls es einen Gelstärke-Gradienten gibt,
DNA-Moleküle
nahe der Oberfläche
schneller wandern würden.
Dies ist in der Tat der Fall, wie in 2 gezeigt.
Es ist jedoch schwierig, das Biegemuster durch einen Gelstärke-Gradienten
von dem Boden zur Oberfläche
zu erklären,
da einige Bänder
mehr und einige weniger gebogen werden. Da das Gel in einer vertikalen
Position mit Probentaschen auf der Oberseite polymerisiert wurde,
bestand die Möglichkeit,
dass sich ein Stärkegradient
auch entlang der Gellänge
erstreckte. Gele mit horizontaler Polymerisation jedoch, bei welchen
der Träger
oben oder unten positioniert wurde, zeigten dasselbe Biegemuster.
Um den Einfluss der Gelstärke
weiter zu erläutern,
wurde ein Schicht des Kunststoffträgers während der Polymerisation auf
jeder Seite eines 6%igen Poly(NAT)-Gels befestigt. Falls es einen
Gelstärke-Gradienten
gibt, sollte das Gel in der Mitte schwächer sein und DNA-Moleküle sollten
in der Mitte des Gels schneller wandern. 3 zeigt, dass dies nicht der Fall ist.
Die Bänder
sind vertikal und daraus wurde gefolgert, dass das Biegen der Bänder nicht
durch Unterschiede in der Gelstärke
verursacht wurde. Obwohl auf diesem Wege das Biegen ausgeschlossen
wurde, wurde beobachtet, dass die Befestigung eines Kunststoffträgers auf
der Oberseite des Gels keine zweckmässige praktische Lösung ist,
da es schwieriger ist, solche Gele vorzubereiten, und da es notwendig
ist, den Träger
vor dem Einfärben
des Gels zu entferner.
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Die Polymerisation des Gels zwischen
zwei Kunststoffschichten beseitigte ebenfalls den Einfluss der Inhomogenität des elektrischen
Feldes, da das Feld in dem Gel durch den Kunststoffträger begrenzt
wurde. Zweitens wurde die Wanderung von Ionen in das Gel und aus
diesem durch seine Oberfläche
ebenfalls verhindert. Deshalb ist es von 3 her nicht möglich zu sagen, welches der
Hauptfaktor ist, der das Biegen der Bänder in einem eingetauchten
Gel verursacht.
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Der Hauptunterschied zwischen eingetauchter
Gelelektrophorese und anderen Verfahren ist die Tatsache, das fünf Seiten
des eingetauchten Gels von einem Puffer umgeben sind. In dem Gel
werden Ionen meist in die Richtung eines elektrischen Feldes durch
das Gel wandern. Während
der Elektrophorese kommen Anionen, welche anfänglich in dem Gel vorhanden
sind, an der Anodenseite des Gels heraus und Kationen auf der Kationenseite
des Gels. Sie werden kontinuierlich durch Anionen und Kationen aus
dem Puffer auf den sich gegenüberliegenden
Seiten ersetzt. Im Vergleich zu anderen Verfahren jedoch kommen
bei eingetauchter Gelelektrophorese wahrscheinlich einige Ionen
augrund von Diffusion und einem nicht einheitlichen elektrischen
Feld aus dem Gel durch seine obere Oberfläche heraus. Es ist ebenfalls
wahrscheinlich, das Ionen durch diese Oberfläche in das Gel eindringen.
Diese Bewegung von Anionen und Kationen in das Gel und aus dem Gel
durch seine Oberfläche
würde die
ionische Zusammensetzung in dem Gel beeinflussen. Die Ladung wird
nahe der Oberfläche
eindeutig grösser
sein. Es ist bekannt, dass die Wanderungsentfernung eines Ions, in
unserem Fall ein DNA-Molekül,
durch die folgende Formel beschrieben werden kann:
d = utE (1), wobei u
die elektrophoretische Mobilität
(cm
2s
–1V
–1),
t die Zeit in Sekunden und E die elektrische Feldstärke (Vcm
–1)
ist. Durch Ersetzen:
wobei i die momentane Dichte
(Scm
–1)
und K die Leitfähigkeit
(Scm
–1)
ist, erhält
man in Gleichung (1)
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Aus Gleichung (3) folgt, dass DNA-Moleküle in einem
Band dieselbe Entfernung nur wandern werden, wenn das Verhältnis der
Strom-Dichte und -Leitfähigkeit
in dem Gelabschnitt konstant bleibt, durch welchen das Band sich
bewegt. Falls sich das Verhältnis
aufgrund der Unterschiede in der Zusammensetzung oder der Konzentration
von Ionen ändert,
werden die DNA-Moleküle
in diesem Bereich des Gels unterschiedlich wandern. Wie in 2 gezeigt, ist dies experimentell
beobachtet worden, da DNA-Moleküle
nahe der Geloberfläche über eine
längere
Distanz wandern.
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An diesem Punkt sollte die ionische
Zusammensetzung eines 6%igen Poly(NAT)-Gels untersucht werden. Ein
Gel weist ein Volumen von ungefähr
17 ml (92 × 62 × 3 mm)
auf, die Werte jedoch sind für
1 l gegeben. Das NAT-Monomer
(58.8 g) und das N,N'-Methylen-Bis-Acrylamid
(1,2 g) werden in dem Puffer (pH 8) aufgelöst, welcher aus 30 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan
(Tris), 15 mM Essigsäure
und 0.75 mM Ethylendiamintetra-Essigsäure-Dinatrium-Salz (Na2EDTA)
zusammengesetzt ist, um einen Liter der Lösung zu ergeben. Um das Gel
zu polymerisieren, werden Tetramethylethylendiamin (TEMED) und Ammoniumpersulfat
in die schlussendliche Konzentration von 15 mM bzw. 1.65 mM hinzugefügt. Somit
enthält
das Gel vier Kationen (Tris, TEMED, Natrium und Ammonium) und die
drei Anionen (Acetat, EDTA und Sulfat als das Ausfallprodukt von
Persulfat, vorausgesetzt die Reaktion ist vollständig). Die Konzentration von
Tris ist 30 mM (nur ein Teil von ihm ist geladen), TEMED 15 mM (das
meiste weist eine Ladung auf und einige Moleküle können zwei positive Ladungen
tragen), Natrium 1.5 mM und Ammonium 3.3 mm. Die Konzentration von
Acetat ist 15 mM, EDTA 0.75 mM und Sulfat 3.3 mM. Somit variieren
die molekularen Gewichte und die Anzahl von Ladungen unter Anionen
und Kationen stark. Deshalb sind ihre Diffusions- und Wanderungsraten ebenfalls unterschiedlich,
was sich in Unterschieden bei äquivalenten
Leitfähigkeiten
der Anionen und Kationen wiederspiegelt. Da einige Ionen das Gel
durch seine Seiten und wahrscheinlich durch seine Oberfläche verlassen
und einige hierdurch eindringen, ist es offensichtlich, dass sich
die momentane Dichte und die Leitfähigkeit des Gels in einer komplexen
Weise ändern.
Da eine mathematische Behandlung dieses Prozesses kompliziert erschien
und von fragwürdiger
praktischer Bedeutung war, wurden Versuche gemacht, das Systeme
durch Verringerung der Anzahl von ionischen Spezies zu vereinfachen.
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Bei dem ersten Versuch wurde Natrium
durch Verwendung von EDTA-freier Säure in dem Gel und in dem vorhandenen
Puffer beseitigt. Der Puffer wurde aus 30 mM Tris, 11 mM Essigsäure und
1.5 mM EDTA zusammengesetzt. Die DNA-Bänder wurden noch immer gebogen
(4). Dann wurden sowohl
Natrium, als auch EDTA aus dem Puffer und dem Gel weggelassen, das
Biegen blieb jedoch.
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Bei den Gelen, welche in den 2 bis 4 gezeigt sind, war die Masse zu den
Ladungsverhältnissen der
Anionen und Kationen sehr unterschiedlich. Es erschien vernünftig zu
sein, zu testen, wie ein Puffer, welcher aus einem Anion und Kation
zusammengesetzt ist und ein ähnliches
Masse-Ladungsverhältnis
aufweist, die Form der DNA-Bänder
beeinflusst. Die molare Leitfähigkeit
und die Diffusionsrate solch eines Anions und Kations wurde als ähnlich erwartet.
N-Methyl-Glucamin
(MW 195) und Glukonsäure
(MW 196) wurden ausgewählt.
Der Puffer enthielt 30 mM N-Methyl-Glucamin und 15 mM Glukonsäure. Das
Gel wurde in diesem Puffer polymerisiert und in den 30 mM Tris,
11 mM Acetat, 1.5 mM EDTA-freier Säurepuffer elektrophoresiert.
Wie in 5a gezeigt, werden
DNA-Bänder
gebogen, jedoch auf der anderen Seite. D. h., DNA- Moleküle wanderten nahe
des Kunststoffträgers
weiter als die Moleküle
nahe der Oberfläche
des Gels, insbesondere in dem Bereich des hohen Molekulargewichtes.
Dieser Versuch war ein starkes Anzeichen dafür, dass die ionische Zusammensetzung
des Gels einen bedeutenden Einfluss auf das Biegen von Bändern hat.
Ein anderes Gel einer identischen Zusammensetzung wurde in demselben
Puffer behandelt, jedoch in dem elektrischen Feld, welches durch
einen Platindraht für
die Anode und Kathode erzeugt wurde. 5b zeigt
dasselbe generelle Biegen, obwohl die Form einiger Bänder leicht
unterschiedlich ist. Dieses Ergebnis zeigte erneut, dass das elektrische
Feld zu der Biegung von Bändern
beiträgt,
dass jedoch sein Beitrag geringer ist als der der ionischen Zusammensetzung.
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Es bestand jedoch eine Möglichkeit,
dass die Unterschiede beim Biegen durch unterschiedliche Elektroendosmose
in den Poly(NAT)-Gelen verursacht wurde. Bekanntermassen beeinflusst
Elektroendosmose die elektrophoretische Wanderung von analysierten
Molekülen
(S. Hjerten, Elektrophorese, 1990, 11, 665–690). Elektroendosmose in
einem Gel hängt
von der Konzentration und dem Typ von geladenen Gruppen ab, welche
auf der Matrix befestigt sind. In Gelen, welche durch die Polymerisation
freier Radikale hergestellt sind, die durch Sulfatradikale initiiert
werden, gibt es immer eine geringe Anzahl von Sulfatgruppen. Des
weiteren kann ein Sulfatradikal, oder Hydroxylradikal, welches aus
ihm abgeleitet wurde, mit einem Pufferion reagieren, falls dieses
Ion eine reaktive Gruppe enthält.
Das neue Radikal kann dann in die Polymermatrix eingebaut werden.
Es ist bekannt, dass Zusammensetzungen mit Hydroxylgruppen mit freien
Radikalen reagieren und einige Pufferionen, welche hier verwendet
werden, drei (Tris) oder fünf
(N-Methyl-Glucamin oder Glukonsäure)
Hydroxylgruppen enthalten. Die Aufnahme von Tris würde das
Gel positiv geladen machen und es würde sowohl positive als auch
negative Ladungen enthalten, falls es N-Methyl-Glucamin und Glukonsäure aufnimmt.
Um aufgrund der aufgenommenen Pufferionen Elektroendosmose auszuschliessen,
wurden Poly(NAT)-Gele mit TEMED und Ammoniumpersulfaten in Wasser
polymerisiert und dann gegen Elektrophoresepuffer äquilibriert.
Ein Gel wurde gegen den 30 mM TAE-Puffer und das andere gegen den
30 mM N-Methyl-Glucamin, 15 mM Glukonsäure-Puffer äquilibriert. Das erste Gel
wurde in demselben TAE-Puffer und das zweite in demselben N-Methyl-Glucamin-Glukonsäurepuffer
behandelt. Die 6 und 7 zeigen, dass das Biegen
der DNA-Bänder
in diesen Gelen vergleichbar mit dem Biegen in Gelen ist, welche
bei Vorhandensein dieser Puffer polymerisiert wurden. Deshalb wurde
daraus geschlossen, dass die durch eingebaute Pufferionen verursachte
Elektroendosmose nicht wesentlich zu dem Biegen der Bänder beigetragen
haben konnte.
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Die andere wichtige Schlussfolgerung
aus den Ergebnissen der 6 und 7 war, dass das Biegen der Bänder auch
auftrat, wenn die Konzentration und die Zusammensetzung von Ionen
in dem Gel identisch zu der in dem Puffer war. Ein weiterer Versuch
wurde durchgeführt,
um diese Schlussfolgerung nachzuprüfen. So wurde ein Gel in Wasser
polymerisiert und ein Vorteil daraus gezogen, dass TEMED eine schwache
Base ist, und dass Hydrogensulfat aus Persulfat hergestellt wird.
Deshalb weist die Lösung
aus TEMED und Ammonniumpersulfat bei der Konzentration, welche verwendet
wird, um das Gel zu polymerisieren, eine ausreichend grosse Pufferkapazität auf, um
als ein Puffer für
Elektrophorese verwendet zu werden. Obwohl das Gel und der Elektrophoresepuffer
nur drei Ionen mit derselben Konzentration enthalten, wurde das
Biegen von DNA-Bändern
nicht vermieden (8).
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Die obigen Ergebnisse beweisen klar
zwei Dinge. Erstens hat die ionische Zusammensetzung des Gels und
des Puffers eine bedeutende Auswirkung auf das Biegen von Bändern. Zweitens
kann das Biegen nicht durch Einstellen der Zusammensetzung und der
Konzentration von Ionen in dem Gel auf denselben Wert wie derjenige
in dem Elektrophoresepuffer vermieden werden. Die Ergebnisse legen
auch nahe, dass die Natur von Ionen vorwiegend in Verbindung mit
ihrem Einfluss auf das Verhältnis
zwischen der momentanen Dichte und der Leitfähigkeit wichtig ist, da ähnliche
Biegemuster bei Gelen und Puffern von unterschiedlicher ionischer
Zusammensetzung beobachtet wurden.
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So ist bei einigen Gelen dieses Verhältnis nahe
der Oberfläche
angeblich höher
und bei anderen Gelen ist es nahe des Bodens höher, was das Biegen in unterschiedliche
Richtung verursacht. Es scheint vernünftig zu sein, zu erwarten,
das aufgrund ihres höheren
Masse-Ladungsverhältnisses
sowohl N-Methyl-Glucamin
als auch Glukonsäure
geringere elektrophoretische Mobilität aufweisen als Tris oder Acetat.
Des weiteren erfahren sie, da sie grösser sind, während der
Wanderung durch das 6%ige Poly(NAT)Gel mehr Widerstand. Es kann
angenommen werden, dass die Leitfähigkeit in diesem Puffer während der
Elektrophorese proportional mehr abnimmt, als die momentane Dichte
in dem Gel, verglichen mit den Werten der Leitfähigkeit und der momentanen
Dichte bei demselben Puffer ausserhalb des Gels. Im Gegensatz dazu
nimmt die Leitfähigkeit
mit TAE-Puffer in dem Gel weniger ab als die momentane Dichte im
Verhältnis
zu solchen in dem freien Puffer. Falls diese Annahmen richtig sind,
sollte es möglich
sein, dass Biegen von Bändern
durch Einstellen des anfänglichen
Verhältnisses
von momentaner Dichte und Leitfähigkeit
in dem Gel und in dem Puffer auf solch einem Wert zu verhindern,
dass das i/K-Verhältnis in
dem Gel während
der Elektrophorese im wesentlichen konstant bleibt. Idealerweise
sollte das anfängliche
i/K-Verhältnis
des Gels und des Elektrophoresepuffers gleich sein und während des
elektrophoretischen Ablaufes konstant bleiben, in der Praxis der
eingetauchten Gelelektrophorese ist es jedoch schwer, diese Anforderung
zu erfüllen,
da sich die ionische Zusammensetzung des Gels und des Puffers ändert, wie
oben beschrieben. Die Anpassung des anfänglichen i/K-Verhältnisses
des Gels an das des 30 mM TAE-Puffers wurde empirisch versucht,
d. h. eine Serie von Gelen wurde mit derselben Menge TEMED und Ammonionpersulfat
polymerisiert, jedoch mit unterschiedlichen Verdünnungen des TAE-Puffers. Diese
Vorgehensweise erschien logisch, auch weil in dem Gel, welches nur
TEMED und Ammoniumpersulfat enthielt, die Bänder auf die andere Seite gebogen
wurden (8), was darauf
hindeutete, dass 30 mM TAE in dem Gel die Veränderung in der Biegerichtung
verursacht. Nach der Behandlung der Gele gab es eine klare Verbesserung
des Bandmusters bei geringeren Konzentrationen des TAE-Puffers. Das Muster konnte
durch Austausch des Ammoniumpersulfates durch Natriumpersulfat weiter
verbessert werden. 9 zeigt,
dass bei der optimalen TAE-Puffer-Konzentration (18 mM) ein sehr
geringes Biegen von DNA-Bändern auftritt.
Es wurde festgestellt, dass dies nicht bedeutet, dass 18 mM TAE-Puffer
in dem Gel das Verhältnis
von momentaner Dichte zu Leitfähigkeit
liefert, welches gleich dem von 30 mM TAE-Puffer ist, der das Gel
umgibt. Das Gel enthielt zusätzliche
Ionen (TEMED, Sulfat, mehr Natrium), welche zu der momentanen Dichte
und der Leitfähigkeit
beitrugen.
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Es war interessant zu sehen, ob die
richtige Pufferkonzentration in dem Gel durch Messen des Stromes
in der Elektrodenkammer bestimmt werden könnte, welche nur den Puffer
oder den Puffer plus das Gel enthielt. Das Messen des Stromes wurde
bei unterschiedlichen Spannungen ohne das Gel (Tabelle 1, Spalte 1)
durchgeführt.
Dann wurden drei Gele mit der optimalen Pufferkonzentration (18
mM) in der Kammer platziert und die Messung wurde wiederholt. Praktisch
dieselben Werte wurden erzielt (zweite Spalte). Drei Gele mit 30 mM
TAE ergaben höhere
Werte (Spalte 3). Danach ist es auf diese einfache Weise möglich, zu überprüfen, ob der
Widerstand des Gels mit dem des Puffers vergleichbar ist. Aus solchen
Messungen ist es jedoch nicht möglich,
zu sagen, ob das Gel die richtige ionische Zusammensetzung aufweist.
Des weiteren ist die Genauigkeit der Ablesungen von Spannung und
Strom der gewöhnlichen
Elektrophorese-Energieversorgungen nicht hoch. Zusätzlich dazu
kann das Gel irgendwo zwischen 10 bis 90%igen des Volumens zwischen
den Elektroden beanspruchen und die Genauigkeit der Messung wird
ebenfalls von dem Verhältnis
zwischen Gel und Puffervolumen abhängen. Schliesslich verändert sich
der Strom während
der Elektrophorese bei konstanter Spannung für gewöhnlich aufgrund von elektrochemischen
Reaktionen an den Elektroden und aufgrund der Wanderung einiger
Ionen, welche ursprünglich
nicht in dem Puffer vorhanden waren, aus dem Gel. Aus diesen Überlegungen
ist es offensichtlich, dass die optimale ionische Gelzusammensetzung
besser empirisch angepasst werden kann durch Behandeln des Gels
mit etwas unterschiedlichen Zusammensetzungen und durch Analysieren des
Bandmusters wie oben beschrieben.
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Aus der Gleichung (3) ist ersichtlich,
dass der Wanderungsabstand eines Bandes von dem Strom pro cm2 und der Leitfähigkeit pro cm abhängt. Deshalb
war es vernünftig,
zu überprüfen, ob
dickere oder längere Gele
eine andere ionische Zusammensetzung für ein optimales Bandmuster
erfordern. Wie aus 10 gesehen werden
kann, ist dies in der Tat der Fall. Bei dem 5 mm dicken, 6%igen
Poly(NAT)-Gel bei 18 mM TAE-Puffer werden DNA-Bänder gebogen (10b), obwohl diese Konzentration für 3 mm dicke
Gele optimal ist. Die Bänder
werden bei 30 mM TAE-Puffer weniger gebogen (10a)
-
Die ionische Zusammensetzung des
Gels muss auch nach Veränderung
der Gelkonzentration angepasst werden. Somit werden bei einem 9%igen
Poly(NAT)-Gel bei 18 mM Puffer die DNA-Bänder gebogen (11a), jedoch sind sie bei 50 mM fast
vertikal (11b). Es ist festgestellt
worden, dass bei Gelkonzentrationen von 9% und höher die Bänder dazu neigen, runder zu
werden und bei geringeren Volumina erscheinen sie als Punkte, wenn
sie von der Seite her betrachtet werden. Sie neigen ebenfalls dazu,
bei den höheren Pufferkonzentrationen,
welche optimal für
die Auflösung
sind, etwas näher
am Boden zu wandern.
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Da alle oben beschriebenen Versuche
mit Poly(NAT)-Gelen durchgeführt
wurden, war es wichtig, zu bestimmen, ob dasselbe Phänomen bei
anderen Gelen auftritt, welche für
die eingetauchte Elektrophorese verwendet werden. Wie in 12a gezeigt, werden die
DNA-Bänder
auch bei einem 5%igen Polyacrylamidgel gebogen, welches 20 mM TAE
enthält,
jedoch bei 35 mM Puffer weniger gebogen (12b). Ebenso werden die DNA-Bänder bei
4%igen, hydroxyethylierter Agarose (US-Patent Nr. 3,956,273) gebogen,
wenn die Pufferkonzentration in dem Gel gleich der das Gel umgebenden
ist (13a). Die Form
der Bänder
ist bei 45 mM Puffer besser, wie in 13b)
gezeigt. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass es bei einer Kombination
eines Elektrophoresegels und eines Elektrophoresepuffers möglich ist,
das Biegen der Bänder
zu eliminieren oder grösstenteils
zu vermindern.
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Bei einer Elektrolytlösung ist
der elektrische Strom äquivalent
zu dem Transport von Ionen. Ionen, welche dieselbe Mobilität aufweisen,
transportieren Strom mit derselben Wirksamkeit. Die Puffer, welche
oben verwendet werden, sind aus Ionen mit unterschiedlichen Mobilitäten und
Konzentrationen zusammengesetzt. Es bestand ein Interesse, den Teil
des Stromes zu bestimmen, welcher durch Anionen transportiert wird,
und den Teil, welcher durch Kationen transportiert wird. Des weiteren
war es wichtig, das Bandmuster in einem Puffer zu sehen, in welchem
Anionen und Kationen dieselbe Menge an Strom transportieren.
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Zunächst wurde der Strom bei 10
bis 120 V in Lösungen
gemessen, welche Ionen enthalten, die in dem Gel und dem TAE-Puffer
vorhanden waren. Die Lösungen
und die Werte bei 80 V sind in Tabelle 2 gegeben. Der Anstieg des
Stromes war leicht höher
als linear bei 100 und 120V für
NaCl, Na2SO4 und
KCl. Die in den Lösungen
gemessenen Ströme
waren proportional zu den äquivalenten
Leitfähigkeiten,
welche in dem CRC-Handbuch der Chemie und der Physik (65. Edition,
D-171-172) gefunden wurden. Der durch jedes Ion transportierte Strom
wurde aus den äquivalenten
ionischen Leitfähigkeiten
errechnet, welche zu unendlicher Verdünnung extrapoliert wurde, vorausgesetzt,
dass das Verhältnis
der ionischen Leitfähigkeiten
von Anionen und Kationen nicht verändert wurde in Lösungen bei
den Konzentrationen, welche bei den Messungen verwendet wurden.
So wurde errechnet, dass unter Versuchbedingungen, welche in Beispiel
14 spezifiziert sind, 5 mM Na+ 35 mA transportieren,
5 mM K+ 51 mA , 5 mM Cl– 53
mA, 5 mM SO4
–2100
mA, 2 mM EDTA (pH 8) 37 mA, 5 mM Acetat 29 mA, 15 mM Tris+ 44 mA und 15 mM TEMED (pH 8) 52 mA. Aus
diesen Werten wurde errechnet, dass der 30 mM TAE-Puffer 155 mA
bei 80 V transportieren sollte. Der Wert von 158 mA wurde gemessen.
Des weiteren wurde gemessen, dass 18 mM TAE-Puffer 15 mM TEMED enthalten
und 1.65 mM Natriumpersulfat 199 mA bei 80V zeigen. Dieser Wert
ist 1,26 mal höher
als der Wert des TAE Behandlungs-Puffers. Es deutet deshalb darauf
hin, dass der Puffer bei einem 6%igen Poly(NAT)Gel 1,26 mal höhere Leitfähigkeit
aufweisen sollte, als der Behandlungs-Puffer, um das optimale Bandmuster
zu erreichen. Es sollte beobachtet werden, dass der pH-Wert des
Gelpuffers aufgrund von TEMED höher
(8.8) ist und sich die Mobilitäten einiger
Ionen, insbesondere Tris und TEMED, daher von solchen in dem Elektrophoresepuffer
unterscheiden, welcher einen niedrigeren pH-Wert aufweisen.
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Bei dem 30 mM TAE-Puffer wurden 55
mA durch Kationen transportiert und 103 mA durch Anionen. Dieses
Ungleichgewicht kann durch Hinzufügen eines Salzes zu dem TAE-Puffer
korrigiert werden, in welchem das Kation eine beträchtlich
höhere, äquivalente
Leitfähigkeit
aufweist, als das Anion. Es gibt viele solcher Salze, jedoch wurde
Potassiumacetat ausgewählt,
da das Acetat bereits in dem Puffer vorhanden war. Der gewünschte Strom
des neuen Puffers in diesem Beispiel wurde auf 158 mA gesetzt und
von diesem Strom sollten 79 mA durch Anionen und 79 durch Kationen
transportiert werden. Die genauen Konzentrationen wurden aus der
unten angegebenen Gleichung errechnet. 158 = 55x + 103x + 29y + 51y (5) 79 = 55x + 51y (6), wobei 55
und 103 den Strom bezeichnen, welcher durch Kationen bzw. Anionen
in dem 30 mM TAE-Puffer transportiert wurden, wohingegen 29 den
Strom bezeichnet, welcher durch Acetat transportiert wurde und 51, welcher
durch Potassium in 5 mM KOAc, alle in mA, transportiert wurde.
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Die Gleichung (5) und (6) können in
einer generellen Form geschrieben werden: It = xIbc +
xIba + yIsc + yIsa (7) 1/2It=
xIbc + yIsc (8), wobei It der gewünschte
Gesamtstrom ist, Ibc der Strom ist, welcher
durch Pufferkationen transportiert wird, Isc der
Strom ist, welcher durch Salzkationen transportiert wird, Isa der Strom ist, welcher durch Salzanionen
transportiert wird und x und y Verdünnungsfaktoren des ursprünglichen
Puffers bzw. der Salzlösungen
sind. Es wurde beobachtet, dass die Konzentrationen des ursprünglichen
Puffers und der Salzlösungen
nahe der schlussendlichen Konzentrationen sein sollten, d. h., x
und y sollten nicht viel grösser
oder kleiner als 1 sein, da es bekannt ist, dass die Leitfähigkeit
mit der Verdünnung
ansteigt. Wenn es gewünscht
wird, die Pufferkonzentration konstant zu halten, dann ist x = 1
und It und y können aus den Gleichungen (7)
und (8) errechnet werden. Analog dazu kann y konstant gehalten werden
und die anderen beiden Parameter variieren.
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Aus den Gleichungen (5) und (6) folgt,
dass bei einer Lösung,
welche 14.3 mM TAE und 5.2 mM KOAc enthält, der Strom durch Anionen
und Kationen gleichmässig
transportiert wird, und dass sein Wert 158 mA sein sollte. Der Wert
von 156 mA wurde gemessen. Bei allen Lösungen, welche das Verhältnis (in
mM) von TAE zu KOAc von 2.75 : 1 aufweisen, wird der durch Anionen
und Kationen transportierte Strom gleich sein. Es ist klar, dass
die gewünschten
Konzentrationen für
andere Bereiche oder für
unterschiedliche Lösungen analog
errechnet werden kann.
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In ähnlicher Weise wurde errechnet,
dass bei einem pH-Wert von 8, der Gelpuffer 15 mM TEMED, 1.65 mM
Natriumpersulfat, 22.5 mM Acetat und 11,6 mM Potassium enthalten
sollte, um denselben Strom durch Anionen oder Kationen zu transportieren.
Der Strom sollte dann 388 mA sein und der Wert von 370 mA wurde gemessen.
Ein 6%iges und ein 9%iges Poly(NAT)-Gel wurde in dem obigen Puffer
hergestellt. Das 6%ige Poly(NAT)Gel wurde in dem TAE-KOAc-Puffer
behandelt und ergab 1.26 mal geringeren Strom (294 mA wurden erwartet
und 268 wurden in dem Puffer gemessen, welcher 26.6 mM TAE und 9.7
mM KOAc enthielt). Das DNA-Bandmuster ist in 14 gezeigt. Wie bei Beispiel 11 beobachtet,
ergab ein 9%iges Poly(NAT)-Gel, welches in 5 mM TAE-Puffer polymerisiert
wurde, ein gutes Bandmuster (11).
Der Strom bei 80 V von 50mm TAE, 15 mM TEMED und 1.65 mM Natriumcetat
lag bei 346 mA, d. h. 2.19 mal höher
als in dem TAE-Puffer (158 mA). Das in dem oben beschriebenen Puffer
polymerisierte 9%ige Poly(NAT)-Gel wurde in dem TAE-KOAc-Puffer
elektrophoresiert und ergab 2.19 mal geringeren Strom als der Gelpuffer.
So enthielt der laufende Puffer 15.3 mM TAE und 5.6 mM KOAc und
das DNA-Muster ist in 15 gezeigt.
Es wurde beobachtet, dass sowohl bei dem 6%igen als auch bei dem
9%igen Gel die DNA-Bänder
gebogen wurden und als symmetrisch gebogene Linien erscheinen (14 und 15). Dieses Ergebnis demonstriert, dass
ein gleichmässiger
Transport von Strom durch Anionen und Kationen in dem verwendeten
Puffer nicht ausreichend ist, um das Biegen der Bänder zu
verhindern, auch wenn das Verhältnis
des Stromes in dem Gel und dem verwendeten Puffer an denselben Wert
angepasst ist, welcher für
eine andere Pufferzusammensetzung als optimal befunden wurde. Entsprechend
den bereits gezeigten Ergebnissen hängt das Bandmuster also klar
von der ionischen Zusammensetzung des Gels und des Puffers ab. Es
wurde beobachtet, dass die beiden oben genannten Gele EDTA und Tris
nicht enthielten, welche in dem verwendeten Puffer vorhanden waren.
Ferner schliesst dies nicht die Möglichkeit aus, dass dieses
Verhältnis
sich nach der Formation des Gels eigentlich unterschied, obwohl
das Stromverhältnis
des Gels und des Elektrophoresepuffers im wesentlichen gleich zu
dem gemessenen war und als optimal mit dem TAE-Puffer befunden wurde.
Das Sieben von Ionen durch das Gel hängt nämlich von den Eigenschaften
eines jeden Ions ab. Deshalb können
zwei Lösungen
mit unterschiedlichen ionischen Zusammensetzungen, welche denselben
Strom im Wasser aufweisen, unterschiedliche Ströme in Gelen mit identischen
Polymerzusammensetzungen ergeben.
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Bei vielen oben beschriebenen Versuchen
wurde TAE als Hauptpuffer verwendet. Dieser Puffer wurde anfänglich ausgewählt, da
er einer der zwei verwendeten Puffern für eingetauchte Gel-DNA-Elektrophorese
ist (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Eds. Maniatis, T. Fritsch,
E. F., and Sambrook, J. Cold Spring Harbor, 1982). Andere ionische
Zusammensetzungen können
offensichtlich verwendet werden, wie durch zahlreiche Beispiele
dieser Erfindung gezeigt. Um jedoch eine optimale Auflösung zu
erzielen, müssen
die ionische Konzentration und die Zusammensetzung des Gels und
des Puffers gemäss
der Lehre dieser Erfindung angepasst werden. Die Anpassung ist am
günstigsten,
wenn eine Serie von Gelen mit einer etwas unterschiedlichen ionischen
Konzentration oder Zusammensetzung hergestellt wird und dann das
Bandmuster nach der Elektrophorese in einem Puffer mit konstanter
Zusammensetzung und Konzentration untersucht wird. Alternativ dazu können viele
Gele mit derselben ionischen Zusammensetzung und Konzentration vorbereitet
werden und dann jedes Gel in einem Puffer mit etwas unterschiedlicher
Zusammensetzung oder Konzentration laufen gelassen werden. Da bei
einem Elektrophoresedurchlauf nur eine Kombination untersucht werden
kann, ist dieser Versuch zeitaufwendig und daher weniger zu bevorzugen.
Es gibt einen weiteren langen Weg zur Anpassung der ionischen Zusammensetzungen
in dem Gel und dem Elektrophoresepuffer. Er erfordert die Herstellung
einer Serie von Gelen mit derselben Polymerzusammensetzung, welche
jedoch ein Kation und Anion oder ein Anion und zwei Kationen pro
Gel enthält.
Zum Beispiel kann ein Gel 5 mM KOAc enthalten, dass andere 5 mM
NaOAc und das dritte 5 mM KOAc plus 5 mM NaOAc. Von der gemessenen
Leitfähigkeit
eines jeden Gels her ist es möglich,
die äquivalente
Leitfähigkeit
von Na+, K+ und
Ac+ in dem Gel für diese spezielle Polymerzusammensetzung
und -grösse
zu errechnen. Nach der Bestimmung der äquivalenten Leitfähigkeit
eines Ions, welches in dem Gel und dem Elektrophoresepufter vorhanden
ist, ist es theoretisch möglich,
die ionischen Zusammensetzungen und Konzentrationen zu errechnen,
welche erforderlich sind, um das i/K-Verhältnis in dem Gelquerschnitt,
durch welchen ein Band wandert, konstant zu halten.
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Es wurde beobachtet, das DNA-Moleküle verwendet
wurden, um unterschiedliche Aspekte der vorliegenden Erfindung zu
demonstrieren, die hier offenbarten Verbesserungen jedoch werden
auch bei der Trennung anderer Moleküle offensichtlich nützlich sein,
welche als Bänder
in einem Gel wandern.
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Die Verwendung einer Kombination
eines Elektrophoresegels und eines Elektrophoresepuffers, wobei die
ionischen Zusammensetzungen des Gels und des Puffers wie hierin
beschrieben angepasst sind, werden scharfe Bänder ergeben.
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Die Erfindung wird nun durch die
folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, welche nicht als Begrenzungen
gedacht sind, es sei denn anderweitig speziell hierin erwähnt.
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Gelvorbereitung, Elektrophoresebedingungen
und Proben
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Ein 6%iges Poly(NAT)-Gel, welches
5.88 g NAT und 0.12 g Bis in 100 ml Wasser oder einem Puffer enthält, wurde
durch den Zusatz von TEMED (225 μl)
und Ammoniumpersulfat (1.82 ml einer 22 mg/ml Lösung) in 100 ml der Lösung polymerisiert.
Die Grössen
des Gels betrugen 92 × 62 × 3 mm.
Die Gele, welche bei den hierin beschriebenen Versuchen verwendet
wurden, wurden zum Polymerisieren zumindest 16 Stunden liegen gelassen
und einige wurden in luftdicht verschlossenen Taschen bei Raumtemperatur
für nicht
länger
als zwei Wochen gelagert. Bei den gelagerten Gelen wurde kein Unterschied
im Bandmuster beobachtet. Die Gele wurden bei der verbesserten Vorrichtung
für eingetauchte
Elektrophorese mit einem oder zwei Platindrähten für die Anode und Katode laufen
gelassen (Kozulic und Heimgartner, US-Patent Nr. 5,259,943). Die beiden
Drähte
waren bei den meisten Versuchen vertikal 6 mm voneinander entfernt.
Die Gele wurden bei 7 V/cm laufen gelassen, d. h. 77 V über 11 cm
Entfernung. Die anfängliche
Stromstärke
betrug 140 bis 150 mA. Die Gele wurden nicht vorelektrophoresiert,
da beobachtet wurde, dass das Biegen der Bänder auch von der genauen Dauer
der Vorelektrophorese abhängig
war. Verwendet wurde eine Energieversorgung mit der Pharmacia-Konstantspannung
von 200 V/400 mA. Während
der Elektrophorese war die Puffertemperatur anfänglich gleich der Raumtemperatur
(17–21°C) und wurde
dann durch einen externen Heizer/Kühler konstant bei 25°C gehalten.
Die Elektrophorese wurde gestoppt, als die Spurfarbe (Bromphenol-Blau)
den Boden des 92 mm langen Gels erreichte, was nach ungefähr 2 Stunden
und 20 Minuten geschah. Die Probe (10 μl) beinhaltete DNA-Moleküle aus der
1 kb-Kette (BRL) mit den folgenden Grössen: 12216, 11198, 10180,
9162, 8144, 7126, 6108, 5090, 4072, 3054, 2036, 1636, 1018, 516,
506, 396, 344, 298, 220, 201, 154, 134, und 75 Basenpaare. Unter
den spezifizierten elektrophoretischen Bedingungen wanderten die
Fragmente, welche grösser als
4072 bp waren, als ein breites Band und 75 bp-Fragmente wanderten
aus dem Gel. Die Gele wurden mit Äthidiumbromid (ungefähr 0.2 μl/ml in Wasser) über Nacht
eingefärbt
und dann in Wasser für
zumindest zwei Stunden entfärbt.
Ein Streifen des Gels, 2 – 3
breit, wurde aus der Mitte der Probenbahn, welche 5.5 mm breit war,
herausgeschnitten. Das Schneiden erfolgte mittels eines 0.17 mm
dicken Nylonfadens (Angelschnur) nach dem Platzieren des Gels auf
einer zylindnschen Glasflasche. Der Streifen wurde dann von dem
Kunststoffträger
abgenommen (Gel-Bond, FMC) und auf seiner Seite auf einem UV-Durchleuchtungskasten
platziert, um die DNA-Bänder
sichtbar zu machen.
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Beispiel 1
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sEin 6%iges Poly(NAT)-Gel wurde in
30 mM TAE-Puffer polymerisiert und in demselben Puffer, wie oben
spezifiziert, laufen gelassen. 2 stellt
eine Seitenansicht von DNA-Bändern
in dem Gel dar.
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Beispiel 2
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Ein 6%iges Poly(NAT)-Gel der in Beispiel
1 spezifizierten Zusammensetzung wurde zwischen zwei Gel-Bond-Schichten
polymerisiert. Die Schicht auf der Oberseite war kürzer und
erstreckte sich von direkt nach den Probentaschen zu dem Gelende.
Die Probe und die elektrophoretischen Bedingungen waren wie in Beispiel
1 beschrieben. An dem Ende des Durchlaufs wurde der Kunststoffträger mit
dem Nylonfaden von der Oberseite entfernt und das Gel wurde anschliessend
eingefärbt.
Das DNA-Muster in diesem Gel ist in 3 gezeigt.
Es wurde beobachtet, dass die Bänder,
obwohl sie im wesentlichen vertikal verlaufen, gerundet waren und
etwas diffuser als bei dem Gel in 2.
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Beispiel 3
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Ein 6%iges Poly(NAT)-Gel wurde in
derselben Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, ausgenommen,
dass der Puffer sich aus 30 mM Tris, 11 mM Acetat und 1.5 mM EDTA-freier
Säure zusammensetzte.
So gab es kein Natrium in dem Gel und in dem Behandlungs-Puffer. 4 zeigt das Biegen der DNA-Bänder in
diesem Gel.
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Beispiel 4
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Ein 6%iges Poly(NAT)-Gel wurde, wie
in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt, ausgenommen, dass das Monomer
und Querverbinder in einem Puffer aufgelöst wurden, welcher aus 30 mM
N-Methyl-Glucamin und ungefähr
15 mM Glukonsäure
zusammengesetzt war (der Puffer enthielt in vier Litern 23 ml der
50%igen Glukonsäure-Wasserlösung, technische
Güte, Fluka)
pH-Wert 9.5. Die Glukonsäurelösung wies
eine bräunliche Farbe
auf. Das Gel wurde in dem Tris-Acetat-EDTA-freien
Säurepuffer
von Beispiel 3 laufen gelassen. 5a zeigt
die DNA, welche sich in der Vorrichtung, die mit einer Elektrode
ausgestattet war, biegt und 5b in
der Vorrichtung mit zwei Elektroden. Bei diesen Gelen wanderten
die DNA-Bänder
noch näher
am Boden.
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Beispiel 5
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Ein 6%iges Poly(NAT)-Gel wurde auf
dieselbe Weise, wie oben beschrieben, hergestellt, ausgenommen,
dass das Monomer und Querverbinder in Wasser aufgelöst wurden.
Nach der Polymerisation wurde das Gel für 16 Stunden in 1 l des 30
mM TAE-Puffers mit sanftem Schütteln
eingeweicht. Die nach der Polymerisation übriggebliebenen Ionen diffundierten
aus dem Gel und ihre Konzentration in dem Gel wurde erwartungsgemäss ungefähr 50 mal
verringert. Das Gel, welches mit dem TAE-Puffer ausgeglichen wurde,
wurde in demselben Puffer unter den oben skizzierten Bedingungen
laufen gelassen und das DNA-Muster dieses Gels ist in 6 gezeigt. Das Biegen ist ähnlich dem
in 2.
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Beispiel 6
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Ein 6%iges Poly(NAT)-Gel wurde in
Wasser polymerisiert und gegen 30 mM N-Methyl-Glucamin, 15 mM Glukonsäurepuffer,
wie in Beispiel 5 beschrieben, ausgeglichen. Das Gel wurde in demselben
N-Methyl-Glucamin-Glukonsäurepuffer
verwendet. 7 zeigt,
dass das Biegemuster dem in 5 ähnelt.
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Beispiel 7
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Ein 6%iges Poly(NAT)-Gel wurde in
Wasser polymerisiert und ohne jede weitere Behandlung wurde das
Gel in einem Elektrophoresepuffer verwendet, welcher aus TEMED und
Ammoniumpersulfat mit identischen Konzentrationen, wie denen in
dem Gel (15 mM TEMED und 1.65 mM Ammoniumpersulfat) zusammengesetzt
war. Der Elektrophoresepuffer wurde einen Tag im voraus vorbereitet,
um eine Zersetzung des Persulfates zu ermöglichen. 8 zeigt das DNA-Muster in diesem Gel.
Es wurde keine Beschädigung
der DNA, möglicherweise
durch Radikale, welche sich aus dem Persulfat abgespaltet haben,
beobachtet als ein Verschmieren der Bänder.
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Beispiel 8
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Eine Reihe von 6%igen Poly(NAT)-Gelen
wurde mit denselben Mengen von TEMED und Natriumpersulfat (15 mM
TEMED und 1.65 mM Natriumpersulfat) polymerisiert, jedoch mit unterschiedlichen
Konzentrationen (12, 15, 18, 21, 24, 27 und 30 mM) des TAE-Puffers.
Die beste Auflösung,
welche auf der von oben aufgenommenen Photografie zu sehen war,
war die bei 18 mM TAE, und, wie in 9 gezeigt,
verliefen die DNA-Bänder
in diesem Gel im wesentlichen vertikal.
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Beispiel 9
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Der elektrische Strom bei mehreren
Spannungen wurde in 300 ml des TAE-Puffers bei 18°C gemessen. Bei dieser Vorrichtung
wurde die obere Kammer permanent von der unteren Kammer getrennt,
um Fehler aufgrund der Unterschiede in dem Puffervolumen zu verringern.
Die Elektroden waren vertikal 6 mm und 11 cm voneinander entfernt.
Das Niveau des Puffers lag 3–4
mm über
der oberen Elektrode. Die Werte für den Puffer sind in der ersten
Spalte von Tabelle 1 gegeben. Die zweite Spalte enthält die Werte,
welche auf der Energieversorgung zu lesen waren, wenn drei Gele,
welche in 18 mM TAE-Puffer
polymerisiert wurden, in 349 ml des Puffers gelegt wurden. Das Volumen
des Puffers wurde verringert, um das Volumen von drei Gelen (51 ml)
auszugleichen. Wenn drei Gele, welche in 30 mM TAE-Puffer polymerisiert
wurden, in 349 ml des Puffers eingelegt wurden, wurden die Werte
in Spalte 3 gemessen.
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Beispiel 10
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Ein 5 mm dickes, 6%iges Poly(NAT)-Gel
wurde in 18 und das andere in 30 mM TAE-Puffer polymerisiert. Wie
in den 10a und 10b gezeigt, wurden die Bänder, welche
1 bis 4 kbp-Fragmente darstellen, in dem Gel, welches 16 mM enthält, mehr
gebogen, als in dem Gel, welches 30 mM TAE enthält. Das Probenvolumen in diesen
Gelen betrug 25 μl.
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Beispiel 11
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Eine Reihe von 9%igen Poly(NAT)-Gelen
mit 3 mm Dicke wurden in dem TAE-Puffer
mit unterschiedlichen Konzentrationen (18, 25, 30, 40, 50 und 60
mM) polymerisiert. Alle Gele wurden in 30 mM TAE-Puffer bei 7 V/cm
für 4.5
Stunden laufen gelassen. Aus den 11a und 11b kann ersehen werden, dass
bei 18 mM TAE die DNA-Bänder
gebogen werden, bei 50 mM jedoch sind sie im wesentlichen vertikal.
Die Bänder
sind auch runder und sie wandern etwas näher am Boden.
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Beispiel 12
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Eine Reihe von Polyacrylamidgelen,
welche 4.85 g Acrylamid und 0.150 g Bis in 100 ml enthalten, wurden
mit denselben Mengen TEMED und Natriumpersulfat, wie in Beispiel
8 beschrieben, polymerisiert, jedoch bei unterschiedlichen Konzentrationen
(15, 20, 25, 30, 35 und 40 mM) des TAE. Alle Gele wurden in 30 mM TEA
bei 7 V/cm für
zwei Stunden und 10 Minuten laufen gelassen. Das Biegen war bei
allen Konzentrationen vorhanden, jedoch auffallender bei 20 (12a) als bei 35 mM TAE (12b).
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Beispiel 13
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Vier 4%ige Hydroxyethyl-Agarose-Gele
(NuSieve, FMC) wurden in 30 mM TAE-Puffer gegossen. Dann wurde jedes Gel
getrennt in 1 l von 30, 35, 40 oder 45 mM TAE-Puffer für 16 Stunden
inkubiert. Die Gele wurden in 30 mM TAE bei 7 V/cm für eine Stunde
und 55 Minuten laufen gelassen. Das Probenvolumen betrug 25 μl. In dem
Gel, welches 30 mM TAE enthielt, wanderten die DNA-Bänder etwas näher am Boden
(13a), jedoch waren
sie in dem Gel, welches 45 mM TAE (13b)
enthielt, im wesentlichen vertikal. Bei diesem Gel waren die Bänder folglich
runder.
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Beispiel 14
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Der elektrische Strom bei 80 V und
18°C ist
für unterschiedliche
Lösungen
gegeben, welche Ionen enthalten, die in den Gelen oder Puffern während der
Elektrophorese (Tabelle 2) vorhanden sind. Die Messung wurde in
300 ml einer jeden Lösung,
wie in Beispiel 9 beschrieben, durchgeführt. Die Lösungen, welche Natriumpersulfat
enthielten, wurden 24 Stunden vor der Messung vorbereitet.
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Beispiel 15
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Ein 6%iges Poly(NAT)-Gel wurde in
einer Lösung,
welche 15 mM TEMED, 1.65 mM Natriumpersulfat, 22.5 mM Acetat und
11.6 mM Potassium (pN-Wert 8.0) enthielt, polymerisiert. Bei dieser
Lösung
sollte der Strom, welcher durch Anionen und Kationen transportiert
wird, identisch sein. Der Strom betrug 370 mM bei 80 V. Das Gel
wurde in dem 26.6 mM TAE- bis 9.7 mM KOAc-Puffer laufen gelassen. Der Strom bei
80 V betrug 268 mA. Das DNA-Muster ist in 14 gezeigt. Der pH-Wert dieses Puffers
war vor und nach der Elektrophorese im wesentlichen gleich.
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Beispiel 16
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Ein 9%iges Poly(NAT)-Gel wurde in
demselben Puffer wie das 6%ige Gel von Beispiel 15 polymerisiert,
jedoch war der verwendete Puffer 15.3 mM TAE bis 5.6 mM KOAc. Das
Gel wurde bei 80 V für
3 Stunden laufen gelassen und die DNA-Bänder sind in 15 gezeigt.
