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Trägermaterial zum Unbeweglichmachen von Enzymen, dessen
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Herstellung und Anwendung Beschreibung: Die vorliegende Erfindung
betrifft Trägermaterialien zum Unbeweglichmachen von Enzymen (solche Trägermaterialien
werden auch als "Enzymimmobilisierungsträger" bezeichnet); ferner betrifft die Erfindung
ein Verfahren zur Herstellung solcher Trägermaterialien und deren Anwendung zum
Unbeweglichmachen von Enzymen.
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Insbesondere betrifft die Erfindung solche Trägermaterialien auf der
Basis eines makroporösen synthetischen Polymers, das anionenaustauschende Gruppen
von 1 meq/g trockenes Harz oder mehr und Carboxymethylgruppen in einem Anteil von
0,5 meq/g
trockenes Harz oder mehr aufweist (im Rahmen dieser Unterlagen
soll mit dem Ausdruck 1llarz" irgendein synthetisches Harz oder ein Kunststoff bezeichnet
werden, wobei Polysaccharide und deren Derivate ausgenommen sind).
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Im Hinblick auf die Einsatzmöglichkeiten für unbeweglich gemachte
Enzyme für industrielle Anwendungen sind in jüngerer Zeit eine Reihe von Verfahren
zum Unbeweglichmachen bzw. Immobilisieren von Enzymen entwickelt worden (vgl. beispielsweise
C.R.Zaborsky :"Immobilized Enzyms", herausgegeben von C.R.C.
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Press, 1973). In der Fachwelt ist eine große Anzahl von Trägermaterialien
zum Unbeweglichmachen von Enzymen bekannt. Zu diesen Trägermaterialien gehören Polysaccharide
und deren Derivate, 3.
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B. Cellulose, vernetzte Dextrane und ionische Cellulosederivate; solche
Trägermaterialien werden in weitem Umfang eingesetzt und einige von ihnen haben
sich als recht vorteilhaft erwiesen. Andererseits weisen Polysaccharide zahlreiche
Nachteile auf; hierzu gehören eine mäßige bis schlechte mechanische Festigkeit;
sofern die Polysaccharide in einer Säule eingesetzt werden, läßt sich ein befriedigender
Durchsatz nur schwierig erzielen und die Säule verstopft leicht; und Polysaccharide
werden leicht von Mikroorganismen angegriffen.
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Sofern Enzyme über ionische Bindungen an ionische Polysaccharidderivate
angebracht sind, werden viele Enzyme von den Reaktionslösungen oder den Produktlösungen
mit bereits mäßig hoher Elektrolytkonzentration
leicht abgelöst,
was in der Praxis ein ernsthaftes Problem darstellt.
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Weiterhin sind auch bereits ionenaustauschende Harze als Trägermaterialien
zum Unbeweglichmachen von Enzymen bekannt geworden (vgl. J. Amer. Chem. Soc. 81,
5133-5136 (1959)). Hier ist jedoch der Anteil an pro Gewichtseinheit Trägermaterial
unbeweglich gemachtem Enzym sehr klein, und die Aktivität des erhaltenen, unbeweglich
gemachten Enzymes ist sehr gering, so daß der praktische Wert dieser Präparate von
der Fachwelt als sehr gering eingestuft worden ist.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Trägermaterialien
zum Unbeweglichmachen von Enzymen bereitzustellen, welche pro Gewichtseinheit Trägermaterial
große Anteile an Enzymen unbeweglich zu machen vermögen, wobei die unbeweglich gemachten
Enzyme eine hohe Aktivität und eine lange Lebensdauer bzw. Beständigkeit aufweisen
sollen.
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Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung besteht darin, Trägermaterialien
zum Unbeweglichmachen von Enzymen dieser Art bereitzustellen, welche für die industrielle
Anwendung geeignet sind, wo unbeweglich gemachte Enzyme als Katalysatoren für Reaktionen
in homogener wässriger Phase eingesetzt werden; an den angestrebten Trägermaterialien
sollen die Enzyme höhere Beständigkeit aufweisen und für eine wiederholte oder kontinuierliche
Anwendung geeignet sein.
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Schließlich soll mit der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung solcher
Trägermaterialien angegeben werden.
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Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ist mit den Merkmalen der
Patentansprüche 1 und 5 angegeben. Vorteilhafte TUeiterbildungen der Erfindung ergeben
sich aus den Unteransprüchen.
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Gegenüber Polysacchariden und deren Derivaten sind aus synthetischen
Harzen bestehende ionenaustauschende Harze als Trägermaterialien in zahlreichen
Punkten überlegen; beispielsweise weisen synthetische Harze hohe mechznische Festigkeit
auf; synthetische Harze halten auch einem langen Betrieb in großen Kolonnen stand,
wobei lediglich relativ geringer Abbau stattfindet; sofern für eine geeignete Teilchengröße
gesorgt wird, kann im Kolonnenbetrieb ein ausreichender Durchsatz z eingestellt
werden; synthetische Harze weisen eine hohe Beständigkeit gegenüber dem Angriff
von Mikroorganismen auf; und in der Regel sind die Kosten für synthetische Harze
gering.
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Wegen dieser vorteilhaften Eigenschaften werden im Rahmen dieser Erfindung
synthetische Harze als Trägermaterialien eingesetzt.
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Darüberhinaus sollen die erfindungsgemäß vorgesehenen Harze makroporöse
Harze oder makroretikulare Harze sein, welche amphotere
ionenaustauschende
Harze darstellen, da diese Harze sowohl Carboxymethylgruppen (die nachfolgend kurz
als CM"-Gruppen bezeichnet,werden) mit einer besonderen Affinität zu zahlreichen
Enzymproteinen aufweisen, sowie anionenaustauschende Gruppen wie primäre, sekundäre
oder tertiäre Aminogruppen oder quarternäre Amoniumgruppen; weiterhin sollen die
erfindungsgemäß vorgesehenen Harze eine große Anzahl von Makroporen mit einem Durchmesser
von ungefähr 0,01m bis zu einigen 0,1 jim aufweisen; schließlich sollen die erfindungsgemäß
vorgesehenen Harze einen großen spezifischen Oberflächenbereich und ein solches
Porenvolumen aufweisen, wie das in den Ansprüchen angegeben ist.
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Erfindungsgemäß ist festgestellt worden, daß insbesondere makroporöse
oder maKroretikulare Harze besonders gute Trägermaterialien ergeben, da an solche
makroporöse oder makroretikulare Harze gebundene Enzyme eine sehr lange lebensdauer
(d.h.
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Beständigkeit wähnend der Anwendung) aufweisen, was als eine besonders
wichtige Eigenschaft für die kontinuierliche, sich über eine lange Zeitspanne hinziehende
Anwendung von unbeweglich gemachten Enzymen angesehen wird.
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Insbesondere amphotere, ionenaustauschende Harze, die sowohl CM-Gruppen
und anionenaustauschende Gruppen (wie z.B. Aminogruppen) aufweisen, stellen besonders
gute Trägermaterialien für das Unbeweglichmachen von Enzymen dar, weil an solchen
Trägermaterialien die unbeweglich gemachten Enzyme eine sehr hohe
Lebensdauer
(Beständigkeit bzw. Standfestigkeit) aufweisen.
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Als Ursache hierfür wird die Ähnlichkeit der anionenaustauschenden
Gruppen am Trägermaterial mit den ionischen Gruppen (etwa Carboxylgruppen oder Aminogruppen)
an den Enzymmolekülen angesehen, so daß eine große Affinität zwischen Trägermaterial
und Enzymen erhalten wird.
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Die erfindungsgemäßen amphoteren, ionenaustauschenden Harze können
nach verschiedenen Verfahren hergestellt werden; ein einfaches und zweckmäßiges
verfahren ist die Einführung von CM-Gruppen in makroporöse, anionenaustauschende
Harze. Zur Einführung der CM-Gruppen setzt man eine Verbindung der allgemeinen Formel
XOH2COOY wobei X für ein Halogenatom und Y für ein Wasserstoffatom oder ein Alkalimetall
stehen, in Gegenwart einer alkalischen Verbindung mit einem makroporösen, synthetischen
Harz um, das Hydroxylgruppen, primäre Aminogruppen, sekundäre Aminogruppen, Iminogruppen,
Sulfhydrylgruppen, oder deren Derivate enthält.
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Damit man ein im hohen Ausmaß mit CM-Gruppen substituiertes Harz erhält,
ist es wesentlich, das Harz bis weit in die Innenbereiche der Makroporen hinein
mit der Reaktionslösung zu benetzen. Sofern nach Durchführung einer Reaktionsstufe
die Substitution mit CM-Gruppen nicht ausreichend ist, wird durch zweimalige, dreimalige
oder öftere Wiederholung dieser Reaktionsstufe
eine gute Substitution
mit CM-Gruppen erreicht. Wegen ihrer Reaktivität und ihrer Kosten werden Monochloressigsäure
und deren Natriumsalz als Reagenzien zur Einführung der CM-Gruppen besonders bevorzugt.
Die angewandte Menge an Reagenz zur Einführung der CM- Gruppen hängt von dem angestrebten
Ausmaß an der Substitution des Harzes mit CM-Gruppen ab; im Rahmen dieser Erfindung
sind jedoch Harze, die nurin geringem Umfang mit CM-Gruppen substituiert sind, von
geringer Bedeutung. Damit die Umsetzungsreaktion rasch fortschreiten kann, ist es
häufig günstig, die Reagenzien zur Einführung der CM-Gruppen in einem über das stöchiometrische
Verhältnis hinausgehenden Anteil einzusetzen. Man kann nur sehr schwierig die exakte
Anzahl der Mole des Harzes angeben, die mit CM-Gruppen substituiert werden sollen.
Empirisch ist festgestellt worden, daß der Anteil an Reagenz zur Einführung der
CM-Gruppen vorzugsweise ungefähr 1/2 bis ungefähr 10 Teile auf 1 Teil trockenes
Harz betragen soll; noch weiter bevorzugt wird ein Anteil von 2/3 bis 3 Teile Reagenz
auf 1 Teil trockenes Harz.
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Die Bestimmung des Trockengewichtes des Harzes erfolgt nach dem nachfolgenden
Verfahren: Die anionenaustauschenden Harze und die amphoteren, ionenaustauschenden
Harze werden in ihre OH-Form bzw. H-Form überführt; die neutralen Harze ohne ionenaustauschende
Gruppen werden nacheinander mit einer Säure, einer Base und daraufhin mit einer
großen Menge Wasser gewaschen; nach Durchführung dieser Maßnahmen werden die Harze
bei 60°C im Vakuum länger als 6 Std. getrocknet; anschließend läßt man die Harze
solange stehen, bis
sie bei Raumtemperatur (18 bis 250C) für eine
Zeitspanne von mehr als 2 Std. ein konstantes Gewicht zeigen; anschließend werden
die Harze gewogen. Sofern im Rahmen dieser Unterlagen das Gewicht von Harzen und
Trägermaterialien angegeben ist, beziehen sich diese Angaben stets auf das Trockengewicht,
das nach dem oben angegebenen Verfahren ermittelt ist, sofern nicht besondere Angaben
gemacht sind.
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Als alkalische Verbindung können Alkalimetallhydroxide (z.B.
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Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid), Erdalkalimetallhydroxide (wie z.B.
Magnesiumhydroxid, Calciumhydroxid) md in einigen Fällen auch organische Amine (wie
z.B. Triäthylamin) eingesetzt werden. Unter diesen Verbindungen wird Natriumhydroxid
ganz besonders bevorzugt. Der Anteil an alkalischer Verbindung soll vorzugsweise
ungefähr 1/3 bis ungefähr 2 Mol, bezogen auf 1 Mol Reagenz zur Einführung der CM-Gruppen
betragen. Bei der Einführung der CM-Gruppen kann eine Nebenreaktion ablaufen, die
zur Erzeugung von Glykolsäure führt. Sofern der Anteil an alkalischer Verbindung
zu groß gewählt wird, nimmt diese Nebenreaktion zu, und die Ausnutzung des Reagenzes
zur Einführung der CM-Gruppen wird schlecht. Dementsprechend soll der Anteil an
alkalischer Verbindung besonders bevorzugt ungefähr 1/3 bis ungefähr 2 Mol auf 1
Mol Reagenz zur Einführung der CM-Gruppen betragen.
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Damit an erfindungsgemäßen Trägermaterialien unbeweglich gemachte
Enzyme für die Anwendung als Industriekatalysatoren besonders gute Eigenschaften
aufweisen, sollen die für die Substitution
mit CM-Gruppen vorgesehenen
Harze makroporöse Harze sein, welche die nachfolgend angegebenen, erfindungsgemäß
vorgesehenen Eigenschaften aufweisen. Das bedeutet, das makroporöse Harz als solches
soll eine oder mehrere funktionelle Gruppen aus der nachfolgenden Gruppe, nämlich
Hydroxylgruppen, primäre Aminogruppen, sekundäre Aminogruppen, Iminogruppen oder
Sulfhydrylgruppen aufweisen, ferner eine große Anzahl von Makroporen mit einem Durchmesser
von ungefähr 0,01 um bis zu mehreren 0,1 zum besitzen, zusätzlich zu Mikroporen,
die von der Vernetzung herrühren; schließlich soll das Harz ein großes' Porenvolumen
und einen großen spezifischen Oberflächenbereich aufweisen.
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Die Makroporen werden auf physikalischem Wege durch spezielle Polymerisationsverfahren
erzeugt und gewährleisten den Einsatz des Trägermaterials über lange Zeitspannen
in kontinuierlicher Arbeitsweise, da solche Harze mit Itakroporen eine physikalische
Festigkeit aufweisen, welche größer ist als die Festigkeit von gelartigen Harzen,
welche lediglich Mikroporen besitzen. Die makroporösen Harze werden auch als MR-Harze,
MP-Harze, makroretikulare Harze oder hochporöse Harze bezeichnet. Damit das makroporöse
Harz eine eindeutige Auswirkung auf das Unbeweglichmachen eines Enzyms hat, ist
es erforderlich, daß der spezifische Oberflächenbereich des Harzes wenigstens 1
m2/g Harz beträgt; vorzugsweise soll der spezifische Oberflächenbereich einen Wert
von 5 m2/g Harz oder mehr haben; daneben soll das Gesamtvolumen der Makroporen mit
einem Durchmesser von 0,01 bis 0,2 pm (100 2 bis 2000 R) wenigstens 0,1 cm3/g Harz
betragen;
vorzugsweise soll das Gesamtvolumen der Makroporen einen
Wert von 0,2 cm3/g Harz oder mehr haben. Der spezifische Oberflächenbereich wird
nach dem Stickstoff-Adsor-tionsverfahren mittels einem von der Carlo-Erbo Co. vertriebenen
Meßgerät bestimmt und nach dem BET-Verfahren errechnet. Der Porendurchmesser und
das Porenvolumen werden mit einem von der Firma Carlo-Erbo Co. vertriebenen Porosimeter
bestimmt, das auf der Basis des Eindringens von Quecksilber arbeitet; bei den ermittelten
Meßergebnissen wird davon ausgegangen, daß die Makroporen zylindrische Form haben
mit einem kreisförmigen Quersc'mitt. Poren mit einem Durchmesser von mehr als 0,2
pm tragen zur Stabilisierung der unbeweglich gemachten Enzyme nicht bei, da der
Durchmesser dieser Poren viel größer ist, als die Abmessungen der Enzyme. Ein bevorzugter
mittlerer Porendurchmesser hängt von der Art des unbeweglich zu machenden Enzyms
ab; häufig soll der mittlere Porendurchmesser Werte von 0,015 bis 0,1 tun (150 A
bis 1000 i) aufweisen.
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Makroporöse Harze, welche die oben angegebenen Anforderungen erfüllen,
können nach bekannten Verfahren hergestellt werden; darüberhinaus sind eine Reihe
solcher makroporösen Harze (hauptsächlich anionenaustauschende Harze) übliche Handelsprodukte
und leicht zugänglich. Zahlreiche dieser Produkte enthalten hauptsächlich Hydroxylgruppen,
aliphatische primäre Aminogruppen oder aliphatische sekundäre Aminogruppen; demgegenüber
gibt es nur sehr wenig handelsüblich zugängliche Harze mit Sulfhydrylgruppen, Iminogruppen
oder aromatischen Aminogruppen.
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In der nachfolgenden Tabelle sind einige Beispiele für makroporöse
Harze sowie deren physikalische und chemische Ei genschaften aufgeführt.
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Tabelle 1 Handelsname des Matrix ionenaustauschende funktionelle spez.
Gesamt- mittl. Ionenaus-Harzes Gruppen Gruppen für die Oberfl. poren- Poren- tauschver
CM-Substitution Bereich Volumen durchm. mögen (m²/g) (cm³/g) (um) (meq/g) Duorite
pheno- tertiarisiertes Pro- -OH 68,1 0,563 0,025 4,38 A-4 lisch dukt aus Polyäthylenpolyamin
Duorite pheno- tertiarisiertes Pro- -OH 24,6 0,600 0,040 5,31 A-6 lisch dukt aus
Polyäthylenpolyamin Duorite pheno- Polyäthylenpolyamin -OH -NH2 31,6 0,534 0,042
7,10 A-7 lisch -NHR Duorite pheno- teilw.tertiarisier- -OH -NHR 95,3 0,680 0,029
4,24 S-37 lisch tes Produkt aus Polyäthylenpolyamin Duorite pheno- - -OH 90,3 0,605
0,034 0 S-30 lisch Amberlite Poly- Polyäthylenpoly- -NH2,-NHR 2,2 0,128 0,146 3,90
IR-45 styrol amin Diaion Poly- Polyäthylenpoly- -NH2,-NHR 4,6 0,290 0,033 4,20 WA-20
styrol amin Diaion Polyst Polyäthylen- -NH2,-NHR 5,1 0,325 0,056 4,75 W-21 styrol
polyamin
noch Tabelle 1 Handelsname des Matrix ionenaustauschende
funktionelle spez. Gesamt- mittl. Ionenaus-Harzes Gruppen Gruppen für die Oberfl.
poren- Poren- tauschver-OM-Substitution Bereich volumenx durchm. mögen (m²/g) (cm³/g)
(µm) (meq/g) Sumichelate Poly- Polyäthylen- -NH2, -NHR 15,0 0,375 0,140 4,12 KA-800
vinyl- polyamin chlorid Diaion Poly- quarternäres -OH 10,8 0,062 0,038 2,37 PA-418
styrol Ammoniumsalz (Vergleichs- (Typ II) präparat) Duorite Poly- quarternäres -OH
0,1 0,06 - 2,40 A-162 styrol Ammoniumsalz (Vergleishs- (Typ II) präparat) Anmerkung:
Sämtliche Eingenschaften sind entsprechend den oben angegeben Verfahren bestimmt
und berechnet worden.
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x Gesamtporenvolumen der Makroporen mit einer Porengrößen von 0,01
bis 0,1 µm
Im wesentlichen gibt es keinen besonderen oberen Grenzwert
für den spezifischen Oberflächenbereich und das Gesamtporenvolumen; andererseits
nimmt die mechanische Festigkeit unzureichende Werte an, wenn für den spezifischen
Oberflächenbereich und das Gesamtporenvolumen zu große Werte vorgesehen werden;
aus diesem Grund hat der spezifische Oberflächenbereich vorzugsweise einen Wert
von 120 m?/g oder weniger; das Gesamtporenvolumen hat vorzugsweise einen Wert von
80% oder weniger des Gesamtvolumens des Harzes.
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Im Hinblick auf das Losungsmittel für die Reaktion ist es nicht wünschenswert,
eine. große Menge Wasser zu verwenden; vielmehr soll der Wasseranteil auf 1 bis
10 Mol pro Mol alkalische Verbindung beschränkt sein, und es soll ein mit Wasser
mischbares nicht-wässriges lösungsmittel zugesetzt werden, um das Vermischen der
Reaktionspartner zu fördern. Zu solchen lösungsmitteln gehören beispielsweise Methanol,
Äthanol, Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran und dgl.. Für die Reaktionstemperatur ist
vorsugsweise ein Wert von 500C oder weniger vorgesehen, um das Auftreten von Nebenreaktionen
möglichst gering zu halten; ein besonders bevorzugter Temperaturbereich liegt zwischen
5 bis 300C, um die Wirksamkeit der Reagenzien für die Einführung der CM-Gruppen
(CM-Reagenzien) möglichst gut auszunutzen. Zweckmäßigerweise wird mit einer solchen
Rührgeschwindigkeit gerührt, daß die Reaktionspartner gut durchmischt werden, ohne
daß das Harz zerbrochen wird.
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Im Rahmen der Erfindung ist vorgesehen, daß das auf die CN-Gruppen
zurückgehende Ionenaustauschvermögen wenigstens einen Wert von 0,5 meq/g Harz, vorzugsweise
einen Wert von 1,0 meq/g Harz oder mehr hat. Daneben muß das Harz in e inem solchen
Ausmaß anionenaustauschende Gruppen aufweisen, daß ein Anionenaustauschvermögen
von wenigstens 1 meq/g Harz gegeben ist. Das Ionenaustauschvermögen wird absatzweise
nach dem nachfolgenden Verfahren bestimmt: Zur Messung des Anionenaustauschvermögens
wird das Harz in seine OH-Form überführt und das Ionenaustauschvermögen durch Neutralisationstitratfton
gemessen; der Wert des Austauschvermögens wird pro Gewichtseinheit Harz angegeben,
das wie oben angegeben getrocknet und gewogen worden ist. Zur Messung des Kationenaustauschvermögens
wird das Harz in seine H-Form überführt und anschließend die gleichen Messungen
durchgeführt. Nachdem die CM-Gruppen in das anionenaustauschende Harz eingeführt
worden sind, hat natürlich das nunmehr gemessene Anionenaustauschvermögen einen
kleineren Wert als das ursprüngliche Harz, was auf die Gewichtszunahme durch die
Einführung der CM-Gruppen zurückzuführen ist.
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Eine der Besonderheiten, der erfindungsgemäß als Trägermaterial für
das Unbeweglichmachen von Enzymen vorgesehenen, makroporösen, amphoteren, ionenaustauschenden
Harze besteht darin, daß das Unbeweglichmachen sowohl über kovalente Bindungen erzeugende
Verfahren wie über Absorptionsverfahren möglich ist, solange nicht reagiert habende
Hydroxylgruppen, primäre Aminogruppen oder sekundäre
Aminogruppen
in dem Harz vorliegen. Eine höchst bemerkenswerte Eigenschaft dieser Harze im Hinblick
auf die Verwendung als Trägermaterialien für das Unbeweglichmachen von Enzymen besteht
jedoch darin, daß die Stabilität (lange lebensdauer) der durch ein Adsorptionsverfahren
unbeweglich gemachten Ezzyme sehr viel höher ist, wie das auch mit den nachfolgenden
Beispielen belegt wird. Dies stellt eine höchst vorteilhafte Eigenschaft im Hinblick
auf die industrielle Anwendung solcher unbeweglich gemachten Enzyme dar.
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Die Herstellung der unbeweglich gemachten Enzyme über Adsorptionsverfahren
kann nach üblichen Maßnahmen durchgeführt werden.
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Zum Beispiel kann das erfindungsgemäß vorgesehene Harz zuerst mit
einer wässrigen Säure oder einer alkalischen Lösung (jeweils in 0,02 bis 3 molarer
Konzentration) aktiviert werden oder das Harz kann mit einer 0,02 bis 3 molaren
Pufferlösung behandelt werden, deren Pufferwirkung in der Nähe des pH-Wertes liegt,
wo das unbeweglich zu machende Enzym gut arbeitet; die Harze werden gut mit Wasser
gewaschen und daraufhin in eine Enzymlösung eingetaucht, so daß auch die inneren
Bereiche der Makroporen mit der Enzymlösung benetzt werden; hierzu kann das Gemisch
nach Bedarf gerührt werden; nachdem an dem Harz eine ausreichende Menge Enzym unbeweglich
gemacht worden ist, wird das erhaltene Produkt filtriert und mit Wasser gewaschen.
Für das Unbeweglichmachen durch ein Adsorptionsverfahren soll die Temperatur bei
40°C oder darunter liegen; bevorzugt werden Temperatur bri 10°C oder darunter, sofern
das unbeweglich zu
machende Enzym nicht ein besonders wärmebeständiges
Enzym ist.
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Die erhaltenen Präparate enthalten gewöhnlich 100 mg oder mehr Enzymprotein
pro g Harz; diese Präparate sind beständig, solange sie nicht mit einer Salzlösung
von sehr hoher Ionenstärke gewaschen werden. Zu den Enzymen, die an den erfindungsgemäßen
Trägermaterialien unbeweglich gemacht werden können, gehören nicht nur diejenigen
Enzyme, die aus einfachen Proteinen bestehen, sondern auch solche Enzyme, die Coenzyme
erfordern; weiterhin kann nicht nur eine einzige Sorte von Enzymen aufgebracht werden,
sondern es ist möglich, gleichzeitig zwei oder noch mehr verschiedene Sorten von
Enzymen unbeweglich zu machen.
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Da die erfindungsgemäßen Trägermaterialien aus einem amphoteren, ionenaustauschenden
Harz bestehen, können sowohl Enzyme aus sauren Proteinen wie Enzyme aus basischen
Proteinen daran unbeweglich gemacht werden.
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Sofern andererseits das Unbeweglichmachen der Enzyme über ein Verfahren
erfolgt, das kovalente Bindungen erzeugt, können verschiedene solcher Verfahren
vorgesehen werden, welche die Reaktivität der Hydroxvlgruppen, der primären Aminogruppen,
der sekundären Aminogruppen, der Sulfhydrylgruppen oder der Iminogruppen ausnutzen,
welche in den Harzen enthalten sind. Im besonderen sei auf die relativ einfachen
Verfahren zur Ausbildung kovalenter Bindungen verwiesen, mittels denen Enzyme dauerhaft
angebracht werden können, wie etwa
(1) Die Anbringung über s-Triazinyl-Derivate,
wobei Cyanurchlorid oder dessen Derivate eingesetzt werden; (2) die Anbringung unter
Verwendung von Glutaraldehyd; (3) die Anbringung über Azidbrücken; und (4) die Anbringung
unter Verwendung von Monohalogenacetyl-Derivaten.
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Sofern das Unbeweglichmachen mittels Verfahren erfolgt, die kovalente
Bindungen erzeugen, ist der Anteil an unbeweglich gemachtem Enzym pro Gewichtseinheit
Trägermaterial gewöhnlich kleiner als im Falle des Unbeweglichmachens über Adsorptionsverfahren;
andererseits können Präparate erhalten werden, bei denen die unbeweglich gemachten
Enzyme eine höhere spezifische Aktivität und Beständigkeit in Anwesenheit von Elektrolyt-lösungen
hoher Konzentration aufweisen.
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Die Auswahl von Enzymen, die an den erfindungsgemäßen Trägern unbeweglich
gemacht werden können, ist nicht in besonderer Weise beschränkt; es können alle
beliebigen Enzyme eingesetzt werden, ausgenommen solche, deren Enzymaktivität beim
Unbeweglichmachen verlorengeht. Zu beispielhaften Enzymen gehören Pronase, Amino-Acylase,
Glukose-Isomerase, Lactase, Nuklease, /1,-Amylase, Isoamylase, Pullulanase, Urease,
Deaminase, Lipase, Esterase, Trypsin und ähnliche Enzyme.
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Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung,
ohne diese einzuschränken.
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Beispiel 1: 10,0 g Duorite A-7 werden in 70 ml Methanol eingebracht;
der Aufschlämmung wird eine konzentrierte Lösung von 6,23 g Natriumhydroxid in 7
ml Wasser zugesetzt; nachdem das Gemisch gut gerührt worden ist, wird entgast; während
das Gemisch mit Eiswasser gekühlt wird, wird 35 min lang an eine Wasserstrahlpumpe
angeschlossen, um das Harz bis weit in die innereIl Bereiche der Makroporen hinein
zu benetzen. Anschließend wird eine Lösung von 8,68 g Monochloressigsäure in 10
ml Methanol zugesetzt; unter langsamem Rühren läßt man bei Raumtemperatur (24 +
1 0C) 7 h langreagieren.
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Nachdem die Reaktion beendet ist, wird das Harz nacheinander mit Wasser,
0,5 m wässriger Natriushydroxid-Tösung, Wasser, 015 m wässriger Salpetersäure-Lösung,
Wasser, 0,5 m wässriger Natriumhydroxid-Lösung, Waseer und 0,5 m wässriger Salpetersäure-lösung
gewaschen; abschließend wird ausreichend mit Wasser gewaschen. Durch diese Behandlung
wird das Harz in seine H-Form übergeführt; anschließend wird das Ionenaustauschvermögen
der eingeführten Carboxylmethylgruppen bestimmt. Hierbei ergeben sich: Ionenaustauschvermögen
4,82 meq/g Harz Gewichtszunahme durch CM-Substitution 3,87 g (= 38,7%)
Weiterhin
wird festgestellt, daß durch diese Gewichtszunahme das Anionenaustauschvermögen
scheinbar von 7,10 auf 5,17 meq/g Harz abgenommen hat.
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Beispiel 2: Die Vorbereitung des Harzes wird analog zu Beispiel 1
durchgeführt. Nachdem das Harz 3 Std. lang entgast worden ist, wird eine Lösung
von 1,42 g Natriumhydroxid und 3,35 g Monochloressigsäure in einem Lösungsmittelgemisch
aus 5 ml Wasser und 10 ml Methanol zugesetzt; anschließend läßt man 4 hlang reagieren.
Am Produkt wird ein Kationenaustauschvermögen von 5,47 meq/g Harz und eine Gewichtszunahme
von 34,2°,b bestimmt.
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(Warum in diesem Falle das Ionenaustauschvermögen nicht proportional
zur Gewichtszunahme ist, konnte noch nicht geklärt werden).
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Beispiel 3: 10 g Duorite A-6 werden in eine Lösung von 11 g Natrium-Monochloracetat
in einem Lösungsmittelgemisch aus 10 ml Wasser und 60 ml Methanol eingebracht; während
die Aufschlämmung mit Eiswasser gekühlt wird, wird 20 min lang an eine Wasserstrahlpumpe
angeschlossen, um die Aufschlämmung zu entgasen. Anschliessend wird eine Lösung
von 6 g Natriumhydroxid in 8 ml Wasser zugesetzt; daraufhin läßt man bei 22 + 20C
6 h lang unter langsamem Rühren reagieren. Nachdem die Reaktion beendet ist, wird
das
Harz abfiltriert, mit Wasser gewaschen und in seine H-Form übergeführt. Das auf
die eingeführten Carboxymethylgruppen zurückführbare Ionenaustauschvermögen hat
einen Wert von 3,10 meq/g Harz; die Gewichtszunahme beträgt 22,3%; das Anionenaustauschvermögen
beträgt nach der OM-Substitution 4,38 meq/g Harz.
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Beispiel 4: In einer Vorbehandlung wird Duorite S-30 sorgfältig mit
Säure, Lauge, und Wasser gewaschen und daraufhin getrocknet; 10 g dieses Materials
werden in 35 ml einer wässrigen lösung mit 7,2 g Natriumhydroxid eingebracht. Während
die erhaltene Aufschlämmung mit Eiswasser gekühlt wird, wird 40 min lang an eine
Wasserstrahlpumpe angeschlossen, um die Aufschlämmung zu entgasen; anschließend
werden ungefähr 35 ml Wasser zusätzlich zugesetzt.
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Daraufhin werden unter Rühren im Verlauf von 2 h 50 ml einer wässrigen
Lösung mit 18,1 g ß -Diäthylaminoäthylchlorid-Hydrochlorid zugesetzt, während die
Aufschlämmung von Harz in Natriumhydroxid-lösung bei Raumtemperatur von 22 + 1 0C
gehalten wird.
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Die Reaktion wird für weitere 7 h fortgesetzt, so daß insgesamt eine
Reaktionsdauer von 9 h erhalten wird. Nach Ablauf der 9 h wird das Harz filtriert,
mit 0,5 m wässriger Salpetersäurelösung, 0,5 m wässriger Natriumhydroxid-Tösung
und daraufhin mit Wasser gewaschen; unmittelbar anschließend (ohne Trocknung) wird
die CM-Substitution wie folgt durchgeführt: Das gesamte erhaltene Harz wird in eine
Lösung von 6,6 g Natriumhydroxid in einem Lösungsmittelgemisch aus 5 ml Wasser und
40 ml
Äthanol eingebracht; unter Kühlung mit Eiswasser wird die
Aufschlämmung 30 min lang gerührt; daraufhin werden 70 ml einer Methanol-Tösung
mit 13 g Natrium-Monochloracetat zugesetzt; unter langsamem Rühren läßt man 7 h
lang bei 21 + 2 0C reagieren. Nachdem die Reaktion beendet ist, wird das Harz zweimal
entsprechend der nachfolgenden Schrittfolge gewaschen, nämlich mit Wasser, 0,5 m
wässriger Natriumhydroxid-Lösung, Wasser und 0,5 m wässriger Salpetersäure-Bösung;
daraufhin wird das erhaltene Produkt in 2 Anteile aufgeteilt. Der eine Anteil wird
wiederholt mit Wasser gewaschen, um das Harz in die H-Form überzuführen. Der andere
Anteil wird ein weiteres Mal mit 0,5 m wässriger Natriumhydroxid-Bösung gewaschen
und daraufhin wiederholt mit Wasser gewaschen, um das Harz in seine OH-Form überzuführen.
Das auf die eingeführten Carboxymethylgruppen zurückführbare Kationenaustauschvermngen
beträgt 1,85 meq/g Harz; das auf die eingeführten Diäthylaminoäthylgruppen zurückführbare
Anionenaustauschvermögen beträgt 1,49 meq/g Harz.
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Wenn dieses amphotere, ionenaustauschende Harz als Trägermaterial
für das Unbeweglichmachen eingesetzt wird, wird das gesamte Harz in seine H-Form
überführt.
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Beispiele 5 bis 12: Es werden beispielhafte erfindungsgemäße Trägermaterialien
für das Unbeweglichmachen von Enzymen hergestellt. In der nachfolgenden Tabelle
sind die Reaktionsbedingungen für das Einführen der CM-Gruppen in Harze mit anionenaustauschenden
Gruppen
zur Gewinnung der amphoteren,ionenaustauschenden Harze
sowie deren Eigenschaften aufgeführt. Vor der Durchführung der eigentlichen Reaktion
werden die ausgewählten Harze in eine alkalische Lösung oder in eine Lösung mit
dem CM-Reagenz eingebracht; anschließend wird die Lösung, während sie mit Eiswasser
gekühlt wird, 30 bis 60 min lang entgast. Zur Bestimmung des auf die CM-Gruppcn
zurückführbaren Kationenaustauschvermögens werden die erhaltenen Harze durch Waschen
analog Beispiel 1 in ihre H-Form überführt. Zur Bestimmung des nionenaustauschvermögens
werden die erhaltenen Harze nach Durchführung der CM-Substitution durch Taschen
in ihre OH-Form überführt.
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T a b e l l e 2: Reaktionsbedingungen Ergebnisse Beispiel Harz Menge
Menge Menge Menge Menge Reaktions- Reaktions- Kationen- Aninonenharz NaOH ClH2COOH
H2O CH3OH Temp. dauer austausch- austauschvermögen vermögen (CM-Gruppen) (g) (g)
(g) (ml) (ml) (°C) (h) (meq/g Harz) (meq/g Harz) 5 Duorite 9,9 3,3 8,73 6 ungefähr
21#2 7 2,43 3,78 A-4 120 6 Duorite 5,0 4,0 8,51) 6 ungefähr 25#1 6 2,15 3,62 A-4
50 7 Duorite 6,0 1,71 5,263) 6 ungefähr 23#2 6,5 3,56 -A-7 80 8 Durite 10,0 9,9
8,73 10 ungefähr 25#2 7,0 2,85 3,57 S-37 150 9 Diaion 10,0 9,9 5,0 10 ungefähr 22#1
7,0 1,102) 4,322) WA-21 100 10 Sumi- 10,0 9,9 5,5 10 ungefähr 20#2 7,0 1,352) 3,722)
chelate 100 KA-800 11 Diaion 10,0 9,9 4,0 10 ungefähr 20#2 7,0 0,742) 3,922) WA-20
120 12 Amber- 10,0 9,9 4,0 10 ungefähr 20#2 7,0 0,682) -lite 120 IR-45
Anmerkungen
zur Tabelle: 1)Lösung von Natrium-Monochloracetat in Aceton; 2)Gesamtaustauschvermögen,
nachdem das Produkt zweimal unter den angegebenen Bedingungen gewaschen worden ist;
3)Lösungsmittel Äthanol.
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Nachfolgend wird über einige Versuche zum Unbeweglichmachen von Enzymen
an den erfindungsgemäßen Trägern berichtet.
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Versuch 1: 800 mg Lactase aus Aspergillus Oryzae (vertrieben von Shinnihon
Kagyo Co., mit einer Aktivität des gelösten Enzymes von 24,1 µMol/mg#min bei pH
4,5 und 40°C gegenüber einem Substrat von 13,3 w/v°,S gereinigter Lactose) werden
in 40 ml, ungefähr bei 4 0C gehaltener 0,02 m Acetatpuffer-lösung (pH 5,5) gelöst.
In diese Lösung werden 4,0 g, nach Beispiel 1 hergestelltes CM-substituiertes Duorite
A-7 eingebracht; zum Unbeweglichmachen des Enzyms hält man 16 h lang bei ungefähr
4°C und rührt bei 80 U/min. Nach Beendigung der Reaktion wird das Produkt sorgfältig
mit 0,05 m Acetatpuffer-Lösung (pH 4,5) gewaschen, bis sich in der Waschlösung Enzymprotein
nicht länger nachweisen läßt. Aus dem Proteingehalt der Waschlösung (nach dem Lowry-Verfahren
bestimmt) wird für den Anteil an unbeweglich gemachte Enzym ein Wett von 149 mg/g
Trägermaterial errechnet.
Das unbeweglich gemachte Enzym hat eine
spezifische Aktivität von 4,8 µMol/mg#min, was aus dem Anteil an erzeugter Glukose
errechnet wird, wenn man das unbeweglich gemachte Enzym bei 40°C und einem pH-Wert
von 4,5 15 min lang mit 13,3 w/v% gereinigter lactose als Substrat bei 80 U/min
rührt.
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Ein Anteil von 3,0 g unbeweglich gemachtes Enzym wird in eine mit
einem Heizmantel versehene Säule gepackt (Innendurchmesser der Säule 12 mm); mit
einer Raumgeschwindigkeit von 2,3 h 1 wird eine Lösung von 7 w/v% gereinigter Lactose
in 0,02 m Acetatpuffer (pH 4,5) durch die Säule geführt, welche bei einer Temperatur
von 40°C gehalten wird. Durch Analyse der im Effluat enthaltenen Glukose wird eine
100°Óige Spaltung der lactose festgestellt. Sofern eine Lactose-Lösung gleicher
Konzentration 100 Tage lang fortlaufend unter den gleichen Bedingungen durch die
Säule geführt wird, beträgt die Lactosespaltung am 100.Tag immer noch 100%. Das
bedeutet, die Aktivität des unbeweglich gemachten Enzym hat überhaupt nicht abgenommen.
Sofern die angegebene Bestimmung der spezifischen. Aktivität 25mal wie der holt
wird, wobei ungefähr 100 mg unbeweglich gemachtes Enzym eingesetzt werden, beträgt
die Aktivität bei der 25. Bestimmung 4,7 pMol/mgmin, was bedeutet, daß die Aktivität
auch bei dieser absatzweisen Methode nicht abgenommen hat.
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Versuch 2: 1200 mg de in Versuch 1 angegebenen Lactame werden in 60
ml
0,05 m Acetatpuffer-Lösung (pH 5,5) gelöst. In diese Lösung
werden 6g des nach Beispiel 2 erhaltenen CM-substituierten Duorite-A-7 eingebracht;
zum Unbeweglichmachen des Enzyms wird 6 Std. lang bei 20 + 2 0C gehalten, während
die Lösung mit ungefähr 180 U/min gerührt wird. Nach Beendigung der Reaktion wird
das unbeweglich gemachte Enzym analog zu Versuch 1 gewaschen. Aus dem Proteingehalt
der Waschlösung wird ein Anteil von 170 mg/g Harz unbeweglich gemachtes Enzym errechnet.
Entsprechend den Bedingungen nach Versuch 1 wird für das unbeweglich gedachte Enzym
eine spezifische Aktivität von 5,2 Mlol/mgmin ermittelt. Das unbeweglich gemachte
Enzym wird in zwei gleiche Anteile aufgeteilt. Der eine Anteil wird in eine mit
einem Heizmantel versehene Säule (Innendurchmesser 14 mm) gepackt, und die in Versuch
1 angegebene Lösung mit gereinigter Lactose bei einer Raumgeschwindigkeit von 8,0
h-i durch die Säule geführt. Mit diesem unbeweglich gemachten Enzym wird eine 95%ige
Spaltung der Lactose erhalten.
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Die Lactosespaltung wird fortlaufend 30 Tage lang mit der gleichen
Säule durchgeführt. Am 30. Tag wird eine Lactosespaltung von 94% festgestellt. Das
heißt, im Bereich der geringfügigen experimentellen Fehlerquellen hat die Aktivität
des unbeweglich gemachten Enzyms auch nach einer ununterbrochenen Versuchsdauer
von 30 Tagen überhaupt nicht abgenommen.
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Versuch 3: Die andere Hälfte der nach Versuch 2 erhaltenen unbeweglich
gemachten Lactase (das entspricht etwa 3 g Trägermaterial) wird
in
eine mit Heizmantel versehene Säule (Innendurchmesser 14 mm) gepackt. Eine lösung
von 12 w/v,§ gereinigter Lactose in der in Versuch 1 angegebenen Pufferlösung wird
mit einer Raumgeschwindigkeit von 5,0 h-1 fortlaufend 30 Tage lang durch die Kolonne
geführt. Aus dem Glukosegehalt des Effluates wird nach 2-tägiger Versuchsdauer eine
Lactosespaltung von 91#2,5% errechnet, was bedeutet, daß die Aktivität des unbeweglich
gemachten Enzyms praktisch nicht abgenommen hat.
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Versuch 4: 600 mg Lactase aus Aspergillus Oryzae (vertrieben von Shinnihon
Kagaku Kogyo Co., Aktivität des gelösten Enzyms 50,9 pMol/mg . min (bei pH 4,5 und
40°C) gegenüber 13,3 w/vQ/o gereinigter Lactose als Substrat) werden in 30 ml 0,05
m Acetatpuffer-lösung (pH 5,5) gelöst. In diese lösung werden 3,0 g des nach Beispiel
5 erhaltenen CM-substituierten Duorite A-4 eingebracht; zum Unbeweglichmachen hält
man das Gemisch 7 h lang bei ungefähr 200(3 und rührt mit 180 U/min. Nach Beendigung
der Reaktion wird das unbeweglich gemachte Enzym analog zu Versuch 1 gewaschen.
Der Anteil an unbeweglich gemachtem Enzym beträgt 118 mg/g Trägermaterial. Entsprechend
den in Versuch 1 angegebenen Bedingungen wird eine spezifische Aktivität des unbeweglich
gemachten Enzyms von 9,2 µMol/min gemessen. Dieses unbeweglich gemachte Enzym wird
in eine mit Heizmantel versehene Säule (Innendurchmesser etwa 13 mm) gepackt und
die in Versuch 1 angegebene lösung von gereinigter
I;actose bei
einer Raumgeschwindigkeit von 5,3 h 1 fortlaufend 30 Tage lang durch die bei 60QC
gehaltene Säule geführt. Auch nach Ablauf von 30 Tagen wird eine 100einige Lactosespaltung
festgestellt; eine Verringerung der Enzymaktivität wird nicht beobachtet. Die kontinuierliche
Lactosespaltung wird für weitere 20 Tage im wesentlichen unter den gleichen Bedingungen
fortgesetzt; abweichend wird lediglich die Raumgeschwindigkeit auf 8,0 h-i erhöht.
Auch unter diesen Bedingungen wird weiterhin eine 100%ige Spaltung festgestellt.
Das bedeutet auch nach einer kontinuierlichen Versuchsdauer von 50 Tagen ist überhaupt
keine Verminderung der Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms eingetreten.
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Versuch 5: 100 mg handelsüblich erhältliches Papain werden in 30 ml
bei 4°C gehaltener 0,02 m Phosphatpuffer-Lösung (pH 6,2) gelöst.
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In diese Lösung werden 1,0 g nach beispiel 6 erhaltenes CM-substituiertes
Duorite A-4 eingebracht; zur Reaktionhält man 10 h lang bei 4 bis 100C, wobei mit
150 U/min gerührt wird.
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Das Produkt wird sorgfältig mit 0,05 m Phosphatpuffer-Lösung (pH 6,2),
0,1 m wässriger Natriumschlorid-Lösung und im Ionenaustauscher entionisiertes Wasser
in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Waschlösungen werden vereinigt, und nach dem
Lowry-Verfahren der Proteingehalt bestimmt. Aus dem ermittelten Proteingehalt ergibt
sich ein Anteil von 76 mg unbeweglich gemachtes Enzym pro g Trägermaterial. Bei
4OOC und pH 6,2 wird
die spezifische Aktivität des unbeweglich
gemachten Enzyms gegen 0,28 m N-Benzoyl-X-Argininäthylester (BAEE) als Substrat
mit einem bei konstantem pH-Wert arbeitenden Meßgerät (Hiranuma pH-stat sp-11) bestimmt;
es wird eine spezifische Aktivität von 2,7 pMol/mgmin ermittelt, was einer Aktivität
von 35% der spezifischen Aktivität des ursprünglichen, gelösten Enzyms entspricht.
Die oben angegebene Messung der spezifischen Aktivität dieses unbeweglich gemachten
Papains wird 15 mal wiederholt; bei der 15. Messung werden immer noch 98% der ursprünglich
ermittelten Aktivität festgestellt, was bedeutet, daß lediglich eine sehr geringe
Aktivitätsabnahme stattgefunden hat. Die oben angegebenen Messungen der Aktivitäten
des unbeweglich gemachten Enzyms und des gelösten Enzyms erfolgten in Anwesenheit
von 2 x 10 3m Athylendiamintetraessigsäure, 5 ; 10-3m Cystein und 0,1 m Natriumchlorid.
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Versuch .6: 60 mg handelsüblich erhältliches, gereinigtes Trypsin
werden in 15 ml bei ungefähr 40(3 gehaltener 0,05 m Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5)
gelöst. Dieser Lösung werden 1,0 g des nach Beispiel 8 erhaltenen, CM-substituierten
Duorite S-37 zugesetzt; zum Unbeweglichmachen des Enzyms wird bei ungefähr 4°C die
lösung langsam gerührt (ungefähr 60 U/min). Nach 10 h wird das unbeweglich gemachte
Trypsin abfiltriert und gut mit 0,05 m Tris-HCl Pufferlösung, 0,1 m Natriumchloridlösung
und destilliertem Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Waschlösungen
werden
vereinigt und durch Bestimmung der Intensität einer charakteristischen UV-Absorption
der Proteingehalt bestimmt. Aus dem ermittelten Wert ergibt sich, daß 56 mg Enzym
pro g Trägermaterial unbeweglich gemacht worden sind. Die spezifische Aktivität
des unbeweglich gemachten Trypsin wird bei 300C und pH 7,5 in Anwesenheit von 0,02
m Calciumchlorid gegen BAEE als Substrat mit dem genannten Meßgerät bestimmt; es
wird eine spezifische Aktivität von 5,8 juMol/mgmin ermittelt, was 22% der ursprünglichen
Aktivität des gelösten Enzyms entspricht. An etwa 100 mg dieses unbeweglich gemachten
Trypsins werden de Messungen zur Bestimmung der spezifischen Aktivität 5 mal unter
den oben angegebenen Bedingungen wiederholt; bei der 5. Messung wird eine spezifische
Aktivität von 4,6 pMol/mg-min festgestellt.
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Versuch 7: Es wird eine Lösung von 20 ml 0,1 m Phosphatpufferlösung
(pH 6,7) mit 1250 Sumner-Einheiten handelsüblich erhältlicher Urease (vertrieben
von Tokyo Kasei Co.) hergestellt. Dieser Lösung werden 1,0 g des nach Beispiel 9
erhaltenen, CM-substituierten Diaion WA-21 zugesetzt; zum Unbeweglichmachen des
Enzyms wird bei ungefähr t°C 16 h lang gerührt (ungefähr 60 U/min). Anschließend
wird das unbeweglich gemachte Enzym abfiltriert und sorgfältig mit 0,05 m Phosphatpufferlösung
und daraufhin mit destilliertem Wasser gewaschen, bis im Filtrat Protein nicht länger
nachweisbar ist. Aus dem Proteingehalt der Waschwässer wird errechnet, daß 1 g Trägermaterial,
382
Sumner-Einheiten unbeweglich gemachtes Enzym enthalten.
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Zur Bestimmung der Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms wird
die erforderliche Zeitspanne ermittelt, bis eine 0,1 m Phosphatpufferlösung mit
3,0 Gew.-°b Harnstoff bei 200C ihren pH-Wert von 6,7 auf 7,7 ändert; hieraus wird
ermittelt, daß 1 g Trägermaterial eine Enzymaktivität von 412 Sumner-Einheiten aufweist.
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Anmerkung (1): Eine Sumner-Einheit bezieht sich auf diejenige Menge
Enzym, welche im Verlauf von 5 min in einer be 200C und pH 7,0 gehaltenen Phosphatpufferlösung
so viel Harnstoff zersetzt, daß die Lösung 1 mg Ammoniak-Stickstoff enthält.
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Versuch 8: 255 mg aus Streptomyces sp. (vertrieben von Nagase Sangyo
Co.) extrahierte und bis zu einer Aktivität von 36 000 gereinigte Glukoseisomerase
werden in 30 ml 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7,65) gelöst. Dieser Lösung werden
3,0 g des nach Beispiel 1 erhaltenen, CM-substituierten Duorite A-7 zugesetzt.
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Zum Unbeweglichmachen des Enzyms wird 9 h lang bei Raumtemperatur
(ungefähr 180(3) gerührt (ungefähr 120 U/min). Das erhaltene, unbeweglich gemachte
Enzym wird abfiltriert und gut mit 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 7,65) gewaschen.
Aus der Aktivität des Filtrates wird ermittelt, daß 1 g Trägermaterial eine Enzymaktivität
von 9500 Einheiten aufweist, was einem Anteil von 61 mg unbeweglich gemachtem Protein
pro g Trägermaterial entspricht. Die erhaltene unbeweglich gemachte Glukose-Isomerase
wird in eine mit Heizmantel versehene Säule
(Innendurchmesser 12
mm) gepackt, und eine 54 w/v% wässrige Lösung von gereinigter Glukose (pH 7,65,
mit 5 x 10'3m MgSO4x x 7H20) wird mit einer Raumgeschwindigkeit von 2,0 hl1 durch
die bei 600C gehaltene Säule geführt, wobei die Isomerisierung der Glukose stattfindet.
Etwa 500 Std. nach Aufnahme der Isomerisierung wird immer noch ein Umwandlungsgrad
von 50 bis 51% erhalten; bei fortschreitender Versuchsdauer nimmt dieser Umwandlungsgrad
schrittweise ab.
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Anmerkung (2): Eine Einheit der Glukose-Isomerase bezeichnet diejenige
Enzymmenge, welche in 0,05 m Phosphatpufferlösung mit 0,005 m MgSO4x7H20 und mit
0,1 m D-Glukoselösung als Substrat bei 700C und pH 7,0 innerhalb 1 h 1 mg Fructose
erzeugt.
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Anmerkung (3): Die Bestimmung der Fructose erfolgt nach dem Cystein-Carbazol-Schwefelsäure-Verfahren,
wie es in JAS beschrieben ist.
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Versuch 9: 200 mg Pullulanase aus Aerobacter Aerogenes (vertrieben
von Nagase Sangyo Co.) werden in 30 ml 0,02 m Acetatpufferlösung (pH 5,0) gelöst.
Der Lösung werden 3 g des nach Beispiel 9 erhaltenen CM-substituierten Diaion WA-21
zugesetzt. Zum Unbeweglichmachen des Enzyms wird bei ungefähr 10°C 16 h lang langsam
gerührt. Das unbeweglich gemachte Enzym wird abfiltriertlund
aus
der Aktivität der vereinigten Waschwässer wird ein Gehalt von 43 mg Enzym pro g
Trägermaterial ermittelt. Das gesamte unbeweglich gemachte Enzym wird in eine mit
Heizmantel versehene Säule (Innendurchmesser 12 mm) gepackt1 und eine 1,0%ige Lösung
von gereinigtem Pullulan (pH 5,0) wird 10 Tage lang mit einer Raumgeschwindigkeit
von 1 -1 kontinuierlich durch die bei 400G gehaltene Säule geführt. Mittels dem
Somogyi-Nelson-Verfahren wird der Gehalt an Maltotriose in dem Effluat bestimmt;
hierbei wird festgestellt, daß im Verlauf der 10 Tage die Umwandlung in Maltotrioee
unverändert 95 + 4% beträgt.
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Versuch 10: Analog zu Versuch 1 werden 600 mg der dort verwendeten
Lactame an 3,0 g des nach Beispiel 11 erhaltenen, CM-substituierten Diaion WA-20
unbeweglich gemacht. Das unbeweglich gemachte Enzym wird abfiltriert, und aus dem
Proteingehalt der Waschlösungen wird ein Anteil von 98 mg unbeweglich gemachtes
Enzym pro g Trägermaterial errechnet. Unter den in Versuch 1 angegebenen Bedingungen
wird eine spezifische Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms von 4,5 /uMol/mgsmin
ermittelt. An ungefähr 100 mg dieser unbeweglich gemachten Lactase wird die Messung
der spezifischen Aktivität 15-mal wiederholt, wobei zu jeder Messung eine neue Lactose-Lösung
eingesetzt wird; bei der 15. Messung wird eine Aktivität von 3,5 pMol/mgemin ermittelt.
Daraus ist ersichtlich, daß das nach Beispiel 11 erhaltene Trägermaterial hinsichtlich
der Stabilität des unbeweglich
gemachten Enzyms bei der Anwendung
etwas schlechter ist, als diejenige des nach Beispiel 1 erhaltenen Trägermaterials.
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Einer der Gründe hierfür kann darin liegen, dß bei dem Material nach
Beispiel 11 weniger CM-Gruppen eingeführt worden sind. Andererseits ist ersichtlich,
daß an dem nach Beispiel 11 erhaltenen Trägermaterial unbeweglich gemachte Enzyme
eine größere Stabilität (d.h. eine längere Lebensdauer) aufweisen, als das Produkt
des nachfolgenden Vergleichsversuchs.
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Vergleichsversuch: Im wesentlichen wird der Versuch 10 wiederholt;
abweichend davon wird ein schwach basisches makroporöses ionenaustauschende3 Harz,
nämlich Diaion WA-20 als Trägermaterial eingesetzt, da die aus Aspergillus Oryzae
gewonnene Lactase ein saures Protein darstellt. Nach den üblichen Verfahren wird
ein Gehalt von 79 mg unbeweglich gemachtes Enzym pro g Trägermaterial festgestellt.
Die spezifische Aktivität des unbeweglich gemachten Enzyms beträgt 3,6 fMol/mgmin.
Die Messung der spezifischen Aktivität wird 10 mal wiederholt; hierbei ist die spezifische
Aktivität bereits bei der 5. Messung auf 1,4 jiMol/mg.min abgefallen; bei der 10.
Messung wird lediglich noch eine spezifische Aktivität von 0,3 iMol/mg.min festgestellt.
Hieraus ist ersichtlich, daß nach diesem Vergleichsversuch ein beständiges, unbeweglich
gemachtes Enzym, das den Anforderungen bei der industriellen Anwendung standhält,
nicht erhalten wird.
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Versuch 11: 2,0 g des nach Beispiel 6 erhaltenen, CM-substituierten
Duorite A-4 werden in 20 ml 1 n Natriumhydroxid-Lösung eingebracht. Die Lösung wird
bei 40(3 15 min lang entgast und anschließend die überschüssige Alkalilauge durch
Filtration entfernt. Das zurückbleibende Harz wird in 25 ml bei Raumtemperatur (ungefähr
200(3) gehaltenes Dioxan eingebracht und etwa 5 min lang gerührt; anschließend werden
eine vorher zubereitete Lösung von 4 g Cyanurchlorid in 20 ml Dioxan zugesetzt und
dadaraufhin bei Raumtemperatur heftig gerührt. Nach Ablauf von 3 min werden 25 ml
kaltes Wasser zugesetzt und nach weiteren 5 sec werden 25 ml Esssigsäure zugesetzt,
um die Reaktion abzubrechen.
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Das Reaktionsprodukt wird filtriert, und das Harz unmittelbar anschließend
mit kaltem Wasser und kaltem Aceton gewaschen. Daraufhin wird das Harzen 30 ml 0,05
m Phosphatpufferlösung (pH 7,8) eingebracht, welche 220 mg handelsüblich erhältliche
Pronase E aus Streptomyces Griseus enthäl. Die Lösung wird bei ungefähr 4°C und
pH 7,8 (was durch Zugabe von 0,2 n Natriumhydroxid-lösung gewährleistet wird) 5
h lang gehalten. Anschliessend wird das unbeweglich gemachte Enzym abfiltriert und
sorgfältig mit eiskalter 1 m Natriumchlorid-Lösung, 0,1 m Phosphatpuffer-lösung
und eiskaltem Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen, bis in der Waschlösung Protein
nicht länger nachweisbar ist. Es wird ein Enzymgehalt von 86 mg unbeweglich gemachtem
Enzym pro g Trägermaterial ermittelt. Die spezifische Aktivität des unbeweglich
gemachten Enzyms beträgt bei 400C und pH 6,0
gegen eine 20,0ige
DL-Lysinmethylester-Lösung als Substrat 2,7 JiMol/mg.min.
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Anschließend wird die Bestimmung der speziIischen Aktivität bei 400C
und pH 6,0 mit 10 ml 1obiger L-Lysinmethylester-Lösung als Substrat wiederholt.
Die Versuchs dauer pro Versuch wird auf 40 min festgesetzt, und das Fortschreiten
der Reaktion mittels einem bei konstantem pH-Wert arbeitendem Meßgerät bestimmt.
Auf diese Weise wird die Bestimmung der spezifischen Aktivität so lange wiederholt,
bis die Reaktion auf den halben Wert der ersten Reaktion abgenommen hat. Die dabei
ermittelte Anzahl von Versuchen wird als "Halbwertszahl" bezeichnet. Für dieses
unbeweglich gemachte Enzym beträgt die Halbwertszahl 83.
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Versuch 12: 2 g des nach Beispiel 2 erhaltenen, CM-substituierten
Duorite A-7 werden in Methanol eingebracht, mittels gasförmigem Chlorwasserstoff
in den Methylester umgewandelt, daraufhin mit Hydrazinhydrat zum Hydrazid umgesetzt
und schließlich mit zeiger Natriumnitritlösung das Azid gebildet. Unmittelbar anschliessend
wird das erhaltene Produkt in 20 ml Phosphatpufferlösung eingebracht, welche 1000
Sumner-Einheiten kommerziell erhältliche Urease (vertrieben von Tokyo Kasei Co.)
enthält. Zum Unbeweglichmachen des Enzyms wird unter leichtem Rühren 16 h lang bei
ungefähr 40C gehalten. Daraufhin wird das unbeweglich gemachte
Enzym
mit 5 m Natriumchloridlösung, 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 6,7) und entionisiertem
Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Mittels colorimetrischer Messung bei 200C
gegen eine 3,0%ige Harnstofflösung als Substrat wird für die spezifische Aktivität
des unbeweglich gemachten Enzyms eine Aktivität von 290 Sumner-Einheiten pro g Trägermaterial
ermittelt. Diese Messung wird 10 mal wiederholt, wobei kaum eine Abnahme der Aktivität
festgestellt werden konnte.
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Versuch 13: 2,0 g des nach Beispiel 4 erhaltenen, amphoter ionisierten
Duorite S-30 werden in 20 ml Dioxanlösung eingebracht, welche 25 g Bramessigsäure
enthält; anschließend wird bei Rauntemperatur 8 h lang langsam gerührt. Daraufhin
werden tropfenweise 17 ml Bromacetylbromid zugesetzt und nochmals 6 h lang gerührt.
Nach Beendigung der Reaktion wird das erhaltene Bromacetylierte Harz mit eiskalter
0,1 m Natriumcarbonatlösung und daraufhin mit eiskaltem Wasser gewaschen. Das erhaltene
Harz wird in 0,2 m Phosphatpufferlösung (pH 8,5) eingebracht, welche 100 mg Aminoacylase
(vertrieben von Amano Seiyaku Co., die Aminoacylase weist eine Aktivität von 15
000 Einheiten/g auf); zum Unbeweglichmachen des Enzyms wird unt.er langsamem Rühren
18 h lang bei ungefähr 40C gehalten. Das erhaltene unbeweglich gemachte Enzym wird
wiederholt gewaschen. Bei 37OC gegen 0,2 m N-Acetyl-DL-Methioninlösung (pH 7,0,
mit 1x10 4 Mol CoC12) als Substrat wird aus dem Anteil an gebildetem
D-Methionin
eine spezifische Aktivität von 270 Einheiten pro g Trägermaterial ermittelt. Das
gesamte unbewehrlich gemachte Enzym wird in eine mit Heizmantel versehene Säule
(Innendurchmesser 10 mm) gebracht und die gleiche N-Acetyl-DL-Methionin-Lösung wird
mit einer Raumgeschwindigkeit von 1,1 h-1 kontinuierlich durch die bei 40°C gehaltene
Säule geführt Nach Ablauf eines Tages beträgt das Ausmaß der Hydrolyse des L-Isomeren
993; nach Ablauf von 10 Tagen war im wesentlichen keine Alnahre der Enzymaktivität
festzustellen.