DE1695662C3

DE1695662C3 - Trägergebundene proteinartige Wirkstoffe

Info

Publication number: DE1695662C3
Application number: DE1695662A
Authority: DE
Inventors: Apollonio Dr. Conte; Klaus Dr. Lehmann
Original assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Current assignee: Roehm GmbH Darmstadt
Priority date: 1967-12-27
Filing date: 1967-12-27
Publication date: 1974-09-19
Also published as: DE1695662A1; DE1695662B2

Description

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Es ist bekannt. Enzyme unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität an wasserunlösliche Träger- $ubstanzen zu binden und mit solchen Produkten tpezifische Abbaureaktionen durchzuführen. Bis zu einem gewissen Grad werden mit dieser Anwendungsform für biologisch aktive Proteinderivate Vorgänge im lebenden Gewebe nachgeahmt, in dem die gleichen oder verwandte Wirkstoffe an Zellstrukturen gebunden oder in Membranen eingebettet sind und in dieser quasi unlöslichen Form biochemische Prozesse katalysieren. Die Bindung der biologisch aktiven proteinertigen Wirkstoffe an einen substratunlöslichen Träger kann adsorptiv oder kovalent sein. Da ein physikalisch adsorbiertes Protein in wäßriger Suspension stets im Gleichgewicht mit gelöstem Protein steht, ist eine unerwünschte Desorption bei den Bedingungen der Anwendung oft nicht zu vermeiden. Daher ist die kovalente Bindung des biologischen Wirkstoffs an einen wasserunlöslichen Träger vorzuziehen; aus einem solchen Komplex wird die Wirksubstanz nicht eluiert.

Die Bindung biologisch aktiver Proteine bzw. proteinartiger Wirkstoffe an die Trägersubstanz erfolgt über funktioneile Gruppen des Eiweißkörpers, die für dessen Wirksamkeit nicht notwendig sind. Diese aktiven Gruppen können terminate oder ε-Amino- gruppen, Carboxylgruppen, Sulfhydril- oder Hydroxygruppen, weiterhin die Phenolgruppe des Tyrosins oder die Imidazolgruppe des Histidins sein.

Als Trägersubstanzen sind natürliche oder synthetische makromolekulare Substanzen, die jeweils den genannten Gruppen zugeordnete reaktive Gruppen besitzen, bekannt. Als Beispiele solcher Träger seien Carboxymethylcellulose, diazotierte p-Aminobenzylcellulose, Polystyrol, diazotiertes Polyaminostyrol, Poly-4-isocyanatstyrol und ein nitriertes Copolymerisat aus Methacrylsäure und Methacrylsäure-3-fluoranilid (Molverhaltws 3:1) genannt. Soweit diese Substanzen wasserlöslich sind, kommen sie als vernetzte Produkte zur Anwendung.

Gegenstand der im nachfolgenden beschriebenen Erfindung ist die Bindung proteinartiger Wirkstoffe an ein Anhydridgruppen enthaltendes Kunstharz. Auf den diesem Verfahren nächsten Stand der Technik sei deshalb näher eingegangen: Levin, Pecht, Goldstein und KatchaJskibeschreibeninwBiochemistry.» 3 (12), S. 1905 bis 1913 (1964), referiert in »Chemical Abstracts«, 62, S. 4260 (1965), die Herstellung eines wasserunlöslichen Trypsin-Kunstharzes, wobei Trypsin an ein Maleinsäureanhydrid-Äthylen-Copolymerisat, das mit Hexamethylendiamin vernetzt ist, gekuppelt wird und die freien Anhydridgruppen anschließend verseift werden. Die Hydrolyseempfindlichkeit des genannten Copolymerisate ist jedoch erhefe'ich, so daß bereits während der Anlagerung des Enzyms an das Harz ein Teil der Anhydridgruppen verseift wird und damit als reaktive Gruppe für die kovalente Bindung des Proteins entfällt. Dazu kommt, wie eigene Versuche gezeigt haben, daß für die Fixierung des Enzyms am Träger eine lange Zeit (etwa 20 Stunden) erforderlich ist, so daß die Verluste an reaktiven Anhydridgruppen besonders groß sind. Weiterhin müssen die erhaltenen Trypsinharze, um von Nebenprodukten, die einen Teil des Enzyms in inaktiver Form enthalten, befreit zu werden, eine lange Zeit gewaschen werden. Die Ausbeuten an Trypsinharz, bezogen auf die eingesetzte Enzymmenge, schwanken in weiten Grenzen (22 bis 65%), so daß die Bindung des Proteins an die Anhydridgruppen des genannten Copolymerisate als relativ unspezifisch angesprochen werden muß.

Es wurde nun gefunden, daß proteinartige Wirkstoffe, wie Enzyme, Enzyminhibitoren, Antigene und Antikörper, soweit diese Substanzen eine reaktionsfähige α- oder f-Aminogruppe aufweisen, leicht und praktisch vollständig unter Erhaltung ihrer biologischen Aktivität an die Homo- oder Copolymerisate des Acryl- bzw. Methacrylsäureanhydrids gebunden werden können. Soweit die genannten makromolekularen Verbindungen wasserlöslich sind, werden sie im Wege einer an sich bekannten Vernetzung in zwar gegebenenfalls noch quellbare, jedoch wasserunlösliche Produkte übergeführt. Dies kann entweder durch eine nachträgliche Behandlung der Copolymerisate mit einem Diamin oder durch Mitverwendung von solchen Monomeren, die mindestens 2 C — C-Doppelbindungeri im Molekül enthalten, bei der Herstellung des Polymerisats erreicht werden. Der gleiche Vernetzungsmechanismus tritt bekanntlich bei der Umsetzung der genannten Homo- oder Copolymerisate mit anderen bifunktionellen Verbindungen, deren reaktive Gruppen mit Anhydridgruppen reagieren, ein. Als Beispiele für vernetzende Verbindungen seien Äthylendiamin, Hexamethylendiamin, Propylendiamin, 2,3-Diaminopropanol, Thioäthylamin und Polyäthylenglykole genannt. Es sei darauf hingewiesen, daß der Vorgang der Vernetzung auch gleichzeitig bei der Bindung bestimmter proteinartiger Wirkstoffe erfolgen kann, wenn diese mit zwei oder mehreren Gruppen mit dem Harz reagieren.

Vernetzende Comonomere, die in Mengen von etwa 0,01 bis 5"/_o zur Anwendung kommen können, sind beispielsweise Vinyl-(meth-)acrylat, Allyl-(meth-)acrylat, Divinylbenzol, Äthylenglykoldi-(meth-)acrylat und Triallylcyanurat. Bei Copolymerisaten des Acryl- bzw. Methacrylsäureanhydrids ist eine Vernetzung in jenen

Fällen unnötig, in denen die geforderte Wasserunlös- Die nachstehenden Beispiele erläptern den Erfin«

Jjchkeit des Harzes durch Art und Menge des bzw. der dungsgegenstand, ohne den Umfang des nachgesuch-

rnitverwendeten Comonomeren erzielt wird. Der ten Schutzrechts aui eben diese Ausführungsformen

Anteil, zu dem eines oder ein Gemisch der genannten zu beschränken.

Anhydride am Aufbau des Copolymerisats beteiligt 5 . .

ist, kann in weiten Grenzen schwanken. Neben den Beispiel ι

vernetzten Homopolymerisaten sind Copolymerisate 107,4 g frisch destilliertes Methacrylsäureanhydrid

mit einem Anhydridgehalt von 1 Gewichtsprozent und werden mit I I wasserfreiem Benzol vermischt. Unter

mehr als Träger im Sinne der vorliegenden Erfindung Rühren werden 1,07 g Benzoylperoxyd hinzugegeben,

brauchbar. Als Comonomere neben (Meth-)Acryl- to Das Gemisch wird in einem nut Rückfluökühler und

Säureanhydrid sind in erster Linie die Ester, Amide Thermometer versehenen Kolben im Stickstoffstrom

und Nitrile der Acryl- und Methacrylsäure sowie der 12 Stunden bei 65 ⁰C Innentemperatur gerührt. Das

Itakon- und Crotonsäure, weiterhin Styrol und Vinyl- nach dem Erkalten ausgefallene Produkt wird abge-

acetat geeignet. saugt, mit Benzol gewaschen und 10 Stunden bei

Die genannten Homo- und Copolymerisate können 15 45⁰C getrocknet. Ausbeute: 107 g Polymethacrylat Block-, Emulsions-, Suspensions- und Lösungs- täureanhydrid.

polymerisate hergestellt werden. Dispersionen und Lö- 5 g Polymethacrylsäureanhydrid werden in einem sungspolymerisate müssen anschließend koaguliert Gemisch aus 150 ml Wasser und 10 ml Methanol bzw. ausgefällt werden; die Fällung der Lösungspoly- suspendiert. Unter Rühren bei Zimmertemperatur läßt merisate kann durch nachträgliches Umsetzen mit 20 man 50 ml einer 0,5%igen wäßrigen Löung von einem Vernetzungsmittel erreicht werden. Dispersionen Hexamethylendiamin innerhalb von 10 Minuten zuwerden in an sich bekannter Weise koaguliert, getrock- tropfen. Das Reaktionsgemisch wird noch weitere net und in grob disperser Form verwendet. In manchen 15 Minuten gerührt, danach wird das Reaktionspro-Fällen kann es vorteilhaft sein, die proteinartigen dukt abfiltriert, mit 50%igem Methanol gewaschen Verbindungen an die dispergierten Kunststoffteilchen 25 und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 5,9 gvernetztes zu binden, diese Dispersionen diiekt weiter zu verwen- Polymethacrylsäureanhydrid.

den oder gegebenenfalls anschließend die Dispersion 3 g des so hergestellten vernetzten Polymethacryl-

unter Beachtung entsprechender Vorsichtsmaßi.ah- säureanhydrids werden in einer Lösung von 0,48 g

men zu koagulieren, das Koagulai zu isolieren und zu krist. Trypsin in 30 ml Wasser suspendiert und 3 Stun-

trocknen. 30 den bei Zimmertemperatur gerührt. Danach wird

Die Bindung prc^einartiger Wirkstoffe an die erfin- zentrifugiert, der Niederschlag mehrmals mit Wasser dungsgemäß zu verwendenden Polymerisate erfolgt gewaschen und zuletzt bei 0⁼C im Vakuum getrocknet, in der Regel derart, daß der in ger'.gneter Verteilung Ausbeute: 3,36 g »Trypsin-Harz«, das sind 96,5% vorliegende Träger in der wäßrigen I ösung des aufzu- der Theorie. Der Proteingehalt beträgt 13%. Die spebringenden Wirkstoffs unter Eiskühüung bei Zimmer- 35 zifische Aktivität des gebundenen Enzymproteins temperatur oder schwach erhöhten, die Proteine nicht gegenüber Casein bei pH 8.0 macht 38% der spezischädigenden Temperaturen gerührt und von der fischen Aktivität des eingesetzten, ungebundenen Flüssigkeit abgetrennt wird. Wie die nachstehenden krist. Trypsins aus.
Beispiele zeigen, findet in verhältnismäßig kurzer Zeit . I₁
bei Einhaltung eines geeigneten Verhältnisses zwischen 40 eispie <.
Anhydridgruppen und Protein eine rasche und voll- 61,6 g Methacrylsäureanhydrid in 640 ml wasserständige Bindung des Wirkstoffs an den Träger statt. freiem Benzol werden mit 0,6 g Divinylbenzol und

An Polymerisate bzw. Copolymerisate der genannten 0,64 g Benzoylperoxyd versetzt und, wie im Beispiel 1

Art können alle proteinartigen Wirkstoffe angelagert erläutert, polymerisiert und aufgearbeitet. Ausbeute:

werden, die eine α- oder f-Aminogruppe besitzen. 45 48 g vernetztes Polymethacrylsäureanhydrid.

Beispiele für Enzyme dieser Art sind Trypsin, Chymo- 1,54 g des so hergestellten Produkts werden zunächst

trypsin, Papain, Insulin, Urease, Katalase, Ribonu- in 50 ml Äthanol suspendiert und durch Zusatz von

clease, Streptokinase, Diastase und Pectinase. 1,47 g 25%iger Ammoniaklösung partiell verseift.

Als Beispiele für Polypeptide seien Oxytocin, Vaso- Nach 15 Minuten wird das Reaktionsprodukt abfil-

pressin, Hypertensin und adrenocorticotropes Hormon 50 triert, mit Äthanol und Äther gewaschen und nach

(ACTH) beispielhaft genannt. dem Trocknen in der zehnfachen Gewichtsmenge einer

Zu proteinartigen Verbindungen, die an die erfin- 1,6%igen wäßrigen Lösung von krist. a-Chymotrypsin dungsgemäßen Träger gebunden werden können, ge- suspendiert. Es wird nun 3 Stunden bei Zimmertempehören auch Antikörper und eine Reihe von Antigenen, ratur gerührt, zentrifugiert, der Niederschlag mehrso daß auch diese mit Hilfe der in Frage stehenden 55 mais mit Wasser gewaschen und bei 0^cC im Vakuum makromolekularen Verbindungen von natürlichen getrocknet. Ausbeute: 0,95 g »Chymotrypsin-Harz« / Begleitstoffen spezifisch abgetrennt werden können. 1 g partiell verseiftes Polymethacrylsäureanhydrid, das Es gelingt beispielsweise, Antikörper aus Serum derart sind 82% der Theorie. Der Proteingehalt beträgt 14%. zu isolieren, daß an ein Polymerisat bzw. Copolymere Die spezifische Aktivität des gebundenen Enzympro= sat gemäß der vorliegenden Erfindung das dem Anti- 60 teins gegenüber Casein bei pH 8 macht 75% der körper zugeordnete Antigen gebunden und das dabei spezifischen Aktivität des eingesetzten, ungebundenen erhaltene »Antigen-Kunstharz« mit dem Antikörper krist. a-Chymotrypsins aus.
enthaltenden Serum in Berührung gebracht wird. Aus _ . . . ,
dem dabei entstehenden Komplex läßt sich der Anti- Beispiel

körper in einfacher Weise, z. B. durch Eluieriing mit 65 150 g eines Gemischs aus 5% Methacrylsäureanhy-

einer wäßrigen Lösung entsprechenden pH-Wertes, drid, 30% Methacrylsäureamid, 60% Methacrylsäure

abtrennen. Das »Antigen-Kunstharz« kann zur Iso- und 5% Äthylenglykoldimethacrylat werden iri 750 ml

lierung weiterer Antikörper verwendet werden. Essigsaureäthylester mit 1,5 g Azoisobuttersäuredini-

tril 2V₈ Stunden bei 75⁰C im CQg-Gasstrom polymerisiert. Das Fällungsprodukt wird abgesaugt, mit Essigestergewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 145 g Copolymerisat.

1,0 g des so hergestellten Copolymerisate wird in JO ml einer wäßrigen Lösung von 0,18 g eines Pancreaspräparats (Enzymgehalt etwa 17% Trypsin und 11% Chymotrypsin) suspendiert und 3 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Danach wird zentrifugiert, der Niederschlag nochmals mit Wasser ge- ίο waschen und zuletzt bei O⁰C im Vakuum getrocknet. Ausbeute: 1,06 g, das sind 90% der Theorie. Der Proteingehalt beträgt 7%. Die Gesamtaktivität der am Harz gebundenen Enzyme gegenüber Casein bei pH 8 macht 44% der eingesetzten Enzymaktivität aus.

Beispiel 4

100 g eines Gemischs aus 10% Methacrylsäureanhydrid und 90°/ Methacrylsäuremethylester werden in 1 1 Benzol mit 1,0 g Benzoylperoxyd 12 Stunden bei 65⁰C polymerisiert und, wie im Beispiel 1 angegeben, aufgearbeitet. Ausbeute: 85 g Methacrylsäuremethylester-Methacrylsäureanhydrid-Mischpolymerisat.

Das so hergestellte wasserunlösliche Copolymerisat kann zum Binden von z. B. Trypsin, aber auch von anderen proteinhaltigen Wirkstoffen benutzt werden.

Beispiel 5

80 mg Polymethacrylsäureanhydrid, das analog zu Beispiel 1 mit Propylendiamin vernetzt wurde, wird in einer Lösung von 40 mg krist. Papain in 1 ml 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7,5) suspendiert und 4 Stunden unter Stickstoff bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsprodukt wird, wie in den vorhergehenden Beispielen beschrieben, aufgearbeitet und getrocknet. Ausbeute: 91 mg »Papain-Harz«, das sind 78% der Theorie. Der Proteingehalt beträgt 28%. Die spezifische Aktivität des gebundenen Enzymproteins gegenüber Casein bei pH 8 macht 3!% der spezifischen Aktivität· des eingesetzten, ungebundenen krist. Papains aus.

Claims

I 695 Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung trägergebundene! proteinartiger Wirkstoffe durch kovalente Bindung des Wirkstoffs an ein anhydridgruppenhaltiges Polymerisat, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung des Wirkstoffs mit vernetztem Poly-Cmeth-Jacrylsäureanhydrid oder mit einem gegebenenfalls vernetzten, wasserunlöslichen Copolymerisat dieser ungesättigten Anhydride, an dessen Aufbau (Meth-)AcryIsäureanhydrid zu mindestens 1 Gewichtsprozent beteiligt ist, in Berührung gebracht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- xs zeichnet, daß ein Poly-(meth-)acrylsäureanhydrid zur Anwendung kommt, das durch nachträgliche Umsetzung mit einem Di- oder Polyamin vernetzt wurde.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- ao zeichnet, daß die erforderliche Wasserunlöslichkeit des Trägers durch Copolymerisation des (Meth-) Acrylsäureanhydrids, gegebenenfalls weiterer copolymerisierender monomerer Verbindungen, mit einem mindestens 2 C —C-Doppelbindungen im Molekül aufweisenden Monomeren erzielt wurde.