JP3342007B2

JP3342007B2 - 低分子ヘパリン修飾体及び皮膚潰瘍治療剤

Info

Publication number: JP3342007B2
Application number: JP2000522139A
Authority: JP
Inventors: 郁男山科; 實岡山; 憲一戸田
Original assignee: 郁男山科
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1998-11-18
Publication date: 2002-11-05
Anticipated expiration: 2018-11-18
Also published as: EP1033375A1; WO1999026984A1; AU1173599A; US6569840B1; CA2310422A1; EP1033375A4

Description

【発明の詳細な説明】技術分野この発明は、低分子ヘパリン修飾体及び皮膚潰瘍治療
剤に関するものである。とくに、この発明は、細胞増殖
因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保
持していて、しかも抗血液凝固活性を実質的に喪失した
ヘパリン修飾体を皮膚潰瘍治療剤として使用することに
関するものであり、またそのような皮膚潰瘍治療剤を作
るに好適な低分子ヘパリン修飾体に関するものである。

背景技術ヘパリンは、グリコサミノグリカン類の一種で、血液
凝固阻止作用を持っていることが大きな特徴とされる。
ヘパリンは健康な食用獣の肝、肺、腸、脾に多く見ら
れ、毛細管周辺のマスト細胞で特異的に産生される。ヘ
パリンは、種々の程度にＯ−硫酸基、Ｎ−硫酸基、又は
Ｎ−アセチル基を持ったグルコサミノグリカンであっ
て、分子量が６，０００〜２０，０００のヘテロ多糖類
である。

さらに詳しく云えば、ヘパリンは下記化学式表１に示
すような１０種類の二糖の組み合わせで構成されてい
る。

ここで、ＧｌｃＡはＤ−グルクロン酸、ＧｌｃＮＡｃ
はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、ＧｌｃＮＳはＮ−
スルホ−Ｄ−グルコサミン、ＧｌｃＡ（２ＯＳ）は２−
スルホ−Ｄ−グルクロン酸、ＧｌｃＮＳ（６ＯＳ）はＮ
−スルホ−Ｄ−グルコサミン−６−硫酸、ＧｌｃＮＳ
（３，６ｄｉＯＳ）はＮ−スルホ−Ｄ−グルコサミン−
３，６−ジ硫酸、ＩｄＡはＬ−イズロン酸、ＩｄＡ（２
ＯＳ）は２−スルホ−Ｌ−イズロン酸である。

ヘパリンは、多彩な生物活性を示す。すなわち、ヘパ
リンは多種類の細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞
接着因子と結合し、またアンチトロンピンIIIを始め多
くの血液凝固・線溶系の酵素及び作用因子と結合して、
前述のように血液凝固を阻害する。

ヘパリン自体には、もともと皮膚の潰瘍治療効果があ
るとは考えられない。なぜならば、ヘパリンを皮膚の潰
瘍に接触させると、ヘパリンが血液凝固を阻害する性質
を持つために、却って出血を促し、潰瘍を悪化させるこ
とになるおそれがある、と考えられるからである。

ヘパリンは、その分子を切断して低分子ヘパリンとし
たり、ヘパリンを化学的に修飾して薬剤として用いよう
とする試みがなされている。例えば、特開昭５４−３０
２７７号公報は、ヘパリンを解重合して分子量が２，０
００〜５，０００の低分子ヘパリンにするとともに、化
学的に修飾して、これを血栓症治療用薬剤として使用す
ることを提案している。

また、ＷＯ８０／０１３８３号公報は、ヘパリンを亜
硝酸で処理したり、又は過沃素酸により酸化し次いでア
ルカリによりβ−脱離反応を行って、抗トロンビン作用
が弱く、抗Ｘａ因子活性が増強された選択的抗血液凝固
活性を有する低分子ヘパリンが得られたことを記載して
いる。

特開昭６３−６６１９２号公報は、細胞成長因子に対
して親和性を示すとともに、特異な核磁気共鳴スペクト
ルを示すヘパリン型の少糖類が、筋肉及び血管の治療用
に使用できることを記載している。

ＷＯ８８／０６８４０号公報は、ヘパリンを適当な濃
度にして、細胞の保存及び回復用に使用することを記載
している。

米国特許第５，２８０，０１６号は、ヘパリンを解重
合することなく、ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで
水素化硼素で還元してヘパリン修飾体を作り、これを筋
肉細胞増殖阻止のための注射薬として使用することを記
載している。

米国特許第５，２９６，４７１号明細書は、ヘパリン
の２−Ｏ−硫酸基及び３−Ｏ−硫酸基を様々な程度に除
去して、癌などの疾病の予防や治療に用いることを記載
している。

特表平７−５０５１７９号公報は、ヘパリンを化学的
又は酵素的に切断して得られた各種少糖類又はオリゴ糖
について、細胞成長因子との結合性を指標として種々の
画分に分け、各画分を特定の細胞に対する増殖調整剤と
して用いることを提案している。

ＷＯ９６／２９９７３号公報は、ヘパリンを亜硝酸に
より切断して低分子ヘパリンとし、得られた低分子ヘパ
リンを過沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元し
て、抗血液凝固活性を持たない低分子ヘパリン修飾体を
得て、これを血栓生成阻止のための注射薬として使用す
ることを記載している。

ＷＯ９８／１４４８１号公報は、ヘパリンを亜硝酸に
より解重合して低分子ヘパリンとし、次いで低分子ヘパ
リンを過沃素酸により酸化し、その後に水素化硼素で還
元して抗血液凝固活性を示さない低分子ヘパリン修飾体
を得て、これを腎臓、心筋梗塞症等の治療用に使用する
ことを記載している。

このように、ヘパリンは、ヘパリンを解重合して得ら
れた低分子ヘパリン又はヘパリンそのものを化学的に修
飾し、得られた修飾体を薬剤として使用することが知ら
れているが、その薬剤は主に注射用のものであって、心
臓、腎臓などの臓器疾患の治療に供せられるものであ
る。

発明の開示この発明者等は、ヘパリンの持つ細胞増殖因子、サイ
トカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持させたま
ま、ヘパリンの持つ抗血液凝固作用及び出血、線溶作用
を消滅させるか又は最小限に抑えると、得られたものは
創傷、褥瘡治療効果を示すことになろうと考えた。

このような考えに基づいて、この発明者等は、ヘパリ
ンを過沃素酸で酸化し次いで水素化硼素で還元してヘパ
リン修飾体を作り、さらにこれを化学的に切断して平均
分子量を約１，５００〜８，０００の範囲内にとどめた
ところ、得られた低分子ヘパリン修飾体が細胞増殖因
子、サイトカイン類又は細胞接着因子などとの結合性を
保持しており、しかも血液凝固性を喪失したものとなる
ことを確認した。

そこで、この発明者等は、上述の低分子ヘパリン修飾
体を適当な基剤と混合してこれを塗布薬とし、この塗布
薬を皮膚潰瘍のある患者に塗布して経過を観察した結
果、この塗布薬がすぐれた創傷治療効果、とくに褥瘡治
療効果を示すことを見出した。この知見を根拠に、この
発明者等はさらに検討を重ねた結果、この発明を完成す
るに至ったのである。

この発明は、ヘパリンを化学的に修飾することによ
り、ヘパリンの持つ細胞増殖因子、サイトカイン類又は
細胞接着因子との結合性を残したまま、抗血液凝固活性
を減弱させて得られたヘパリン修飾体を皮膚潰瘍治療剤
として使用することを骨子とするものである。また、こ
の発明は、そのような皮膚潰瘍治療剤として使用するの
にとくに好適な低分子ヘパリン修飾体を提供するもので
ある。

ここで、ヘパリンの持つ細胞増殖因子、サイトカイン
類又は細胞接着因子との結合性とは、例えば免疫応答の
制御作用、抗潰瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖、分
化の調節作用などを示すこと、また細胞から放出され、
細胞間相互作用を媒介する蛋白質性因子、サイトカイン
類又は細胞接着因子と相互作用を持つこと、さらに互い
の作用を増強（場合によっては減弱）することを意味し
ている。また、上記の蛋白質性因子としては、例えばイ
ンターフェロンγ、インターロイキン、腫瘍壊死因子、
リンホトキシン、コロニー刺激因子、上皮増殖因子、繊
維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子β、
血管内皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、ラミニン、フ
ィブロネクチンなどが挙げられる。

また、抗血液凝固活性とは、血液を凝固させない性質
を云うのである。抗血液凝固活性は、ＡＰＴＴ(Activat
ed Partial Thromboplastin Time、活性部分トロンボプ
ラスチン時間）により抗トロンビン活性を測り、また抗
Ｘａ因子活性測定法によって抗Ｘａ因子活性を測って、
それらの値をもって知ることができる。これら活性の測
定方法は、例えば、T. W. Barrowcliffe氏の記述（Hepa
rin assays and standardization in Heparin, D.
A. Lane and U. Lindahl ed. Edward Arnold, 198
9, P. 393-415）に詳しく説明されているので、これに
よって抗血液凝固活性を知ることができる。

以下で、この発明を詳しく説明するが、その場合、図
１はヘパリンと比較した実施例１、実施例２、実施例
３、参考例１及び参考例２の化合物の高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）による分析結果を示しており、
図２は試験例１における実施例１、実施例２、実施例３
及び参考例２の化合物による皮膚潰瘍治療日数の比較を
示しており、図３は試験例２におけるワセリンとヘパリ
ン又は参考例１の化合物の皮膚潰瘍治療日数の比較を示
し、図４は試験例１におけるワセリンのみによる治療１
１日目の染色した組織標本の顕微鏡写真を示し、図５は
試験例１における実施例１、実施例２及び実施例３の化
合物による治療１１日目の染色した組織標本の顕微鏡写
真を示し、図６は試験例２における参考例２の化合物に
よる治療１１日目の染色した組織標本の顕微鏡写真を示
している。

この発明では、ヘパリンを修飾したヘパリン修飾体、
又はヘパリンを低分子化するとともに修飾して低分子ヘ
パリン修飾体としたものを皮膚潰瘍治療剤として用い
る。低分子化と化学的修飾とは、何れを先にしてもよ
い。従って、低分子ヘパリン修飾体は、低分子ヘパリン
を入手してこれに化学的修飾を施すだけで得られたもの
であってもよく、またヘパリンをまず化学的に修飾して
のち、得られた修飾体の分子を切断して低分子ヘパリン
としたものであってもよい。

低分子ヘパリン修飾体を作るのに、この発明では、ま
ずヘパリンを化学的に修飾してヘパリンの血液凝固性を
喪失させ、その後に低分子化する方法を用いた。化学的
に修飾するには、古くから知られている過沃素酸により
まず酸化し、次いで水素化硼素により還元する方法を用
いた。過沃素酸は既に知られているように、一般に隣接
するジオール構造又はアミノアルコール構造を有する部
分に作用して、２個のアルデヒド基を生成させる（例え
ば、L.-A. Fransson等、Carbohydr. Res., 80, 131-14
5, 1980 ）。ヘパリンに過沃素酸を作用させると、化学
式表２に示すように、ヘパリンの中では硫酸基を持たな
いヘキスロン酸（グルクロン酸及びイズロン酸）が、こ
の酸化を受ける。酸化の程度は、試薬の濃度、反応のと
きのpH、温度、時間によって著しく左右される。

過沃素酸による酸化の場合には、pHはとくに重要であ
る。pH３程度の低いpHではイズロン酸が優先的に酸化さ
れ、pHが約５以上ではグルクロン酸も酸化される。抗血
液凝固活性を喪失させるためには、グルクロン酸を酸化
する必要があるので、この発明ではpHを３〜６、好まし
くは５とする。こうして、化学式表２中でアルデヒド基
を持った化合物(c)を得る。この化合物(c)をさらに水素
化硼素によって還元して、化学式表２中の化合物(a)を
得る。化合物(a)は血液凝固活性を持たないものである
（B.Basu et al, Arzneim. -Forsh./Drug Res.,36,637-
642, 1986 ）。化合物(a)は、米国特許第５，２８０，
０１６号に記載されている化合物である。

化学式表２では、イズロン酸を例に取ってその酸化、
還元を示しているが、グルクロン酸の場合も同様であ
る。化学式(a)で表されるヘパリン修飾体は酸性で低分
子化するが、この時pH、温度、反応時間を調節すること
により、適当な大きさの低分子物を得ることができる。
化学式(a)及び(c)で表されるヘパリン修飾体は、皮膚潰
瘍治療作用を有するが、その治療作用はこれを低分子化
した低分子ヘパリン修飾体に比べると劣っていることが
判明している。

他方、過沃素酸によって酸化された化合物(c)は、強
アルカリ性の下では化学式表２に示したように、β脱離
反応を起こして低分子化し、(b)で示す化合物を生じて
さらに分解される。こうして得られた低分子ヘパリン修
飾体(d)も、皮膚潰瘍治療剤として使用することができ
る。

このように、化学式表２において化学式(a)及び(c)で
示されたヘパリン修飾体は、何れも皮膚潰瘍治療剤とし
て使用できるが、これらはさきに述べたように、これを
低分子化したものに比べると、潰瘍治療効果において劣
るものである。

この発明では、化学式表２中の化学式(a)で示される
ヘパリン修飾体を低分子化することにより、細胞増殖因
子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持
していて、しかも抗血液凝固活性を実質的に喪失した低
分子ヘパリン修飾体(e)及び(f)を得ることができる。

ヘパリンの低分子化に用いられる化学的切断反応に
は、例えば加水分解法、脱アミノ化分解法、過沃素酸酸
化分解法、ラジカル誘導酸化還元分解法、加硫酸分解
法、及び脱離反応による分解法などが挙げられる（長沢
金蔵、糖鎖工学、(株)産業調査会・バイオテクノロジー
情報センター発行、１９９２年８月、P.315-342 ）。

この発明では、ヘパリンの低分子化に加水分解法又は
脱アミノ化分解法を用いた。何れの方法を用いても、充
分に制御された条件の下で反応を進めれば、満足な効果
を得ることができる。

加水分解法は、酸性で行うこととし、例えばpHを２と
し温度を６０℃とすれば３時間で完全に加水分解を行う
ことができる。こうして化学式表２の左下に示すよう
に、最終的にはすべてのヘキスロン酸のところで分子を
切断することができる。そこで、反応時間を適当に短縮
したり、反応温度を下げたりすることによって、加水分
解を適当のところで止め、所望の平均分子量を持った低
分子ヘパリン修飾体(e)及び(f)を得ることができる。

ここに得られる(e)の還元末端であるアミノ糖のアグ
リコンであるＬ−トレオン酸のカルボキシル基をエステ
ル化、アミド化等によって修飾して得られる二次変換体
も低分子ヘパリン修飾体に含まれる。

脱アミノ化分解法は、亜硝酸を用いて酸性で化学式表
３に示すように行われる。亜硝酸は低いpHではアミノ糖
のＮ−硫酸基に反応して中間体として不安定なＮ−ニト
ロソ体を生じ、この中間体が分子内縮環により２、５−
アンヒドロ−Ｄ−マンノースを形成し、アミノ糖のグリ
コシド結合が切断される。亜硝酸とアミノ糖のＮ−硫酸
基との反応はpH１．５で最も迅速に進行し、pHの上昇と
ともに反応速度が低下し、pH４になると反応が実質的に
進行しなくなる。従って、亜硝酸の濃度（量）、反応時
間、pH及び反応温度を調節することにより、所望の平均
分子量を持った低分子ヘパリン修飾体を得ることができ
る。

上述の亜硝酸との反応により得られる低分子ヘパリン
の還元末端である２、５−アンヒドロ−Ｄ−マンノース
のアルデヒド基は、下記の化学式表４に示すような種々
の化学修飾をすることができる。例えば、アミノ基を持
った化合物と反応させてシッフ塩基を形成させて誘導体
にすることができ、また、炭酸水素ナトリウムの存在下
に水又はアルコール等の溶媒中で当量の水酸化硼素ナト
リウムを用いて氷冷ないし室温で還元することにより対
応するアルコールにすることができ、またセライト存在
下に活性二酸化マンガンを１ないし５当量用いて水又は
アルコール中で酸化することにより対応するカルボン酸
にすることができる。さらにこうして得られたカルボン
酸をエステル化又はアミド化することにより、対応する
種々のエステル体又はアミド体にすることができ、また
アミンの存在下に水素化硼素による還元アミノ化反応に
より対応する種々の置換アミノメチル体にすることがで
きる。こうして得られた二次変換体も、皮膚潰瘍治療効
果を発揮する。従って、この二次変換体も、低分子ヘパ
リン修飾体に含まれる。

低分子ヘパリン修飾体としては、平均分子量が約１，
５００〜８，０００のものが好ましく、とりわけ約２，
０００〜６，０００のものが好ましい。ヘパリン修飾体
と、もとのヘパリンと、低分子ヘパリン修飾体（例え
ば、のちに述べる実施例１〜実施例３で得られた低分子
ヘパリン修飾体）とは高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）によって明瞭に区別することができる。

図１は、東ソー(株)製のカラム、ＴＳＫ、Ｇ−２００
０ＳＷＸＬ（直径０．７８ｃｍ、長さ３０ｃｍ）を使
用し、この中にシリカ樹脂を加工して分子篩の性質を持
たせたものを充填して行ったＨＰＬＣの結果を示すもの
である。このカラムはヘパリンのような直鎖状に近い分
子の場合に、分子量が約５００から２０，０００の範囲
内で有効な分別を行うことができるものである。

カラムを(株)島津製作所製のＨＰＬＣ６Ａシリーズ
のクロマトパックＣ−Ｒ４Ａに接続した。溶媒として
０．１５Ｍ食塩を含むpH７．３の０．０１Ｍ燐酸緩衝液
を用い、１分あたり０．５mの流速で展開した。室温
で行い溶出液に２１０ｎｍの光をあてて、この光の吸収
によりヘパリン及びその誘導体を検出した。

図１は、横軸に時間（単位は分）を取り、縦軸に２１
０ｎｍの光の吸収の相対強度を目盛ったものである。図
１において、四角印を含む線はヘパリンを示し、丸印を
含む線はヘパリン修飾体（参考例２で得られたヘパリン
修飾体）を示し、三角印を含む線は低分子ヘパリン（参
考例１で得られたもの）を示し、無印の太い実線は低分
子ヘパリン修飾体（実施例１、実施例２及び実施例３で
得られたもの）を示している。低分子ヘパリン修飾体は
分子量約１，５００〜８，０００の領域に溶出されてい
る。このように、低分子ヘパリン修飾体はもとのヘパリ
ン及びヘパリン修飾体とは明瞭に区別できる。なお、図
１では参考例２で得られたヘパリン修飾体がやや低分子
物のように振る舞っているが、これは分子変形のため
で、恐らくヘキスロン酸が開環したために、分子がやや
湾曲したことによるものと考えられる。また、溶出時間
約２２分の位置に見られるピークは塩類に相当する。

このようにして得られるヘパリン修飾体又は低分子ヘ
パリン修飾体は、自体公知の方法で適宜分離精製して治
療剤として使用する。分離精製する方法としては、有機
溶媒（アルコール、アセトンなど）を用いる沈殿法、各
種のクロマトグラフィー（例えば、イオン交換樹脂クロ
マトグラフィー、活性炭、抗体、セファロースなどを用
いるクロマトグラフィーなど）、分子篩による精製など
を用いることができる。

この発明では、皮膚潰瘍治療剤として、参考例２で得
られた低分子化されていないヘパリン修飾体と、低分子
化されたヘパリン修飾体とを用いることができるが、そ
のうちで好ましいのは低分子ヘパリン修飾体である。

低分子化を加水分解法で行った場合には、還元末端に
Ｌ−トレオン酸をアグリコンとするアミノ糖、非還元末
端にアミノ糖を有するものが得られ、低分子化を脱アミ
ノ化分解法で行った場合には、還元末端に２、５−アン
ヒドロ−Ｄ−マンノース、非還元末端にウロン酸を有す
るものが得られる。

この発明では、ヘパリン修飾体及び低分子ヘパリン修
飾体（以下、この両者を併せてヘパリン誘導体という）
は、遊離体又は各種の塩として用いることができる。塩
としては薬理学的に許容される塩であれば、どのような
ものであってもよい。例えば、酢酸などの有機酸、又は
塩酸などの無機酸の塩として用いることができる。ま
た、ヘパリン誘導体中の硫酸残基などの酸性基をアルカ
リ金属、アルカリ土類金属の塩として用いることもでき
る。また、修飾体は単一化合物でなくて混合物であって
もよい。

本発明のヘパリン誘導体は各種皮膚潰瘍、例えば、皮
膚組織の壊死、剥離、融解等によりもたらされる皮膚の
破損、欠損など、さらに具体的には創傷、褥瘡、熱傷、
凍傷または手術創、皮膚感染により発症する潰瘍（例、
皮膚真菌症、乾癬、水疱瘡、水虫、たむし、ニキビな
ど）の治療に有効である。

本発明のヘパリン誘導体は皮膚潰瘍治療剤として、非
経口または経口により投与することができる。好ましく
は、非経口投与により用いられる。投与形態としては、
非経口の場合は、経皮投与製剤の形態、すなわち皮膚患
部に投与できる形態であればいずれでも良い。経皮的に
活性成分を投与し得る製剤として、好ましくは、パッチ
剤、パップ剤、軟膏剤（クリーム剤も含む）、硬膏剤、
テープ剤、ローション剤、液剤、懸濁剤、乳剤、噴霧剤
（スプレー剤も含む）などが挙げられる。また、活性成
分のコントロール等の点からパッチ剤、パップ剤、テー
プ剤、硬膏剤等の貼付剤、軟膏剤および噴霧剤が特に好
ましい。

軟膏剤、ローション剤、液剤、懸濁剤、乳剤、噴霧剤
は、製剤分野において自体公知の溶剤、懸濁化剤、乳化
剤、噴射剤、基剤などと共に活性成分を配合して製造す
ることができる。その際、必要により、防腐剤（例、パ
ラオキシ安息香酸エチル、塩化ベンザルコニウムなど）
を配合することもできる。

また、パッチ剤、パップ剤、硬膏剤、テープ剤は製剤
分野において自体公知の基剤を用いて、必要に応じて防
腐剤などを加え、適当な担持体に吸収または付着させ製
造することができる。担持体としては、高分子膜（例、
ポリエチレン、酢酸ビニル共重合体、ポリエチレンフタ
レートなど）、織布、不織布、紙、アルミニウム箔など
が挙げられる。パッチ剤、パップ剤、テープ剤に用いら
れる粘着剤としてはポリアルキルビニルエーテル系、ポ
リアルキルアクリレート系、ポリイソブチレン系、天然
ゴム系、合成ゴム系粘着剤が挙げられる。また、適度な
可塑性と粘着性を保持させるために動物油（例、スクワ
レン、スクワランなど）、植物油（例、オリーブ油、ホ
ホバ油など）、ワセリン、ラノリンなどが加えられても
よい。

軟膏剤、硬膏剤、テープ剤、パッチ剤、パップ剤など
の経皮投与製剤を製造する際には、経皮吸収を調節する
成分、例えば脂質や脂溶性物質、具体的にはレシチンな
どのリン脂質、固形パラフィン、ミツロウ、カルナウバ
ロウ、硬化ヒマシ油、ラノリン、ワセリン、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリ
コール、グリセリン脂肪酸エステル、コレステロール、
炭素数約６〜約２２の脂肪族カルボン酸（例、カプロン
酸、カプリル酸、カプロン酸、ラウリン酸、ミリスチン
酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸など）
およびその塩類、炭素数約６〜約２２の脂肪族アルコー
ル（例、ｎ−オクチルアルコール、ｎ−セチルアルコー
ル、ステアリルアルコールなど）、シリコン樹脂及び低
級アルコール（例、エタノール、イソプロピルアルコー
ルなど）などを配合することができる。当然、活性成分
とこれらの基剤単独または複合で用いてもよい。

溶剤としては水、低級アルコール（例、エタノールな
ど）、炭素数約２〜約６のアルカンジオール（例、グリ
セリンなど）、炭素数約３〜約７のアルカントリオール
（例、グリセリンなど）などが挙げられる。

懸濁化剤や乳化剤としては、アラビアゴム、カルボキ
シメチルセルロース、メチルセルロース、アルギン酸ナ
トリウムなどが挙げられる。

軟膏剤、テープ剤、パッチ剤、パップ剤などの基剤と
しては、例えば、ワセリン、固形パラフィン、植物油、
鉱物油、ラノリン、蝋類、マクロゴール類などが挙げら
れる。硬膏基剤としては、ミツ蝋、パラフィン、マクロ
ゴール類、グリセリン脂肪酸エステル類などが挙げられ
る。

噴射剤としては、不燃性液化ガス（例、フレオン１
１、フレオン１２、フレオン１３など）などが挙げられ
る。

経口投与の場合は、例えば、錠剤、カプセル剤、散
剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤などとして投与
され、これらは常法にしたがって製造できる。

本発明の皮膚潰瘍治療剤に含まれるヘパリン誘導体の
配合量は所望の治療効果を発揮できる量であれば特に制
限はない。投与する対象がヒトあるいは動物により異な
ると同時に、その疾患の種類および疾患の程度により異
なる。例えば、本発明の褥瘡治療剤における活性成分の
ヘパリン誘導体は経皮製剤全重量の約０．００１重量％
〜約３０重量％、好ましくは、０．０１重量％〜約１０
重量％、より好ましくは約０．０５重量％〜約５重量％
であり、パッチ剤、硬膏剤、テープ剤などにおいては単
位面積当たりでは、約０．１ｍｇ〜約２００ｍｇ／ｃｍ
² 、好ましくは約１ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｃｍ² である。
投与回数は疾患およびその程度により適宜選択される
が、例えば、１日１回ないし数回経皮貼付あるいは投与
され、貼付日数あるいは投与日数は２日以上である。

本発明の皮膚潰瘍治療剤は、互いの治療効果を減弱し
ない限り、有効成分として他の薬剤を含有していても良
い。かかる他の薬剤としては、皮膚潰瘍治療を阻害しな
いものであればいずれでも良く、例えば各種の細胞増殖
因子、サイトカイン類または細胞接着因子（好ましくは
トランスフォーミング増殖因子β、血管内皮細胞増殖因
子、繊維芽細胞成長因子、肝細胞増殖因子）、各種抗生
物質（抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤など）、各種ス
テロイド剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、抗ヒスタミン
剤などが挙げられる。

脂質としては例えばリン脂質、好ましくはレシチン、
脂溶性物質としては例えば動物油（例、スクワレン、ス
クワランなど）、植物油（例、オリーブ油、ホホバ油な
ど）、固形パラフィン、ミツロウ、カルナウバロウ、硬
化ヒマシ油、ラノリン、ワセリン、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、
グリセリン脂肪酸エステル、コレステロール、炭素数約
６〜約２２の脂肪族カルボン酸（例、カプロン酸、カプ
リル酸、カプロン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パル
ミチン酸、ステアリン酸、アラキドン酸など）およびそ
の塩類、炭素数約６〜約２２の脂肪族アルコール（例、
ｎ−オクチルアルコール、ｎ−セチルアルコール、ステ
アリルアルコールなど）、好ましくはワセリン、ポリエ
チレングリコール、炭素数約６〜約２２の脂肪族アルコ
ール（例、ｎ−オクチルアルコール、ｎ−セチルアルコ
ール、ステアリルアルコールなど）、より好ましくはワ
セリン、ポリエチレングリコール、ステアリルアルコー
ルなどが挙げられる。

本発明の皮膚潰瘍治療剤は極めて毒性が低く、長期投
与においても副作用あるいは毒性がほとんど見られな
い。従って、本発明のヘパリン誘導体を含んでなる経皮
投与製剤は前述の皮膚潰瘍、特に褥瘡治療のために安全
に経皮投与することができる。

本発明のヘパリン誘導体を含むことを特徴とする製剤
は投与が簡便であり、特に褥瘡の治療では院内使用のみ
ならず在宅治療における患者およびその介護の負担を大
幅に軽減することができる。

本発明はさらに下記の参考例、実施例、試験例で詳し
く説明されるが、これらは単なる例であって本発明を限
定するものではない。

発明実施の形態参考例１ブタ由来のヘパリン１ｇを蒸留水１２．５ｍｌに溶解
し、これに室温で５％亜硝酸ナトリウム水溶液１．２５
ｍｌを加えた。次いで、撹拌しながら３３％酢酸水溶液
１．２５ｍｌを加え、さらに室温で５０分間撹拌した。
反応溶液に１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液４ｍｌおよび１Ｍ
水酸化ナトリウム水溶液１ｍｌを順次加え、反応溶液の
pHを９．０に調整した。これに０．２５Ｍ水素化硼素ナ
トリウムを含有する０．０１Ｍ水酸化ナトリウム溶液
０．３ｍｌを加え、５０℃で３０分間放置した。ついで
氷酢酸を加えて過剰の水素化硼素ナトリウムを分解した
後、０．３Ｍ酢酸ナトリウムで平衡化したセファデック
スＧ−２５のカラムに通した。得られた高分子量画分を
減圧下に濃縮した後、エタノールを加えて目的物を沈殿
させた。これを濾別後、乾燥して抗血液凝固活性を有す
る低分子ヘパリン約０．９g を得た。

同様の操作でウシ由来のヘパリンから抗血液凝固活性
を有する低分子ヘパリンを得ることができる。ここで得
られた低分子ヘパリンのＨＰＬＣでの振る舞いは、図１
に三角印を含む線で示した。

参考例２ブタ由来のヘパリン１g を２０ｍｌの、０．１Ｍ過沃
素酸ナトリウムを含む０．０５Ｍ酢酸緩衝液（pH５．
０）に溶解し、４℃で暗所に７２時間放置した。反応液
にグリセロールを加えて、過剰の過沃素酸を分解した
後、透析用半透膜（S ｐｅｃｔｒｕｍ社製ＣｏｄｅＮ
ｕｍｂｅｒ５３０−３５１８，ＭＷ５００ｃｕｔ）を用
いて、約５℃の蒸留水で３日間透析した。透析した反応
液を凍結乾燥に付し、得られた凍結乾燥品を０．２Ｍ水
素化硼素ナトリウムを含有する０．２５Ｍ炭酸水素ナト
リウム（pH９．５）に１０％になるように溶解した。こ
の反応液を４℃で３時間放置した。氷酢酸を加えて過剰
の水素化硼素ナトリウムを分解しながら、反応液のpHを
５．０に調整し、３０分放置した。次いで、反応液を
０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で中和した。得られた
反応液は再度透析用半透膜を用いて、約５℃の蒸留水で
３日間透析した後、凍結乾燥に付し、ヘパリン修飾体
０．８５ｇの凍結乾燥品を得た。

同様の操作でウシ由来のヘパリンからヘパリン修飾体
を得ることができる。

ここに得られたヘパリン修飾体のＨＰＬＣでの振る舞
いは図１に丸印を含む線で示したが、元のヘパリンに比
して見かけ上やや低分子である。これは分子の変形によ
るものと考えられ、ここに示した修飾では本来分子量の
変化は起こらない筈である。

実施例１参考例１に記載した方法で得たブタ由来の低分子ヘパ
リン１ｇを２０ｍｌの、０．１Ｍ過沃素酸ナトリウムを
含む０．０５Ｍ酢酸緩衝液（pH５．０）に溶解し、４℃
で暗所に７２時間放置した。反応液にグリセロールを加
えて、過剰の過沃素酸を分解した後、透析用半透膜（Ｓ
ｐｅｃｔｒｕｍ社製ＣｏｄｅＮｕｍｂｅｒ５３０−
３５１８，ＭＷ５００ｃｕｔ）を用いて、約５℃の蒸留
水で３日間透析した。透析した反応液を凍結乾燥に付
し、得られた凍結乾燥品を０．２Ｍ水素化硼素ナトリウ
ム溶液を含有する０．２５Ｍ炭酸水素ナトリウム（pH
９．５）水溶液に１０％になるように溶解した。この反
応液を４℃で３時間放置した。氷酢酸を加えて過剰の水
素化硼素ナトリウムを分解しながら、反応液のpHを５．
０に調整し、３０分放置した。次いで、反応液を０．１
Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で中和した。得られた反応液
は再度透析用半透膜を用いて、約５℃の蒸留水で３日間
透析した後、凍結乾燥に付し、本発明の抗血液凝固活性
を有しない低分子ヘパリン修飾体０．７ｇの凍結乾燥品
を得た。

同様の手法でウシ由来の低分子ヘパリンから本発明の
低分子ヘパリン修飾体を得ることができる。

ここに得られた低分子ヘパリン修飾体のＨＰＬＣでの
振る舞いは図１に無印の太い実線で示したが、ヘパリン
及び参考例２で得られたヘパリン修飾体に比して明らか
に低分子である。分子量は見かけ上約１，５００から
８，０００の範囲にある。

実施例２参考例２に記載した方法で得たブタ由来のヘパリン修
飾体１ｇを０．１Ｍ塩酸２０ｍｌに溶解し、pHを注意深
く２．０に調節した。６０℃に急速に加温し、約１時間
放置した。直ちに氷冷しながら０．１Ｍ水酸化ナトリウ
ムで中和し、透析用半透膜（S ｐｅｃｔｒｕｍ社製Ｃ
ｏｄｅＮｕｍｂｅｒ５３０−３５１８，ＭＷ５００ｃ
ｕｔ）を用いて約５℃で、蒸留水に対して３日間透析し
た。内液を凍結乾燥して、０．７ｇの本発明の低分子ヘ
パリン修飾体を得た。

同様の手法でウシ由来のヘパリン修飾体から本発明の
低分子ヘパリン修飾体を得ることができる。

ここに得られた低分子ヘパリン修飾体のＨＰＬＣでの
振る舞いは図１の無印の太い実線で示したが、見かけ上
実施例１で得られた低分子ヘパリン修飾体と同じであ
る。

実施例３参考例２に記載した方法で得たブタ由来のヘパリン修
飾体１ｇを蒸留水１２．５ｍｌに溶解し、これに室温で
５％亜硝酸ナトリウム１．２５ｍｌを加えた。次いで攪
拌しながら３３％酢酸１．２５ｍｌを加え、さらに室温
で５０分間攪拌した。反応溶液に１Ｍ炭酸ナトリウム４
ｍｌ及び１Ｍ水酸化ナトリウム１ｍｌを順次加えてpHを
９．０に調節した。これに０．２５Ｍ水素化硼素ナトリ
ウムを含有する０．０１Ｍ水酸化ナトリウム０．３ｍｌ
を加え、５℃で３０分間放置した。次いで氷酢酸を加え
て過剰の水素化硼素ナトリウムを分解した後、０．３Ｍ
酢酸ナトリウムで平衡化したセファデックスＧ−２５の
カラムを通すか、あるいは、実施例１又は実施例２の場
合と同様、透析した。カラム通過液（分子量の大きい画
分）又は透析内液を濃縮した後エタノールを加えて目的
物を沈殿させた。乾燥して０．９ｇを得た。

同様にして、ウシ由来のヘパリン修飾体から低分子ヘ
パリン修飾体を得ることができる。

ここに得られた低分子ヘパリン修飾体のＨＰＬＣでの
振る舞いは、無印の太い実線で示した実施例１及び実施
例２で得られた低分子ヘパリン修飾体と見かけ上同じで
あった。

実施例４実施例１〜３の何れかで得られた低分子ヘパリン修飾体１重量部ステアリルアルコール３３重量部プロピレングリコール３３重量部ポリアルキルビニルエーテル３３重量部上記量の低分子ヘパリン修飾体およびプロピレングリ
コールを混和後、ステアリルアルコールを加え、混和撹
拌により均一な膏体を調製後、粘着成分のポリアルキル
ビニルエーテルと混和して均一な膏体とした。

得られた膏体をポリエステル製離型ライナーに厚さが
約０．１ｍｍとなるように塗布し、膏体層を形成後、ポ
リエステルフィルムに展着して低分子ヘパリン修飾体１
％（Ｗ／Ｗ）配合貼付剤を得た。

この配合塗布剤を患部の大きさに応じて適宜切断して
治療に用いることができる。

実施例５実施例１〜３の何れかで得られた低分子ヘパリン修飾体１重量部ワセリン６９重量部ポリアルキルビニルエーテル３０重量部これらをよく混和して均一な膏体とした後、伸縮自在
のガーゼ（織布）に厚さ約０．１ｍｍとなるように塗布
して低分子ヘパリン修飾体１％（Ｗ／Ｗ）配合塗布剤を
得た。

実施例６実施例１〜３の何れかで得られた低分子ヘパリン修飾体１重量部ワセリン９９重量部これをよく混和して均一な膏体を得た。この膏体を患
部の大きさに応じて適宜塗布して治療に用いることがで
きる。

試験例１マウス（糖尿病マウスを含む）、ラット、モルモット
およびミニブタを実験動物として用い、本発明の皮膚潰
瘍治癒試験を行うことができる。本試験例ではモルモッ
トを用いた例を以下に記す。

体重約２００ｇないし約３００ｇのモルモットの背部
に、背骨を中心として左右にそれぞれ３ケ所ずつ、径８
ｍｍ、深さ２〜３ｍｍの皮膚潰瘍を金属製パンチ等を用
いて形成せしめた。ワセリン１ｇ当たりに１ｍｇの実施
例１〜３の何れかで得られた低分子ヘパリン修飾体を加
えてよく混和したもの１ｇを左右いずれかの潰瘍部に塗
布し、その対称の位置に薬剤を含まないワセリン１ｇを
塗布して、これを対照とした。背部全体をトランスペア
レントドレッシング（１０ｃｍ×１２ｃｍ）で覆い、伸
縮テープで固定した。

薬剤の有効性は、（ｉ）潰瘍部の完全治癒までの日数
を対照と比較すること、および（ｉｉ）潰瘍部の組織切
片を染色（ヘマトキシリン−エオジン染色）後、解析す
ること、の両方法で判定した。

その結果、（ｉ）図２に示すように、ワセリンのみで
は見かけ上の治療（表面の修復）でも２２±２日を要す
るのに対し、実施例１〜３の何れかで得られた低分子ヘ
パリン修飾体では、１６±２日と顕著な治癒日数短縮効
果が有意に見られた。参考例２の化合物では１７±２日
と、実施例１〜３の何れかで得られた低分子ヘパリン修
飾体と一見匹敵するような効果が見られたが、組織を検
査した結果は、この効果があくまで見かけ上のものであ
ることが分かった。（ｉｉ）１１日目に採取した組織標
本について染色すると、ワセリンのみでは、図４に示す
ように、表面の修復が見られず再表皮化が起こっていな
いと判断された。実施例１〜３の何れかで得られた低分
子ヘパリン修飾体では、図５に示すように、角層も付属
器も形成されてほぼ完全な表皮形成が見られた。一方、
参考例２の化合物では、図６に示すように、一応表面は
修復されているように見えるものの角層も付属器の形成
も不十分で、実施例１〜３の何れかで得られた低分子ヘ
パリン修飾体とは著しく異なっていた。これらの結果か
ら、本発明の低分子ヘパリン修飾体は皮膚潰瘍治療に有
効であることが確認された。

試験例２試験例１と同様の方法で、ヘパリンおよび抗血液凝固
活性を有する参考例１の化合物の皮膚潰瘍治癒試験を行
った。その結果、完全治癒日数の短縮効果（図３）およ
び組織標本における上皮形成ともに有意な差は認められ
なかった。

産業上の利用の可能性本発明のヘパリン修飾体及び低分子ヘパリン修飾体は
優れた創傷治療効果、特に褥瘡治療効果などの皮膚潰瘍
治療効果を有し、しかも極めて毒性が低くて長期投与に
おいても副作用あるいは毒性がほとんど見られないの
で、皮膚潰瘍治療剤として有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特表平６−506685（ＪＰ，Ａ) 国際公開98／14481（ＷＯ，Ａ１) 国際公開96／29973（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C08B 37/10 A61K 31/727 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水
素化硼素で還元して作られ、抗血液凝固活性を実質的に
喪失し、細胞増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因
子との結合性を保持しているヘパリン修飾体を含有して
いることを特徴とする、皮膚潰瘍治療剤。
【請求項２】ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水
素化硼素で還元し、その後低分子化して作られ、１，５
００〜８，０００の平均分子量を持ち、抗血液凝固活性
を実質的に喪失し、細胞増殖因子、サイトカイン類又は
細胞接着因子との結合性を保持している低分子ヘパリン
修飾体を含有していることを特徴とする、皮膚潰瘍治療
剤。
【請求項３】ヘパリンを低分子化し、その後これを過
沃素酸で酸化し、次いで水素化硼素で還元して作られ、
抗血液凝固活性を実質的に喪失し、細胞増殖因子、サイ
トカイン類又は細胞接着因子との結合性を保持している
低分子ヘパリン修飾体を含有していることを特徴とす
る、皮膚潰瘍治療剤。
【請求項４】ヘパリンを過沃素酸で酸化し、次いで水
素化硼素で還元し、その後低分子化して得られた低分子
ヘパリン修飾体の末端にあるアルデヒド基を対応するカ
ルボキシル基、そのエステル、そのアミド又はシッフ塩
基に変化させて作られ、１，５００〜８，０００の平均
分子量を持ち、抗血液凝固活性を実質的に喪失し、細胞
増殖因子、サイトカイン類又は細胞接着因子との結合性
を保持している、皮膚潰瘍治療剤用低分子ヘパリン修飾
体。
【請求項５】請求項１−３の何れか１つの項に記載の
皮膚潰瘍治療剤、又は請求項４に記載の皮膚潰瘍治療剤
用低分子ヘパリン修飾体を、経皮吸収調整剤及び粘着剤
と混合し、得られた混合物を坦持体に塗布してなる皮膚
潰瘍治療用貼付剤。
【請求項６】請求項５に記載の皮膚潰瘍治療剤又は皮
膚潰瘍治療剤用低分子ヘパリン修飾体が混合物中で０．
００１重量％〜３０重量％を占めている皮膚潰瘍治療用
貼付剤。