JPS5910492B2 - 電気泳動用ｐＨ−フアンクシヨンの発生方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は電気泳動分離に用いるｐＨ−ファンクション（
ｐＨ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を発生させる方法に関する。

種々の分離方法および分析方法、特に電気泳動において
、対流の起らないように安定化された分離路に沿つて温
度およびｐＨ値が十分に制御される必要がある。従来、
電気泳動法に用いられるｐＨ−ファンクションは少なく
とも１０−２Ｍの濃度（普通はこれより相当高い濃度）
を有する種々の低分子の緩衝液によつて得ていた。

このような濃度では電気伝導度が相当高くなり、これに
応じた電流が流れる。従つて、もし温度を一定に維持し
ようとすれば、比較的弱い電界強度を使用する必要があ
る。しかし分離に要する時間は電界強度に反比例するの
で、これは非常に不利なことである。緩衝液槽内の電極
反応によつて、操作中に分離路に沿つてｐＨ値が変動し
ないようにするためには、比較的多量のアノード溶液お
よびカソード溶液が使用される。

これらの槽は分離路において使用される緩衝物質と同じ
緩衝物質を含んでいる。等電点分画（ｅｌｅｃｔｒｏｆ
ｏｃｕｓｉｒ！ｇ）はたん白質および他の両性電解質の
電気泳動分離方法であつてこの方法は両性物質に電界を
作用させると、それがｐＨ勾配中を実効易動度（ｎｅｔ
ｍｏｂｉｌｉｔｙ）が零となる点、即ちいわゆる等電点
（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｐｏｉｎｔ）に向つて電気泳
動的に移動するという事実に基づくものである。この分
離法に必要なｐＨ勾配を作るためのいくつかの方法が知
られているが、最も重要な方法は所望のｐＨ範囲にわた
つて分布された異なるｐｌ値（即ち、等電点におけるｐ
Ｈ値）を有する多数の成分を含む両性電解質、いわゆる
キャリヤ両性電解質（ｃａｒｒｉｅｒａ用法ｏｌｙｔｅ
ｓ）の混合物を使用する。加えられた電界によるイオン
移動によつて、これらのキャリヤ両性電解質はｐＨ−フ
ァンクションを発生し、それによつて分離が行われる。
すべての電気泳動法においてそうであるように等電点分
画においても分離時間を短縮することは・ 一般的関心
事である。

ｐＨ勾配をキャリヤ両性電解質によつて形成する等電点
分画においては、ｐＨ勾配を作り出さなければならず、
試料成分はそれぞれの等電点に向つて移動させられねば
ならない。印加電圧、従つて電界強度を増加させると、
ＰＨ勾配の形成および試料成分のそれぞれの等電点への
移動はより早くなる。しかし高電圧を印加することは、
系中に発生する熱を冷却する必要性によつて制限される
。ＰＨ勾配の形成時およびその後の段階において流れる
電流の大部分はキヤリヤ両性電解質によつて運ばれ、電
流の一部のみが試料に関係する。

従つてその形成および維持のために電流を流す必要がな
いようなＰＨ勾配は等電点分画に必要な時間を相当短縮
することができる。また、等電点分画において得られる
ゾーンの境界面の明確さは電界強度に応じて増加する。
従つて印加電圧が高くなれば得られる分解能が高くなる
。キヤリヤ両性電解質によるＰＨ勾配には他の欠点があ
る。

分析および分離に一般的に使用する合成キヤリャ両性電
解質を作る現存の方法では、両性電解質混合物は得られ
たＰＨ勾配における導電度と濃度に相当の違いがある。
ＰＨ勾配の状態も時間とともに変化し、ＰＨ勾配のひず
みによつて試料ゾーンの変動が生じる。

限定されたＰＨ範囲をカバーするＰＨ勾配を形成するに
は、この範囲内にある個々の両性電解質の数はこの種の
両性電解質混合物において少なくなる傾向がある。キヤ
リヤ両性電解質に基づくＰＨ勾配において激しい擾乱を
防ぐためには、試料はあまり大量の塩を含んではならな
い。

調製用等電点分画は試料成分をキヤリヤ両性電解質から
分離する工程を伴わなければならない。本発明の目的は
電気泳動あるいは等電点分画に用いられるＰＨ−フアン
クシヨンを発生する方法であつて、上述の欠点を除いた
方法を提供するにある。

本発明によればＰＨ−フアンクシヨンは非移動性の帯電
されたまたは帯電可能な基ないしグループ（ＮＯｎ−Ｍ
Ｏｂｉｌｅ−］員０ｒｃｈｒｇｅａｂ１ｅｇｒ０ｕ戸）
によつて形成される。

ここに帯電可能なグループは、使用される分離用媒体（
ＳｅｐｒａｔｉＯｎｍＯｄｉｕｍ）に対するプロトリン
ス平衡ないし陽子移動平衡（ＰｒＯｔＯｌｙｓｉｓｅｑ
ｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）によつて正または負の正味電荷を
与えることができるグループからなる。］ 負に帯電可能なグループの例としてはカルボン酸基、ス
ルホン酸基、ホウ酸基、リン酸基および多価酸の酸性エ
ステル等がある。

正に帯電可能なグループとしては種々のアミノ基あるい
は他の帯電可能な窒素化合物がある。非移動化はこれら
の基ないしグループをマトリツクス（Ｍａｔｒｉｘ）に
固定することによつて達成される。

このマトリツクスは対流安定化媒体を構成することもで
きる。このマトリツクスは分離用媒体と結合してゲルを
作るような物質によつて形成することが！ましい。ここ
に非移動性とは外部電界を加えても帯電したまたは帯電
可能なグループの実質上の移動が何ら生じないことを意
味する。

マトリツクス構造の柔軟性のためにこれらのグループが
持つことのある移動性も上述の原理にそれほど影響を与
えない。電界方向に沿つて濃度の変化する数種の帯電し
た及び（または）帯電可能なグループを用いることによ
つて、これらのグループそれ自身によりまたは両性電解
質と組合わせることによつて、時間に対して安定でかつ
分離路に沿つて任意に変化するＰＨ−フアンクシヨンを
生ぜしめることができる。これによつて電界の方向にお
けるＰＨの変動並びに導電度および緩衝能力の変動に関
連する分離上の問題を解決できる。分離用媒体としては
水、または水と水に溶解または混合可能な物質を好適に
選ぶことができる。

マトリツクスとしては対流安定化システムを、それが本
発明のＰＨ−フアンクシヨンと組合わせることができる
限り、使用できる。対流安定化システムとしては、例え
ば粒状、繊維状のもの、または他の方法によつて毛管現
象に対して安定化された（Ｃａｐｉｌｌａｒｙｓｔａｂ
ｉｌｌｚｅｄ）もの、あるいはゲルを使用することがで
きる。適当な物質の例としてはポリアクリルアミド、セ
ルロース、アガロース、デキストラン（Ｄｅｘｔｒａｎ
）、ポリピニルアルコール、デンプン、シリカゲルもし
くはスチレンジビニルベンゼン、またはこれらの混合物
がある。マトリツクスは、アノードからカソードまで連
続していてもよいし、あるいは例えげ多室電解槽の隔膜
によつて不連続としてもよい。後者は特に等電点分画に
おいて関心がもたれている。しかし分離されるべき両性
電解質および（または）付加された両性電解質は、非移
動性の帯電したグル一プおよび（または）非移動囲の帯
電可能なグループを含むマトリツクスが充填されていな
い電極間のゾーンにおいて十分な導電性を与えることが
必要である。非移動性の帯電可能なまたは帯電したグル
ープ ．″は１リツトル当り１０−２Ｍ〜１０−４Ｍの
量で、本発明のＰＨ−フアンクシヨンを発生する方法を
実施するのに十分である。

しかし、分離におけるゾーン間の境界面を明確にするに
は、一定の緩衝能力が必要である。ＰＨ−フアンクシヨ
ンをキヤリヤ両性電解質なしで電気泳動法または等電点
分画に使用するときは、非移動性帯電グループまたは非
移動性帯電可能グループの濃度は１リツトル当り１０−
２Ｍ以下でないことが適当である。対流安定化マトリツ
クスの各区画ないしセクシヨンは非移動性グループの存
在によつて一定のＰＨ値を与えられる。最適の緩衝能力
を得るためにはマトリツクスの一定のセクシヨン内の非
移動性グループは、そのマトリツクスセクシヨンのＰＨ
値に近いＰＫｓ値を持つことが望ましい。帯電したグル
ーブまたは帯電可能なグループの濃度の上限は、例えば
マトリツクスに化学的に結合しうるグループの量、ある
いはマトリツクスが当該分離における対流安定化媒体と
しての特性を維持しつつ含むことのできるグループの量
のような実際的な条件によつて規定される。マトリツク
スに前述の帯電したグループまたは帯電可能なグループ
を組み込むいくつかの方法がある。

使用可能なポリアクリルアミドの誘導体は共重合によつ
て適当に作ることができる。ほとんどすべての共役極性
ビニルモノマー（ＣＯｎｊｕｇ＆ＴｅｄｐＯｌａｒｖｉ
ｎｙｌｍＯｎＯｍｅｒｓ）はアクリルアミドと共重合す
る。この方法によつて、マトリツクス中に非移動化させ
ることができる帯電グループあるいは帯電可能グループ
の選択範囲は大きくなる。アクリルアミドを含むゲルと
反応縮合させることができる官能性モノマーの例として
は、ビニルスルホネート（ＶｉｎｙｌｓｕｌｆＯｎａｔ
ｅ）、アクリル酸、ビニルリン酸、マレイン酸、フマル
酸、イタコン酸、アコニツト酸、ビニルピリジン、ビニ
ルイミダゾール、アリルアミン、ジアリルアミンなどが
ある。またこれらの化合物の官能性誘導体、例えば適当
な官能基を含む上述の酸のエステル例えばアミノアルキ
ルアクリレートもアクリルアミドとフ共重合させること
ができる。

上に規定したモノマーのあるものは、ビスアクリルアミ
ド（Ｂｉｓａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）または他の交叉結合
剤を用いることによつて、ポリマー中に成分としてアク
リルアミドを含まないゲルを作ることができる。

ポリアクリルアミド中にＰＨ−フアンクシヨンを発生さ
せるためには、重合を水溶液中で従来の方法によつて行
うのが適当である。

このプロセスを開始するには過酸化物、アゾ化合物、レ
ドツクス対（ＲｅｄＯｘｐａｉｒ）、光化学システムお
よび（または）イオン化放射（１０ｎｉＺｉＩ）Ｇｒａ
ｄｉａｔｉＯｎ）を用いることができる。共重合体がゲ
ルを形成するために、ある種の交叉結合剤をモノマー混
合物に含ませることができる。各モノマーの濃度の調節
は、従来の方法例えば垂直に配置された重合室に充填す
ることにより、および分離において使用される勾配を、
充填時において対流安定化に必要であり、重合の発生熱
による混合に対抗する直接的密度勾配に一致させること
によつて、行うことができる。

対流安定化マトリツクスが最初から存在する場合、例え
ば紙あるいは酢酸セルロースを使用する場合には、適当
な官能基ないしグループを有する化合物をマトリツクス
の中に導入して、勾配を作り次いで反応を生ぜしめて非
移動性帯電グループまたは非移動性帯電可能グループが
マトリツクス中に得られるようにすることができる。

これらのグルーブはマトリツクスによつて取り囲まれた
ポリマーの一部あるいは元のマトリツクスに化学的に結
合されたポリマーあるいは他の配座（ＣＯｎｓｔｅｌｌ
ａｔｉＯｎ）の一部となる。

本発明のＰＨ−フアンクシヨンを用いた電気泳動分析な
いし分離においては、優れた緩衝能力を維持しつつ、導
電度を低く保つことができる。従つて、実質上熱の発生
がなく、高電界強度を加え従つて短い分離時間を達成す
ることができる。また従来の方法におけるような大量の
電極緩衝液は必要でなく、小ない接触量（ＣＯｎｔａｃ
ｔｖＯｌｕｍｅ）の酸ないしは塩基を用いるだけでよい
。ＰＨ−フアンクシヨンの分離路の部分におけるＰＨ−
フアンクシヨンを変えることにより、あるいはＰＨ−フ
アンクシヨンと対流安定化マトリツクスの両者を変える
ことにより、分離路の異つた部分における帯電分子に異
つた易動度を与えることによつて、不連続システムにお
ける電気泳動法に容易に適用させることができる。

本発明のＰＨ−フアンクシヨンによる等電点分画では、
少ない発熱と迅速な分離という利点が達成できる。

加うるに、均等に分布した電気伝導度と緩衝能力をもつ
ＰＨ勾配の形態においてＰＨ−フアンクシヨンを得るこ
とができる。今まで、これはキヤリヤ両性電解質を用い
ることによつては充分に得ることができなかつた。ＰＨ
勾配の変動の問題もＰＨ−フアンクシヨンの使用によつ
て解決され、試料中に大量の塩をＰＨ−フアンクシヨン
を乱すことなく使用することができる。電界が分離媒体
の対流安定化された流れに対して直角である場合に、分
離を連続操作でも行うことができる。

対流安定化は種々の方法、例えばＰＨ−フアンクシヨン
が非移動化された粒状あるいは繊維状システム、あるい
は流れ安定化がＰＨーフアンクシヨンが非移動化された
二つの近接表面の間のスロット内で行われる他の毛細管
安定化システムのようなそれ自体公知の種々の方法で行
うことができる。以下本発明の態様を要約するが、本発
明はこれに限られないこと勿論である。

（１）マトリツクス中に非移動化され、かつ、炭素、硫
黄、燐、ホウ素および窒素のうち一つまたは複数のもの
を含む帯電したもしくは帯電可能な基ないしグループま
たはこれら両方の基ないしグループの分離用媒体とのプ
ロトリンス平衡ないし陽子移動平衡によつてＰＨ−フア
ンクシヨンを分離路の少なくとも一部に沿つて発生する
ことを特徴とする電気泳動用ＰＨ−フアンクシヨンの発
生方法。

（２） ＰＨ−フアンクシヨンが非移動化されたおよび
非移動化されない帯電した官能基（ＦｕｎｃｔｉＯｎ＆
１ｇｒ０ｕｐ８）および（または）帯電可能な官能基の
分離用媒体とのプロトリンス平衡によつて発生されるこ
とを特徴とする（１）項の方法。

（３） ＰＨ−フアンクシヨンがＰＨ範囲２〜１２また
はこの範囲を一部内で単調（ＭＯｎＯｔＯｎＯｕｓ）ま
たは単調でないことを特徴とする（１）項の方法。

尚、ここに「単調］とはＰＨ値が分離路に沿つて増加の
みするかまたは減少のみし、交互に増加したり減少した
りしないことを意味する。（４）マトリツクスが対流安
定化媒体（ＣＯ！ＴｖｅｃｔｉＯｎｓｔａｂｉｌｉｚｉ
ｎｇｍｅｄｉｕｍ）を構成することを特徴とする（１）
項の方法。（５）マトリツクスがゲルによつて形成され
ることを特徴とする（４）項の方法。

（６）ゲルが多孔率勾配（ＰＯｒＯ８ｌｔｙｇｒ＆Ｄｉ
ｅｎｔ）を有することを特徴とする（５）項の方法。

（７）マトリツクスが粒状であることを特徴とする（４
）項の方法。

（８）マトリツクスが繊維性であることを特徴とする（
４）項の方法。

（９）マトリツクスが毛細管安定化システム（Ｃａｐｉ
ｌｌ＆Ｒｙｓｔａｂｉｌｌｚｅｄｓｙｓｔｅｍ）におけ
る一つあるいは数個の表面を構成することを特徴とする
（１）項の方法。

住０電気泳動的分離がゾーン電気泳動として行われるこ
とを特徴とする（１）項の方法。

（自）電気泳動的分離が免疫電気泳動として行われるこ
とを特徴とする（１）項の方法。

（代）電気泳動的分離が等電点分画として行われること
を特徴とする（１）項の方法。

（自）等電点分画が一つあるいは数種の非移動化されな
い両性電解質の存在のもとで行われることを特徴とする
（代）項の方法。

（自）非移動化された基ないしグループを担つたマトリ
ツクスが多室電解槽の浸透膜をなし、ＰＨ−フアンクシ
ヨンがこれらの膜および両性電解質により交互に作られ
ていることを特徴とする（２）項の方法。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ マトリックス中に非移動化され、かつ、炭素、イオ
   ウ、リン、ホウ素および窒素のうち一つまたは複数を含
   む帯電したもしくは帯電可能な基またはこれら両方の基
   の分離用媒体との陽子移動平衡によつてｐＨ−ファンク
   ションを分離路の少なくとも一部に沿つて発生させるこ
   とを特徴とする電気泳動用ｐＨ−ファンクションの発生
   方法。