DE2219063C3

DE2219063C3 - Verfahren zur Herstellung einer enzymatisch aktiven Membran, nach diesem Verfahren hergestellte Membran und deren Verwendung für enzym-katalysierte Substratumwandlungen

Info

Publication number: DE2219063C3
Application number: DE2219063A
Authority: DE
Inventors: Shaw S. North Brunswick N.J. Wang
Original assignee: Research Corp
Current assignee: Research Corp
Priority date: 1971-04-20
Filing date: 1972-04-19
Publication date: 1982-03-11
Also published as: JPS5218273B1; SE402110B; DE2219063B2; IT953717B; PH10143A; NL164321B; DK135950B; GB1385585A; US3843446A; DK135950C; CA1008005A; NL7205308A; NL164321C; IL39228A0; IL39228A; DE2219063A1; CH575432A5

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung jo einer enzymatisch aktiven Membran durch Inberührungbringen eimer Proteinmembran mit der wäßrigen Lösung eines Enzyms sowie eine nach diesem Verfahren hergestellte enzymatisch aktive Membran.

Enzyme sind Proteinkatalysatoren, welche sich für eine Vielfalt von industriellen und wissenschaftlichen Anwendungen eignen und insbesondere in der pharmazeutischen Industrie, der Papierindustrie und der Textilindustrie oder dergleichen. Ihre Wirksamkeit ist hoch spezifisch und sie führen im allgemeinen nicht zu *o wesentlichen Mengen von unerwünschten Nebenprodukten. Enzymreaktionen sind industriell vorteilhaft, da sie keine großen Investitionen hinsichtlich Wärmeübertragungseinrichtungen erfordern und leicht mehrstufig durchführbar sind. Daher werden die mit der Abtrennung von Zwischenprodukten verbundenen Probleme auf ein Minimum reduziert.

Bei enzymatischen Reaktionen bereitet jedoch die Abtrennung und die Wiedergewinnung des Enzymmaterials große Schwierigkeiten.

Bei den meisten industriell verwendeten Verfahren wird die enzymatische Reaktion durch einfaches Vermischen des Enzyms mit dem Substrat durchgeführt, worauf das Enzym inaktiviert und/oder zurückgewonnen wird. Eine solche Verfahrensweise ist jedoch oft für das Produkt schädlich und führt zu einem unumgänglichen Verlust großer Mengen des Enzyms, da das Enzym gewöhnlich nicht zurückgewonnen wird oder bei einer Zurückgewinnung nur in geringen Ausbeulen anfällt.

Ein weiteres Problem besteht darin, daß die Enzyme gewöhnlich in wäßriger dispergierter Form vorliegen. Demzufolge haben Enzyme, welche in dieser Form aufbewahrt werden, eine begrenzte Lebensdauer oder Lagerfähigkeit. Dies ist insbesondere der Fall, wenn sie in verdünnter Form gelagert werden. Sie verlieren rasch « ihre Aktivität.

Zur Überwindung dieses Problems wurde ein Verfahren entwickelt, um die Enzyme zu immobilisieren.

d, h. an einem inerten unlöslichen Träger zu binden. Nach Beendigung der enzymatischen Reaktion kann das unlösliche Enzym-Material von dem nicht umgesetzten Substrat und von dem Produkt durch herkömmliche Techniken, wie z. B. durch Ultrafiltration oder dergleichen abgetrennt werden.

Die Auswahl eines geeigneten inerten Trägers bereitete jedoch Schwierigkeiten. Der Träger muß nicht nur inert gegenüber dem Enzym sein, er muß vielmehr auch auf die katalytische Aktivität des Enzyms keinen hemmenden Einfluß haben, noch zu unerwünschter unspezifischer Adsorption führen. Darüber hinaus sollte das Trägermaterial zu einem Minimum an sterischer Hinderung in bezug auf die Enzym-Substratreaktion führen. Es wurde bereits eine große Vielfalt von Trägermaterialien vorgeschlagen, je nach der speziellen Enzymreaktion und je nach dem spezie'Jen Enzym. Solche herkömmlich verwendeten Trägermaterialien umfassen z. B. synthetische Polymere, wie Polyamide, Cellulose-Derivate, verschiedene Tone und Ionen-Austausch-Harz, insbesondere DEAE-Cellulose und DEAE-Dextrane, siehe Suzuki et aL, Agr. Biol. Chem, Band 30. Nr.8, Seiten 807-812 (1966). Bekannte Arten der Immobilisierung von Enzymen umfassen z. B. die direkte kovalente Bindung, die indirekte Bindung durch eine Brücken-Verbindung, die Vernetzung des Enzyms oder das Einschließen des Enzyms im Polymergitter.

Die DE-OS 19 15 970 beschreibt z. B. die chemische Bindung eines Enzyms an ein Trägersubstrat, z. B. an Kollagen durch Brücken-Verbindungen. Bei dem dabei angewandten Verfahren kommt es zu Beginn zu einer adsorptiven Bindung des Enzyms an die Kollagenmembran. Diese adsorptive Bindung ist jedoch äußerst lose, so daß das Enzym leicht ausgewaschen werden kann. Aus diesem Grunde ist es bei dem bekannten Verfahren erforderlich, eine kovalente Bindung des Enzyms durch Brücken-Verbindungen herbeizuführen. Durch diese Maßnahme wird jedoch die Aktivität des Enzyms erheblich beeinträchtigt.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer enzymatisch aktiven Membran zu schaffen, welches einerseits zu einer festen Bindung zwischen Membran und Enzym führt und andererseits die enzymatische Aktivität des Enzyms im wesentlichen nicht beeinträchtigt, sowie eine nach diesem Verfahren hergestellte enzymatisch aktive Membran.

Ferner sollen die erstrebten Membranen zum Einsatz bei enzym-katalysierten Substraturr.'yandlungen geeignet sein.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemßß dadurch gelöst, daß man eine Kollagen-, Zein-, Casein-, Ovalbumin-, Weizengluten-, Fibrinogen-, Myosin-, Mucoprotein-, Polyglutamat-, Polyaspargat·, Po'.yphenyalanin-, Polytyrosin- oder Leucjn-p-Aminophenylalanin-Copolymer-Membran mit einem pH von 2—12 bis zur maximalen Quellungskapazität quillt und daß man die gequollene Membran in eine wäßrige Lösung des Enzyms mit einem pH zwischen dem isoelektrischen Punkt der Membran und dem isoelektrischen Punkt des Enzyms eintaucht.

Das erfindungsgemäße Verfahren führt überraschenderweise zu einer äußerst stabilen Bindung des Enzyms an die Kollagen-Membran und selbst bei längerem Auswaschen mit einer Salzlösung wird das Enzym nicht von der Membran getrennt.

Der Komplexierungsmechanismus zwischen den Enzymen einerseits und den Proleinmembranen an-

dererseits umfaßt die Ausbildung von mehrfachen Wasserstoffbindungen, von Salzbindungen und von van der Waals-Weehselwirkungen, Die Komplexbildung verläuft besonders leicht bei einem pH-Wert zwischen dem isoelektrischen Punkt des Enzyms und dem ϊ isoelektrischen Punkt der Proteinmembran.

Die Auswahl eines speziellen synthetischen Polypeptids oder eines speziellen Naturproteins aus den im Anspruch 1 genannten in modifizierter oder unmodifizierter Form hängt unter anderem von der Natur des zu w komplexierenden Enzyms ab, sowie von der Natur des umzusetzenden Substrats und von den Reaktionsbedingungen. Kollagen und Zein sind bevorzugte Naturproteine, da sie gegenüber einer großen Zahl von Enzymen inert sind. Die folgende Beschreibung bezieht sich in der ι > Hauptsache auf Kollagen und Zein.

Ein Kollagenfilm kann in herkömmlicher Weise durch Gießen einer Kollagendispersion hergestellt werden. Sodann wird dieser Film bis zur maximalen Quellurigskapazität gequoilen, mit Wasser gewaschen und in eine Enzymlösung eingetaucht Es wird gekühlt gelagert, um dem Enzym Gelegenheit zu geben, in die Kollagenmembran einzudiffundieren. Der Film kann sodann auf eine Basis aufgebracht werden, wie z. B. auf einen Celluloseacetatfilm. Schließlich wird der RIm getrocknet. Koliagen ist ein Hydroxyprolin-Glycin-Protein. Es bildet den organischen Hauptbestandteil von tierischem Bindegewebe und von Knochen. Chemisch unterscheidet sich Kollagen von anderen Proteinen durch einen ungewöhnlich hohen Glycin-Gehalt Etwa '/3 der Amino- m säurereste im Kollagen besteht aus Glycin. Ferner hat Kollagen einen hohen Gehalt an Prelin und Hydroxyprolin. Hinsichtrich seines Gehahes an Hydroxyglycin nimmt das Kollagen unier den Proteinen eine Sonderstellung ein. Der Gehalt Jes Kollagens an r> aromatischen und schwefelhaltigen Aminosäuren ist bemerkenswert gering. Das Kollagen kann in guten Ausbeuten aus Körperteilen von einer großen Vielzahl von Säugetieren und Fischen gewonnen werden. Häufig wird Kollagen aus Schweinesehnen, Schafsehnen und -to Rindersehnen gewonneil, sowie aus Schweinehaut, aus Gerbereiabfällen, wie z. B. aus nicht für die Ledergewinnung verwendbaren Kalbsfellen, sowie aus Ossein, welches aus Rinderknochen durch Säurebehandlung unter Entfernung des Kalziumphosphats und anschließende Trocknung erhalten wird.

Eine andere brauchbare Methode zur Herstellung einer Kollagen-Membran besteht aus folgenden Schritten: Die Kollagenquelle wird zunächst mit einer Enzymlösung behandelt, um das Elastin aufzulösen, welches die Kollagenfasern umgibt und verbindet. Für diesen Zweck kommen z. B. proteolytische Enzyme aus pflanzlichen oder tierischen Quellen in Frage. Daneben eignen sich jedoch auch andere Enzyme. Sodann wird die Kollagenquelle mit Wasser gewaschen und die löslichen Proteine und Lipoide werden durch Behandlung mit einer verdünnten wäßrigen Lösung eines Chelatisierungsmittels, wie z. B. des Tetranatriumsalzes der Äthylsndiamin-tetraessigsäure, entfernt. Sodann werden die Kollagenfasern in einer geeigneten Säure, wie z. B. in Cyanessigsäure, gequollen, wobei sich eine Kollagenfaserdispersion ausbildet (Hochstadt, et al., US-PS 29 20 000). Diese Dispersion kann sodann in eine geeignete Membranform gegossen oder extrudiert werden. Die getrocknete KoHagenmembran wird sodann während 48 h bei 6O⁰C und 95% relativer Feuchtigkeit nachbehandelt oder fixiert oder gehärtet.

Ferner können geeignete Membranen gemäß GB-PS 11 53 55| durch elektrische Abscheidung des Kollagens aus der Kollagenfaserdispersion gewonnen werden. Neben den genannten Methoden der Herstellung von Kollagenmembranen eignen sich natürlich auch alle anderen bekannten Techniken zur Herstellung solcher Membranen, Vorzugsweise haben die erfindungsgemäß verwendeten Kollagenmembranen eine Dicke von 0,005 mm bis 0,1 mm und insbesondere von 0,01 mm bis 0,05 mm. Wenn die Membrandicke geringer als 0,005 mm ist, so hat die Membran keine genügende Festigkeit Ferner ist es möglich, daß sich bei diesen geringen Dicken kein vollständiger zusammenhängender Film ohne Poren, Löcher oder andere strukturelle Defekte ausbildet. Wenn die Dicke 0,1 mm übersteigt, so. sieigen die Kosten unnötig an, ohne daß die Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Membran noch erheblich ansteigt Natürlich ist die erfindungsgemäße Membran auch noch bei größeren Dicken voll" funktionsfähig.

Für spezielle Zwecke können die Membranen noch andere Stoffe enthalten. Weichmacher können verwendet werden, um die molekulare Struktur der Membran zu modifizieren. Hierdurch wird eine Kettenverschiebung und damit eine größere Elastizität bewirkt Durch Zusetzung von Anfeuchtungsmitteln oder Befeuchtungsmitteln kann die Wasseraufnahmekapazität günstig beeinflußt werden Durch Zugabe von Vernetzungsmitteln, durch Wärmefixierung oder durch Gerbung, z. B. durch Chromgerbung oder durch Formaldehydgerbung nach herkömmlichen Verfahren, kann eine Hydrolyse vermieden werden. Ferner können auf diese Weise zusätzliche Bindungsstellen für das Enzym gebildet werden, so daß auf diese Weise die Enzymabsorption verbessert wird.

Sodann wird die KoHagenmembran für die Komplexierung mit dem Enzym vorbereitet Dies geschieht im allgemeinen durch Quellen mit einer organischen Säure, welche ein niedriges Molekulargewicht hat oder in einigen Fällen durch Quellen nit einer geeigneten Base, so daß der pH-Wert im Bereich von etwa 2 bis 12 liegt. Geeignete Säuren umfassen z. B. Milchsäure und Cyanessigsäure. Fails erwünscht, können Weichmacher oder andere oben genannte Zusätze während der Quellstufe zugesetzt werden. Die Quellung wird durchgeführt, indem die Membran während'/2 bis 1 h,je nach den speziellen Badbedingungen, im allgemeinen bei Zimmertemperatur in das Quellungsbad eingetaucht wird. Wenn zu lange gequollen wird, so besteht die Gefahr, daß das Kollagen in lösliche Gelatine umgewandelt wird. Die Membran wird auf Grund der Acidität der organischen Säure und auf Grund der Weichmacherwirkung der organischen Säure gequollen. Weitere Zusätze sind nicht erforderlich. Auf Grund der Säurebehandlung kommt eine Veränderung der Wasseraufnahmefähigkeit zustande. Nach der Quellungsbehandlung wird die gequollene KoHagenmembran sorgfältig mit Wasser gewaschen bis der pH-Wert der Membran innerhalb eines Bereiches liegt, in dem das jeweilige Enzym gemäß den kennzeichengemäßen Maßnahmen an die Membran komplex gebunden werden kann.

Sodann wird die gequollene und gespülte Membran in eine wäßrige Enzymlösung eingetaucht bis die Komplexierung der Membran mit dem Enzym gemäß den kennzeichengemäßen Maßnahmen beendet ist. Gewöhnlich nimmt diese Stufe etwa 10 h bis 2 Tage in Anspruch. Während dieser Zeitdauer sollte die Temperatur bei 4⁰C bis 20⁰C, je nach dem speziellen

angewandten Enzym, gehalten werden. Nach dem Waschen wird die maximale Enzymaufnahme durch Aktivitätsmessung bestimmt. Diese Messung zeigt an, ob die Komplexierung beendet ist. Der Enzym-Kollagen-KompIex sollte sorgfältig getrocknet werden, ■ vorzugsweise etwa bei Zimmertemperatur oder bei einer niedrigeren Temperatur, so daß das komplex gebundene Enzym nicht zerstört oder beschädigt wird.

Im folgenden sei ein zweites Beispiel für die Herstellung eines Enzym-Komplexes mit einem natürli- ι» chen Protein beschrieben. Ein Zeinfilm wird hergestellt, indem man eine Zeinlösuing in herkömmlicher Weise zu einem RIm gießt. Es wird das gleiche Verfahren wie bei der Herstellung des Kollagenfilms angewandt, außer daß bei der Quellung des Zeinfilms Weichmacher als r> Quellungshilfen zugesetzt werden, wie z. B. 1,5-Pentandioi.

Zein ist das Prolamin (alkohoMösliches Protein) der Maiskörner. Es ist das einzige im Handel erhältliche Prolamin und eines der wenigen leicht zugänglichen m Pflanzenproteine. Zein findet sich in erster Linie im Endosperm des Maiskorns. Die Menge an dlkohol-löslichem Protein steht in direkter Beziehung zum Gesamtproteingehalt im Endosperm. Der Zeingehalt liegt bei 2,2 bis 10,4%, bezogen auf die Trockensubstanz r> von verschiedenen Maisproben.

Zein zeichnet sich im Vergleich zu den meisten anderen Proteinen durch einen relativ geringen Gehalt an hydrophilen Gruppen aus. Der hohe Anteil an nicht-polaren Seitenketten (Kohlenwasserstoffgruppen) jo und Säureamid-Seitenketten bewirkt die Löslichkeit des Zeins in organischen Lösungsmitteln, weshalb das Zein als Prolamin klassifiziert wird.

Ein im Handel erhältliches Zein ist Argo-Zein G-200, hergestellt durch Corn Products Refining Company, r> Argo, Illinois. Die Filmgießlösungen können auf der Basis von reinen Komponenten hergestellt werden, wobei man den Wassergehalt des Rohzeins und der anderen Komponenten berücksichtigen muß. Die Gießlösungen werden durch Auflösung des Proteins in dem ausgewählten organischen Lösungsmittel unter leichter Rührung bei Zimmertemperatur während 1 bis 2 h hergestellt. Während dieser Zeitdauer findet eine vollständige Auflösung statt. Im folgenden werden einige Beispiele geeigneter Lösungsmittel genannt: 81% (Gewicht/Gewicht) Isopropylalkohol und 4% Äthylenglycol-monoäthyl-äther. Die klaren Lösungen, welche 20 bis 30 Gewichtsprozent trockenes Zein enthalten, haben eine Bernsteinfärbung. Härtungsmittel, wie z. B. Formaldehyd, und Weichmacher können kurz vor dem Gießen des Films zugesetzt werden. Natürlich kann jede beliebige herkömmliche Methode zur Herstellung von Zeinmembranen angewandt werden.

Erfindungsgemäß eignen sich insbesondere Zeinmembranen mit einer Dicke von 0,005 mm bis 0.1 mm. Sodann wird die Zeinmembran für die Komplexierung mit dem Enzym vorbereitet. Dies geschieht durch Quellung mit einem Weichmacher, fails beim Filmgießen kein Weichmacher zugesetzt wurde. Geeignete Weichmacher sind 1,5-Pentan-diol, Glycerin und Sorbit. Dies geschieht durch Eintauchen der Membran in ein Bad von 2% (Gewicht/Gewicht) des Weichmachers in Wasser während 10 h bei Zimmertemperatur. Sodann wird die gequollene Membran mit Seidenpapier getrocknet und in eine wäßrige Enzymlösung einge· i>5 taucht, bis die Komplexierung gemäß den kennzeich nenden Maßnahmen beendet ist. Gewöhnlich bedarf es hierzu einer Zeitdauer von 10 h bis 2 Tagen.

40

45

50 Dabei sollte dje Temperatur in einem Bereich von 4 C bis 20°Γ, je nach dem eingesetzten Enzym gehalten werden. Der Enzym-Zein-Komplex sollte sorgfältig getrocknet werden, vorzugsweise etwa bei Zimmertemperatur oder bei einer niedrigen Temperatur, so daß das komplex gebundene Enzym nicht zerstört wird.

Für die Komplexierung mit Naturproteinen, wie z. B. mit Kollagen, oder Zein oder dergleichen, eignen sich viele verschiedene Proteine je nach der speziellen Anwendung. Im folgenden sei eine Auswahl der geeigneten Enzyme aufgezählt:

Amylasen, Lysozym, Invertase, Urease, Cellulasen, Brenzkatechin-methyltransferase,
Saccharose-6-glucosyl-transferase,
Carboxyl-Esterase, Aryl-Esterase, Lipase,
Pektinesterase, Glucoamylase,
Amylopektin-1,6-glucosidase,
Oligo-l.e-glucosidase.Polygalacturonase,
a-GJucosidase^-Glucosidase.ji-Galactosidase,
Glucose-Oxydase, Galactose-Γ >;ydase,
Brenzkatechin-Oxydase, Kataiä-'-e, Peroxydase» Lipoxydase, Glucose-Isomerase, Pentosanase,
Cellobiase, Xylose-isomerase, Sulfit-oxydase,
Äthanolamin-oxydase, Peniciflinase,
Carbonanhydrase, Gluconolactonase.
3-Ketosteroid-4'-dehydrogenase,
11-/?-Hydroxylase und Aminsosäureacylasen.
Es können auch verträgliche Kombinationen von Enzymen und Multienzymsysteme an das. Kollagen komplex gebunden werden.

Insbesondere geeignet sind Lysozym, Invertase, Urease und Amylasen. Lysozym hat verbreitete Anwendung zur Hydrolyse von Mikroorganismen in der pharmazeutischen Forschung gefunden, sowie bei der Abwässerbehandlung. Es wird entweder altein oder in Kombination mit anderen Enzymen angewandt. Eine besonders wichtige Anwendung des Lysozym-Proteinmembrankomplexesist die Lysis von Zellen.

Invertase oder ß-D-Fructofuranosidase findet in der Nahrungsmittel- und Getränkeindustrie sowie in der Analyse Anwendung. Invertase kann dazu verwendet werden, die Hydrolyse von Saccharose zu Glucose und Fructose oder die Inversion von Zucker zu katalysieren. Invertase ist bei der Hydrolyse von 0-D-Fructofuranesylbindungen in Saccharose, Raffinose, Gentianose und Methyl- und /?-Fructofructose wirksam. Eine besonders wichtige Anwendung des Invertase-Proteinmembrankomplexes ist die kontinuierliche Hydrolyse von Saccharose.

Urease ist ein hoch spezifisches Enzym, welches die Umwandlung von Harnstoff in Ammoniumcarbonat katalysiert. Urease wird oft dazu verwendet, den Harnrtoffgehalt in Urinproben zu bestimmen. Wegen dieser hoch spezifischen Wirksamkeit kann man die erfindungsgemäße Urease-ProteinkompliXinembran in künstlichen Nieren anwenden. Darüber hinaus können Urease-Proteinkomplexmembranen für die wiederholte Hydrolyse von Harnstoff verwendet werden, wie z. R. für die Behandlung von menschlichem Urin oder dergleichen.

Λ-Amylase wird als »verflüssigendes Enzym« bezeichnet. Es hydrolysiert allgemein Stürke, Glykogen und Dextrane, /?-Amylase dient zur Erzeugung von Maltose aus Zucker, Glykogen und Dextran. Andere geeignete AmylasÄi sind Λ-Glucosidase, Amyloglucosidase, Amylo-1,6-«-glucosidase (Enzym zur Entfernung von Verzweigungen), Oligo-1,6-glucosidase (Limi(-Dex-Irinasc). Isomaltase und Isotriase. Der Ausdruck

»Amyliisc« bezieht sich somit auf eines oder mehrere dieser und anderer Amylasen. Eine besonders wichtige Anwendung des Amylase-Protcinkomplexes gemäß vorliegender Erfindung ist die kontinuierliche Hydrolyse von Stärke durch kontinuierliches Überleiten eines Stärkesubstrats über die enzymatisch aktive Membran.

Mehrere Enzyme können gleichzeitig komplex an die Proteinmembran gebunden werden. Es ist z. B. erwünscht, rt-Amylase zusammen mit anderen Enzymen komplex zu binden, da Λ-Amylase das Stärkemolekül in unspezifischer Weise spaltet, so daß reaktive Stellen für andere spezifischere Enzyme gebildet werden.

Die auf diese Weise gebildeten immobilisierten Komplexe haben eine hohe cnzymalischc Aktivität. Wenn ein enzymatisch aktives Substrat mit diesen Komplexen in Berührung gebracht wird, so verbleibt während der gesamten Reaktionsdauer eine konstante Menge des Enzyms am Trägermaterial, so daß eine uc5üfiu£rc Abtrennung wie bei iicrkoiTiFiuiCnci'i Vci'riiiiren nicht erforderlich ist. Ferner wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Enzym-Proteinkomplexe auch bei langen Lagerungszeiten stabil sind und daß sie wiederholt ausgewaschen werden können, ohne daß es zu einem wesentlichen Verlust der enzymatischen Aktivität kommt.

Die Art der komplexen Bindung des Enzyms an die Proteinmembran ist nicht bekannt. Es wird jedoch angenommen, daß der Komplexicrungsmechanismus zwischen der Proteinmembran oder dem filmähnlichen Proteinträger einerseits und dem Enzym andererseits die Bildung einer Vielzahl von Wasserstoffbindungen, sowie von Salzbindungen und von van der Waals-Wechselwirkungen umfaßt. Die Komplexbildung geht besonders leicht bei einem pH-Wert zwischen dem isoeleklrischen Punkt des Enzyms und der Proteinmembran vonstatten. Es muß betont werden, daß die Herstellungen von Membranen, z. B. aus Kollagenfilmen oder dergleichen, dem Fachmann wohl bekannt sind. So ist das US-Patent 29 20 000. welches oben erwähnt wunde, eine unter vielen Veröffentlichungen, welche die Herstellung von Kollagenfilmen und -Membranen betreffen.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

In allen Beispielen wurden die Membranen bis zur maximalen Quellungskapazität gequollen.

Beispiel 1 (Lysozym)

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung und die Verwendung eines Lysozym-Kollagen-Membrankoimplexes.

1 cm³ eines 0.025 mm dicken Kollagen-Films (während 48 h bei 55= C und bei 90% relativer Feuchtigkeit nacherhitzt) wurde in einer Milchsäurelösung (pH = 3) gequollen und sodann 5 min in fließendem Leitungswasser gewaschen. Sodann wurde der gewaschene Film in eine Enzym-Lösung von 250 mg Lysozym in 15 cm³ -Wasser eingetaucht und bei 2"C während 14 h so belassen. Sodann wurde der behandelte Film auf Celluloseacetat aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet. Auf diese Weise erhielt man eine Lysozym-Kollagen Komplexmerr.bran.

Eine Lösung von Mikrococcus-iysodeictikus (300 mg getrockneter Zellen pro Liter) wurde dazu verwendet die enzymaiische Aktivität des Komplexes zu bestimmen Dabei wurde die Abnahme der optischen Dichte der Bakterieniös-jng bei 450 nrn gemessen. Der getrocknete Membrankomplex wurde zunächst mit 10 I fließendem Wasser gewaschen und seine anfängliche enzymatische Aktivität wurde gemessen. Diese Bestimmung erfolgte auf der Basis der Abnahme der optischen ■> Dichte nach einer Reaktionsdauer von 30 min. dividiert durch die anfängliche optische Dichte. Der Komplex wurde zwischen den einzelnen Experimenten mit 2 I Wasser gewaschen. Die anfängliche Aktivität betrug 0,538. entsprechend einer Auflösung von 53,8% der

ι» Zellen. Die zweite Wiederholung ergab eine Aktivität von 0.420. entsprechend einer Auflösung von 42%; die dritte Wiederholung ergab eine Aktivität von 0.489. entsprechend einer Auflösung von 48,9% und das vierte Experiment ergab eine Aktivität von 0,533, entspre-ί chend einer Auflösung von 53,3%.

Beispiel 2 (Invertase)

2« Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Verwendung eines Invertase-Kollagen-Komplexes. 1.5 cm¹ eines 0,025 mm dicken Kollagen-Films (ungegerbt und mindestens 2 Monate bei Zimmertemperatur gelagert) wurden in einer Milchsäurelösung (pH = 3)

->"i gequollen. Der Film wurde sodann während '/? h in Wasser gewaschen und der gewaschene Film wurde in eine Lösung von 140 mg Invertase in 10 cm³ Wasser eingetaucht -and in einem Kühlschrank über Nacht stehengelassen. Sodann wurde der behandelte Film auf

tn ein Celluloseacetat-Substrat aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet. Der getrocknete Film stellt eine Koüagen-Invertase-Komplexmembran dar. welche bei dem nachfolgenden Versuch einer Saccharosehydrolyse verwendet wurde.

ji 400cm' einer 6%-Saccharoselösung wurden als Substrat bei dem Enzym-Versuch verwendet. Die enzymatische Aktivität wurde in einem Umlaufreaktorsystem polarimetrisch verfolgt. Nach Bestimmung der Aktivität des Films wurde dieser in 21 Wasser

■in gewaschen und die Aktivität wurde wiederum gemessen. Dieses Verfahren wurde mehr als 20mal wiederholt, wobei insgesamt mit mehr als 40 I Wasser gewaschen wurde. Die enzymatische Aktivität des Invertase-Kollagen-Komiplexes nahm allmählich nach dem Waschen ab.

um schließlich einen stabilen Grenzwert zu erreichen, welcher beim Waschen mit mehr als 101 Wasser konstant blieb. Die gesamte bis zu diesem Zeitpunkt abgelaufene Zeit betrug 13 Tage.

Tabelle I

Zahl der	% invertierte Saccharose
Waschungen	nach 30 min Reaktions
	dauer
	25C pH 5-6
I	50
5	40
10	38
15	30
20	28
25	26
30	25
35	25
40	24

Die enzymatische Aktivität des Invertase-Komplexes bei der stabilen unteren Grenze entspricht einer

10

Reaktionsgeschwindigkeit von 1,73 χ 10 ^J inol/l/min. Wenn man dem Komplex den gleichen Umsatz, zuschreibt wie dem freien Enzym (370 Mol Saccharose pro Mol Enzym pro Sekunde), so entspricht die obige Reaktionsgeschwindigkeit einer Aktivität von 21.4 mg ί Invertase in I I einer 6%igen Saccharose-Lösung. Da nur 1,5 cm¹ eines Invertase-Komplexes für die Hydrolyse von 400 cm^J Substrat verwendet wurden, so wird die an 1,5 cm³ Membran gebundene Menge Invertase zu 8,56 mg berechnet oder zu 5,7 mg Invertase pro I cm^J n> des Komplexes.

Diese Serie von Experimenten wurde über eine Zeitdauer von 13 Tagen durchgeführt. Der Komplex wurde bei 2°C in 5 cm^J destilliertem Wasser aufbewahrt, wenn er nicht gebraucht wurde. r>

Tabelle 2

Beispiel 3 (Urease)

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Verwendung von Urease-Kollagen-Membranen. I cm^! eines 0.025 mm dicken Kollagen-Films (während 48 h bei 60"C und 95% relativer Feuchtigkeit nacherhitzt) wurde in einer Milchsäurelösung (pH = 3) gequollen und sodann V>h lang in Wasser gewaschen. Der gewaschene Film wurde in eine En/ymlösung von 200 mg Urease in 15 cm¹ Wasser während 16 h eingetaucht. Sodann wurde der Film auf eint; Celluloseacetat-Substrat aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet.

Vor der Verwendung wurde der Membran-Urcasc-Komplex mit 5 I Wasser gewaschen und 5 Tage bei 2T gelagert, ehe die Urease-Aktivität gemessen wurde.

Hydrolyse	von Harnstoff mit	dem Urease-Kollagen-Membrankomplex	-	pH der Harnstnfllösung anfänglich endgültig	-
Tag	Konzentration d. HarnstofTlösung i.3 x 10"' M (anfänglich)	% hydrolysierter Harnstoff während angegebener Reaktionsdauer Potentiometrische Messung Verwendung von Nessler's Reagenz	-	-	-
a 1	100	0,21% (30 min)	-	-	-
2	100	0,3 % (20 h)	—	-	—
3	10	0,20% (160 min)	-	—	-
4	1	7,6% (200 min)	8% (20 min)	-	-
5	1	C 14% (20 min)	5% (20 min)	-	7.40
8	I	7,6% (20 min)	99 % (20 h)	7,30	7,90
8	1	3,8 % (20 min)		7.30
8	1	99% (20 h)

a. Bei allen Experimenten zur Hydrolyse von 50cm' HarnstofTlösung wurde 1 cm' des Membrankomplexes verwendet.

b. Der am 4. Tag verwendete Membrankomplex wurde vor der Verwendung am 5. Tag in 50 cm einer Enzymlösung (100 mg Urease/50 cm ) während 14 h eingetaucht und sodann mit 2 I Wasser gewaschen.

c. Durchschnitt von zwei Experimenten.

Die Urease-Aktivität wurde durch direkte potentiometrische Messung der Ammoniumionenkonzentration unter Verwendung einer kationenempfindlichen Elektrode. Beckman 39137. verfolgt. Ferner wurde eine colorimetrische Messung mit Hilfe von Nessler's Reagenz durchgeführt. Ammoniumsulfat wurde verwendet, um in beiden Fällen eine Standardkurve zu erhalten. Ein Tropfen eines frisch hergestellten Nessler's Reagenz wurde zu 2 ml Substratlösung gegeben und die Farbintensität wurde spektral fotometrisch bei einer Wellenlänge von 430 πιμ gemessen. Drei Konzentrationen von Harnstoff, nämlich 33 x 10-',33 χ 10-² und 33 χ 10-³ Mol in destilliertem Wasser wurden verwendet. Die Aktivität des Membrankomplexes wurde während 1 Woche getestet Die Membran wurde in 50 cm³ destilliertes Wasser eingetaucht, bei Zimmertemperatur gelagert, wenn sie nicht verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigen, daß bei Verwendung von 1 cm³ Membrankomplex, welcher zuvor schon 1 Woche lang verwendet wurde, während 20 h bei 50 ml einer 33 x 10~³ molaren Lösung eine 99%ige Hydrolyse stattfand

Beispiel 4 (Amyiase)

Dieses Beispiel zeigt die Bildung und Verwendung einer Amylase-Kollagen-Komplexmembran. 2 cm³ eines Kollagen-Films mit einer Dicke von 0.038 mm (während 48 h bei 6O⁰C und 95% relativer Feuchtigkeit nacherhitzt) wurde in einer Milchsäurelösung (pH =3)

·»> während '/.'h gequollen. Sodann wurde der Film während 5 min unter fließendem Leitungswasser gewaschen und der gewaschene Film wurde in eine Lösung von 200 mg Malzamylase in 15 cm³ Wasser eingetaucht und 15 h bei 2^CC so belassen. Es bestand keine

-υ- Notwendigkeit, die überschüssige Enzymlösung zu entfernen und der so behandelte Film wurde unmittelbar auf einen Celluloseacetatfilm mit einer Dicke von 0,025 bis 0,05 mm aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet Die getrocknete Kollagen-Amylase-

■>5 Komplexmembran wurde für die Hydrolyse von Stärke verwendet 50 cm³ einer 1 %igen Stärkelösung wurde als Substrat bei dem Enzymversuch verwendet Die enzymatische Aktivität wurde anhand der Abnahme der Intensität der Blaufärbung des Stärke-Jodkomplexes gemessen (Veränderung der optischen Dichte bei 400 πιμ). Ein Standard-Jod-Reagenz wurde durch Auflösen von 30 g Kaliumiodid und 3 g J2 in 11 destilliertem Wasser hergestellt 1 Tropfen von diesem Reagenz wurde zu 20 cm³ des umgesetzten Substrats gegeben, welches während 15 min bei 40° C mit 2 cm³ der Amylase-Kollagen-Komplexmembran behandelt worden war. Die Absorption bei 400 πιμ wurde gemessen.

Die folgenden Ergebnisse der Stärke-Hydrolyse mil der Kollagen-Amylase-Komplexmembran. welche vor Durchführung des Experimentes mit 101 Wasser gewaschen wurde, wurden gemessen. Nach 15 min wechselte die Färbung der |od-Stärke-Lösung von Blau nach Violett, entiprcchend dem Abbau der Stärke-Moleküle von einem anfänglichen durchschniitlichen Polymerisationsgrad von mehr als 30 bis zu einem endgültigen durchschniitlichen Polymerisationsgrad von 10 bis 15. Beim ersten Experiment bei einer Umsetzung von 50 cm¹ einer l%igen Stärke-t.ösung während 15 min bei 40"C in Gegenwart von 2 cm' des Films ergab sich eine Amylase-Aktivitäl von 0,700, gemessen als Quotient der Abnahme der optischen Dichte bei 400 ηιμ. dividiert durch die anfängliche optische Dichte bei 400 ιημ. Der Komplex wurde mit 2 I Wasser gewaschen. Beim zweiten Experiment ergab sich eine Amylase-Aktivität von 0,325. Sodann wurde

tat von 0.500 beim dritten Experiment festgestellt.

Beispiel 5 (Cellulase)

Dieses Beispiel zeigt die Herstellung und Verwendung eines Cellulase-Kollagen-Komplexes. I cm³ eines 0,038 mm dicken Kollagen-Films (während 30 h bei 55°C und 95% relativer Feuchtigkeit nacherhitzt und sodann 2 Monate bei Zimmertemperatur gelagert) wurde in einer Milschsäurelösung (pH =■ 3) gequollen. Der gequollene Film wurde sodann Ui h lang in Wasser gewaschen und der gewaschene Film wurde in eine Lösung von 200 mg Cellulase in 10 cm³ Wasser eingetaucht und 14 h bei 4°C belassen. Sodann wurde der so behandelte Film auf ein Cellulose-acetat-Substrai aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet. Der getrocknete Film wurde in I I Wasser während 2 Wochen bei 4°C gewaschen, bevor er bei den nachstehenden Experimenten der Hydrolyse von Carboxyl-methyl-ceilulose (CMC) verwendet wurde. 50cm^J 1.5% CMC wurden als Substrat für den Enzymversuch verwendet. Die enzymatische Aktivität wurde durch Verfolgung der Abnahme der relativen Viskosität des Substrats mit einem Ostwald-Viskosimeter festgestellt. Zwischen den einzelnen Experimenten wurde der Film mit 21 Wasser gewaschen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt.

Tabelle 3 Versuch Abnahme der relativen

Viskosität während 30 min bei 20 C

Vergleich	12,90
1	10,75
2	7,74
3	5,60
4	5,43
5	5,27

Aus diesen Ergebnissen ersieht man, daß nach fünf Experimenten der Cellulase-Kollagen-Komplex noch befähigt war, die Viskosität des Substrats auf weniger als die Hälfte des ursprünglichen Wertes zu sei.ken. Während des fünften Versuchs wurde die relative Viskosität des Substrats nach 18 h Reaktionsdauer auf 1,43 gesenkt

Bei» ρ ie I 6 (Inveruise-Zdn)

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung und Verwendung eines Invertase-Zein-Komplexes. 2 cm^J eines 0,038 mm dicken Zein-Films (mit Formaldehyd gegerbt) wurden in 2% (Gewicht/Gewicht) 1,5-Pentandiol gequollen. Der Film wurde sodann mit Seidenpapier getrocknet und in eine Enzymlösung von 200 mg Invertase in 15 cm³ Wasser eingetaucht und über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Der so behandelte Film wurde sodann auf ein Celluloseacetat-Siibsirat aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet. Die getrocknete Zein-lnvertiise-Komplexmeinbran wurde bei den nachstehenden Experimenten zur Hydrolyse von Saccharose verwendet.

400 cm^J einer 6%igen Saccharose-Lösung wurden al· Substrat bei der Feststellung der Enzym-Aktivität verwendet. Wie in Beispiel 2 wurde die Enzym-Aktivität

Nach Messung der Aktivität des Komplexes wurde dieser mit 2 ! Wasser gewaschen und wieder verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt.

Tabelle 4

Zahl der	In 2 h invertierte
Waschungen	Saccharose (%) bei
	25 C und pH = 6
1	40
2	16
4	8
6	8
10	6
15	7

Die enzymatisch'; Aktivität des Invertase-Zein-Komplexes wurde allmählich bei den Waschungen verringert und erreichte schließlich einen stabilen Grenzwert ähnlich dem Kollagen-Invertase-Komplex gemäß Beispiel 2.

₄- Beispiel 7 (Glucose-Isomerase)

Dieses Beispiel zeigt die Bildung und Verwendung eines Glucose-Isomerase-Kollagen-Membrankomplexes. 1 cm³ eines 0.025 nun dicken Kollagen-Films

in (während 28 h bei 60⁰C und 90% relativer Feuchtigkeit nacherhitzt) wurde in einer Milchsäurelösung (pH = 3) gequollen und sodann 5 min in fließendem Wasser gewaschen. Der gewaschene Film wurde sodann während 16 h bei 2° C in 55 cm³ Enzymlösung eingetaucht Die verwendete Enzymlösung hatte eine enzymatische Gesamtaktivität von 5,4 χ 10"⁵ Einheiten (1 Einheit = 1 Mol gebildetes Produkt/min). Der so behandelte Film wurde auf Celluloseacetat aufgebracht und bei Zimmertemperatur getrocknet Man erhielt so einen Glucose-Isomerase-Kollagen-Membrankomplex.

Dieser Membrankomplex wurde dazu verwendet die

Isomerisierung von D-GIucose zu katalysieren. Es

wurde bei 60° C und pH 7,2 mit 50 ml einer 9%igen

gepufferten Lösung gearbeitet Nach 2 h Reaktionsdauer wurde 1 ml Reaktionslösung entnommen und die gebildete D-Fructose wurde nach der Cystein-Carbazol-Methode (Z. Dische und E. Berenfreund, J. Biol. Chem, 192,583, (1951)) bestimmt Die anfängliche Aktivität des

Membrankomplexes betrug 8,3 χ 10-* Einheiten. Der Membrankomplex wurde sodann mit 1,5 1 Wasser gewaschen und vor dem zweiten Versuch während 17 h bei 4°C in 100 cm' Wasser gelagert. Bei dem zweiten Versuch zeigte sich eine geringe Zunahme der Aktivität, welche wahrscheinlich auf eine Zunahme der Reaktionstemperatur von 60 auf 65"C während des Versuchs zurückzuführen war. Die enzymatische Aktivität betrug

9,8 χ I Q~^b Einheiten. Sodann wurde der Membrankomplex mit weiteren 1,5 I Wasser gewaschen und in einem dritten Versuch bei 6O⁰C verwendet. Die Enzym-Aktivität betrug sodann 8,7 χ IO-^fc Einheiten. Beim dritten Versuch wurde der Membrankomplex während mehr als 6 h bei 60⁰C gehalten. Diese Ergebnisse zeigen die Stabilität und wiederholte Verwendbarkeit des (vienibrankomplexes.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer enzymatisch aktiven Membran durch Inberührungbringen einer Proteinmembran mit der wäßrigen Lösung eines Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kollagen-, Zein-, Casein-, Ovalbumin-. Weizengluten-, Fibrinogen-, Myosin-, Mucoprotein-, Polyglutamat-, Polyaspargat-, Polyphenylalanin-, Polylyrosin- oder Leucin-p-Aminophenylalanin-Copolymer-Membran bei einem pH von 2—12 bis zur maximalen Quellungskapazität quillt und daß man die gequollene Membran in eine wäßrige Lösung des Enzyms mit einem pH zwischen dem isoelektrischen Punkt der Membran und dem isoelektrischen Punkt des Enzyms eintaucht.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Membran einsetzt, die auf einen Träger aufgebracht ist

3. Verwendung der nach Ansprach 1 oder 2 hergestellten enzymatisch aktiven Membran zu enzym-katalysierten Substratumwandlungen.

4. Enzymatisch aktive Membran, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 oder 2.