DE1200236B - Hochmolekulare Verbindungen mit Fermentwirkung - Google Patents

Hochmolekulare Verbindungen mit Fermentwirkung

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DE1200236B DEM46105A DEM0046105A DE1200236B DE 1200236 B DE1200236 B DE 1200236B DE M46105 A DEM46105 A DE M46105A DE M0046105 A DEM0046105 A DE M0046105A DE 1200236 B DE1200236 B DE 1200236B
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Dr Georg Manecke
Dr Siegfried Singer
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Description

  • Hochmolekulare Verbindungen mit Fermentwirkung Es ist bekannt (Kurzmitteilungen für das Symposium über makromolekulare Chemie in Wiesbaden 12. bis 17. Oktober 1959), daß es gelingt, durch Copolymerisation von Methacrylsäure-m-fluoranilid mit Methacrylsäure bzw. deren Derivaten oder mit anderen polymerisationsfähigen Verbindungen und anschließende Nitrierung des Copolymerisats Harze herzustellen, welche Serumeiweiß chemisch zu binden vermögen.
  • Es wurde nun gefunden, daß man Copolymerisate von Methacrylsäurefluoranilid mit Methacrylsäure, welche im Benzolkern nitriert sind, zur chemischen Bindung von Fermenten verwenden kann, wobei die Fermentwirkuna erhalten bleibt.
  • Dadurch erhält man also hochmolekulare feste Verbindungen mit Fermentwirkung, die für Fermentreaktionen einsetzbar sind, und zwar wiederholt, d. h., diese hochmolekularen festen Verbindungen mit Fermentwirkung können nach Durchführung einer Fermentreaktion von der Substratlösung abgetrennt und für die fermentative Umsetzung einer neuen Substratlösung eingesetzt werden.
  • Zur Herstellung des reaktionsfähigen Copolymerisats geht man zunächst so vor, daß man Methacrylsäure-3-fluoranilid, welches aus 3-Fluoranilin und Methacrylsäurechlorid in Pyridin erhältlich ist, in einer anderen polymerisierbaren Verbindung zweckmäßig im Molverhältnis 1 : 3 löst und gegebenenfalls unter Zusatz von etwa 1 °/o Divinylbenzol polymerisiert Die Polymerisation erfolgt zweckmäßig unter Reinststickstoff im geschlossenen Gefäß unter Zusatz von 0,2 Gewichtsprozent Benzoylperoxyd bei 50 bis 70°C. Nach einigen Tagen erhält man ein hartes, gelblich opakes Harz, das zerkleinert wird. Dieses Harz wird unter milden Bedingungen nitriert, wobei alle im Copolymeren anwesenden Benzolkerne nitriert und etwa 600/, der Benzolkerne doppelt nitriert werden.
  • Das nitrierte Copolymerisat wird dann in einer Lösung des Ferments suspendiert und längere Zeit gerührt. Es wird mehrmals mit Pufferlösung gewaschen und dann abfiltriert. Es kann zur Durchführung von Fermentreaktionen direkt verwendet werden.
  • Beispiel l 500 mg eines nitrierten vernetzten Copolymerisats von Methacrylsäurefluoranilid und Methacrylsäure im Molverhältnis 1: 3 werden in einer Lösung von 10m1 Invertin (M e r c k) in 40m1 n-10-NaHC03-Lösung suspendiert und 7 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Das umgesetzte Harz wird mit insgesamt 500m1 n-10-Acetatpufferlösung (pH 4,5) gewaschen, über Nacht in Pufferlösung stehengelassen und am anderen Tage nochmals mit 500 ml Pufferlösung gewaschen. Daraufhin wird es 7 Tage lang in n-10-Acetatpufferlösung (pH 4,5) im Kühlschrank aufbewahrt, abfiltriert und in 50 ml 6,5°/oiger Saccharose-Pufferlösung (n-10-Acetat; pH 4,5) suspendiert. Nach 12, 30, 60 bzw. 120 Minuten werden jeweils 5 ml Substrat entnommen und nach der Dinitrosalicylsäure-Methode (J. Biol. Chem., 65, S. 393 [1925]) auf Glucose analysiert: nach 12 Minuten: 6,5 mg Glucose (^-_ 13 mg Invertzucker) nach 30 Minuten: 22,6 mg Glucose (- 45,2 mg Invertzucker) nach 60 Minuten: 41,4 mg Glucose (A 82,8 mg Invertzucker) nach 120 Minuten: 85,1 mg Glucose (- 170,2 mg Invertzucker) Beispiel 2 Ein Copolymerisat aus Methacrylsäure, Methacrylsäure-m-fluoranilid und Divinylbenzol (Molverhältnis 1 : 1 mit 1 % Divinylbenzol) wurde vor der Nitrierung mit Methanol extrahiert, um nicht polymerisierte Monomere und niederpolymere nichtvernetzte Anteile zu entfernen. Das extrahierte Harz enthielt Methacrylsäure und Methacrylsäure-m-fluoranilid im Molverhältnis 2,05:1. Bei der anschließenden Nitrierung ergab sich ein Nitrierungsgrad von 1,4 pro Benzolkern. Dieses Harz wurde in schwach alkalischer Lösung mit Diastase und Pepsin umgesetzt.
  • Umsetzung mit Diastase 100 bis 200 mg dvs gemahlenen Harzes (Korngröße: 0,2 bis 0,1 und < 0,1 mm Durchmesser) wurden mit 10 cm3 einer 0,1°/oigen Diastaselösung und 10 cm3 10°/oiger Natriumazetatlösung 24 Stunden gerührt und weitere 24 Stunden im Kühlschrank aufbewahrt. Das Harz wurde danach filtriert und mit Wasser gewaschen.
  • Die gleiche Umsetzung wurde auch bei Zusatz von 10 cm3 n-10-NaHC03-Lösung statt der Natriumazetatlösung durchgeführt.
  • Zur Berechnung der an das Harz gebundenen Enzymmenge wurde eine Eichkurve über die Abhängigkeit der aus Stärke gebildeten Maltosemenge zu der eingesetzten Diastasemenge aufgenommen.
  • Zur Aktivitätsbestimmung der Diastase diente die quantitative Bestimmung der aus einer 1°/oigen Stärkelösung nach 30 Minuten Einwirkung bei 37°C gebildeten Maltose. Nach der Umsetzung der Diastaselösung mit dem reaktionsfähigen Harz wurde die Diastasemenge im Filtrat und im Waschwasser bestimmt. Aus der Differenz zu der in der Lösung vor der Reaktion mit dem Trägerharz eingesetzten Enzymmenge wurde die vom Harz gebundene Menge berechnet. Das erhaltene Diastaseharz zeigt eine geringere Aktivität als aus dieser Differenzmethode zu errechnen ist. Das kann einmal auf eine Änderung der Reaktionsgeschwindigkeit bei der heterogenen Reaktion zwischen dem Enzymharz und dem gelösten Substrat zurückgeführt werden; zum anderen kann man einen Aktivitätsverlust des gebundenen Enzyms annehmen.
  • Das Harz wurde in Phosphatpufferlösung bei pH 6,8 im Kühlschrank aufbewahrt. Bei diesem pH wurde auch die Umsetzung mit Stärke vorgenommen; es ist das günstigste pH für die Maltosebildung.
  • Die Aktivität des Harzes wurde innerhalb von 14 Tagen durch wiederholtes Umsetzen derselben Enzymharzprobe überprüft. Sie nahm während dieser Zeit ab.
    Tabelle I
    Beständigkeit der Aktivität der Diastaseharze, die durch Umsetzung einer 0,1°/oigen Diastaselösung mit
    reaktionsfähigem Harz erhalten wurden
    Korngröße des Harzes: 0,2 bis 0,1 mm Durchmesser Korngröße des Harzes: < 0,1 mm Durchmesser
    Umsetzung in Umsetzung in Umsetzung in Umsetzung in
    n-10 NaHC03 10o/oigem Natriumazetat n-10 NaHC03 10o/oigem Natriumazetat
    Zeit gebildete berechnete gebildete berechnete gebildete berechnete gebildete berechnete
    Milligramm gebundene Milligramm gebundene Milligramm gebundene Milligramm gebundene
    Maltose Milligramm Maltose Milligramm Maltose Milligramm Maltose Milligramm
    pro Gramm Diastase pro Gramm Diastase pro Gramm Diastase pro Gramm Diastase
    Diastaseharz pro Gramm Diastaseharz pro Gramm pro Gramm pro Gramm
    Harz Harz Diastaseharz Diastaseherz Diastaseharz Diastaseharz
    1. Tag 23 ( 12,2 22 8,55 108,5 39,8 61 I 33,8
    3. Tag 22 15,2 108,5 54
    7. Tag 19 ! 13,4 71,7 40
    14. Tag 17,7 ; 11,5 60,5 I 27,8
    Zum Vergleich wurde eine Diastaselösung in Phosphatpuffer ebenfalls 14 Tage im Kühlschrank aufbewahrt. Die Aktivität dieser Lösung nahm auch ab. Zur Überprüfung, ob etwa vom Harz abgelöstes Enzym in der Stärkelösung weiter reagiert, wurde diese nach der Einwirkung auf das Enzymharz abfiltriert und in zwei Teile geteilt. Die Maltosemenge des einen Teils wurde sofort, die des anderen Teils erst 24 Stunden später bestimmt. Beide Werte waren gleich. Daraus kann gefolgert werden, daß das Enzym aus dem Harz nicht herausgewaschen wird und daß deshalb die Aktivitätsabnahme des Enzymharzes auch nicht durch Auswaschen der Diastase hervorgerufen wird.
  • Da die Löslichkeit der Diastase sehr gering ist und deshalb, wie oben beschrieben, nur eine verdünnte Lösung (0,1°/oig) mit dem reaktionsfähigen Harz umgesetzt wurde, wurde eine Probe des feingemahlenen Harzes (Korngröße: <0,1 mm Durchmesser) mit der dreifachen Gewichtsmenge Diastase wie oben in 15 cm3 n-10-NaHC03-Lösung suspendiert verrührt. Hier konnte die ans Harz gebundene Menge nicht wie oben bestimmt werden, da mit 11/, 1 Wasser gewaschen werden mußte. Die Aktivität dieser Probe war erheblich größer. Die Beständigkeit dieses Enzymharzes zeigt die Tabelle 1I.
    Tabelle II
    Beständigkeit der Aktivität der Diastaseharze, die
    durch Umsetzung einer Emulsion des Diastase in
    n-10-NaHC03 mit dem reaktionsfähigen Harz (Korn-
    größe: <0,1 mm Durchmesser) erhalten wurden
    Zeit Gebildete Milligramm Maltose
    pro Gramm Diastaseharz
    1. Tag 191
    2. Tag 189
    5. Tag 180
    9. Tag 170
    13. Tag 169
    Beispiel 3 Umsetzung mitPepsin 100 bis 200 mg des gemahlenen Harzes (Korngröße: 0,2 bis 0,1 mm und <0,1 mm Durchmesser) wurden in 10 cm3 n-10-NaHC03-Lösung mit 10 cm3 einer 1°/oigen Pepsinlösung 24 Stunden gerührt und weitere 24 Stunden im Kühlschrank aufbewahrt.
  • Zur Aktivitätsbestimmung des Pepsins sowie des Pepsinharzes diente die aus einer 2,5°/oigen Hämoglobinlösung bei 25°C nach 10 Minuten gebildete Menge Tyrosin. Diese wurde kolorimetrisch bestimmt. Auch hier wurde die Aktivität innerhalb von 14 Tagen mehrmals geprüft. Nach jedem Umsatz wurde das Harz abzentrifugiert und in Wasser im Kühlschrank aufbewahrt. Die Aktivität nahm auch hier ab.
    Tabelle III
    Beständigkeit der Aktivität der Pepsinharze, die
    durch Umsetzung einer 1 °/oigen Pepsinlösung mit reak-
    tionsfähigem Harz erhalten wurden
    Korngröße Korngröße
    des Harzes: des Harzes:
    0,2 bis 0,1 mm < 0,1 mm
    Durchmesser Durchmesser
    Zeit
    gebildete gebildete
    Milligramm Milligramm
    Tyrosin Tyrosin
    pro Gramm pro Gramm
    Pepsinharz Pepsinharz
    1. Tag 10,2 14,5
    2. Tag 9,45 13,0
    4. Tag 7,6 11,95
    8. Tag 9,45 14,0
    12. Tag 6,53 11,4
    16. Tag 7,22 12,45
    Über die Menge des gebundenen Pepsins kann noch nichts ausgesagt werden. Bei 19 des Pepsinharzes der Korngröße 0,2 bis 0,1 mm Durchmesser würde die aus der Hämoglobinlösung gebildete Menge Tyrosin einer ungebundenen sich in Lösung befindlichen Menge von 54 mg Pepsin entsprechen. Bei 1 g des Pepsinharzes der Korngröße <0,1 mm Durchmesser würde die Tyrosinmenge 75 mg ungebundenen gelösten Pepsins entsprechen. Daraus kann lediglich gefolgert werden, daß die Menge gebundenen Pepsins wesentlich größer ist als die der Diastase, was auf die bessere Löslichkeit des Pepsins und somit auf eine höhere Konzentration des umgesetzten Pepsins bei der Reaktion mit dem Harz zurückzuführen ist. Nimmt man an, daß bei der Umsetzung des Pepsins mit der Trägersubstanz die Aktivität des Enzyms nicht abgenommen hat, so könnte man auch hier nach der Umsetzung des reaktionsfähigen Harzes mit der Pepsinlösung die Pepsinmenge im Filtrat und im Waschwasser bestimmen und daraus, wie beim Diastaseharz, die am Harz gebundene Pepsinmenge berechnen. Dabei würden sich 324 mg Pepsin pro Gramm Pepsinharz der Korngröße <0,1 mm Durchmesser ergeben und 272 mg Pepsin pro Gramm Pepsinharz der Korngröße 0,2 bis 0,1 mm Durchmesser. Beispiel 4 Ungefähr 30 mg des Copolymerisats nach Beispiel 2 (Korngröße <0,1 mm Durchmesser) wurden mit einer 0,3°/oigen Lösung vonAlkoholdehydrogenase in 0,01 ml Phosphatpuffer (pH = 7,5), die noch 0,10/, Pferdeserumalbumin zur Stabilisierung enthielt, und 10 ml n-10 Natriumhydrogencarbonat versetzt. Diese Suspension wurde 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und weitere 24 Stunden im Kühlschrank stehengelassen. Das Enzymharz wurde danach abzentrifugiert, mit Pnosphatpufferlösung gewaschen und unter Phosphatpufferlösung aufbewahrt.
  • Zur Aktivitätsbestimmung der Alkoholdehydrogenase und des Alkoholdehydrogenaseharzes diente die quantitative Bestimmung des DPNH, das durch Einwirkung der Alkoholdehydrogenase auf das Coferment DPN (Diphosphopyridin-Nucleotid) und Alkohol gebildet wird.
  • Aus der Differenz der bei der Umsetzung mit dem reaktionsfähigen Copolymerisat eingesetzten und nach der Reaktion im Filtrat und Waschwasser verbleibenden Alkoholdehydrogenasemenge wurde die an das Copolymerisat chemisch gebundene Enzymmenge abgeschätzt.
  • Durch wiederholtes Umsetzen der gleichen Enzymharzprobe mit DPN und Alkohol innerhalb von 14 Tagen wurde die Beständigkeit des Enzymharzes überprüft (Tabelle IV).
    Tabelle IV
    Beständigkeit der Aktivität des Alkoholdehydro-
    genaseharzes
    Abgeschätzte
    Milligramm gebundene
    Zeit gebildetes DPNH Milligramm
    pro 100 mg Alkoholdehydro-
    Enzymharz genase-Menge
    pro 100 mg Harz
    1. Tag 14,35 16,2
    2. Tag 11,95
    4. Tag 10,40
    7. Tag 9,30
    11. Tag 8,08
    14. Tag 7,53
    15. Tag 6,90
    Beispiel 5 Ungefähr 400 mg des nitrierten Copolymerisats nach Beispiel 2 (0,1 bis 0,2 mm Durchmesser) werden mit 20 ml 2°/oiger Celluloselösung in n-10 NaHCOg 24 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt und weitere 24 Stunden im Kühlschrank belassen. Das so hergestellte Cellulaseharz wird mit Wasser gewaschen und unter Wasser im Kühlschrank aufbewahrt.
  • Zur Aktivitätsbestimmung des Cellulaseharzes dient die quantitative Bestimmung des aus 1°/oiger Carboxymethylcellulose nach einer Stunde bei 37°C gebildeten reduzierten Zuckers.
  • Die Beständigkeit des Cellulaseharzes wird durch wiederholtes Umsetzen derselben Enzymharzprobe mit dem Substrat innerhalb von 18 Tagen überprüft.
    Tabelle V
    Beständigkeit der Aktivität des Cellulaseharzes
    Einheiten)
    Zeit pro 1 g umgesetztes
    Copolymerisat
    1. Tag 803
    4. Tag 476
    5. Tag 438
    10. Tag 318
    18. Tag 279
    *) 1 Einheit ist die Enzymmenge, die 1 #tg Glucose nach
    einer Stunde bei 37°C aus 20m1 1°/oiger Carboxymethyl-
    cellulose bildet.
    Um die an das Copolymerisat gebundene Enzymmenge zu bestimmen, wird der Eiweißgehalt der Cellulase bestimmt. Aus der Differenz des Eiweißgehaltes der zur Reaktion eingesetzten Cellulaselösung und der in Filtrat und Waschwasser nach der Umsetzung Copolymerisatcellulase verbliebenen Eiweißkonzentration wird die an das Copolymerisat gebundene Cellulase bestimmt. Es werden 200 mg Cellulase pro 1 g an das zur Umsetzung verwendete Copolymerisat gebunden.
  • Beispiel 6 Ungefähr 100 mg des reaktionsfähigen Copolymerisats nach Beispiel 2 (0,1 bis 0,2 mm Durchmesser) werden mit einer 2°/oigen Papainlösung in n-10 NaIIC03 24 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt und weitere 24 Stunden im Kühlschrank aufbewahrt. Das entstandene Papainharz wird mit Wasser gewaschen.
  • Die Aktivitätsmessung des Enzymharzes wird mit x-Benzoyl-L- argininamid-HCl durchgeführt, wobei die nach 30 Minuten bei 37°C aus 4 ml 0,1 M n-Benzoyl-L-arginoamid - HCl-Löung freigesetzte Menge Aminosäure titrimetrisch in Formalin bestimmt wird.
  • Die Beständigkeit des Harzes wird durch wiederholtes Umsetzen ein und derselben Harzprobe innerhalb von 19 Tagen geprüft (Tabelle VI).
    Tabelle VI
    Beständigkeit der Aktivität des Papainharzes
    Milliliter verbrauchte
    Zeit 0,02 M NaOH pro 100 mg
    umgesetztes Copolymerisat
    1. Tag 7,75
    9. Tag 7,44
    16. Tag 7,15
    19. Tag 6,08
    Die an das Copolymerisat gebundene Papainmenge wird aus der Differenz der Eiweißkonzentration der zur Reaktion verwendeten Papainlösung und des Eiweißgehaltes des Filtrates und des Waschwassers bestimmt. Es werden 100 mg Papain an 100 mg zur Reaktion verwendetes Copolymerisat gebunden.

Claims (1)

  1. Patentanspruch: Die Verwendung von vernetzten Copolymerisaten von Methactylsäurefluoranilid mit Methacrylsäure, welche im Benzolkern nitriert sind, zur chemischen Bindung von Fermenten.
DEM46105A 1960-07-30 1960-07-30 Hochmolekulare Verbindungen mit Fermentwirkung Pending DE1200236B (de)

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DEM46105A DE1200236B (de) 1960-07-30 1960-07-30 Hochmolekulare Verbindungen mit Fermentwirkung
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GB25867/61A GB912897A (en) 1960-07-30 1961-07-17 Process for the production of high molecular weight compounds with enzymic action
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1915970A1 (de) * 1968-03-29 1969-10-09 Anvar Verfahren zur Herstellung von Produkten auf der Basis aktiver Proteinsubstanzen

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1915970A1 (de) * 1968-03-29 1969-10-09 Anvar Verfahren zur Herstellung von Produkten auf der Basis aktiver Proteinsubstanzen

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GB912897A (en) 1962-12-12
CH430631A (de) 1967-02-28

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