DE1543594A1 - Verfahren zur Herstellung von Hydroxyaminosaeurehaltigen Peptiden - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Hydroxyaminosaeurehaltigen Peptiden

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DE1543594A1 DE19661543594 DE1543594A DE1543594A1 DE 1543594 A1 DE1543594 A1 DE 1543594A1 DE 19661543594 DE19661543594 DE 19661543594 DE 1543594 A DE1543594 A DE 1543594A DE 1543594 A1 DE1543594 A1 DE 1543594A1
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acid
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Ferdinand Fraunberger
Weygand Dr Friedrich
Steglich Dr Wolfgang
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Hoechst AG
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/06—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length using protecting groups or activating agents
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Description

Frankfurt (M)-Hoechst
Anlage I
zur Patentanmeldung Fw 27· Mai I966
Dr .Hg/f e
5IO3 A
Verfahren zur Herstellung von Hydroxyaminosäure-haltigen Peptiden
Bei der Synthese von Hydroxyaminosäure-haltigen Peptiden ist es zweckmäßig, die Hydroxylgruppe zu blockieren, um Nebenreaktionen zu vermeiden und die Löslichkeit in aprotischen Lösungsmitteln zu erhöhen. Hierzu wurden bisher Acylreste, Benzylresteund tert.-Butylreste verwendet. Alle diese Schutzgruppen haben Nachteile: Die Acylreste können eine Acylwanderung eingehen und werden bei der Esterverseifung hydrolysiert, die 0-Benzyl-derivate sind nicht direkt aus den optisch aktiven Aminosäuren herstellbar und die tert.-Butyläther sind nicht resistent gegen kalte Trifluoressigsäure, die zur Abspaltung von tert.-Butyloxycarbonylsowie p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-resten verwendet wird.
Es wurdenun gefunden, daß man Hydroxyaminesaure-haitige Peptide herstellen kann, indem man an der Hydroxygruppe der Aminosäure durch 2,2.2-Trihalogen-l-benzyloxy-carbonylamino-äthyl-schutzgruppen substituierte Hydroxyatninosäuren. bzw.
Hydroxyaminosäurehaltige Peptide mit einer freien Aminogruppö und Aminosäuren oder Peptide mit einer freien Carboxylgruppe miteinander kondensiert oder umgekehrt ent»
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sprechende Hydroxyamine)säuren oder Ilydroxyaminosäurehaltige Peptide mit einer freien Carboxylgruppe und Amino,-säuren oder Peptide mit einer freien Aminogruppe miteinander kondensiert und gegebenenfalls alle oder einige der vorhandenen Peptidschutzgruppen abspaltet.
Eine Schutzgruppe für die Hydroxylgruppen des Serins und Threonine soll
a) bei den bei der Synthese von Peptiden üblicherweise vorzunehmenden Reaktionsschritten, wie der Abspaltung von tert.-Butyloxycarbonyl- sowie p-Methoxy-benzyloxy-carbonylresten und bei der Esterverseifung stabil sein, b) keine Acylwanderung eingehen sowie c) in die optisch aktiven N-Acylaminosäuren und die Hydroxyaiainosäure-haltigen i-.'-Acylpeptide leicht einführbar und nach beendeter Peptidsynthese ohne Angriff auf die Peptidbindung wieder abspaltbar sein.
Allen diesen Anforderungen genügt der erfindungsgemäß verwendete 2.2.2-Trihalogen-l-benzyloxycarbonylamino-äthyl-rest (I).
X CtCII-
NH-CO-O-CH0CgH
wobei X gleiche oder verschiedene Fluor-, Chlor- oder Bromatome bedeutet.
Diese Schutzgruppen können beispielsweise in N-Acyl-hydroxyaminosäuren vorzugsweise N-Acyl-serine, N-Acyl-threonine und N-Acyl-peptide eingeführt werden, indem man diese Verbindungen mit den aus 1.2.2.2.-Tetrahaiogen-N-benzyloxycarbonyl-äthylaminen mit Hilfe einer tert.-Base entstehenden N-Benzyloxycarbonyl-trlhalogen-acetaldininen umsetzt. Die 1.2.2.2-Tetrahalogen-N-benzyloxycerbonyl-äthylamine können analog der in J. Ind. Chem. Soc. Bd. 13, S. II7 (1936) beschriebenen Weise hergestellt werden. Hierbei ist es nicht notwendig, die gegen Wasser sehr empfindlichen N-Benzyloxycarbonyl-trihalogenacetaldiiuine zu isolieren. Es ist vielmehr zweckmäßig, die Umsetzung
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der Tetrahalogenverbindungen in Gegenwart des zu schützenden Aminosäure- bzw. Peptidderivatee durch Zusatz von Triäthylarain vorzunehmen. Bei diesen .Reaktionen muß auf größtmögliche Wasserfreiheit des Reaktionsmediums geachtet werden. Wird Tetrahydrofuran als Lösungsmittel verwendet, so wird es über Lithiumalurainiumhydrid direkt in das Reaktionsgemäß eindestilliert.
Die 2.2.2-Trihalogen-l-benzyloxycarbonylamino-äthylreste in den Ilydroxyaminosäurederivaten sind beständig bei der alkalischen Verseifung von Estergruppen sowie gegen wasserfreie Trifluoressigsüure bei 0° (1 Std.). Daher können N-tert.-Butyloxycai'bonyl-gruppen und N-p-ilethoxy-benzyl oxy carbonyl- gruppen mit Trifluoressigsäure abgespalten werden, ohne daß die neuen Ü-Schutzgruppen angegriffen werden. Man lcann also Ilydroxyaminosäure-haltige Peptide, deren Hydroxylgruppen durch die neuen Schutzgruppen blockiert sind, sowohl am Carboxylende wie auch am Aminoende für weitere l'eptidsynthosen einsetzen. Die Peytidsynthesen selbst werden nach den in der Peptidchemie üblichen Methoden wie Dicyclohexylcarbodiimid- oder Azidmethode sowie beispielsweise der Methode de** gemischten Anhydride oder der aktivierten Ester durchgeführt.
Die Abspaltung der neuen 0-Schutzgruppen gelingt in der für den Benzyloxycarbonyl-rest bekannten Weise, z.U. durch katalytische Hydrierung in Methanol oder durch erwärmen mit Trifluoressigsäure. Hierbei bilden sich zunächst Verbindungen vom Typ
X C-OH-2,
die durch Waeeer oder Alkohole in Trifluoracetaldehyd-hydrat bzw. Trifluoracetaldehyd-halbacctale und Ammoniak unter Freisetzung des Peptid» zerfallen.
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Beispiel 1
O-(2.2.2-Trifluor-1-benzyloxycarbonylamino-äthyl)-N-(benzyloxycarbonyl)-L-serin
0,24 g N-Benzyloxycarbonyl-L-serin und 0,34 g 2.2.2-Trifluor-1-brom-N-benzyloxycarbonyl-äthylamin werden in 5 ml frisch über Lithiumaluminiumhydrid destilliertem Tetrahydrofuran gelöst und mit 0,31 ml Triethylamin versetzt. Nach einer Stunde wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand mit etwas Wasser verrührt. Sodann wird mit verdünnter Salzsäure angesäuert, mit Essigester ausgeschüttelt und die Essigesterlösung mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Umkristallisiert wird aus Essigester/Petroläther. Ausbeute 69 #1 Schmp. 120-125°, sintern ab 115°.
Beispiel 2
N-(p-Methoxy-benzyloxycarbonyl)-0-(2,2.2-trifluor-1-benzyloxycarbonylamino-äthyl)-L-serin
3,0 g (11,1 mMol) N-p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-L-serin und 4,2 g (I3i4 mMol) 2.2.2.-Trifluor-l-brom-N-benzyloxycarbonyläthylamin werden in 50 ml frisch über Lithiumaluminiumhydrid destilliertem Tetrahydrofuran gelöst, worauf man 4 ml Triäthylamin zufügt. Nach 12stündigem. Stehen wird in» Vakuum eingedampft, der Rückstand mit 50 ml Wasser versetzt, worauf wenig 2.2.2.2·.2··2'-Hexafluor-1.1·-dlbenzyloxycarbonyrarainodiäthyläther auekristallisiert, der abgesaugt wird. Das Filtrat wird mit 0,5 Mol Citronensäure angesäuert und mit Essigester ausgeschüttelt. Die Esaigesterlösung wird mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Es hinterbleibt ein Öl, das in Äther gelöst mit 2,1g Dicyclohexylamin versetzt, rasch das kristallisierte Dicyclohexylammoniumsalz des N- und O-geschützten Serins liefert. Ausbeute 8l S, Schmp. 162°, sintern ab 155°.
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Die Verbindung liefert mit Trifluoressigeäure bei 0 (10 Min.) 0-(2.2.2-Trifluor-l-benzyloxycarbonylaminoäthyl)-L-serin, beim Kochen mit Trifluoressigeäure. (45 Min.) L-Serin.
Beispiel 3
N-(p-Methoxy-benzyloxycarbonyl)-0-(2.2.2-trifluor-1-benzyloxycarbonyla«ino-äthyl)~L-seryl-L-phenylalanin- methyleeter
5 g des nach Beispiel 2 erhaltenen Bicyclohexylammoniumsalzes werden in 100 ml Wasser suspendiert, mit Essigester überschichtet und 2 Stunden lang mit einem saueren Ionenaustauscher (z.B. 15 g Dowex 50 in der flM-Form) gerührt. Die Eesigesterlösung wird mit Natriumsulfat gut getrocknet und eingedampft. Nun fügt man 1,59 g L-Phenylalanin-methylester-hydrochlorid, 20 ml absoluten Tetrahydrofuran und 1,03 »Ι Triethylamin zu und läßt im Laufe einer Stunde 0,9 g Methyl-äthinyl-diäthylamin, gelöst in 5 ml absolutem Tetrahydrofuran, zutropfon. Nach dem Eindampfen im Vakuum wird in Essigester aufgenommen, worauf mit 0,5 Mol Citronensäure, mit Natriurahydrogencarbonatlösung und mit Wasser gewaschen wird. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird im Vakuum eingedampft. Der Rückstand kristallisiert beim Anreiben mit Petroläther. Ausbeute 95 %· Der Schmelzpunkt variiert in den einzelnen Fraktionen nach dem Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther, weil die 0-Schutzgruppe ein Asymmetriezentrum enthält und somit Diastereoisomere vorliegen. Schmp. 1, Fraktion 168 , nach Sintern, Schmp* 2. Fraktion 1Λ2°, nach Sintern.
Zur Abspaltung des p-Methoxy-benzyloxycarbonyl-restes wird in wasserfreier Trifluoressigsäure unter Zusatz von Anisol (3:2 voL) 30 Minuten stehen gelassen, im Hochvakuum eingedampft,
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Toluol zweimal nachdestilliert und mit Äther versetzt. Hierbei kristallisiert das Trifluoracetat von 0-(2.2.2-Trifluor-l-benzyloxycarbonyl-amlno-äthyl)-L-seryl-L-phenylalanin-methylester aus. Durch Einleiten von Chlorwasserstoff erhält man das kristalline Hydrochlorid, Schmp. 90°, wird wieder fest und schmilzt scharf bei I690 (Zers.). Ausbeute 76 %.
Zur Verseifung der Estergruppe im N-(p-Methoxy-benzyloxycarbonyl)-0-(2.2.2-trifluor-1-benzyloxycarbonylaminoäthyl)-L-seryl-L-phenylalanin-methylester wird die Verbindung mit 1,1 Äquivalenten NaOH in wässrigem Dioxan bei 20 über Nacht stehen gelassen. Die anschließende Entfernung der N- und O-Schutzgruppe wird durch katalytische Hydrierung mit Pd-Kohle als Katalysator in Methanol vorgenommen. Es resultrieart L-Seryl-L-phenylalanin, das in allen Eigenschaften mit einer authentischen Probe übereinstimmt.
Beispiel 4
N-(p-Methoxy-benzyloxycarbonyl)-0-(2.2.2-trifluor-l-benzylexycarbonylaoaino-äthyl) -L-threonin
2,0 g (7»07 mMol) N-p-Methyloxy-benzyloxycarbonyl-L-threonin und 4,6 g (14,7 mMol) 2.2.2-Trifluor-l-brom-N-benzyloxycarbonyl-äthylamin werden in 45 ml frisch über Lithiumaluminiumhydrid destilliertem Tetrahydrofuran gelöst, worauf man 3,5 «al Triethylamin zufügt. Nach Stehen über Nacht wird im Vakuum eingedampft, worauf zweimal Wasser nachdestilliert wird. Sodann wird mit Wasser versetzt und mit Essigester Ausgeschüttelt. Hierbei geht das N- und 0-geschützte TriäthylamMoniumsalz des Threonine in die Essigestherphase. Die Sssigesterlö'aung wird mehrmals mit verdünnter Citronensäurelöeung geschüttelt. Hierbei verbleibt das N- und O-geschützte Threonin in dem Essigester. Nach
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Trocknen mit Natriumsulfat wird im Vakuum eingedampft, das hinterbliebene Öl in Äther aufgenommen, mit 1,^5 g Dicyclohexylamin versetzt und das Dicyclohexylanunoniumsalz durch Zugabe von Petroläther gefällt. Ausbeute nahezu quantitativ, Schmp. I5I-I53 , sintern ab 1^5 ·
Beispiel 5
N-(p-ilethoxy-benzyloxycarbonyl)-0-(2.2.2-trifluor-ibenzyloxycarbonylamino-äthyl)-L-threonyl-L-phenylalaninmethylester
Aus dein nach Beispiel k erhaltenen Dicyclohexylammoniumsalz wird das N- und O-geschützte L-Threonin, wie in Beispiel 3 für die Serinverbindung beschrieben, freigesetzt. Die weitere Umsetzung zum N- und O-geschützten Dipeptidmethylester erfolgt analog Beispiel 3. Ausbeute 89 %, Schmp. 130-131°, sintern ab 110°.
Zur Gewinnung von L-Threonyl-L-phenylalanin wird die Estergruppe mit 1,1 Äquivalent NaOH in wässrigem Dioxan verseift und die resultierend« Säure der katalytischen Hydrierung in Methanol mit Pd-Kohle ale Katalysator unterworfen. Das erhaltene Dipeptid ist in allen Eigenschaften mit einer authentischen Probe identisch.
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Claims (2)

Patentansprüche
1) Verfahren zur Herstellung von Ilydroxyaminoßäure-haltigen Peptlden, dadurch gekennzeichnet, daß man an der Hydroxylgruppe der Aminosäuren durch 2.2.2-Tr!halogen-1-benzyloxycarbonylamino-Kthyl-schutzgruppen substituiert· Hydroxyamine säuren · Hydroxyaminosäurefcaltige Peptide mit einer freien Aminogruppe und Aminosäuren oder Peptide mit einer freien Carboxylgruppe miteinander kondensiert oder umgekehrt entsprechende Hydroxyamlnosäuren oder Hydroxyaminosäure-haltige Peptide mit einer freien Carboxylgruppe und Aminosäuren oder Peptide mit einer freien Aminogruppe miteinander kondensiert und gegebenenfalls alle oder einige der vorhandenen Peptidschutzgruppen abspaltet.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Trihalogenverbindungen die Trifluor- und die Trichlor-verbindungen verwendet werden.
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