При использовании ВруТКЯ АКрООрГаЩЗмов 7-АДШ не вьшэп гсг ..;; реакхион ной смеси, поскольку глубина гидролиза составл ет только 40-60%, Однако в таком способе гидролитичес ка активность используемых ферментных препаратов низка , поэтому цлитель ность гидролиза даже дл малых концентраций субстрата очень велика (8О ч). Применение дл получени 7-A.O,IJK малых концентраций субстрата, обусловЛенное с одной стороны низкой активностью используемого катализатора, а с другой стороны малой растворимостью 7-ФАДЦК (или 7-ФМДЦК) в водных растворах с рН 7-85 приводит к сложному методу выделени целевого продукта с использованием органических растворите лей (необходимость регенерации растворителей ). Использование органических растворителей дл вы целени 7-АДЦК не сколько увеличивает выход 7-АДЦК, вследствие ее меньшей растворимости в водно-органической среде, по сравнению с водной, однако при этом качество выдел емого продукта невысокое (93%-на чистота). С целью упрощени процесса предлагаетс способ получени производных 7 амино-3-цефем-4 карбоновой Ю1слоты об щей формулы S HaK-p Y (} где X -водород или отрицательный зар д если I. -пиридиний1 руппа; R. - водород, ацетокси- или пиридинийгруппа , путем деадилнровани 7 ациламиноцефал( спорановых производных общей формулы ITTl ,. в,сжош (Н) где RJ , X имеют указанные значени ; RI - фенил, фенокси- или тиеншр группа, R,- водород или аминогруппа, р водном растворе при 25-4О°С или их солей с неорганическим или органическим основанием и деадилирование провод т выделенной из микроорганизмаE.coFi пениоиллинацилазой с удельной активностью 4,5-12 ед,,/мг белка, ковалентно св занной с нерастворимым в воде носи телем, полученным на основе сополимера циметакрилата тетраэтиленгликол и анГИ (фида малеиновой или итаконовой или дитраконовой кислоты, циметакрилата тетраэтиленгликол , метакриловой кислоты и ангидрида малеиновой кислоты, циметкрилатаокиси полипропилена, акриловой к-цслоты и/или ангидрида малеиновой кислоты , диметакрилата этиленгликол 5 ангидрица итаконовой кислоты и акриловой кислоты или ангидрида малеиновой кислоты, метакриловой кислоты и триметакрилата сополимера окиси этилена и окиси пропилена (la). Предлагаемый способ имеет то преимущество , что благодар ковалентной св ; :-1 пенйциллинацмлазу можно неоднократ1 .-ID использовать без потери активности Крог-ле rorOj можно использовать 10%«ные растворы цефалоспоринов вместо 1%-ных растворов в известном способе, Дл провецени способа могут быть использованы практически все ферментные смолы (ФС), в которых пенициллинацилаза ковалентно св зана с нерастворимым в воде полимеризатом-носителем. В качестве ФС берут такие, в которых пени циллинацилаза при помощи бромциана ко- валентно св зана с полисахаридами, например декстран или сшитые агарозы. Могут быть использовйны также ФС, дл получени которых пенициллинацилазу подвергают взаимодействию с бромацетилцеллюлозой или с субстанцией ионообменника на основе замещенного карбоксилгруппами трехмерно сшитого декстрана в присутствии способного к образованию амида соединени , например карбодиимида, причем могут быть использованы и активированные смолы ионообменника, как хлораэгидрид кислоты, смолы акриловой кислоты и сшитые с гидразином смолы из этилена и ангидрида малеиновой кислоты. Особенно пригодной вл етс ФС, в которой пенициллинацилаза ковалентно св зана сополимером из акриламида, N,N метиленбисакриламида и малеиновой кислоты , ФС может быть получена следующим образом. Исходный сополимер получают известными методами. После сополимеризации гелеобразную смолу продавливают через сито с отверсти ми 0,5 мм, хорошо промывают и высушивают в вакууме, Полимеризованную дикарбоновую кислоту, нагрева в течение 2 ч до 18ос, перевод т в ангидрид дикарбоновой кислотьь На 1 г фермента берут Юг сополимера. Из этой смесил.3-4 г прибавл ют в раствор фермента в 25О мл 0,05 М фосфатного буфера при рН 5,5;, интенсивно размешивают и через 2 ч добавл ют малень56 кими дозами остальной сополимер. рН в течение всей реакции поддерживают посто нным , добавл разбавленный раствор едкого натра. Если через 5 ч отсто вшийс верхний водный cnnf содержит ещё непрореагировавший фермент, цобавл ют еше сополимер. Соотношение 1 ч. фермента к 15-2О ч. сополимера вл етс обычно достаточным дл полной реакции. После сочетани отфильтровывают св занную с носителем . пенициллинадилазу и интенсивно.промывают водой и 1М раствором поваренной соли. Особенно предпочтительными в качестве используемых ФС вл ютс такие, при которых пенициллинацилаза св зана с сшитыми сополимерами, содержашими сополимерные единицы следующего состава: А. О,1-5О, предпочтительно 2-2О, вес. -моноолефиновых ненасыщенных ангидридов дикарбоновой кислоты с 4-9, предпочтительно 4 или 5, атомами углерода, например ангидрид малеиновой. кислоты, итаконовой кислоты и/или цитраконовой кислоты, особенно ангидрид малеиновой кислоты, и Б. 99,9-5О, предпочтительно 8О-98 вес. % ди- и/или поли-{мет)-акрилатов диолов и/или многоатомных спиртов, как диакрилаты или диметакрилаты диолов с 2-4 атомами углерода и/или продукты реакции 1 моль этого диола с 1-2Омоль окиси алкилена с 2-4 атомами углерода или триметилолпропантриметакрилат, особенно диметакрилаты этиленгликол , диэти .пенгликол , триэтиленгликол , тетра-; этиленгликол или высших полиалкилен гликолей с мол рным весом до 1ООО или их смеси Полимеризацию гфоаоц т методом осадительной или бисерной полимеризации в растворител х или смес х растворителей, крторые вл ютс инертными против ангидридных групп, например бензол, при 20-2ОО С, например при 6О-70°С, в присутствии образующих радикалы соединений , например динитрил азоизомасл ной кислоты. Полученные таким образом сополимеры дл получени ФС при рН 5,7-6,8 и 4-ЗО С ввод т в водный раствор пенициллинацилазы (1 вес. ч., пенициллинацилазы на 1-1О вес. ч. полимерного носител ). Через 2 ч отсасы вают или центрифугируют и остаток про- мывают сол ными растворами высокой ионной силы, например 1 моль водного раствора хлорида натри . Особенно предпочтительными ФС вл ютс такие, в ко торых пенициллинацилаза св зана с сши8 тыми- сополимерами, содержащими сополимерные единицы следующего состава: Указанный состав А,, Б. 35-9О, предпочтительно 5О-85, вес. % ди- и/или поли-(мет)-акрилатов диолов и/или многоатомных спиртов, как диакрилаты или диметилакрилаты диолов с 2-4 атомами углерода и/или продукты реакции 1 моль этих циолов с 1-10 мол ми окиси алкилена с 2-4 атомами углерода или триметилолпропантриметакри-+ лат, например диметилакрилаты этиленгликол , диэтиленгликол ; триэтиленгликол , тетраэтиленгликол 5 или высших полиалкилгликолей с мол рным весом до 500 или смеси их. В. 5-бО, предпочтительно 1О-5О, вес.% по меньшей мере одного неназванного в п. Б гидрофильного мономера, предпочтительно ненасыщенные гидрофильные мономеры, содержащие по меньшей мере карбоксильную-, аминокарбоиильную-, сульфо- или сульфамоильную группу, причем аминогруппы аминокарбоиильного или сульфамоильного радикалов в случае необходимости могут быть за( С. - С -алкилами или -алкоксиметилом , например акрилова кислота, мет акрилова кислота, полиэ ир малеило вой кислоты, N -виниллактамы, кик М винилпирролидон, метМкриламид, Н -замещенные (мет)акриламнды, как W -метил- и W -метоксиметил-(мет)- акриламид и W -акролоилдиметилтаурин. Сумма компонентов А -В составл ет 1OQ вес. То. Сшитые сополимеризаты имеют насыпной объем 2-2О мл/г и . у удельные поверхности 1-4ОО Nr/г и после омылени а11гидридных трупп содержат 0,О2-11 мэкв, кислоты на 1 г„ Полимеризацию провод т методом осадительной или бисерной полимеризации в растворител х или смес х растворителей, которые вл ютс инертными против анидридных групп, например бензоле, при 20-2ОО°С, предпочтительно 5О и 1ОО°С, например 60-70 С, в присутствии обраующих радикалы соединений, например инитрила азоизомасл ной кислоты. Дл олучени ФС полимернзат ввод т в водый раствор пенициллинацилаЬы (предпочи те;шн о 1 вес, Чо пенициллинацилазы а 4-1О вес, ч. смолы) при О-ЗО С, апример 4 -2О С, причем рН путем доавлени основани , например натрового елока, поддерживают 5,7-6,8, По оконании реакции отсасывают и промывают уферным или сол ным раствором, наприер 1 М раствором хлорида натри . Особенно лреш10чтйге.1. ;; йЛ;:егс использование ФС, в которо Я9ниц {ллин ацилаэа ковалентно св зана с сополиме ром из цимегилакрилата тетраэтиле:нгликол , ангидрида малеиновой кислоты и в случае необходимости метакриловой КИСЛОТЫо в качестве растворител берут воцу или смесь вооы и органического растворител в количестве до 10%, например метано , этанол, ацетон или-диметилформ амид. Реакцию провод т при 20-45 С, предпочтительно 35-4О С. Соединение Л раствор ют в указанном растворителе, причем раствор должен содержать 2-4О, лучше 4-6, вес, ч, соединени формулы И. Его можно в любом виде приводить в контакт с ФС. ФС может быть, например, суспендирована в растворео При нейтрализации отщепл емого при реакции ацильного раоикала рН поааерживают 6-9, лучше 7,5-8,5, добавл к реакционной смеси пригодное основание, в качестве которого используют неорганические и органические основани , например трет-фосфат натри , гиароокиси щелочного металла, карбонаты или гицрокарбонаты щелочного металла, первичные, вторичные и третичны алифатические т ароматические амины, а также гетероциклические основани . Скорость реакции зависит от отношени количества имеющейс св занной с носителем шенициллинацилазы к количеству вз того соединени формулы 11 и от специфической активности используемой св занной с носителем пенициллинацилазы , котора указана в ед./г влажного веса. 1 ед. определена как активность пенидиллинацилазы, котора в течение 1 мин гидрслизует 1 макромоль, пеницил лина Q при 37 С и рН 7,8 в 6-аминопенициллановую кислоту и фенилуксусную кислрту. Дл расщеплени 1 кг 7-:Фенил ацетамидодезацетоксицефалоспорановой кислоты в течение 2 ч требуютс 7OGOO ед. св занной с носителем пенициллинацилазы , соответственно 1 кг мокрой ФС, При концентрации 6% реакционный объем составл ет 16,6 л. При более продолжительном времени расщеплени требуетс соответственно меньще св занной с носителем пенициллинацилазы. По окончании реакции расщеплени св занную с носителем пенициллинацилазу отдел ют, например, путем фильтрации или- центрифугир .овани и она может быть сразу же исгпэльзовйна дл дальнейшей исходной смеси расшенлени . Из прозрачного раствора выдел ют соедине ше формулы 1 известными способами , например неорганическими минеральнь ми кислотами, как сол на , серна , фосфорна кислоты, или органическими карбоновыми кислотами, как уксусна кислота, у изоэлектрической точки или же методом хроматографии. Выделенный иди полученный хроматографией продукт цл полного удалени отщепл емого ра икала промывают пригодным растворителем , например бутйлшдетатом или ацетоi- .o-..;j И сушат в вакууме,. ; р И м 8 р 1, Расщ&пле-аке соединений формулы . 2 мм ОЛЬ соединени формулы 11 растЕюр ют в 20 мл воды (в случае необхоинмости путем добавлени едкого натра) при рН 7,5 к размешанному раствору в нагретом до 37 С сосудеприбавл ют 5 г (влажный вес) ФС (полученной по методу А), поддержива рН 7,5 10 М едким натром. По окончании реакции св занную с нocитeлe пенициллинацилазу отсасывают через слой спекшихс частиц стекла и промывают водой. Фильтрат и промывную воду сгущают в вакууме при ЗО С до объема 5 мл цефалоспорановую кислоту осаждают, добавл 5 н. сол ную кислот до изоэлектрической точки 3,7, выдерживают 2-3 ч в холодильнике, отфильтровывают, про;чывают 1О мл воды и ацетона и сушат в вакууме. Содержание продуктов наход т фотометрическим методом определени освобожденной 7-аминогруппы после реакции с п-оиметилеминобензальдегидом в измененном виде метода Свотека. Экстинкцию при 415 нм сравнивают со стандартными кривыми дл чистой 7-АЦК и 7 АД1ДКр Кроме того, идентичность продуктов доказана ИК- и ЯМРслектрометрией и хроматографии на бумаге в системе бутанол-лед на уксусна кислота-вода (12:3:5). АО В качестве исходного соединени берут 9О8 мг 7(2-тиенил)-ацетамидоцефалоспорановой кислоты (натриева соль). Продолжительность реакции 42 мин. Получают 7-АЦК, выход 52О мг (88%), чистота 98%, Т 0,27 (не обнаружено аезацетил-7-аминоцефалоспорановой кислоты сТ 0,1О). Бс В качестве исходного соединени берут 866 мг 7-(2-тиенил)-ацетамидо--пиридинийметил--3-цефем-4-карбоксиата . Продолжительность реакции 35 мин. Получают 7-амино-З-пиридинийметил-З цефем-4-карбоксилат, 0,05. Из-за наличи пиридинового кольца в молекуле целевой продукт нельз выделить у изоэлектрической точки. Полно та разложени и идентичность продукта доказана хроматографией на бумаге. В. В качестве исходного соединени берут 687 мг Т-ФАДИК. Продолжитель ность реакции 27 мин. Получают 7-АДЦ выход 35О мг (84%), чистота 99%, т. пл. 238-240°С (разл,). Г. В качестве исходного соединени берут 696 мг 7-феноксиацетамидодеэацетоксицефалоспорановой кислоть, получают Т-АД ЦК, выход 35О мг (82%), чистота 96%, т, пл. 238-240 0 (разл, Д. В качестве исходного соединени берут 696 мг (л -аминофенилацетил}аезацетоксиаефалоспорановой кислоты, получают 7-АД:ЦК, выход 364 мг (85% чистота 98%. Пример 2. 1кг 7-ФАДЦК раствор ют в 12,5 л воды и в течение 2 ч полностью расщепл ют при 38 С, добавл 1 кг св занной с носителем пеницил линацилазы (по методу А) и поддержива рН 7,5 путем непрерывного добавлени триэтиламйна. По окончании реакции св занный с носителем фермент отфильтровы вают и промывают 2 л воды. Фильтрат и промывную воду сгущают в вакууме до объема 3 л при 30-40 С, добавл ют 2 л бутилацетата и 5 н. сол ной кислотой при рН 3,7+0,1 осаждают 7-АДЦК. Через 2 ч кристаллй отсасывают, промывают 1 л воды и ацетона и сушат в вакуум е при 40 С. Выход 574 г (89%) чистота 98%. Таким образом используют одну и ту же св зант/ю с носителем пенициллинацилаау 25 раз. Выход из 25 расщеплений 9О,3%. Примерз. 2г(6 ммоль) 7ФАДЦК суспендируют в 190 мл воды, раствор ют, добавл 1 н. раствор едкого кали до рН 7,8, нагревают до 37 и добавл ют 3,2 г ФС, полученной по ме тоду А, поддержива рН 7,8+0,3 триэтил амином. . Через 1,5 ч реакци заканчиваетс , ФС отфильтровывают, промывают водой и фильтрат сгушают в вакууме при 50 С до четверти объема. Псх:-,. ле добавлени 16О мл метилизобутилкетона разбавленной сол ной кислотой устанавливают рН 4,3 и выкристаллизовавшийс осадок выдерживают 1 ч, отсасывают и промывают небольшим количеством смеси вода-метилизобутилкетон. Получают 7-АДЦК, выход 1,01 г (78,8%), т. пл. 238-24О°С (разл.). П .р и м е р 4. 5ОО г 7-ФАДЦК раствор ют в 8,3 л воды и полностью расщепл ют при 38 С, добавл в течение 4 ч 22О г св заюшй с носителем пенициллинаиилазы (по методу Б), далее обрабатывают аналогично примеру 2, получа 7-АДДК. Выход 294 г (91%), чистота 97%. Аналогично провоц т 25 расщеплений с такой же св занной с носителем пени иллинацилазой. Средний выход из 25 расщеплений 90,5%. Примера, 500 г 7- раствор ют в 8,3 л воды и при 38 С полностью расщепл ют, добавл 1,1 г св занной с носителем пенициллинацилазы (по методу В). По окончании поглощени триэтиламйна перерабатывают аналогично примеру 2. Получают 7-АДЦК, выход 265 г (86%), чистота 98%. Метод А. Получение ФС. 8О г диметакрилата тетраэтиленгликол , 2О г ангидрида малеиновой кислоты и 1 г нитрила азоизомасл ной 1сислоты раствор ют в 1 л бензола и, размешива , нагревают 4 ч до 60 С. Затем добавл ют 1 г гштрила азоизомасл ной кислоты и 20О мл петролейного эфира (т. кип. 10О-14О С) и полимеризуют 5ч при 7О С: Порощкообразный продукт отсасывают , взмучивают один раз в бензоле , три раза впетролейном эфире (т. кип. ЗО-5О С) и сушат в вакууме. Выход 94г, насьшной объем 3,5 мл/г, объем набухани в воде 4,7 мл/г, удельна поверхность 5 м /г, содержание кислоты после омылени ангидридных групп 3,5 л экв/г. 1ОО г полученной смолы-носител суспендируют в 3,5 л водного раствора 48ООО ед. пенициллинацилазы специфическа активность 12 ео/мг протеина (тест с биуретом), поддержива рН 6,3 1 н, едким натром, суспензию размешивают 2О ч при 25 С, затем отсасывают через большую перегородку спекшихс частиц стекла и промывают 5 л О,О5 М фосфатного буфера при рН 7,5, содержащего 1 М хлорид натри , и затем тем же буером без хлорида натри . .Получают5ООг лажной ФС с специфической активностью 58 ец/г, что составл ет 290Ор Д, св занной с носителем пенициллинцилааы или 6О%. Получение пенициллинацилазы. Сырой экстракт, содержащий пеницилинацилазу , получают, выращива Е. соВ о известному способу. Культуру центриугируют , концентрируют в густую суспению и известными- механическими спосоами открывают клетки, в случае необхо