DE1915970B2 - Verfahren zur Herstellung von durch Brückenbildner an inaktive Proteine gebundenen aktiven Proteinsubstanzen durch Polymerisation - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von durch Brückenbildner an inaktive Proteine gebundenen aktiven Proteinsubstanzen durch PolymerisationInfo
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Description
Enzyme und unlösliche Träger wurden bereits mit Hilfe von Adsorptionsverfahren kombiniert (I. Langmir
und V. Schaefer, J. Am. Chem. Soc. 60, 1351 [1938]), aber die erhaltenen Produkte denaturierten 4-,
teilweise und die Enzyme wurden allmählich freigesetzt, während sie sich mit den Substraten in Berührung
befanden. Die Fixierung der Enzyme war somit nicht stabil mit der Zeit oder blieb gegenüber
äußeren Einwirkungen schlecht. -,<)
Kombinationen von Cellulosederivaten und Enzymen wurden von A. Mitz und J. Summaria hergestellt
(Nature 189, 576 [1961]), die beispielsweise eine Carboxymethylcellulose in die Azidform überführten
und dann dieses Azid mit einer stabilisierten -,-, Lösung eines Enzyms umsetzten.
Ein ähnliches Verfahren wird von J. Epstein und B. A η fi η se η in J. Biol. Chem. 237 (1962) beschrieben.
Hierbei handelt es sich um eine Kupplung zwischen Carboxymethylcellulose und Ribonuklease oderTryp- h()
sin.
Von P. Bern feld wird in Science 142, 678 (1963)
ein Verfahren beschrieben, bei dem Antigene und Enzyme durch Bindung in Netzen von synthetischen
Polymeren unlöslich gemacht werden. Das Verfahren fa-, besteht darin, daß die löslichen makromolekularen
Verbindungen in den »Maschen« eines stark vernetzten Polymeren mechanisch eingeschlossen werden, indem
gewisse symhetische Monomere in wäßriger Lösung in Gegenwart der zu fixierenden, biologisch aktiven,
makromolekularen Substanz polymerisiert werden.
Die vorstehend genannten Verfahren haben insbesondere die folgenden Nachteile: Die Ausbeuten an
fixierten Proteinen sind gering. Die Fixierung der Proteine ist nicht dauerhaft und während ihrer Fixierung
werden die Proteine denaturiert.
Andererseits wird in einem Artikel von S. Avrameas und T.Termynck »Biologically Active Waterinsoluble
Protein Polymers« in The Journal of Biological Chemistry, Bd. 242, Nr. 7,10.4.67, S. 1651 -1659
beschrieben, daß man unlösliche Derivate von Antigenen und Antikörpern durch Kupplung des Antigenproteins
an Carboxymethylcellulose mit Hilfe von Äthylchlorformiat nach der bekannten Methode mit
gemischten Carbonsäureanhydriden und Kohlesäureanhydrid im zweiphasigen Milieu Wasser-Chloroform
erhalten kann. Es scheint, daß das Äthylchlorformiat zur Bildung von Carbonylbrücken zwischen gewissen
Aminogruppen des Proteinmaterials beiträgt.
Ein derartiges Verfahren ist jedoch kaum industriell verwertbar, da es das Arbeiten an der Zwischenphase
zwischen der wäßrigen Phase und der Chloroformphase nötig macht, die das Reaktionsmilieu darstellen.
Außerdem ist es notwendig, die erhaltenen Polymeren auszusalzen, wobei man einen bestimmten pH-Wert,
der genau dem isoelektrischen Punkt entspricht, einhalten muß und daher die Produkte auszufällen, ohne
ihnen mechanische Eigenschaften zu verleihen, die mit den beabsichtigten Verwendungen verträglich sind.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, das die obengenannten Nachteile nicht aufweist und die Herstellung
von trägergebundenen aktiven Proteinsubstanzen zum Gegenstand hat, wobei hohe Ausbeuten an fixierten
Proteinen irmöglicht werden, die Fixierung der Proteine stabil ist und die Proteine während ihrer
Fixierung nicht denaturiert werden.
Die Erfindung betrifft die in den Ansprüchen definierten Gegenstände.
Die aktiven Proteinsubstanzen, die für die Zwecke der Erfindung geeignet sind, können allgemein natürliche
oder durch Synthese erhaltene Produkte sein, die im Rohzustand oder nach vorheriger Reinigung
verwendet werden können. Diese Substanzen werden aus Enzymen, Antikörpern, Antigenen, Allergenen,
Hormonen, Mikroben und Viren ausgewählt.
Diese aktiven Proteinsubstanzen werden im allgemeinen in gepufferten wäßrigen Medien gelöst. Die
Puffer sind in den meisten Fällen mineralische Puffer, z. B. auf Basis von Alkaliphosphaten oder Erdalkaliphosphaten
und sind allgemein bekannt.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung können alle geeigneten inaktiven Proteine verwendet werden, die
mit der aktiven Proteinsubstanz verträglich sind, d. h. diese Substanz nicht denaturieren. Wie nachstehend
nähei ausgeführt wird, können die Produkte, die nach einem solchen Verfahren erhalten werden, die verschiedensten
Formen haben.
Die Produkte können in wäßrigen Medien löslich sein und somit die Form einer wäßrigen Lösung haben,
oder sie können in wäßrigen Medien suspendiert werden. Die Produkte können die Form von Gelen,
Feststoffen in Form von Granulat, Pillen, Tabletten, Platten, Kuchen und anderen geformten Massen, z. B.
die Form eines Films, einer Membran oder eines inerten und porösen Materials haben.
Nachstehend werden einige Ausführungsbeispiele
und Anwendungen des Verfahrens gemäß der Erfindung beschrieben.
Bei einer Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung fixiert man ein Enzym wie Glucoseoxydase
durch Copolymerisation auf einem als Träger dienenden inerten Protein, z. B. Albumin, in Gegenwart
eines kennzeichengemäßen Brückenbildners wie Glutaraldehyd. In der gleichen Weise wird ein Film
aus aktivem Protein durch Bildung von Brückenbindungen zwischen Albuminmolekülen und Carboanhydrase
mit Hilfe kennzeichengemäßer Brückenbildner, im vorliegenden Fall Glutaraldehyd, hergestellt.
Der auf diese Weise erhaltene Film hat wertvolle Eigenschaften und kann beispielsweise als biologische
Membran verwendet werden. Es ist auch möglich, andere Enzyme in einen solchen Film einzubauen,
wobei man ihm die spezifischen Eigenschaften des jeweiligen Enzyms verleiht, wie dies bei Carboanhydrase
der Fall ist.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung polymerisiert man in Gegenwart
eines Brückenbildners ein aktives Protein, z. B. ein Enzym, ein Antigen oder eine analoge Proteinsubstanz,
in Gegenwart eines als Träger dienenden inerten Proteins und unterbricht die Polymerisation
so, daß das erhaltene Produkt in wäßrigen Lösungsmitteln löslich bleibt.
Als Brückenbildner eignet sich Glutaraldehyd. Als inertes Protein, das sich als Träger eignet, kann beispielsweise
Plasma-Albumin verwendet werden.
Die folgenden aktiven Proteine können eingesetzt werden: Hydrolasen, z. B. insbesondere proteolytische,
lipolytische und amylolytische Hydrolasen des Verdauungstraktes sowie Urease, Asparaginase und andere
hydrolytische Enzyme, Oxydasen, z. B. Uricasc, GIucoseoxydase, Peroxydase, Katalase, Hydroxylasen,
z. B. Phenylalaninhydroxylase, die Isomerasen und Transferasen, z. B. Galactosephosphaturidyltransferase,
und die Lyasen, die die C-C-, C-O- und C-N-Bindungen lösen.
Als aktive Proteine können femer lösliche Antigene und Allergene eingesetzt werden.
Ein solches Verfahren kann für die Herstellung von Produkten angewandt werden, die in der Therapie
wirksam sind, und in denen die Wirkungsweise der aktiven Proteine verbessert ist. Zum Beispiel können
die nach diesem Verfahren aufgepfropften proteolytischen Enzyme oral verabfolgt werden, um die Verdauung
zu erleichtern oder zu aktivieren.
Die erhaltenen löslichen Produkte können intravenös injiziert werden. Gewisse, z. B. Uricase und Aspariginase
enthaltende Produkte können intravenös injiziert werden und haben eine therapeutische Wirkung
bei Gicht bzw. bei akuter Leukose.
Galactosephosphat-Uridyltransferase kann ebenso wie Phenylalaninhydroxylase durch die Produkte zugeführt
werden, um Personen, die gewisse Enzyme nicht mehr oder nur in ungenügenden Mengen bilden
können, normalen Stoffwechsel zu ermöglichen.
Die Injektion von aufgepfropften Antigenen führt zu bleibender Bildung von Antikörpern über einen
langen Zeitraum, und die Injektion von Allergenen ermöglicht es, den empfangenden Organismus dauerhaft
zu desensibilisieren.
In allen Fällen hat die Konstitution der nach einem solchen Verfahren erhaltenen aufgepfropften Proteine
bei der Verabfolgung protrahierte Wirkung oder lang anhaltende therapeutische Wirkung zur Folge.
Bei einer Variante des Verfahrens gemäß der Erfindung polymerisiert man aktive Proteine in Gegenwart
eines Brückenbildners mit einem inaktiven Proteinträger, um feine unlösliche Teilchen zu bilden,
die in einer physiologischen Lösung oder einer wäßrigen Lösung suspendiert werden können.
Als inerter Proteinträger kann Plasma-Albumin und als Vernetzungsmittel oder BrückenbildnerGlutaraldehyd
verwendet werden. Die Moleküle der einsetzbaren aktiven Proteine sind Enzyme, Antigene, Allergene
odsr andere Proteinsubstanzen. Bei diesem Verfahren können Suspensionen gebildet werden, die proteolytische
Enzyme, Oxydoreduktasen, Lyasen, die die C-C-, C-O- und C-N-Bindungen lösen, Isomerasen,
Transferasen oder andere Enzyme enthalten. Außerdem werden bei diesem Verfahren Suspensionen erhalten,
die in der Therapie verwendet werden können. Beispielsweise können aufgepfropfte proteolytische,
lipolytische und amylolytische aufgepfropfte Enzyme oral verabfolgt werden, um die Verdauung zu aktivieren.
Suspensionen von Enzymen wie Uricase oder Asparaginase sind subkutan oder intramuskulär oder
intravenös injizierbar, um gewisse toxische oder schädliche Produkte wie Harnsäure oder Asparagin abzubauen
oder um die ungenügende Versorgung gewisser Personen, beispielsweise mitGalactosephospha'uridyltransferase
bei Fällen von Galactosämie zu ergänzen. In der gleichen Weise können Antigene subkutan
injiziert werden, um die langanhaltende Bildung von entsprechenden Antikörpern zu bewirken. Ebenso
kann die Injektion von Allergenen, die auf feine Teilchen aufgebracht sind, die Desensibilisierung gegenüber
diesen Proteinen begünstigen. Ferner ist es möglich, Membrane bakteriellen Ursprungs oder ganze
Bakterien mit Albuminmolekülen so zu koppeln, daß feine Teilchen gebildet werden, die die Bildung von
antibakteriellen Antikörpern in sehr dauerhafter Weise bewirken. Ebenso können Koppelungen zwischen
Viren und inaKtiven Proteinen wie Albumin verwirklicht werden. Diese Koppelungen ermöglichen wirksame
Impfungen, insbesondere örtliche Impfungen, wie dies bei der Impfung im Nasenrachenraum der
Fall ist, oder die Zuführung von Konkurrenzkeimen einer gestörten Darmfiora.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung polymerisiert man ein aktives
Protein in Gegenwart eines Brückenbildners und eines inaktiven Proteins, das als Träger dient, bis eine feste
und unlösliche Masse von genügender Größe erhalten wird, die die aktiven Proteine enthält, die ihre ursprünglichen
Eigenschaften bewahrt haben. In diesem Fall sind die aktiven Proteine in einen Träger gepfropft,
der aus einer unlöslichen Proteinmasse besteht und beispielsweise die Form von Granulat, Pillen
oder Tabletten hat. Zahlreiche Enzyme können auf diese Weise in ein Polymeres von Plasma-Albumin
eingearbeitet werden, insbesondere proteolytische, lipolytische und amylolytische Hydrolasen. Das gleiche
gilt für gewisse Mikroorganismen, die an Albuminmoleküle durch die Proteine ihrer Wand gebunden
werden können. Diese Proteine und diese aufgepfropften Mikroorganismen können oral genommen werden,
um die Verdauung zu aktivieren oder um eine pathologische Darmfiora kompetitiv zu hemmen.
Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung polymerisiert man in Gegenwart
eines Brückenbildners ein Enzym oder ein beliebiges anderes aktives Protein allein oder in Korn-
bination mit einem anderen aktiven oder inaktiven Protein im Innern eines inerten Materials, z. B. einer
Prothese, einer Plastik usw., das an der Oberfläche leicht porös ist, wodurch die Proteint eindringen und
fixiert werden können. In diesem Fall werden die aktiven Proteine auf einen Träger gepfropft, der aus
einem unlöslichen inerten und leicht porösen Material besteht.
Die Verwendung solcher Prothesen, auf die entweder ein einfacher Proteinfilm cdei ein Film als Träger in
von enzymatischen Funktionen gepfropft ist, kann in Fällen empfohlen werden, in denen entweder die
Bedeckung der Oberflächen der Prothese mit angrenzendem Gewebe erleichtert oder diese Bedeckung
verhindert werden soll. Dies ist insbesondere der Fall \r>
bei Prothesen, die bei plastischen Operationen verwendet werden, bei Slarr-K lappen, bei Zellen, die
bei der Osteosynthese verwendet werden, und bei allen Oberflächen von unlöslichem und inertem Material,
das in den Organismus als Plastik oder Prothese eingeführt wird.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ermöglicht ferner die Herstellung von Produkten, bei denen die
Enzyme auf einen Träger gepfropft sind, der aus einem
Proteinfilm besteht. Solche Filme können nach entsprechender Behandlung auch in der Kosmetik und
Therapie verwendet werden.
Die nach dem Aufpfropfen der Enzyme erhaltenen Filme müssen anschließend getrocknet und durch Bestrahlung
mit Ultraviolettlicht sterilisiert werden, be- jo vor sie in sterilen Beuteln konditioniert werden.
Die kutane Anwendung solcher Filme oder ihre Aufbringung auf leicht zugängliche Schleimhäute ermöglicht
die örtliche Einwirkung gewisser Enzyme, insbesondere proteolytischer Enzyme wie Trypsin, r>
Chymotrypsin, Papasin, Keratinase und Elastase, Subtilisin, Pronase, Kollagenase, Pepsin usw. Diese Enzyme
können eine therapeutische Wirkung bei gewissen Hautkrankheiten und bei gewissen Störungen
der Narbenbildung haben.
Die Proteinfilme als Enzymträger können auch in der Kosmetik für die Hautpflege verwendet werden.
Außer für die obengenannten Anwendungen eignen sich die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung
erhaltenen Produkte für die Verwendung auf dem Gebiet der aktiven Filtration, der selektiven Adsorption,
der Elektrophorese, der Chromatographie und für andere analoge Anwendungen.
Beispielsweise kann man bei der aktiven und selektiven
Filtration durch Filtration durch eine Membran, die Träger eines proteolytischen Enzyms wie Trypsin
ist, eine Lösung von Proteinen zu entsprechenden Aminosäuren und Peptiden abbauen.
Bei der Elektrophorese und bei der Chromatographie kann man die Affinitäts- und Umwandlungskonstanten
einer Verbindung, die durch ein Enzym angreifbar ist, bestimmen, indem man diese Verbindung in einem
Film, der Enzymträger ist, wandern läßt.
B e i s ρ i e I 1 mi
Herstellung eines Films aus einem Copolymcren von Glucoseoxydase und Albumin
50 mg Glucoseoxydase werden in 0,7 ml eines Phosphatpuffers von pH 6,8 gelöst. Ferner werden 50 mg hr>
Albumin in 0,7 ml des gleichen Puffers gelöst. Die beiden Lösungen werden gemischt und bewegt, bis
ein homogenes Gemisch erhallen wird. Anschließend wird eine Lösung, die 2,5 Gew.-% Glularaldehyd enthält,
unter Bewegung zugelropft. Die hierbei erhaltene Lösung wird in eine Glasform mit flachem Boden,
der eine Fläche von 40 cm2 hat, gegeben. Nach einer Stunde wird eine Membran einer Dicke von 0,1 bis
0,2 mm erhalten, die in Wasser aufbewahrt wird, um Austrocknung zu vermeiden.
Enzymalische Ausbeute 90%. Die ?.nzymalische Ausbeute
ist das Verhältnis von im Endprodukt enthaltener Aktivität zur in das Milieu eingeführten Aktivität,
auf 100 bezogen.
Wenn ein Träger verwendet wird, der für Proteinlösungen und für Lösungen von Brückenbildnern undurchlässig
ist, wird ein abstreifbarer Film erhalten, der allein oder nach Aufbringung auf einen anderen
Träger verwendbar ist.
Eine Lösung von 3 mg Carboanhydrase in 0,4 ml eines 0,02molaren Phosphatpuffers, der einen pH-Wert
von 6,8 hat, wird mit einer Lösung von 50 mg Plasma-Albumin in 1,4 ml des gleichen Puffers gemischt. Zu
dieser Lösung werden 1,2 ml einer Lösung gegeben, die 2,5%Glutaraldehyd in destilliertem Wasser enthält.
Die Vernetzung findet bei 4 C" im Verlauf von ^Stunden statt. Erhalten wird ein geschlossener und geschmeidiger
Proteinfilm, der gute mechanische Eigenschaften hat. Die nicht umgesetzten Moleküle werden
durch Spülen mit destilliertem Wasser entfernt.
Enzymalische Ausbeute —40%.
Ein solcher Film hat nach guter Spülung gewisse Eigenschaften von biologischen Membranen. Insbesondere
verändert er nicht die Elemente von Blut, die mit ihm in Berührung kommen.
An Stelle von Carboanhydrase können auch andere Enzyme in einen solchen Film eingearbeitet werden.
Die Einarbeitung von Carboanhydrase macht diesen Film sehr durchlässig für Kohlensäure und ermöglicht
seine Verwendung in Membranoxygenatoren.
Man mischt eine Lösung von 10 mg Glucoseoxydase in 0,4 ml eines 0,02molaren Phosphatpuffers, der einen
pH-Wert von 6,8 hat, mit einer Lösung, die 50 mg Plasma-Albumin in 1,4 ml des gleichen Puffers enthält.
Man gibt zu dieser Lösung 1,2 ml einer Lösung von 2,5% Glutaraldehyd in destilliertem Wasser. Man läßt
die Vernetzung 1 Stunde bei der Laboratoriumstemperatur vonstatten gehen. Man gibt anschließend zum
Reaktionsgemisch 0,05 ml eines 0,05molaren Tris(hydroxymethyl)aminoäthan-HCl-Puffers,
der einen pH-Wert von 7,8 hat, wodurch die Polymerisation unmittelbar vor dem Erscheinen einer unlöslichen Phase verhindert
wird. Man erhält hierbei Albuminverknüpl'ungen, an die eine, zwei oder mehrere Glucoseoxydasemoleküle
gebunden sind. Die Glucoseoxydase bewahrt ihre Aktivität und Spezifität. Wie die Messung des
Molekulargewichts ergibt, sind Polymere gebildet worden.
Die kleinen Moleküle, z. B. die GlutaraldehydmoleküIc,
die nicht umgesetzt worden sind, werden durch Dialyse gegen 10 Volumina Pufferlösung und dann
gegen 10 Volumina Wasser entfernt. Jede Flüssigkeit der Gegendialyse wird dreimal von Stunde zu Stunde
erneuert.
Das Polymere wird anschließend lyophilisicrt. Die
Sterilisation wird durch Ultraviolettbestrahlung vorgenommen. Das Produkt wird in einer injizierbaren
physiologischen Lösung aufgenommen. Das Polymere ist besonders beständig gegenüber einer Temperaturerhöhung
und widersteht den meisten proteolytischen Enzymen.
Enzymatische Ausbeute 60%.
Ebenso gute Ergebnisse werden erhalten, wenn bei dem vorstehend beschriebenen Beispiel die Glucoseoxydase
durch eines der folgenden Enzyme ersetzt 1« wird: proteolytische, lipolytische und amylolytische
Hydrolasen des Verdauungstraktes, Urease, Asparaginase und andere hydrolytische Enzyme, Oxydasen,
z. B. Uritase, Peroxydase, Katalase, Hydroxylasen, z. B. Phenylalanin-hydroxylase, Isomerasen und Transferasen,
z. B. Galactosephosphat-uridyltransferase, Lyasen, die die C-C-, C-O- und C-N-Bindungen
lösen, und lösliche Antigene oder Allergene, die vorher vom natürlichen unlöslichen Träger befreit worden
sind. 2»
Man mischt eine Lösung von 11mg Trypsin in 0,4 ml 0,02molarem Phosphatpuffer, der einen pH-Wert
von 6,8 hat, mit einer Lösung von 50 mg Albumin in 1,4 ml des gleichen Puffers. Man gibt zu dieser
Lösung 1,2 ml einer Lösung von 2,5% Glutaraldehyd in destilliertem Wasser. Das Gemisch wird in Formen
der gewünschten Gestalt gegeben. Man läßt die Vernetzung 48 Stunden bei einer Temperatur des Labo- jo
ratoriums vonstatten gehen, bis das in der Form enthaltene Material vollständig erstarrt ist. Man entformt
die auf diese Weise gebildeten Teilchen, die anschließend gut gespült werden, um nicht umgesetzte Moleküle
zu eluieren. Die Wirksamkeit der Spülung wird jj durch Absorption von Licht einer Wellenlänge von
280m[x überprüft. Die Spülung gilt als beendet, wenn keine Absorption bei dieser Wellenlänge stattfindet.
Die in dieser Masse fixierten aktiven Moleküle bewahren ihre Aktivität und ihre Spezifizität. 4(1
Enzymatische Ausbeute 70 % unter Verwendung von B. A. E. E. als Substrat.
Äquivalente Ergebnisse werden erhalten, wenn bei dem vorstehend beschriebenen Versuch das Trypsin
durch eine proteolytische, lipolytische oder amyloly- -ti tische Hydrolasc ersetzt wird.
Beispiel 5
(nachgcrcicht) Γ)|)
(nachgcrcicht) Γ)|)
In 50ml eines 0,lmolaren Phosphatpuffers vom pi 16,8, der 8 % Rinderplasma-Albumin (Gew./Vol.) enthielt,
wurde gewaschener Bazillus subtilis in einer solchen Menge suspendiert, um eine Konzentration
von 50 Millionen Baktcrienkörpern/ml zu erhalten. Kalter Glutaraldehyd wurde in einer solchen Menge
hinzugefügt, daß eine Konzentration von 3% entstand. Die Lösung wurde unverzüglich auf -60 C gefroren.
Nach 2 Stunden wurde die Suspension langsam aufgc- mi laut, wobei eine lamcllcnförmige Struktur entstand,
die vcrnclzlcs Extrakt des ganzen Baktcrienkörpcrs enthielt.
Das Produkt wurde gemahlen und in eine Säule gegeben, Sie baute Amylose und Dextrine ab, wie h5
durch den Anstieg des Reduktionsvermögens und das Geringerwerden der Färbung in Gegenwart von Jod
gezeigt wurde.
Beispiel 6
(nachgereicht)
(nachgereicht)
Gesammelter und gemahlener Hausstaub wurde zu einer Konzentration von 1 Million Teilchen/ml eines
0,02molaren Phosphatpuffers vom pH 6,5 suspendiert, der 10 mg/ml menschliches Albumin enthielt. Die
Mischung wurde mit Glutaraldehyd bei einer Endkonzentration von 3% bei 15 C während 24 Stunden behandelt.
Der erhaltene Kuchen wurde langsam aufgetaut, dann gemahlen und mit Äthylenoxyd sterilisiert.
Die gleiche Methode kann mit suspendierten Viren mit den im wesentlichen gleichen Resultaten angewendet
werden.
Dieses Verfahren erlaubt die Realisierung von Allergenen, die als Desensibilisatoren verwendet werden
können.
Die erfindungsgemäß hergestellten, aktive Proteine enthaltende Produkte haben eine erhöhte Widerstandsfähigkeit
gegen Denaturierung in der Wärme und gegen Proteolyse. Die aktiven Proteinsubstanzen behalten
ihre Aktivität in einer Pufferlösung bei 25 und 37 C während mehrerer Monate. Beispielsweise
wurde Glukoseoxydase zusammen mit Albumin an Cellophan mit Hilfe von Glutaraldehyd gemäß der
Erfindung gebunden und bei 37 C sowohl unter trockenen Bedingungen als auch in Lösung gehalten.
Nach 1 Monat hatte das trockene Produkt seine gesamte ursprüngliche Aktivität behalten, während die
Lösung nur noch 60% der ursprünglichen Aktivität hatte. Unter den gleichen Bedingungen verlor freie
Glukoseoxydase ihre gesamte enzymatische Aktivität.
Die gestiegene Widerstandsfähigkeit gegen Denaturierung und Proteolyse der gemäß der Erfindung fixierten
Enzyme wurde bei jedem der getesteten Enzyme beobachtet. Zum Beispiel wurde Glukoseoxydase
der Einwirkung von Trypsin, Chymotrypsin und einer enzymatischen Zusammensetzung, die im Handel erhältlich
ist, unterworfen. Lediglich löslich gemachte Glukoseoxydase wurde innerhalb 5-20Stunden inaktiv.
Dagegen halte. Glukoseoxydase, die mit Hilfe von Glutaraldehyd in einer Cellulosemembran zusammen
mit Fibrinogen gemäß der Erfindung gebunden war, nach wenigstens 40Stunden noch 100%
ihrer ursprünglichen Aktivität.
Zur Prüfung der Denaturierung durch Wärme wurden zwei Proben hergestellt. Die erste bestand
aus Glukoseoxydase, die an Cellophan zusammen mit Albumin gebunden war (1); die zweite bestand
aus mit Hilfe von Glutaraldehyd zusammenvernclztcn Glukoseoxydase und Albumin gemäß der Erfindung
(2), aber ohne irgendeinen vorher bestehenden Träger. Die Proben wurden bei 55 C während verschiedener
Zeiträume gehalten. Die enzymatische Aktivität wurde bei 25 C gemessen.
Was das freie Enzym betrifft, so nahm die Aktivität der freien Glukoseoxydase bis zu 50% seines ursprünglichen
Werts in 6-7 Stunden bei 55 C ab und war nach 40Stunden praktisch gleich Null. Im Gegensatz
dazu zeigte Probe (2) mehr als 90% ihrer Aktivität nach 6-7 Stunden bei 55 C und sogar noch etwa
60% nach mehr als 40 Stunden bei der gleichen Temperatur. Probe (1) behielt etwa 95% ihrer ursprünglichen
Aktivität nach 6-7Stunden bei 55 C und etwa 80% nach mehr als 40Stunden bei der gleichen Temperatur.
Zur Bestimmung der cnzymalischcn Ausbeute wurden verschiedene Vorgleichstestc mil verschiedenen
Enzymen durchgeführt. Verglichen wurde die enzymatische
Ausbeute, die einmal nach Vernetzung eines Enzyms mit einem Träger und zum anderen nach
Immobilisierung eines Enzyms mit einer inaktiven Proteinsubstanz gemäß der Erfindung erhalten worden
ist. Im ersten Fall wurde das Enzym gemäß den bekannten Zweistufenverfahren an verschiedene unlösliche
Träger, wie in der nachstehenden Tabelle angegeben, gebunden. Beispielsweise wurde in dem Fall,
in dem ein Blatt aminiertes Papier verwendet wurde, dieses mit 0,5 N-NaOH und dann mit Wasser, dann
mit 0,5 N-HCl und mit Wasser, bis es frei von Chlorid war, gewaschen. Das nasse Blatt wurde mit Aceton
gewaschen und getrocknet und dann gemahlen. 1 g
Wirksam gebundene Enzyme
ίο
10
des trockenen aminierten Papierpulvers wurde zu 0,5 g Enzym gegeben, das in 100 ml Wasser gelöst war.
Dann wurden 0,4 ml 50%iger Giutaraidehyd zugegeben und die Suspension auf den benötigten pH eingestellt.
Die Lösung wurde bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Reaktion wurde die Suspension zentrifugiert
und der Rückstand mehrere Male mit 0,lmolarem Natriumcarbonat, dann mit Wasser, dann mit 0,01
N-HCI und mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen und dann gefriergetrocknet.
Im zweiten Fall wurde die Fixierung bzw. Co-Vernetzung gemäß dem Verfahren der vorliegenden Anmeldung
durchgeführt. Das inaktive i'rotein wird in der nachstehenden Tabelle in Klammern angegeben.
Gebundene Enzyme
Ausbeute, erhalten durch Immobilisierung auf einem Träger gem. Stand d. Technik
Erfindungsgemäße Ausbeute, erhalten durch Co-Vernetzung mit einem inaktiven Protein
Oxido Reduktasen
Glukoseoxydase
Urateoxydase
L-Aminosäureox\ dase
Xanthinoxydase
Catalase
Peroxydase
Transferasen
Hexokinase
Ribonuklease
Isomerasen
Glukose-6 Phosphat
Isomerase
Triose-phosphat
Isomerase
Lyasen
Carbonanhydrase
Tyrosindecarboxylase
Phenylalanin
Decarboxylase
Hydrolasen
(einige Beispiele)
alpha-Amylase
/7-Galactosidase
Trypsin
Chymotrypsin
Urease
Asparaginase
10%aufCellophan 5% auf Cellophan
5% auf Aktivkohle
5% auf Whatman 3-Filterpapier
3% auf aminiertem Papier
5% auf Silikonfolie
2% auf Seide nichts (Cellophan) 30% auf Cellophan 30% auf Cellophan
nichts 80% (Albumin) 30% (Albumin) 50% (Albumin) 60% (Albumin) 80% (Albumin) 60% (Albumin)
30% (Albumin) 30% (Albumin)
50% (Albumin) 50% (Hämoglobin)
50% (Albumin) 60% (Albumin)
80% (Albumin)
60% (Albumin) 30% (Albumin)
Wie man aus den Resultaten eindeutig entnehmen kann, werden mit dem Verfahren gemäß der Erfindung
immer unvorhersehbar viel bessere Ergebnisse erzielt.
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung von durch Brückenbildner an inaktive Proteine gebundenen aktiven >
Proteinsubstanzen durch Polymerisation, dadurch ge ken η ze ich net, daß man inaktive Proteine
mit der Lösung mindestens einer aktiven Proteinsubstanz in Gegenwart von Dialdehyden,
Diazo-bis-benzidin, Diazobis-o-anisidin oder u> 5-Chlortriazinen als Brückenbildner in wäßriger
Lösung polymerisiert und anschließend den inaktiven Proteinträger mit der auf ihm fixierten aktiven
Proleinsubstanz isoliert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- π zeichnet, daß man als aktive Proteinsubstanzen
Enzyme, Antikörper, Antigene, Allergene, Hormone, Mikroben oder Viren verwendet.
3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polymerisation so _'n
unterbricht, daß das Produkt in wäßrigen Lösungsmitteln löslich bleibt.
4. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polymerisation bis
zur Bildung einer festen und unlöslichen Masse r, oder bis zur Bildung von feinen unlöslichen Teilchen,
die in einer physiologischen Lösung oder einer wäßrigen Lösung, suspendiert werden können,
fortschreiten läßt.
5. Verfahren nach Ansprüchen 1-4, dadurch ge- ju
kennzeichnet, daß man als Brückenbildner Glutaraldehyd einsetzt.
6. Verfahren nach Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß man als inertes Protein Plasma-Albumin
verwendet. π
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1985
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