DE1593862A1 - Verfahren zur Synthese von N-Acylpeptiden an Festkoerpern - Google Patents

Description

Verfahret! zur Synthese von N-Acyl-peptiden an Festkörpern

Verfahr^en xur Herstellung von Peptiden an Festkörpern sind bekannt, so ist z.U. in Biochemistry 2 (1964) Seite 1385 ein Verfahren angegeben, bei d*m eine tert.-Butyloxycarbenylaminosäure durch Umsetzung mit chlormethyliertem, vernetztem Polystyrol benzylesterartig gebunden wird.

Nach Abspaltung der Aaiinoechutagruppe nit liCl/Eiseseig und PreileQgung der Aminogruppe aus dem Hydrochlorid wird die nächste Aminosäure als tort.-Dutyloxycarbonylaminosäure mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiimid ankondensiert. Dieses Verfahren wird so oft wiederholt, bis die gewünschte Ketten* länge erreicht ist. Anschließend wird das Peptid vom Polymer mit Hilfe von Bromwasserstoff in Trifluoressigsäure abgespalten, wobei gleichzeitig die Auiinoschutzgruppe und ander·« mit diesem Reagens entfernbare Schutzgruppen abgespalten werden. Dieses Verfahren liefert nur dann einheitliche Peptide, wenn jede I'ejvtidverknupf ungsstufe quantitativ verläuft. Die in der Literatur beschriebenen Ergebnisse zeigen

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jedoch, daß dies nicht der Fall ist..

Lin wesentlicher Vorteil hinsichtlich der Einheitlichkeit des zu synthetisierenden Peptide wird durch die Verknüpfung von N-Acylpeptiden anstelle von N-Acyl-aminosäuren mit den am Polymer haftenden Aminosäuren oder Poptiden erzielt (Zeitschrift Naturforschung 21b (136C) Seite Il4l).

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Acyl-peptiden, das dadurch gekennzeichnet ist, da-ß man Salze von N-Acyl-aminosäuren oder -peptiden. u»it tertiären Aminen mit brom- bzw. chlona.eetyliertem, vernetztem Polystyrol umsetzt, den erhaltenen polymeren N-Acy!aminosäure- bzw. -peptid-phenacyleeter nach saurer Abspaltung einer N-Acylgruppe mit N-Acyl-arainosäuren oder N-Acyl-peptiden mittels Dicyclohexyl-carbodiimid und N-Hydroxy-succiniinid oder mit N-Acyl-aminosäure- bzw· N-Acyl-peptid-hydroxysuccinimidestern kondensiert und gegebenenfalls nach beliebig häufiger Wiederholung von Abspaltung der N-Acylgx-uppen und Ankondeneiercn neuer N-Acy!aminosäuren oder -peptide aus dem polymeren Reaktionsprodukt das N-Acyl-peptid vom Polymeren durch Behandeln mit Natriuiflthiophenolatj gegebenenfalls unter Zusatz von Natriumjodid, Abspaltet..

Als Polymer dient Polystyrol, das durch einen Zusatz von 0,5 - 5 Si bevorzugt 1-2 }ί Divinylbenzol, vernetzt wurde, und das zunächst mit Hilfe von Droui- bzw. Chlor-acetyl« Chlorid in einer Friedel-Crafts-Ueaktion broniacetyliert wird. Es stellt ein farbloses Pulver dar.

Dieses bromacetylierte Polystyrol wird mit einer N-Acylaminosäure oder einem N-Acyl-peptid in einem indifferenten Lösungsmittel, z.B. Methylenchlorid, in Gegenwart eines tert.-Arnins, z.B. Triethylamin, N-Methyl-iuorpholin oder bevorzugt

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BAD ORIGINAL ^/3

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Äthyl-diisopropylamin, bei 0 bis 100 , bevorzugt bei 10-30 zu einem N*.\cyl -aminosäure- oder N—Acyl-peptidderivat umgesetzt:

Ac-(NiICHCu) -UCil_o-CU-(C_rli, -Polymer) j η J ut

η = l,2,3..i. ■ Als Hausteine für die N-Acylpeptide kommen alle in natürlich

_vorkommenden Peptideh anzutreffenden Aminosäuren in ihrer L- oder D-Form infrage. Auch der Linsatz von ß-Amiriosäurcn , wie

.Z-.D. B-Alanin oder anderer nur synthetisch oder halbsynthetisch zuganglicher Aminosäuren, 7..IJ, «^-Methyl-alanin , ctf-Methyl-3 -, ¹V-dioxy-L-phenylolanin oder Π-Chlor-L-a]anin ist möglich.

Für die für die weitere Kondensation benötigte freie Amino- «rruppe werden solche Acylreste als Schutzgruppen verwendet, die mit Jalzsäure/Cisessig, Salzsaure/Dioxan

oder mit Tr.ifluoressigsaure abspaltbar sind, wie der p-Methoxyben^yloxycarbonyl-rest, der tert.Butyloxycarbonyl-rest oder der^o-Nitroät.lf enyl-rest.

>i eitere funKtionellc Gruppen werden zweckmäßig ent sprechend den in der l'eptidcheuiie üblichen Hegeln geschützt (vgl. L. Schröder und K.Liibke, "The J eptides" , New York und London 190-5··. Dd. I. insbee, Seiten 3-75.

Nach Abspaltung der Aminoschutzgruppe, z.U. mittels Trifluoressigsäure, wird die Salzbildunjr tuit der freigelegten Aiüinogruppe durch Waschen mit einem tertiären Am-in , bevorzugt Athyl-diisopropylaiiiin, das in einem Lösungainit tel wie iJimethylformauiid oder Mett:ylenchlorid gelöst ist, aufgehoben, worauf das nächste N-Acyl-peptid oder die nächste N-Acyl-aminosäure mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiiiiiid und N-IIydroxysucciniinid oder [uittels eines ^-Acyt-atiiino säure- bzw. eines N-Acyl-pe.ptid.--

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N-hydroxysuccinimidesters unkondensiert wird. Diese Ueaktionsfolge kann so lange wiederholt werden, bis man zu ei dem Acylpeptid der gewünschten Zusammensetzung gelangt ist.

Die Abspaltung den N-Acyl-peptids vom Polymer geschieht mit Hilfe von Natriuinthiophenolat oder mit Natriumthiophenolat unter Zusatz von Natriumjodid in einem Lösungsmittel wie Dimethylformamid oder Dimethylacetamid bei Raumtemperatur. ,Hierbei werden Schutzgruppen, die keine Phenacy!gruppierung

darstellen, ni;lt mit abgespalten, also etwa solche, die zum Schutz der Hydroxylgruppen des Serins, Threonine oder der Iuiinogruppe dos Histidine verwendet werden, ebenso z.U. Ucnzy!estergruppen von Asparaginsäure oder Glutaminsäure. Man erhält also ein N-Acylpeptid, in welchem lediglich die Carboxylgruppe, welche zuvor die Bindung zum Polymer herstellte, freigesetzt wird.

Lin so vom Polymer abgetrenntes,geschütztes Peptid mit freier Carboxylgruppe Kann unmittelbar oder gegebenenfalls nach Reinigung z.D. durch Kristallisation, Gogenstromverteilung oder Chromatographie mit der freigesetzten Aminogrüppe eines anderen, am Polymer gebundenen Peptide erneut kondensiert werden.

Die Üblichen Maßnahmen zur Erzielung einer vollständigen Umsetzung wie die Verwendung eines mehrfachen Überschusses, z.D. des 2-10-fachen, an N-Acyl-peptid zur Umsetzung mit dem am Polymer haftenden Peptid.können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren getroffen werden. Dieser Überschuß ist nicht verloren, er fällt vielmehr in Fona des N-HydroxysucciriiuAleaters an und kann für andere Synthesen wieder eingesetzt werden.

Das Verfahren bietet große technische Vorteile gegenüber den bisher bekannten Verfahren. Vährend bei bisher bekannten Feet-

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körper-Synthesen, bei denen die Peptide benzylesterartig an das Polymer gebunden sind, bei einer Spaltung von Peptid und Polymer die Aminoschutzgruppen stets gleichzeitig abgespalten werden, bietet das erfindungsgemäße Verfahren

unter Bedingungen den Vorteil, daß das N-Acylpeptid vom PolymerYabgespalten wird, unter denw sämtliche anderen Schutzgruppen erhalten bleiben können. Hierdurch ist bei dem erfindungsgemäiien Vorfahren erstmalig die Möglichkeit gegeben, Zwischenprodukte bei der. Festkörpe-r-peptidsynthese zu isolieren, gegebenenfalls zu reinigen und erneut einer Festkörpersynthese zuzuführen.

Während bei den bisher bekannten Kestkörper-synthesen die benzylesterarti<?;e Bindung zwischen Polymer und Peptid nicht völlig säurestabil ist, so daß im Verlauf der Synthese mehr oder weniger große Mengen Peptid verloren gehen, ist die phenacylesterartige Bindung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren unter den angewendeten Heaktionsbedingungen völlig säurestabil..

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ebenso wie die bekannten Festkörpersyntheso weitgehend automatisiert werden. Darüber" hinaus könnon kurssket tige, vom Polymer abgespaltene und bis auf die Carboxylgruppe noch vollständig geschützte Peptide wie schon weiter oben ausgeführt, analysiert, gegebenenfalls

gereinigt und wieder aur Kondensation eingesetzt werden. Die Abspaltung von einer Probe des N-Acyl-peptid-polymers kann auch der analytischen Kontrolle des lieaktionsverlaufs dienen. Eine solche Kontrolle war bei der Festkorpersynthese bisher nur schwer und ohne großen Aussagewort möglich.

Das Verfahren sei schematisch am Aufbau eines Nonapeptids erläutert, vob-ei auch andere Koinbinationsiuöglichkeiten gewählt werden-können. Auch-kurzkettige X-Acyl-peptide , die auf üblichen» gewonnen worden sind, können eingesetzt worden.

ΟΟ0β22/1ββδ BADORiGiNAL /6

Polymer ÜOC -As ³-Ae* -Polymer

3 h
Il-As -As -Polymer

1 ■ ° 3 Ί *■

BCC-As '-As -As-As -Polymer

1 2 T k
BCC-^s -As-As-As-OU

Ii-As -As ' -Polymer Polymer

BOC-As^-As -As'-Polymer BOC-As -As -Polymer

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-As -As^-lolymer

BGC-^s-As-As' -UlI

ks-As-As-as -As -rolyiii .Il-.iS^-As -As'-As°-As -Polyiner

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1'⁵T 'i S 6 7 {Ί ^c) BOC-As -As^-As-As -As-As -As-As -As -Polyiiier

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As = beliebige Aminosäure

CT) K)

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Benzyloxycarbonyl .-L-phrnyliilanyl -L-lcuc} 1-L-ralanyl-L-alanin

Beispiel 1

a) Dromacetyliertcs Polystyrol: 30 je mit Divinylbenzol vernetztes und pulverförmiges Polystyrol werden in 100 ml Nitrobenzol suspendiert, worauf man 9 g Muminiumchlorid und innerhalb 10 Minuten 9»5 F Droniacctylbromid zufügt. Man erwärmt sodann auf 70 , hält 1 Stunde bei dieser Temperatur und rührt noch 20 Stunden bei 20 . Das Polymer wird abgesaugt, mit 100 ml Nitrobenzol und anschließend mit 100 ml Wasser, mit Methanol, mit Henzol und Äther gevaschon. Bei den Kaschvorgangen wird jeweils 5-10 Minuten lang dos Polymer gerührt« Sodann wird im Vakuum ^«trocknet.

b) 10 g des Polymer'werden in 50 ml Methylenchlorid suspendiert und nach Zugabo von 1,6 ml /Vthyldiisopropyl.unin 10 i'inuten lang gerührt. Sodann wird das Polymer abgesaugt, mit Methylenchlorid gewaschen und erneut in Methylenchlorid suspendiert. Man fügt 520 m«r tcrt .But yloxycarbonyl -L-alanyl-L-alanin und 'έΟΟ tng Äthyl-bis-diisopropyl'amin zu und rühr* über Na«ht—bei Zimmertemperatür. Gesamtvolumen des Polymers + Lösungsmittel etwa 50 ml

Anderntags wird das Polymer abgesaugt und mehrfach mit Methylenchlorid gevaschcn. Ls wird iiii Vakuum getrocknet und mit 10 i;il Trif 1 uorcssirsöur e vorsetzt 1¹^ Minuten stehen gelassen. Sodann wird i::i Vakuum unter Kühlung der Vorlage mit Trockcneis/.Vceton die Trifluoressigsäure abgedampft, das.Polymer in Methylenchlorid suspendiert, abgesaugt , in Methyleiichlorid unier Zusatz von ausreichend ■-Äthyl•»di-isropropylau.in versetzt, so daß die Lösung alkalisch reagiert (Test mit Indikatorpapier), abgesaugt und im

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Vakuum ge txocknet. ITs liegt nunmehr an das Polymer phenacylesterartig gebundendes L-Alanyl-L-alanin vor.

c) '1,5 n>Mol Benzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-leucin, 9 mMol N-llydroxysuccinitnid und 't,5 mMol Uicyclohexylcarbodiiinid werden in 30 uil Methylenchlorid 1 1/2 Stunden bei 0° gerührt. Sodann wird der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff abgesaugt und die Lösung wird im Vakuum bis auf etwa 10 ml konzentriert.

Diese Lösung wird dem nach b) erhaltenen Polymer zugefügt un<ly6iit Methyl en chlor id aufgefüllt, so daß ein Gesamtvolumen von etwa 50 ml vorliegt. Nach 2A-stündigem It uhr en bei Zimmertemperatur (20 ) wird das Polymer abgesaugt und mitMethylenchlorid zweimal gewaschen.

Die Methylenchloridlösung wird wiederholt mit Wasser gewaschen und eingedampft. Nach Umkristallisieren aus Eesigestcr/PetrolHther liegen 3.15 niMol Denzyloxycarbonyl-L-phenylulanyl-I.-leucin-K-hydroxysuccininiidester vor , welcher

für andere Synthesen eingesetzt wird.

Zur Abspaltung des Denzyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-leucyl-L-alonyl-L-alanins vom Polymer wird mit 2 g Natriumthiophenolat in 20 ml Dimethylformamid über Nacht gerührt. Cs wird abgesaugt und das Polymer wird mehrmale mit Methanol gewaschen. Nun wird im Vakuum zunächst das Methanol und sodann unter 1 Torr das Dimethylformamid abgedampft. Der Rückstand wird mit Wasser und Easigester versetzt, worauf mit verdünnter Salzsaure auf pH 2 gebracht wird. Die Essigesterlösung.wird mit Wasser gewaschen, mit Natriuoisulfot getrocknet und im Vakuum konzentriert. Hierbei kristallisiert das nenzyloxycarbonyl-tctrapeptid aus. Ausbeute 276 mg (0,'l9 mMol), Schaip, nach Umkristallisieren aus E3sigester/

Fetroläther 209°

/9

008.822/1865 ^BAD

- 9 - Kw .5355 Α

Der .C 62,80 H 6,91 NlC₁IO Gef, C 62,Ίΐ H 6,9^ II 10,'iß

tert. -Butyloxycarbonyl -I.-pro Iy 1 -.L-pro IyI-L-phcnyla L-phenylalänyl-L-alanyl-L-alnnin

Beispiel 2 .

k, C! mMol tert. -Dutyloxycarbonyl-L-prolyl-L-prolyl-L-phenyl alanyl-L-phenylalanin werden mit 8,4 niMol N-lIydroxysuccinimid und 'i , 2 ΐη>ΐο1 Dicyclohexylc.arbodiimid in 30 ml Methylenchlorid 11/2 Stunden bei 0° gerührt. Vom gebildeten Dicyclohexylharnstoff wird abgesaugt, und die Lösung wird bis auf etwa. 1.0 ml eingeengt. Diese Losung fügt man zu 9,5 g nach Beispiel 1 b) hergestallten L-Alanyl-L-alanin-polymer zu und füllt mit He.thylenchlorid auf etwa 50 ml Gesamtvolumen auf. Man rührt 'to Stunden, saugt ab und arbeitet wie bei Beispiel 1 beschrieben auf. Angesäuert wird anstatt mit verdünnter Salzsäure mit Citronensäurelösung. Nebenbei werden. 2,9 mMol Berizyloxycarbonyl-L-prolyl-L-prolyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanin-N-Jiydroxysuccinimidester gewonnen.

Ausbeute am Benzyloxycarbonyl-hoxapeptid 353 mg (0,^7 mMol).

Zur Befreiung von etwas im geschützten I'eptid vorhandenem polymerein Material wird es in verdünntem Ammoniak gelöst, worauf eine geringe Menge unlösliches Material mit Lssigester ausgeschüttelt wird. Die ajumoniakalische Lösung wird mit verdünnter Citronensäure angesäuert, wobei das geschützte Peptid ausfällt. Es wird abgesaugt, mit Ivasser gewaschen und getrocknet.
Sehuip. 2/i4-2'i6^o

Bor. C 62,55 JI 7,00 ■ N U, 22 Clef. C '62,71 II 7,06 K 10,6?

9822/1865- bad qrjqj_Nal

Claims (1)

1. Vorfahren zur Herstellung von X-Acy i-pept idun , dadurch gekennzeichnet, daß man Salze von N'.- \cyl-uminos.uir en oder -peptiden mit tertiären Aminen mit brow- bzw. chloracetyliertctn, vernetzten! l'olystyrol umsetzt , den erhaltenen polymeren N-Acyleminosäure- bzw . -pep t id-pheniicylester nach saurer Abspaltung einer N-Acylgruppe mit N-Acyl-aminosnuren oder N-Acyl-peptiden mittels Dicyclohexyl-carbodiimid und ll-llydroxy-succiniiuid oder iuit N-Acyl-ajtiinosäure- bzw. N-Acyl-peptid-hydroxysuccinimid-estern kondensiert und gegebenenfalls nach beliebig häufiger Wiederholung von Abspaltung der N-Ac>lgruppen und Ankondensieren· neuer N- . Acylaminosäur en oder -pej^tide aus den» polymeren lieakt io-> «- produkt das N-Acyl-peptid vom Polymeren durch Behände]η mit Natriuinthiophenolat, gegebenenfalIs unter Zusatz von Natriunijodid_t abspaltet.

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