DE19903655A1 - Proteinhaltige Hydrogele - Google Patents
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- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
Abstract
Hydrogel, bestehend aus zumindest einem Protein und/oder Enzym und/oder SOD/Katalase-Enzym-Mimic und PEGs sowie Teilen von Proteinen und Enzymen und/oder rekombinant hergestellten Proteinen und Enzymen, wobei die Verbindung zwischen den Proteinen und/oder Enzymen und den PEGs über Harnstoffgruppen erfolgt.
Description
Seit Menschengedenken ist die Heilung von therapieresistenten Wunden eine große
Herausforderung für die Medizin und Naturwissenschaften. Die heutigen Anforderun
gen an die Funktion von interaktiven Wundauflagen für chronische Wunden gehen
zurück auf Winter (1962, Nature 193, 293) und sind jüngst von Turner neu formuliert
(1994, Wound Rep. Reg. 2, 202). Im Vordergrund steht dabei die Schaffung eines
feuchten Wundheilungsmilieus, das im Gegensatz zur traditionellen trockenen
Wundbehandlung mit zum Beispiel Mullkompressen den natürlichen Abläufen der
Wundheilung physiologische und damit bessere Konditionen bietet.
Das Prinzip der feuchten Wundheilung kann derzeit als der Stand der Technik in der
Therapie schwer oder nicht heilender Wunden angesehen werden. Die Wundauflage
muß die Hauptmenge des Exsudates aufnehmen und gleichzeitig aber auf der
Wunde selbst einen Flüssigkeitsfilm belassen, in dem die eigentliche feuchte Wund
heilung stattfindet. Bei trockenen und schwachexudierenden Wunden muß die Ver
sorgung der Wunde mit ausreichend Feuchtigkeit erfolgen, um eine Rehydrierung
des dehydratisierten Gewebes zu erreichen. In der auf diese Weise etablierten
feuchten Wunde kommt es dann zur Proliferation von neuen Blutgefäßen und ver
minderten Bakterienwachstum unter Einstellung eines geeigneten pH-Wertes.
Erfüllt werden diese Anforderungen von schwammartigen Strukturen, wie beispiels
weise Hydrogele, die über einen Überschuß in Form von gebundenem Wasser ver
fügen.
Hydrogele werden im allgemeinen dadurch hergestellt, daß hydrophile, kohärent vor
liegende Monomere in einem Dispersionsmittel eine dreidimensionale Raumnetz
struktur ausbilden, in dessen Zwischenräumen sich das Dispersionsmittel, üblicher
weise Wasser, einlagern kann. Ein Hydrogel sollte über eine gewisse Sauerstoff
durchlässigkeit verfügen und eine Barrierefunktion gegenüber möglicherweise aus
der Umgebung eindringende Keime einnehmen. Eine grundlegende Anforderung an
ein Hydrogel sind auch ein einfacher Herstellungsprozeß sowie eine gewisse Lager
stabilität.
Der Gebrauch und die Vielfältigkeit der möglichen Anwendungen von Hydrogelen in
der Wundbehandlung, sowie deren Zusammensetzung und Herstellung ist hinrei
chend dokumentiert (Peppas in: Hydrogels in Medicine and Pharmacy, 1986, CRC
Press, Volume II, Chapter 4). Hydrogele werden bevorzugt für die Behandlung von
trockenen nekrotischen Wunden wie zum Beispiel Brandwunden und chronisch
venöse Ulcera eingesetzt (Thomas, in: Wound Management and Dressings, 1990,
The Pharmaceutical Press, London, S. 50).
Sie bestehen aus unlöslichen polymeren Materialien, die in der Lage sind, in wäßri
gen Medien aufzuquellen. Des weiteren sollten sie über einen hohen Wassergehalt
verfügen, inert sein gegen biologische Prozesse, permeabel für zelluläre Metaboliten
und vor allem im Kontakt mit lebenden Gewebe keine Reizungen auslösen.
Die Synthese eines biokünstlichen oder semi-synthetischen Hydrogels kann dadurch
erzielt werden, daß das hydrophile synthetische Monomer kovalent an die Oberfläche
eines Proteins verknüpft wird, wobei es dann innerhalb des Dispersionsmittels zur
Ausbildung einer dreidimensionalen Polymer-Proteinmatrix kommt. Diese Klasse von
Hydrogelen, bestehend aus synthetischen Polymeren und Biopolymeren, ist seit kur
zer Zeit Gegenstand der Forschung. Diese neuartigen Biomaterialien werden als bio
künstliche Hydrogele bezeichnet (Giusti et al., 1993, Trends in Polymeric Science, 9,
261).
In US 5,804,213 wird die Herstellung eines biologisch aktiven, wasserhaltigen Gels
als Wundauflage berichtet. Dabei wird ein trockenes, hydrokolloidales Polymer mit
Wasser und einer biologisch aktiven Substanz vermischt.
Die Verwendung von dehydratisierten, vernetzten Collagenmaterialien als Drug-Deli
very-System wird in WO 98/22153 beschrieben. In WO 96/31551 werden im trocke
nen Zustand Proteine oder Peptide als aktive Agentien zu Polyurethan-vernetzten
Microgelen gemischt. Die Microgele quellen im wäßrigen Medium zu Hydrogelen auf
und setzen aus der Hydrogelmatrix das Protein bzw. das Peptid wieder frei. Auch US
5,000,955 beschreibt Polyurethan-Hydrogele für kosmetische, biologische und medi
zinische Anwendungen.
Kubische Phasen bestehend aus Glycerylmonooleat können Enzyme durch nicht
kovalente Bindungen, wie in WO 96/39125 berichtet, immobilisieren. Dabei bleibt
durch die Immobilisierung die enzymatische Aktivität erhalten und ist sogar, im Ver
gleich zu gelöstem Enzym, über einen längeren Zeitraum erhöht. Hervorzuheben ist
weiterhin die Barrierefunktion der Gelmatrix, die den proteolytischen Abbau der
immobilisierten Enzyme, wie in der Wundflüssigkeit anzutreffen, unterbindet.
Von besonderem Interesse sind Hydrogele, in die ein Biomolekül kovalent eingebun
den ist, wie in US 5,733,563 und 1994 von Fortier (1994, Biotechnol. Techn., 8, 71)
beschrieben. Diese Hydrogele werden durch Copolymerisation von einem durch 4-
Nitrophenylchloroformiat aktiviertem Polyethylenglykol und bovinem Serumalbumin in
Boratpuffer gebildet. Dabei kann die aktivierte Gruppe mit einer Amino-, SH-, OH-
oder COOH-Gruppe des Proteins reagieren.
Nachteile der im Stand der Technik bekannten biokünstlichen Hydrogele sind die
hohe Gelbildungszeiten von 20 bis zu 270 Minuten, die Entstehung von Spaltpro
dukten in Form von p-Nitrophenolen in der Hydrogelmatrix und die fehlende Möglich
keit oligomere Proteine wie zum Beispiel dimere SOD oder tetramere Katalase stabil
mit dem 4-Nitrophenylchloroformiat aktivierten Polyethylenglykol zu vernetzen.
Aufgabe der Erfindung ist es, wasserunlösliche, wasserquellbare Hydrogele mit kur
zen Gelbildungszeiten zu fertigen, die für medizinische Zwecke einsetzbar sind und
sich in besonderem Maße zur Förderung der Heilung von chronischen Wunden eig
nen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch ein Hydrogel, das aus zumindest einem Protein
und/oder Enzym und PEGs besteht, wobei die Verbindung zwischen den Proteine
und/oder Enzymen und den PEGs über Harnstoffgruppen erfolgt.
Bei der Herstellung des Hydrogels werden zusätzliche Substanzen verwendet, die mit
den in Wundflüssigkeiten von chronischen Wunden vorhandenen Sauerstoffspezies
(ROS) wechselwirken, d. h. mit Faktoren, die den Wundheilungsprozess behindern,
wobei man diese zusätzlichen Substanzen kovalent in das Hydrogel einpolymerisiert.
Die Erfindung beschreibt die neuartige Herstellung von proteinhaltigen Hydrogelen,
mit denen es möglich ist, reaktive ROS in der Wundflüssigkeit von chronischen Wun
den unschädlich zu machen. Sie beschreibt das Herstellen von collagenasehaltigen
und trypsinhaltigen Hydrogelen zur Behandlung von nekrotischen Wundbeilägen,
sowie das Herstellen von lysozymhaltigen Hydrogelen, die zur Bekämpfung von mit
Bakterien infizierten Wunden eingesetzt werden können. Ferner wird die Machbarkeit
beschrieben, in die Hydrogele biologisch aktive Substanzen wie zum Beispiel Anti
biotika, Wachstumsfaktoren und andere Wirkstoffe einzuarbeiten.
Die vorliegende Erfindung bedient sich der Reaktion von insbesondere α,ω-Diisocya
nato-Polyethylenglykolen mit Protein unter Bildung eines proteinhaltigen Hydrogels
im wäßrigen Milieu. Dabei ist die Vernetzungsreaktion des Isocyanats mit den Amino
gruppen des Proteins eine durch die höhere Nucleophilie bevorzugte Reaktion, im
Vergleich zur Hydrolyse des Isocyanats zum Amin unter Bildung von Kohlendioxid.
Die Reaktion stellt eine Möglichkeit zur dreidimensionalen Vernetzung von Polyethy
lenglykol und Proteinen dar ohne das Auftreten von Spaltprodukten, die aus der akti
vierten Gruppe entstehen. Ferner können stabile Hydrogele mit oligomeren Proteinen
wie zum Beispiel SOD und Katalase gebildet werden.
Polyethylenglykole (PEGs) zählen zur Klasse der Polyether gehörenden Polyalkylengly
kole der allgemeinen Formel (Römpp Lexikon Chemie - Version 1.3, Stuttgart/New
York: Georg Thieme Verlag 1997):
H O-CH2-CH2 nOH
Polyethylenglykole (PEGs) werden technisch hergestellt durch basisch katalysierte
Polyaddition von Ethylenoxid (Oxiran) in meist geringe Mengen Wasser enthaltenden
Systemen mit Ethylenglykol als Startmolekül. Sie haben Molmassen im Bereich von ca.
200-5.000.000 g/mol, entsprechend Polymerisationsgraden n von ca. 5 bis < 100.000.
Im weiteren Sinne werden auch Produkte mit n = 2-4 (Di-, Tri- u. Tetramethylenglykol) zu
den PEGs gerechnet; sie sind mol.-einheitlich herstellbar, während die PEGs mit höhe
ren Molmassen polymol. sind, d. h. aus Kollektiven von Makromolekülen mit unter
schiedlichen Molmassen bestehen.
Flüssige Produkte mit Molmassen < ca. 25.000 g/mol werden als eigentliche Polyethy
lenglykole, die höhermolekularen festen (Schmelzpunkt ca. 65°C) als Polyethylenoxide
bezeichnet. Polyethylenoxide besitzen eine äußerst niedrige Konzentrationen an reakti
ven Hydroxy-Endgruppen und zeigen nur noch schwache Glykol-Eigenschaften.
Als PEG werden auch verzweigte Polyaddukte von Ethylenglykol an mehrwertige Alko
hole bezeichnet.
PEG sind flüssige bzw. wachsartige bis feste Produkte, die sich in Wasser bis ca.
100°C und in vielen organischen Lösungsmitteln gut lösen. Wäßrige Lösungen haben
auffallende rheologische Eigenschaften, so zeigen verschiedene Lösungen zum Teil
starke Viskoelastizität. In fließendem Wasser bewirken schon minimale PEG-Mengen
den sogenannten Toms-Effekt (Herabsetzung des Reibungswiderstands). PEG sind
sehr hydrolysestabile, bei höheren Temperaturen aber oxididationsempfindliche Pro
dukte. Ihre chemische Reaktivität wird durch die terminalen Hydroxy-Gruppen bestimmt,
die leicht verestert (zu Polyethylenglykolester) oder verethert (zu Polyalkylenglykolether)
oder mit Isocyanaten zu Urethanen umgesetzt werden können.
PEG werden als toxikologisch unbedenklich eingestuft. Ihre biologische Abbaubarkeit ist
stark Molmassen-abhängig; Produkte mit niedrigen Molmassen, z. B. 4000 g/mol, wer
den bis zu 80% abgebaut.
PEGs werden u. a. verwendet als Lösungsvermittler, Bindemittel, Konsistenzgeber,
Emulgatoren, Dispergatoren, Schutzkolloide, Weichmacher oder Trennmittel für sehr
unterschiedliche Einsatzgebiete; als Bindemittel für keramische Massen, Schlichtemittel,
Flockungsmittel, Klebstoff-Komponenten, zur Verminderung des Fließwiderstands wäß
riger Flüssigkeiten (drag-reduction), als Zwischenprodukte für Polymer-Synthesen, zum
Beispiel im großen Umfang für die Herstellung von Polyurethanen; hochmolekulare
PEGs als Stärkeersatz sowie zur Herstellung von Filmen und Folien.
Vorteilhafterweise hat das eingesetzte PEG ein Molgewicht von 8.000 bis 18.000
g/mol, insbesondere 10.000 bis 15.000 g/mol.
Erfindungsgemäß können auch modifizierte PEGs eingesetzt werden, die die fol
gende Strukturschemata aufweisen können:
wobei B einen hydrophilen Bereich des jeweiligen Vernetzermoleküls symbolisiert
und A eine Isocyanatgruppe darstellt, welche auch innerhalb eines Moleküls unter
schiedlicher chemischer Natur sein mögen.
Ebenfalls in den Rahmen der hiermit vorgelegten Erfindung fallen Struktur
schemata wie folgt:
wobei Z dabei eine Zentraleinheit darstellt, welche hydrophil oder hydrophob sein
kann und in der Regel aus einem oligo- oder polyfunktionellen Molekülrest besteht.
Selbstverständlich fallen auch Verknüpfersubstanzen mit höherem Verzweigungs
grad in den Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Beispielsweise kann Z in Schema (10) aus einem Glycerylrest bestehen, dessen
drei OH-Funktionen in die Bereiche B übergehen, welche ihrerseits beispielsweise
Polyoxyethylenketten gleicher oder ungleicher Länge darstellen können, und
deren terminale OH-Gruppe mit einer längerkettigen Fettsäure verestert sind. Auch
Teilsubstitution an Glycerin ist denkbar, wodurch Strukturen entstehen können,
welche Schema (9) entsprechen.
Für das Strukturschema (1) können beispielsweise folgende spezielleren Struktur
schemata befolgt werden:
wobei R1, R2, R3, R4, R5 und R6 unabhängig voneinander Isocyanatgruppen oder
verzweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, cyclische oder ket
tenförmige aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Reste darstellen
können, beispielsweise verzweigte oder unverzweigte oder cyclische Alkyl- oder
Alkanoylreste, mit Alkyl- oder Arylsubstituenten substituierte oder unsubstituierte
Aryl- oder Aroylreste oder auch alkylierte oder arylierte Organylsilylreste bedeuten,
wobei aber mindestens einer dieser Reste eine Isocyanatgruppe darstellt. x, y und
z bedeuten dabei unabhängig voneinander Zahlen, die es dem Gesamtmolekül
erlauben, in Wasser löslich oder zumindest dispergierbar zu sein, typischerweise
gewählt aus dem Bereich größer als 10, vorteilhaft aus dem Bereich 20 bis 107. a
und b sind Zahlen, die in Abhängigkeit von x gewählt werden, dergestalt, daß die
Verknüpfersubstanz eine wenigstens ausreichende Wasserlöslichkeit bzw. Was
serdispergierbarkeit aufweist. Im Einzelfalle, beispielsweise wenn der Verdicker
aus der Gruppe der derivatisierten Polysaccharide gewählt wird, kann x gegebe
nenfalls wesentlich höhere Werte als z. B. 300, sogar mehrere Millionen, anneh
men. Dies ist dem Fachmanne an sich bekannt und bedarf keiner weiteren Erläu
terung.
Für das Strukturschema (2) können beispielsweise folgende spezielleren Struktur
schemata befolgt werden:
wobei R1, R2 und R3 unabhängig voneinander Isocyanatgruppen oder verzweigte
oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, cyclische oder kettenförmige ali
phatische, aromatische oder heteroaromatische Reste darstellen können, bei
spielsweise verzweigte oder unverzweigte oder cyclische Alkyl- oder Alkanoyl
reste, mit Alkyl- oder Arylsubstituenten substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder
Aroylreste oder auch alkylierte oder arylierte Organylsilylreste bedeuten, wobei
aber mindestens einer dieser Reste eine Isocyanatgruppe darstellt. x, y und z
bedeuten dabei unabhängig voneinander Zahlen, die es dem Gesamtmolekül
erlauben, in Wasser löslich oder zumindest dispergierbar zu sein, typischerweise
gewählt aus dem Bereich größer als 10, vorteilhaft aus dem Bereich 20 bis 107.
Auch Teilsubstitution ist dabei denkbar, wobei einer oder mehrere der Indices x, y,
oder z den Wert Null annehmen können und einer oder mehrere der Reste R1, R2
oder R3 Wasserstoffatome darstellen können.
Für das Strukturschema (3) können beispielsweise folgende spezielleren Struktur
schemata befolgt werden:
wobei R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander Isocyanatgruppen oder ver
zweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, cyclische oder ketten
förmige aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Reste darstellen kön
nen, beispielsweise verzweigte oder unverzweigte oder cyclische Alkyl- oder Alka
noylreste, mit Alkyl- oder Arylsubstituenten substituierte oder unsubstituierte Aryl-
oder Aroylreste oder auch alkylierte oder arylierte Organylsilylreste bedeuten,
wobei aber mindestens einer dieser Reste eine Isocyanatgruppe darstellt. x, y und
z bedeuten dabei unabhängig voneinander Zahlen, die es dem Gesamtmolekül
erlauben, in Wasser löslich oder zumindest dispergierbar zu sein, typischerweise
gewählt aus dem Bereich größer als 10, vorteilhaft aus dem Bereich 20 bis 107.
Auch hier gilt selbstverständlich, daß Teilsubstitution denkbar ist, wobei einer oder
mehrere der Indices u, v, w, x den Wert Null annehmen können und einer oder
mehrere der Reste R1, R2, R3 oder R4 Wasserstoffatome darstellen können. Dabei
gehen die Substanzen natürlich in andere Strukturschemata über.
Für das Strukturschema (9) können beispielsweise folgende spezielleren Struktur
schemata befolgt werden:
wobei R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander Isocyanatgruppen oder ver
zweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, cyclische oder ketten
förmige aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Reste darstellen kön
nen, beispielsweise verzweigte oder unverzweigte oder cyclische Alkyl- oder Alka
noylreste, mit Alkyl- oder Arylsubstituenten substituierte oder unsubstituierte Aryl-
oder Aroylreste oder auch alkylierte oder arylierte Organylsilylreste bedeuten,
wobei aber mindestens einer dieser Reste eine Isocyanatgruppe darstellt. x, y und
z bedeuten dabei unabhängig voneinander Zahlen, die es dem Gesamtmolekül
erlauben, in Wasser löslich oder zumindest dispergierbar zu sein, typischerweise
gewählt aus dem Bereich größer als 10, vorteilhaft aus dem Bereich 20 bis 107.
Für das Strukturschema (10) können beispielsweise folgende spezielleren Struk
turschemata befolgt werden:
wobei R1, R2, und R3 unabhängig voneinander Isocyanatgruppen oder verzweigte
oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, cyclische oder kettenförmige ali
phatische, aromatische oder heteroaromatische Reste darstellen können, bei
spielsweise verzweigte oder unverzweigte oder cyclische Alkyl- oder Alkanoyl
reste, mit Alkyl- oder Arylsubstituenten substituierte oder unsubstituierte Aryl- oder
Aroylreste oder auch alkylierte oder arylierte Organylsilylreste bedeuten, wobei
aber mindestens einer dieser Reste eine Isocyanatgruppe darstellt. x, y und z
bedeuten dabei unabhängig voneinander Zahlen, die es dem Gesamtmolekül
erlauben, in Wasser löslich oder zumindest dispergierbar zu sein, typischerweise
gewählt aus dem Bereich größer als 10, vorteilhaft aus dem Bereich 20 bis 107.
Für das Strukturschema (11) kann beispielsweise folgendes speziellere Struktur
schema befolgt werden:
wobei R1, R2, R3 und R4 unabhängig voneinander Isocyanatgruppen oder ver
zweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, cyclische oder ketten
förmige aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Reste darstellen kön
nen, beispielsweise verzweigte oder unverzweigte oder cyclische Alkyl- oder Alka
noylreste, mit Alkyl- oder Arylsubstituenten substituierte oder unsubstituierte Aryl-
oder Aroylreste oder auch alkylierte oder arylierte Organylsilylreste bedeuten,
wobei aber mindestens einer dieser Reste eine Isocyanatgruppe darstellt. x, y und
z bedeuten dabei unabhängig voneinander Zahlen, die es dem Gesamtmolekül
erlauben, in Wasser löslich oder zumindest dispergierbar zu sein, typischerweise
gewählt aus dem Bereich größer als 10, vorteilhaft aus dem Bereich 20 bis 107.
Für das Strukturschema (12) kann beispielsweise folgendes speziellere Struktur
schema befolgt werden:
wobei R1, R2, R3, R4 und R5 unabhängig voneinander Isocyanatgruppen oder ver
zweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, cyclische oder ketten
förmige aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Reste darstellen kön
nen, beispielsweise verzweigte oder unverzweigte oder cyclische Alkyl- oder Alka
noylreste, mit Alkyl- oder Arylsubstituenten substituierte oder unsubstituierte Aryl-
oder Aroylreste oder auch alkylierte oder arylierte Organylsilylreste bedeuten,
wobei aber mindestens einer dieser Reste eine Isocyanatgruppe darstellt. x, y und
z bedeuten dabei unabhängig voneinander Zahlen, die es dem Gesamtmolekül
erlauben, in Wasser löslich oder zumindest dispergierbar zu sein, typischerweise
gewählt aus dem Bereich größer als 10, vorteilhaft aus dem Bereich 20 bis 107.
Für das Strukturschema (13) kann beispielsweise folgendes speziellere Struktur
schema befolgt werden:
wobei R1, R2, R3, R4, R5 und R6 unabhängig voneinander Isocyanatgruppen oder
verzweigte oder unverzweigte, gesättigte oder ungesättigte, cyclische oder ket
tenförmige aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Reste darstellen
können, beispielsweise verzweigte oder unverzweigte oder cyclische Alkyl- oder
Alkanoylreste, mit Alkyl- oder Arylsubstituenten substituierte oder unsubstituierte
Aryl- oder Aroylreste oder auch alkylierte oder arylierte Organylsilylreste bedeuten,
wobei aber mindestens einer dieser Reste eine Isocyanatgruppe darstellt. x, y und
z bedeuten dabei unabhängig voneinander Zahlen, die es dem Gesamtmolekül
erlauben, in Wasser löslich oder zumindest dispergierbar zu sein, typischerweise
gewählt aus dem Bereich größer als 10, vorteilhaft aus dem Bereich 20 bis 107.
Es ist auch gegebenenfalls von Vorteil, die vorab beschriebenen Strukturschemata
so abzuwandeln, daß am Ende des Verdickermoleküls erneut Verzweigung auftritt,
etwa dergestalt, wie es in der Gruppe der sogenannten Dendrimere verwirklicht
wird.
Die Wahl des zur Herstellung des Hydrogels erforderlichen Proteins ist abhängig von
den gewünschten Eigenschaften des Hydrogels. Prinzipiell eignen sich alle Proteine
und Enzyme sowie Teile von Proteinen und Enzymen oder rekombinat hergestellte
Proteine und Enzyme wie beispielsweise:
- - Antikörper
- - Radikale detoxifizierende Enzyme wie z. B. Superoxiddismutase, Katalase, Glutathion-Peroxidase, Myeloperoxidase und/oder Kombinationen daraus sowie SOD/Katalase-Enzym-Mimics
- - proteolytisch wirkende Enzyme wie Collagenase, Trypsin, Elastase und/oder Kombinationen daraus
- - Proteaseinhibitoren aus der Klasse der Tissue Inhibitos of Matrixmetalloprotei nases (TIMPs) und/oder andere proteinogene Proteaseinhibitoren wie Aprotenin, Sojabohnen-Trypsininhibitor und Alpha-2-Makroglobulin
- - antimikrobiell wirksame Enzyme wie zum Beispiel Lysozym und Hydrolase
- - phosphorylierend wirksame Enzyme wie Phosphatasen und Kinasen
- - Wachstumsfaktoren wie z. B. PDGF
- - beliebige Mischungen der Proteine, wobei sich die Zusammensetzung der Mischung ebenfalls an den gewünschten funktionalen Eigenschaften des Hydro gels orientiert.
Als Enzyminhibitoren werden besonders natürliche proteinogene Protease-Inhibitoren
aus der Klasse der TIMPs gewählt sowie Aprotinin, Alpha-2-Antiplasmin, Alpha-2-
Makroglobulin, Alpha-1-Antichymotrypsin, Sojabohnen-Trypsininhibitor und Alpha-1-
Protease-Inhibitor.
Im Falle eines proteinhaltigen Hydrogels, das aus SOD, Katalase oder aus einer
Mischung der beiden Enzyme besteht, ist ein selektives Entfernen von ROS aus der
Wundflüssigkeit möglich. ROS werden in der entzündlichen Phase der Wundheilung
durch Neutrophiele und Monozyten nach einem zellulären Reiz ausgeschüttet. Das
Enzym SOD katalysiert die Dismutationsreaktion von reaktivem Superoxid in die
weniger toxische Zwischenstufen Wasserstoffperoxid und Sauerstoff (Gleichung 1).
Es spielt die Hauptrolle in der zellulären Verteidigung gegen die sauerstoffvermittelte
Toxizität von ROS und bei der Regulierung der intrazellulären Sauerstoffkonzentra
tion (Fridovich, 1995, Annu. Rev. Biochem., 64, 97). Das durch die Reaktion der SOD
gebildete Wasserstoffperoxid wird anschließend durch das in aeroben Organismen
ubiquitäre Redoxenzym Katalase in einem mehrstufigen katalytischen Zyklus in die
nichttoxischen Moleküle Wasser und Sauerstoff (Gleichung 2) umgewandelt (Gouet
et al, 1996, Nature Structural Biology, 3, 951). Außer Katalase sind auch die Enzyme
Gluthathion-Peroxidase und Myeloperoxidase befähigt, Wasserstoffperoxid abzu
bauen.
2 O2 - + 2 H+ → H2O2 + O2 (1)
H2O2 → H2O + ½O2 (2)
Collagenasehaltige Salben werden seit Jahren zur Entfernung von nekrotischen
Wundbelägen eingesetzt (Nano et al., 1996, in: Proteolysis in Wound Repair,
Abatangelo, Donati und Vanscheidt (Eds.), Springer Verlag, Berlin, Seite 61) und J.
Hansbrough & W. Hansbrough 1996, in: Proteolysis in Wound Repair, Abatangelo,
Donati und Vanscheidt (Eds.), Springer Verlag, Berlin, Seite 97. Das Enzym Collage
nase und andere Proteasen spalten dabei Collagenmoleküle in abgestorbenem
Gewebe und machen somit das Einwandern von Fibroblasten möglich und somit das
Abheilen der Wunde (Glyantsev et al., 1997, J. Wound Care, 6, 13). Ein aus Colla
genase bestehendes Hydrogel trägt in vergleichbarer Art und Weise zur Auflösung
des nekrotischen Gewebes bei.
Die aktiven Enzyme werden beim Entfernen des Hydrogels ebenfalls mit entfernt,
ohne daß sie in der Wunde bzw. in der Wundflüssigkeit verbleiben. Erfindungsgemäß
schließt diese Wechselwirkung eine Umwandlung der ROS als Störfaktoren in die
Wundheilung nicht mehr behindernde Substanzen ein. Die zur Wechselwirkung ver
wendeten, kovalent in das Hydrogel eingebundenen Enzyme werden somit nur vor
übergehend in die Wunde eingebracht und werden, nachdem sie ihre bestimmungs
gemäße Aufgabe verrichtet haben (d. h., die oben genannten Wechselwirkungen
eingegangen sind), wieder aus dem Wundbereich entfernt. Durch die selektive
Beseitigung bzw. Eliminierung der toxischen ROS, das proteolytische Auflösen von
totem Gewebe und das Abtöten von Mikroorganismen wird der Heilungsprozeß chro
nischer, d. h. schwer oder nicht heilender, Wunden verbessert bzw. eingeleitet.
In der chronischen Wunde findet man eine deutlich erhöhte Proteaseaktivität (Weck
roth et al., 1996, J. Invest. Dermatol., 106, 1119; Grinell & Zhu, 1996, J. Invest. Der
matol. 106, 335) im Vergleich zur akuten Wunde. Dem steht eine deutlich verringerte
Menge an Proteaseinhibitoren gegenüber (Grinell & Zhu, 1996, J. Invest. Dermatol.
106, 335). Durch dieses Ungleichgewicht kommt es zu einem proteolytischen Abbau
von proliferationsfördernden Substanzen wie zum Beispiel Wachstumsfaktoren (Wla
schek et al., 1997, Brit. J. Dermatol., 137, 646). Enzyme wie zum Beispiel SOD und
Katalase die durch ihre schützende Wirkung wundheilungsfördernd wirken, würden
dadurch proteolytisch abgebaut und somit unwirksam. Ein proteinhaltiges Hydrogel in
das solche Enzyme kovalent eingearbeitet sind, wirkt als Schutzschild und kann den
Angriff von Proteasen verhindern, wie mit Polyethylenglykol modifizierten gelösten
Enzymen gezeigt wurde (Beckman et al., 1988, J. Biol. Chem., 14, 6884; Inada et al.,
1995, Tibtech, 13, 86).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es somit nicht nur möglich, ein feuchtes
Wundmilieu zu generieren, um den Heilungsprozeß chronischer Wunden zu verbes
sern, sondern der Heilungsprozeß kann auch erfindungsgemäß dadurch weiter
beschleunigt werden, zum Beispiel durch die oben genannten Umwandlungs
prozesse.
Anschließend werden Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Hydrogeles
näher erläutert.
In übersichtlicher Form stellt sich ein vorteilhaftes Verfahren zur Herstellung der
erfindungsgemäßen Hydrogele wie folgt dar:
- a) Wasserfreie PEGs werden in Lösungsmittel mit Diisocyanat gegebenenfalls unter Zusatz eines Katalysators umgesetzt,
- b) das resultierende Produkt aus aktiviertem PEGs wird vom Lösungsmittel durch Abfiltern, Waschen oder Trocknung befreit,
- c) die aktivierten PEGs werden in wäßriger Lösung mit Proteinen umgesetzt, wobei sich die Proteine in einem Puffer befinden, der bevorzugt so gewählt ist, daß die Proteine ihre biologische Aktivität erhalten,
- d) gegebenenfalls werden Reinigungsschritte und Waschungen vorgenommen.
Vorzugsweise wird das Hydrogel anschließend dehydratisiert.
Das erfindungsgemäße Hydrogel ist besonders vorteilhaft als Wundauflage insbe
sondere für tiefe und flächige chronische Wunden sowie Brandwunden geeignet.
Des weiteren zeigt das Hydrogel vorteilhafte Eigenschaften als Auflage auf gegebe
nenfalls luft- und wasserdampfdurchlässigen Trägermaterialien wie Binden, Kompres
sen, Pflastern, Folien, Filmen und dergleichen.
Im folgenden werden die einzelnen Verfahrensschritte intensiver beschrieben.
Die Experimente zur Herstellung eines aktivierten Polyethylenglykols werden wie folgt
beschrieben durchgeführt.
Polyethylenglykol verschiedener Molmassen (6000-35.000 g/mol) werden durch
kovalente Verknüpfung von aliphatischen Diisocyanaten, unter Ausbildung von
Urethanbindungen in α,ω-Diisocyanato-Polyethylenglykolen überführt. Um eine
Hydrolyse der eingesetzten Isocyanatgruppen zu vermeiden, wird das PEG vor der
eigentlichen Verwendung dehydriert. Dazu werden 1.0 mmol PEG in 60 ml Benzol
gelöst und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das dabei gebildete Benzol-Wasser
Azeotrop wird für 7 h im Hochvakuum abgetrennt. 1.0 mmol des so dehydratisierten
PEG werden unter Aufrechterhaltung einer Argonatmosphäre in 50 ml abs. Dichlor
methan gelöst. Zu dieser Lösung werden beispielsweise 10 mmol Hexamethylendi
isocyanat und 1 ml abs. Pyridin gegeben und für 12 h bei RT gerührt. Die Reaktions
lösung wurde durch zweimaliges Umfällen in 800 ml abs. Petrolether 35/60 aufgear
beitet. Das kristalline Produkt wurde über einen Büchnertrichter abgefiltert und mit
abs. Petrolether 35/60 (2 × 100 ml) gewaschen. Nach 8 h Trocknung im Hochvakuum
wird das aktivierte PEG in einer Argonatmosphäre bei -20°C gelagert.
Für die Aktivierung der PEG können erfindungsgemäß neben 1,6-Hexamethylendi
isocyanat auch andere aliphatische oder aromatische Diisocyanate eingesetzt wer
den, beispielsweise 1,12-Dodecandiisocynat, Isophorondiisocyanat, Methylcyclo
hexan-2,4- und/oder -2,6-diisocyanat, Dicyclohexylmethan-2,4'- und/oder -4,4'-diiso
cyanat ferner Cyclobutan-1,3-diisocyanat, Cyclohexan-1,3- und 1,4-diisocyanat, 2,4-
und/oder 2,6-Hexahydrotoluylendiisocyanat, Hexahydro-1,3- und/oder -1,4-phenylen
diisocyanat sowie 1,3- und 1,4-Phenylendiisocyanat, 2,4- und 2,6-Tolylendiisocyanat,
Diphenylmethan-2,4'- und/oder -4,4'-diisocyanat und Naphthylen-1,5-diisocyanat.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß die neuheitliche Reaktion der α,ω-Diiso
cyanato-Polyethylenglykole mit Proteinen unter Bildung proteinhaltiger Hydrogele im
Vergleich zu der 4-Nitrophenylchloroformiat-Aktivierung mit erheblich kürzeren Gelbil
dungszeiten verbunden ist.
Fig. 1 ist die graphische Darstellung der Abhängigkeit der Gelbildungszeit in Abhän
gigkeit vom Molekulargewicht der eingesetzten α,ω-Diisocyanato-Polyethylenglykole
und dem pH-Wert der Reaktionslösung. Dabei ist auf der x-Achse das Molekular
gewicht der eingesetzten PEG in Gramm/Mol und auf der y-Achse die Gelbildungs
zeit in Sekunden dargestellt. Desweiteren sind drei 0.1 M Boratpufferlösungen unter
schiedlicher pH-Werte dargestellt (○ = pH 9.5, = pH 9.0, Δ = pH 8.5).
Fig. 2 ist die graphische Darstellung der Abhängigkeit der maximal aufnehmbaren
Wassermenge von der Ionenstärke der Inkubationslösung. Der prozentuale Was
seranteil am Gesamtgewicht der Hydrogele ist auf der x-Achse dargestellt, während
auf der y-Achse die Ionenstärke der Inkubationslösung in Form der Boratkonzentra
tion, aufsteigend von 0-0.2 Mol pro Liter, aufgeführt ist. Der dargestellte Versuch
erfolgte mit Hydrogelen der Zusammensetzung 100 mg PEG15000 und 35 mg BSA.
Wie oben beschrieben, war es bisher nicht möglich, andere als albuminartige Pro
teine isoliert, in dreidimensionaler Form, innerhalb einer Hydrogelmatrix zu immobili
sieren. Erfolgte eine beobachtbare Gelbildung mit anderen Proteinen bzw. Enzymen,
lösten sich diese innerhalb weniger Minuten wieder auf (siehe US 5,733,563) und
lediglich eine Immobilisierung als ternäres System, bestehend aus PEG/BSA/Enzym,
konnte erzielt werden (Fortier et al. 1996. Enz. Microbiol. Technol 18, 482).
Überraschenderweise stellte sich weiterhin heraus, daß die beschriebene Form der
PEG-Aktivierung über Diisocyanate, eine Immobilisierung anderer Proteine und
Enzyme, als albuminartige, zuläßt, so Superoxiddismutase (SOD) aus Rind und Hefe.
Hierzu werden 44 mg Superoxiddismutase in 2 ml 0.1 m Boratpuffer gelöst und mit
150 mg PEG verschiedener Molekulargewichte versetzt. Nach erzielter Vernetzung
werden die SOD-Hydrogele analog zu den BSA-Hydrogelen durch Inkubation in phy
siologischem Boratpuffer gewaschen und die Waschlösung auf unvernetztes PEG
und Enzym hin untersucht. Hierbei wird festgestellt, daß unter bestimmten Voraus
setzungen eine Gelbildung erfolgt, so daß sich ein stabiles SOD-Hydrogel ergibt. Als
ein wesentlicher Faktor erweist sich dabei das Molekulargewicht und damit die Ket
tenlänge, der eingesetzten Polyethylenglykole. Oberhalb eines Molekulargewichtes
von PEG20000 ist eine Gelbildung nur mehr schwerlich möglich.
Um eine Abschätzung über die Beibehaltung der Enzymaktivität zu erhalten, werden
Proben der hergestellten SOD-Hydrogele mithilfe des NBT-Nachweises (Auclair and
Voisin, 1985, in: CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research, CRC
Press Inc., Boca Raton) hinsichtlich ihrer Aktivität untersucht. Da sich dieser Test nur
zur quantitativen Bestimmung gelöster SOD eignet, lassen sich damit nur qualitative
Aussagen über das Vorhandensein von Aktivität immobilisierter SOD treffen. Die
erzielten Ergebnisse lassen jedoch darauf schließen, daß die Immobilisierung inner
halb der Gelmatrix keinen signifikanten Einfluß auf die Aktivität des Enzyms zu neh
men scheint. Auch nach mehrwöchiger Lagerung bei unterschiedlichen Temperatu
ren (4°C, 25°C, 37°C), anschließender Dehydratisierung im Hochvakuum und
erneutem Quellen in Inkubationslösung, kann eine unverändert vorhandene Enzy
maktivität beobachtet werden.
Ausgehend von diesen Ergebnissen wurden die Versuche auf andere Enzyme aus
geweitet. Dabei wurde die Vernetzungsmöglichkeit folgender Enzyme getestet:
- - Katalase aus Rind
- - Lysozym aus Hühnereiweiß und
- - Collagenase aus achromobacter iophagus.
Mit allen genannten Enzymen kann ein stabiles Hydrogel erzielt werden, wobei der
limitierende Faktor die Kettenlänge des eingesetzten PEG-Molekül ist.
Vernetzungsmöglichkeiten von verschiedenen Proteinen und Enzymen mit α,ω-
Diisocyanato-PEG.
Alle Versuche erfolgten in 2 ml 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0) mit 150 bis 300 mg PEG
und 35 bis 100 mg Protein/Enzym.
Nach vollendeter Vernetzung werden die Hydrogele bei RT in 15 ml physiologischem
Boratpuffer (0.1 m H3BO3, 0.1 m MgCl2, 0.1 m CaCl2, 0.15 m NaCl; pH 7.0) inkubiert.
Nach jeweils 12 Stunden wird die Inkubationslösung gewechselt und der erhaltende
Überstand auf ausgewaschenes Protein und PEG hin untersucht. Die Evaluation der
resultierenden Mengen an Protein erfolgt mithilfe des BCA- und Micro BCA-Nachwei
ses (Rhoderick, Jarvis and Hyland, 1989, Anal. Biochem., 180, 136) und die Bestim
mung der eluierten Mengen an PEG mithilfe des Jod-Nachweises (Sims and
Snape, 1980, Anal. Biochem., 107, 60).
Das Ende der Waschung ist dann erreicht, wenn weder Protein noch PEG in der
Waschlösung detektierbar sind (zwischen 48-72 h Inkubation). Anschließend wer
den die Hydrogele entweder in dehydratisierter (siehe Methode zur Dehydratisierung
proteinhaltiger Hydrogele) oder in gequollener Form bei RT gelagert.
Nach Abschluß des Waschvorganges werden die Gele im Hochvakuum bis zur
Gewichtskonstanz dehydratisiert und erneut in Pufferlösungen inkubiert, um so die
Abhängigkeit der Wasseraufnahme von verschiedenen Faktoren wie pH-Wert und
Ionenstärke der Hydrogele zu untersuchen. Das Quellen der Gele wird, bis zum
Erreichen der maximalen Wasseraufnahmekapazität, durch regelmäßige Gewichts
bestimmung verfolgt, wobei die Inkubationslösung alle 12 h gewechselt wird. Der
Quellfaktor (SF) [Gleichung 3] und der maximale Wassergehalt (EWC) [Gleichung 4]
werden durch zwei mathematische Beziehungen beschrieben, die zur Bestimmung
des Quellverhaltens von Polyvinylalkohol-Hydrogelen benutzt werden (Urushisaki et al.,
1990, Int. J. Pharm., 58, 135):
Quellfaktor (SF) = (Ws-Wd)/Wd (3)
Hierbei entspricht Ws dem maximal erreichbaren Quellgewicht und Wd dem Trocken
gewicht der Hydrogele. Dieses Trockengewicht wird nach Abschluß der Unter
suchungen durch Trocknung der Gele bei 70°C, über einen Zeitraum von 24 h
bestimmt.
Aus diesen gewonnenen Daten läßt sich auch der prozentuale Anteil des Wassers
am Gesamtgewicht der Hydrogele bestimmen:
EWC = (Gewicht Wasser/Gewicht gequollenes Hydrogel) × 100 (4)
Versuche hinsichtlich des Quellverhaltens bei unterschiedlichen pH-Werte und
Ionenstärken der Inkubationslösungen haben gezeigt, daß ein direkter Zusammen
hang zwischen diesen Parametern und dem Quellvermögen der Hydrogele besteht.
Bewirkt zum Beispiel die Erhöhung der Ionenstärke der Inkubationslösung eine
Abnahme der Wasseraufnahmekapazität, so läßt sich bei der Variation des pH-Wer
tes der Inkubationslösung der gegenläufige Effekt beobachten. Hier führt die Erhö
hung des pH-Wertes zu einer Zunahme der Wasseraufnahmekapazität.
Der Einfluß des Molekulargewichtes der eingesetzten Polyethylenglykole auf das
Quellverhalten der resultierenden Hydrogele ist in Tabelle 1 detailliert aufgeführt.
Evaluierung der Quellparameter (Quellfaktor SF und Wassergehalt EWC) verschie
dener Hydrogele folgender Zusammensetzung: 100 mg α,ω-Diisocyanato-PEGx und
35 mg BSA in 2 ml 0.1 m Boratpufferlösung (pH 9.0).
Die Bestimmung der Quellparameter erfolgte nach 72 h Inkubation in physiologi
schem Boratpuffer (0.1 m H3BO3, 1 m MgCl2, 1 m CaCl2, 0.15 m NaCl; pH 7.0) bei RT
und 24 h Trocknung bei 70°C.
Hierbei ist zu beobachten, daß eine stetige Zunahme der Wasseraufnahmekapazität
in Richtung höherer eingesetzter Molekulargewichte von PEG vorliegt. Eine Wieder
holung des Versuches nach durchgeführter Trocknung der Hydrogele (Dehydratisie
rung im Hochvakuum bis zur Gewichtskonstanz) zeigt eine Irreversibilität hinsichtlich
der maximalen Wasseraufnahmekapazität auf. Tatsächlich liegen die Wassergehalte
nach erneutem Quellen, in Anschluß an einen Trocknungsschritt, bei 60-70% der
vor dem Trocknen erreichbaren Wassergehalte.
Hinsichtlich der Sauerstoffdurchlässigkeit der vorliegenden Hydrogele kann ange
nommen werden, daß ab einem Wassergehalt < 94% die Sauerstoffdiffusion inner
halb der Hydrogele der einer wäßrigen Lösung entspricht (Corkhill et al. 1990, Crit.
Rev. Biocompatibility., 5, 363).
Für die Messung der Aktivität der verschiedenen SOD-Enzyme wurde der Biotech
SOD-525-Assay (OXIS International S. A., Frankreich) eingesetzt. Dieser Assay
basiert auf dem durch SOD verursachten Anstieg der Geschwindigkeitskonstante der
Autooxidationsreaktion des Catechols 5,6,6a,11b-Tetrahydro-3,9,10-Trihydroxy
benzo[c]fluoren (BXT-01050) in wäßriger alkalischer Lösung (Nebot et al., 1993,
Analytical Biochemistry, 214, 442). Diese Autooxidationsreaktion erzeugt ein
Chromophor mit einer maximalen Absorption bei 525 nm. Der Assay wird in einem
luftgesättigten Puffer mit 50 mM 2-Amino-2-Methyl-1,3-Propandiol, 0.1 mM Diethy
lentriaminpentaessigsäure und 3 mM Borsäure, pH 8.8, bei 37°C durchgeführt. Kine
tiken werden bei 525 nm innerhalb einer Minute nach Zugabe von BXT-01050
gemessen. Die SOD-Aktivität wird bestimmt durch das Verhältnis der Geschwindig
keitskonstante der Autooxidationsreaktion Vs/Vc, die in Gegenwart (Vs) und in Abwe
senheit (Vc) der Probe gemessen wird. Eine SOD-Einheit (U-525) wird definiert als
die Aktivität, die den Hintergrund der Autooxidationsreaktion verdoppelt, das heißt
Vs/Vc = 2.
Katalase (EC 1.11.1.6, Boehringer Mannheim) katalysiert die Spaltung von Wasser
stoffperoxid (H2O2) in Sauerstoff und Wasser. Die Aktivitätsbestimmung des gelösten
Enzyms erfolgt mit einem spektrophotometrischen Assay modifiziert nach R.F. Beers
und I.W. Sizers (J. Biol. Chem. 195, 133 (1952)). Die Extinktionsabnahme bei 240
nm korreliert hierbei mit der Abnahme von Wasserstoffperoxid durch Katalase-Akti
vität im Reaktionsgemisch.
In einer Quarzküvette (Hellma, Jena) werden 3 ml Phosphatpuffer (50 mM, pH 7.0)
(Referenzposition) bzw. 3 ml eines mit H2O2 versetzten Phosphatpuffers (0,05 mM,
pH 7) (Probe) mit je 0,05 ml der Katalase-haltigen Probe gegeben. Dabei wird die
Wasserstoffperoxidkonzentration in dem H2O2-haltigen Puffer durch Extinktionsmes
sung bei 240 nm kontrolliert, deren Absorption bei 0,500 ± 0,01 liegt. Nach Mischen
der Komponenten in den Quarzküvetten (Schichtdicke 10 mm) wird die Reaktion
solange beobachtet, bis die Extinktion einen Wert von 0,450 erreicht. Ab dann wird
mit einer Stoppuhr diejenige Zeitspanne erfaßt, die benötigt wird, die Extinktion auf
0,400 zu vermindern. Die Enzymkonzentration in der Küvette wird dahingehend
angepaßt, daß die hierfür benötigte Zeit 20 s ± 2 s beträgt. Die Errechnung der
Volumenaktivität erfolgt nach folgender Formel:
Volumenaktivität [U/ml] = (17 × 13)/gestoppte Zeit [s] × 0,05
Gesamtaktivität der Probe [U] = Vol. akt. [U/ml] × Verdünnung × Probenvolumen [ml]
Gesamtaktivität der Probe [U] = Vol. akt. [U/ml] × Verdünnung × Probenvolumen [ml]
Ein Unit ist dabei definiert als diejenige Enzymaktivität, die 1 µmol Wasserstoffper
oxid unter den gewählten Assaybedingungen (25°C, pH 7.0) pro Minute dispropor
tioniert.
Collagenase (EC 3.4.24.3, Boehringer Mannheim) katalysiert die hydrolytische Spaltung
von N-(3[2-Furyl]Acryolyl)-Leu-Gly-Pro-Ala (FALGPA) (Sigma Chemical Steinheim) an
der Peptidbindung des Substrates zwischen den Aminosäuren Leucin und Glycin. Die
Aktivitätsbestimmung des gelösten Enzyms erfolgt mit einem spektrophotometrischen
Assay modifiziert nach H.E. von Wart und D.R. Steinbrink (Anal. Biochem. 113, 356
(1981)). Die Extinktionszunahme bei 345 nm korreliert hierbei mit der Freisetzung von
gefärbtem N-(3-[2-Furyl]Acryloyl)-Leu aus dem Substrat durch Collagenase-Aktivität im
Reaktionsgemisch.
In einer Quarzküvette (Schichtdicke 10 mm, Hellma Jena) werden 2.9 ml Pufferlösung
(50 mM Tricin, 10 mM Calciumchlorid, 400 mM Natriumchlorid, pH 7.5) mit 0.1 ml der
collagenasehaltigen (2 units/ml) Probe (Probenposition) bzw. mit 0.1 ml destilliertem
Wasser (Referenzposition) versetzt. Nach Mischen der Komponenten in den Quarz
küvetten und Temperatureinstellung auf 25°C wird die resultierende Extinktionsdifferenz
über einen Zeitraum von fünf Minuten bei 345 nm kontrolliert. Die Berechnung der
Volumenaktivität der Probe erfolgt nach folgender Formel:
Volumenaktivität der Probe [U/ml] =
DE nm/min Probe - DE nm/min Referenzposition/(0.53) × (mg Enzym/ml Reaktions
mix)
DE = Extinktionsdifferenzdifferenz
Gesamtaktivität der Probe [U] = Vol. akt. [U/ml] × Verdünnung × Probenvolumen [ml]
Gesamtaktivität der Probe [U] = Vol. akt. [U/ml] × Verdünnung × Probenvolumen [ml]
Eine Unit ist definiert als diejenige Enzymaktivität, die 1.0 mmol FALGPA unter den
gewählten Assyaybedingungen (25°C, pH 7.5) pro Minute hydrolisiert.
Trypsin (EC 3.4.21.4, Sigma Chemical Steinheim) katalysiert die Spaltung von Peptid
bindungen am C-terminalen Ende der Aminosäuren Arginin und Lysin. Die Aktivitäts
bestimmung des gelösten Enzyms erfolgt mit einem spektrophotometrischem Assay
modifiziert nach Hummel (Can. J. Biochem. Physiol. 37, 1393 (1959)). Die Extinktions
zunahme bei 257 nm korreliert mit der Freisetzung von p-Toluolsulfonyl-I-arginin aus p-
Toluolsulfonyl-I-arginin-methylester (Sigma Chemical Steinheim).
In einer Quarzküvette (Schichtdicke 10 mm, Hellma Jena) werden 2.6 ml Pufferlösung
(0.65 m Tris(hydroxymethyl)-amminomethan, 11 mM Calciumchlorid-Dihadrat, pH 8.1)
und 0.3 ml Substratlösung (10 mM p-Toluolsulfonyl-I-arginin-methylester) gegeben und
mit 0.1 ml Enzymlösung (0.5 U/in 1 ml 0.001 n Salzsäure) versetzt. Nach Mischen in der
Quarzküvette und Temperatureinstellung auf 25°C wird die Extinktionszunahme über
einen Zeitraum von fünf Minuten gegen destilliertes Wasser bestimmt, wobei ein kon
stanter Wert pro Minute ermittelt wird. Die Berechnung der Volumenaktivität der Probe
erfolgt nach folgender Formel:
Volumenaktivität der Probe [U/ml] =
DE nm/min Probe × Probevolumen ×/(0.54) × (mg Enzym/ml Reaktionsmix)
DE = Extinktionsdifferenzdifferenz
Gesamtaktivität der Probe [U] = Vol. akt. [U/ml] × Verdünnung × Probenvolumen [ml]
Gesamtaktivität der Probe [U] = Vol. akt. [U/ml] × Verdünnung × Probenvolumen [ml]
Eine Unit ist definiert als diejenige Enzymaktivität, die die Bildung von 1 mmol p-Toluol
sulfonyl-I-arginin unter den gewählten Assyaybedingungen (25°C, pH 7.5) pro Minute
bewirkt.
Elastase (EC 3.4.21.36, Sigma Chemical Steinheim) katalysiert die Spaltung von zum
Beispiel Elastin in Aminosäuren und Peptide. Die Aktivitätsbestimmung des gelösten
Enzyms erfolgt mit einem spektrophotometrischem Assay modifiziert nach Sacher et al.
(Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 90, 1955 (1955)). Die Extinktionszunahme bei 590 nm korre
liert mit der hydrolytischen Freisetzung von Orcein aus Elastin-orcein (Sigma Chemical
Steinheim).
In einem Erlenmeyerkolben werden 20 mg Elastin-orcein eingewogen und mit 1.5 ml
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid (197 mM, pH 8.8) versetzt und auf 37°C
temperiert. Nach Zugabe von 0.5 ml Enzymlösung wird der Kolben verschlossen und bei
37°C gelagert. Durch Zugabe von 2 ml Phosphatpufferlösung (500 mM, pH 6.0) wird die
Reaktion nach 20 Minuten unterbrochen. Der Ansatz wird filtriert und der Kolben mit 1
ml destilliertem Wasser gespült. In einer Quarzküvette (Schichtdicke 10 mm, Hellma
Jena) wird die Extinktion von 3 ml Probenlösung gegen 3 ml einer Referenzposition (2.0
ml Tris(hydroxymethyl)-aminomethan-hydrochlorid (197 mM, pH 8.8), 2.0 ml Phosphat
pufferlösung (500 mM, pH 6.0) und 1.0 ml destilliertes Wasser) bei 590 nm bestimmt.
Die Berechnung der Volumenaktivität der Probe erfolgt nach folgender Formel:
Volumenaktivität der Probe [U/ml] =
E590 × 19.45-0.1185 = mg gespaltenes Elastin-orcein
mg gespaltenes Elastin-orcein/(mg Enzym/0.5 ml Reaktionsmix)
Gesamtaktivität der Probe [U] = Vol. akt. [U/ml] × Verdünnung × Probenvolumen [ml]
Gesamtaktivität der Probe [U] = Vol. akt. [U/ml] × Verdünnung × Probenvolumen [ml]
Eine Unit ist definiert als diejenige Enzymaktivität, die innerhalb von 20 min 1 mg Elastin
unter den gewählten Assyaybedingungen (37°C, pH 8.8) spaltet.
Im folgenden sollen anhand mehrerer Beispiele besonders vorteilhafte Ausführungsfor
men der Erfindung dargestellt werden, ohne damit die Erfindung unnötig einschränken
zu wollen.
Die Synthese der Hydrogels erfolgt durch eine kovalente Vernetzung von α,ω-akti
viertem PEG mit Albumin aus Rinderserum. Zu einer 2%igen (m/V) Proteinlösung in
0.1 m Boratpuffer (pH 6.5-9.0) werden verschiedene Mengen (1-20% m/V) akti
viertes PEG zugegeben und solange gerührt, bis der Gelpunkt einsetzt. Anschlie
ßend wird das gebildete Hydrogel 12 h bei RT gelagert, um eine vollständige Vernet
zung zu erlangen. Um unvernetztes PEG und Protein abzutrennen, wird das Hydro
gel in 15 ml physiologischem Boratpuffer (0.1 m H3BO3, 1 m MgCl2, 1 m CaCl2, 0.15 m
NaCl; pH 7.0) für 48 h inkubiert, wobei die Waschlösungen mehrmals gewechselt
werden. Die dabei eluierten Mengen an Protein werden mithilfe des BCA- und Micro
BCA-Nachweises (Rhoderick, Jarvis and Hyland, 1989, Anal. Biochem., 180, 136)
und die eluierten Mengen an PEG mithilfe des Jod-Nachweises (Sims and Snape,
1980, Anal. Biochem., 107, 60) evaluiert.
Analog findet die Vernetzungsreaktion in 0.05 M Natriumbicarbonatpuffer mit den pH-
Werten 8.5, 9.0 und 9.3 statt sowie in einem 0.1 M Natriumveronalpuffer bei pH 9.0.
Die in Natriumphosphatpuffer hergestellten Hydrogele können durch Austausch in
physiologischen Boratpuffer stabil gehalten werden.
Die folgende Darstellung zeigt schematisch die Vernetzung von PEG35000 mit Rinder
serumalbumin (BSA).
Das ubiquitäre Enzym SOD tritt als dimere oder tetramere Form auf. Die verschiede
nen Enzyme mit Molekulargewichten von 32.000 bis 56.000 Da haben Metall-Ionen
wie Kupfer und Zink (Cu-Zn-SOD), Mangan (Mn-SOD) oder Eisen (Fe-SOD) als Co-
Faktoren im katalytischen Zentrum.
Die Synthese der Hydrogele erfolgt durch eine kovalente Vernetzung von α,ω-akti
viertem PEG mit Superoxiddismutase aus Rind und Hefe. Zu einer 2%igen (m/V)
Proteinlösung in 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0) werden verschieden Mengen (6-25%
m/V) aktiviertes PEG zugegeben und solange gerührt, bis der Gelpunkt einsetzt. Es
werden grünlich transparente Gele erhalten.
Anschließend werden die Hydrogele 12 h bei RT gelagert, um eine vollständige Ver
netzung zu erlangen. Um unvernetztes PEG und Protein abzutrennen, werden die
Hydrogele in 15 ml physiologischem Boratpuffer (0.1 m H3BO3, 0.1 m MgCl2, 0.1 m
CaCl2, 0.15 m NaCl; pH 7.0) für 48 h inkubiert, wobei die Waschlösungen mehrmals
gewechselt werden.
Eine Gelbildung wurde für die PEG PEG20000, PEG15000, PEG10000 und PEG6000 beob
achtet.
Die weitverbreitetste Form der Katalase ist ein Homotetramer (235.000 Da, Rinder
leber) mit einer porphyrinischen Gruppe mit einem Eisenatom je Untereinheit.
Die Synthese der Hydrogele erfolgt durch eine kovalente Vernetzung von α,ω-akti
viertem PEG mit Katalase aus Rinderleber. Zu einer 2.5%igen (m/V) Proteinlösung
in 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0) werden 7.5% (m/V) aktiviertes PEG10000 bzw. 15%
(m/V) aktiviertes PEG6000 zugegeben und solange gerührt, bis der Gelpunkt einsetzt.
Es werden bräunlich transparente Gele erhalten.
Anschließend werden die Hydrogele 12 h bei RT gelagert, um eine vollständige Ver
netzung zu erlangen. Um unvernetztes PEG und Protein abzutrennen, werden die
Hydrogele in 15 ml physiologischem Boratpuffer (0.1 m H3BO3, 0.1 m MgCl2, 0.1 m
CaCl2, 0.15 m NaCl; pH 7.0) für 48 h inkubiert, wobei die Waschlösungen mehrmals
gewechselt werden.
Die Synthese der Hydrogele erfolgt durch eine kovalente Vernetzung von α,ω-akti
viertem PEG mit Superoxiddismutase aus Hefe und Katalase aus Rinderleber. Zu
einer 2.4%igen (m/V) Superoxiddismutase-Lösung in 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0)
werden 0.8-0.15% (m/V) Katalyse und 5% (m/V) aktiviertes PEG zugegeben und
solange gerührt, bis der Gelpunkt einsetzt. Es werden grün-bräunlich transparente
Gele erhalten.
Anschließend werden die Hydrogele 12 h bei RT gelagert, um eine vollständige Ver
netzung zu erlangen. Um unvernetztes PEG und Protein abzutrennen, werden die
Hydrogele in 15 ml physiologischem Boratpuffer (0.1 m H3BO3, 0.1 m MgCl2, 0.1 m
CaCl2, 0.15 m NaCl; pH 7.0) für 48 h inkubiert, wobei die Waschlösungen mehrmals
gewechselt werden. Eine Gelbildung wurde für PEG10000 und PEG6000 beobachtet.
Die Synthese der Hydrogele erfolgt durch eine kovalente Vernetzung von α,ω-akti
viertem PEG mit Collagenase aus Achromobacter iophagus. Zu einer 5%igen (m/V)
Proteinlösung in 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0) werden 7.5-15% (m/V) aktiviertes
PEG15000 bzw. aktiviertes PEG10000 zugegeben und solange gerührt, bis der Gelpunkt
einsetzt. Es werden rot-bräunlich transparente Gele erhalten.
Anschließend werden die Hydrogele 12 h bei RT gelagert, um eine vollständige Ver
netzung zu erlangen. Um unvernetztes PEG und Protein abzutrennen, werden die
Hydrogele in 15 ml physiologischem Boratpuffer (0.1 m H3BO3, 0.1 m MgCl2, 0.1 m
CaCl2, 0.15 m NaCl; pH 7.0) für 48 h inkubiert, wobei die Waschlösungen mehrmals
gewechselt werden.
Die Synthese der Hydrogele erfolgt durch eine kovalente Vernetzung von α,ai-akti
viertem PEG mit Lysozym aus Hühnereiweiß. Zu einer 2.5-0%igen (m/V) Protein
lösung in 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0) werden 7.5-15% (m/V) aktiviertes zugegeben
und solange gerührt, bis der Gelpunkt einsetzt. Es werden milchig-trübe Gele erhal
ten.
Anschließend werden die Hydrogele 12 h bei RT gelagert, um eine vollständige Ver
netzung zu erlangen. Um unvernetztes PEG und Protein abzutrennen, wird das
Hydrogel in 15 ml physiologischem Boratpuffer (0.1 m H3BO3, 0.1 m MgCl2, 0.1 m
CaCl2, 0.15 m NaCl; pH 7.0) für 48 h inkubiert, wobei die Waschlösungen mehrmals
gewechselt werden.
Eine Gelbildung konnte für folgende PEG beobachtet werden: PEG35000, PEG20000,
PEG15000, PEG10000 und PEG6000.
Die Synthese der Hydrogele erfolgte durch eine kovalente Vernetzung von α,ω-akti
viertem PEG mit Trypsin aus Rind. Zu einer 2.5-5%igen (m/V) Proteinlösung in 0.1 m
Boratpuffer (pH 9.0) wurden 7.5-15% (m/V) aktiviertes PEG zugegeben und solange
gerührt, bis der Gelpunkt einsetzte. Es wurden milchig-trübe Gele erhalten. Anschlie
ßend werden die Hydrogele 12 h bei RT gelagert, um eine vollständige Vernetzung zu
erlangen. Um unvernetztes PEG und Protein abzutrennen, wurde das Hydrogel in 15 ml
physiologischem Boratpuffer (0.1 m H3BO3, 0.1 m MgCl2, 0.1 m CaCl2, 0.15 m NaCl; pH
7.0) für 48 h inkubiert, wobei die Waschlösungen mehrmals gewechselt wurden. Eine
Gelbildung konnte für folgende PEG beobachtet werden: PEG10000 und PEG6000.
Die Synthese der Hydrogele erfolgte durch eine kovalente Vernetzung von α,ω-akti
viertem PEG mit Phosphatase aus Weizenkeimen. Zu einer 2.5%igen (m/V) Protein
lösung in 0.1 m Boratpuffer (pH 9.0) wurden 10-15% (m/V) aktiviertes PEG zugegeben
und solange gerührt, bis der Gelpunkt einsetzte. Es wurden bräunliche Gele erhalten.
Anschließend werden die Hydrogele 12 h bei RT gelagert, um eine vollständige Vernet
zung zu erlangen. Um unvernetztes PEG und Protein abzutrennen, wurde das Hydrogel
in 15 ml physiologischem Boratpuffer (0.1 m H3BO3, 0.1 m MgCl2, 0.1 m CaCl2, 0.15 m
NaCl; pH 7.0) für 48 h inkubiert, wobei die Waschlösungen mehrmals gewechselt wur
den. Eine Gelbildung konnte für folgende PEG beobachtet werden: PEG10000 und
PEG6000.
Claims (15)
1. Hydrogel, bestehend aus zumindest einem Protein und/oder Enzym und/oder
SOD/Katalase-Enzym-Mimic und PEGs sowie Teilen von Proteinen und Enzymen
und/oder rekombinant hergestellten Proteinen und Enzymen, wobei die Verbin
dung zwischen den Proteinen und/oder Enzymen und den PEGs über Harnstoff
gruppen erfolgt.
2. Hydrogel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das PEG ein Mol
gewicht von 8.000 bis 18.000 g/mol, insbesondere 10.000 bis 15.000 g/mol auf
weist.
3. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß zur Aktivie
rung des PEGs aliphatische oder aromatische oder araliphatische Diisocyanate,
insbesondere 1,6-Hexamethylen-diisocyanat, eingesetzt werden.
4. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine
Antikörper, Matrix-Metallo-Proteasen, Enzyminhibitoren, Peptide verwendet wer
den.
5. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine
Radikalfänger wie Superoxiddismutase, Katalase, Glutathion-Peroxidase, Myelo
peroxidase und SOD/Katalase-Enzym-Mimics und/oder Kombinationen daraus
verwendet werden.
6. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine
antimikrobiell wirksame Enzyme wie Lysozym und Hydrolasen eingesetzt werden.
7. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine
phosphorylierend wirksame Enzyme wie Phosphatasen und Kinasen eingesetzt
werden.
8. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine
Wachstumsfaktoren wie PDGF eingesetzt werden.
9. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Proteine
proteolytisch wirkende Enzyme wie Collagenase, Trypsin, Elastase und/oder
Kombinationen daraus eingesetzt werden.
10. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß als Pro
teine proteinogene Protease-Inhibitoren wie Aprotenin, Sojabohnen-Trypsininhibi
tor und Alpha-2-Makroglobulin und/oder Kombinationen daraus eingesetzt werden.
11. Hydrogel nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß Proteine
in Mischungen eingesetzt werden.
12. Verfahren zur Herstellung eines Hydrogels nach zumindest einem der vorherigen
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) wasserfreie PEGs in Lösungsmittel mit Diisocyanat gegebenenfalls unter Zusatz eines Katalysators umgesetzt werden,
- b) das resultierende Produkt aus aktiviertem PEGs vom Lösungsmittel durch Abfiltern, Waschen oder Trocknung befreit wird,
- c) die aktivierten PEGs in wäßriger Lösung mit Proteinen umgesetzt werden, wobei sich die Proteine in einem Puffer befinden, der bevorzugt so gewählt ist, daß die Proteine ihre biologische Aktivität erhalten,
- d) gegebenenfalls Reinigungsschritte und Waschungen vorgenommen werden.
13. Verfahren zur Herstellung eines Hydrogels nach Anspruch 12, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Hydrogel dehydratisiert ist.
14. Verwendung des Hydrogels gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche
als Wundauflage insbesondere für tiefe und flächige chronische Wunden sowie
Brandwunden.
15. Verwendung des Hydrogels gemäß mindestens einem der vorherigen Ansprüche als
Auflage auf gegebenenfalls luft- und wasserdampfdurchlässigen Trägermaterialien
wie Binden, Kompressen, Pflastern, Folien, Filmen und dergleichen.
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