DE2215687A1

DE2215687A1 - Neue wasserunloesliche proteinpraeparate

Info

Publication number: DE2215687A1
Application number: DE2215687A
Authority: DE
Inventors: Herbert Dr Bartl; Bruno Dr Boemer; Fritz Dr Hueper; Erich Dr Rauenbusch; Guenter Dr Schmidtkastner
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1972-03-30
Filing date: 1972-03-30
Publication date: 1973-10-11
Also published as: SU576959A3; DD114084A5; FR2186478A1; AT325562B; BE797505A; HU169022B; BG25785A3; PL90704B1; TR17197A; HK38476A; NL7304331A; BG25648A3; ATA401174A; DD108996A5; FR2186478B1; CA1036745A; AR201660A1; AT322488B; ZA732179B; IT1033413B

Description

FARBENFABRIKEN BAYER AG

LEVERKU S EN-Bayerwcrk

Zentralbereich

Patente, Marken und Lizenzen

Er/Fr/Schu 2 9. März 1972

Neue wasserunlösliche Proteinpräparate

Die Erfindung betrifft neue wasserunlösliche Proteinpräparate, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich um Proteine handelt, welche an neue, vernetzte, quellfähige Copolymerisate fixiert sind, Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser neuen wasserunlöslichen Proteinpräparate und die Verwendung von neuen wasserunlöslichen Enzympräparaten zur Durchführung von durca Enzyme katalysierbaren Reaktionen.

Die covalente Bindung von Substanzen an unlösliche polymere Träger hat in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. Besondere Vorteile bietet die Fixierung von katalytisch wirksamen Verbindungen, z.B. Enzymen, da sie in dieser Form nach beendeter Umsetzung leicht abgetrennt und mehrfach wiederverwendet werden können.

Als Träger mit reaktiven Gruppen wurden bereits mehrfach Copolymerisate aus Maleinsäureanhydrid und Vinylverbindungen vorgeschlagen. Copolymere des Maleinsäureanhydrids mit Äthylen und Monovinylverbindungen werden jedoch bei der Umsetzung mit wäß-

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rigen Enzymlösungen mehr oder weniger wasserlöslich, so daß vor oder während der Umsetzung zweckmäßig ein zusätzlicher Vernetzer z.B. ein Diamin zugesetzt wird. So erhaltene Enzympräparate sind relativ schlecht filtrierbar und besitzen lösliche Anteile, was zu Verlusten an gebundenem Enzym führt (vgl. E. Katchalski, Biochemistry 3, (1964), Seiten 1905-1919).

Ferner wurden Copolymerisate aus Acrylamid und Maleinsäure beschrieben, die durch nachträgliches Erhitzen in die Anhydridform überführt werden. Diese Produkte sind relativ schwach vernetzt, quellen sehr stark in Wasser und besitzen eine nur mäßige mechanische Stabilität, was zu Abriebsverlusten bei der Anwendung dieser Harze führt (vgl. deutsche Offenlegungsschrift

1 908 290).

Außerdem wurden stark vernetzte Trägerpolymere durch Copolymerisation von Maleinsäureanhydrid mit Divinyläthern hergestellt. Aufgrund der alternierenden Copolymerisationsart der Monomeren enthalten diese Polymeren einen sehr hohen Anteil an Anhydridgruppen - in den angegebenen Beispielen jeweils über 50 Gew.-% Maleinsäureanhydrid -, der durch das Molekulargewicht des Vinyläthermonomeren bestimmt wird und daher nur in relativ engen Grenzen dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßt werden kann (vgl. deutsche Offeniegungsschrift

2 008 996).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, neue Umsetzungsprodukte von Proteinen und Peptiden mit neuen stark vernetzten, in Wasser quellfähigen Copolymerisaten mit stark variierbarem Gehalt an cyclischen Dicarbonsäureanhydridgruppen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung aufzufinden. Die neuen Umsetzungsprodukte von Proteinen und Peptiden mit den neuen Copolymerisaten sollten die Nachteile der bisher bekannten Proteinpräparate nicht, bzw. nur in geringerem Maße aufweisen.

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Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß nach den Methoden der Perl- oder Fällungspolymerisation Anhydride öl ,ß-monoolefinisch ungesättigter Dicarbonsäuren, Di- oder Poly-(Meth)-Acrylate von Di- oder Polyolen und mindestens ein weiteres hydrophiles Monomere zu statistisch aufgebauten Copolymerisaten polymerisiert und diese erfindungsgemäßen Copolymerisate mit wäßrigen Proteinlösungen zu Proteinpräparaten umgesetzt wurden.

Gegenstand der Erfindung sind somit Proteine, die an vernetzte Copolymerisate bestehend aus copolymerisierten Einheiten von

A 0.1-30 Gew.-%, vorzugsweise 2-20 Gew.-%

οΐ,β-monoolefinisch ungesättigten Dicarbonsäureanhydriden mit 4-9 Kohlenstoffatomen,

B 35 - 90 Gew.-%, vorzugsweise 50-85 Gew.-$

Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylaten von Di- und/oder Polyolen und

C 5 - 60 Gew.-%, vorzugsweise 10-50 Gew.-%

mindestens eines nicht unter B genannten hydrophilen Monomeren,

wobei die Summe der Prozentgehalte A bis C 100 beträgt und wobei die vernetzten Copolymerisate Schüttvolumina von 2-20 ml/g und spezifische Oberflächen von 1-400 m /g besitzen und nach der Verseifung der Anhydridgruppen 0.02-11 Milliäquivalente Säure pro Gramm enthalten, fixiert sind.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Proteinpräparaten, dadurch gekennzeichnet, daß man - bezogen auf Gesamtmonomere -

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A 0.1-50 Gew.-%, vorzugsweise 2-25 Gew.-#

(A₁ ß-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4-9 Kohlenstoffatomen,

B 35 - 90 Gew.-%, vorzugsweise 50-85 Gew.-#

Di- und/oder Poly-(meth)Acrylate von Di- und/oder Polyolen und

C 5-60 Gew.-%, vorzugsweise 10-50 Gew.-%

mindestens eines hydrophilen Monomeren

- die Summe der Prozentgehalte A bis C beträgt 100 nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Änhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 20-200⁰C in Gegenwart Radikale bildender Verbindungen polymerisiert und die so erhaltenen Copolymerisate mit Proteinlösungen unter Bildung der erfindungsgemäßen Proteinpräparate umsetzt.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von erfindungs· gemäß erhaltenen wasserunlöslichen Enzympräparaten zur Durchführung von durch Enzyme katalysierbaren Reaktionen.

Über die Darstellung der als Ausgangsprodukte für die Synthese der Proteinpräparate benötigten Copolymerisate ist folgendes zu sagen. '

Als oi,ß-monoolefinisch ungesättigte Dicarbonsäureanhydride mit 4-9 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise mit 4-5 Kohlenstoffatomen, die für die Herstellung der Copolymerisate benötigt werden, seien namentlich genannt: Maleinsäure-, Itaconsäure- oder Citraconsäureanhydrid, insbesondere Maleinsäureanhydrid· Für die Copolymerisation können auch Mischungen dieser Anhydride eingesetzt werden.

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Die erfindungsgemäß zu verwendenden Di- -und/oder Polymethacrylate bzw. Di- und/oder Polyacrylate von Di- und/oder Polyolen leiten sich von Verbindungen mit mindestens 2 alkoholischen oder phenolischen, vorzugsweise alkoholischen OH-Gruppen bzw. deren Umsetzungsprodukten mit Alkylenoxiden mit 2-8 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2-4 Kohlenstoffatomen oder Gemischen dieser Alkylenoxide ab, wobei an 1 Mol der Hydroxylgruppen tragenden Verbindung 1-10 , bevorzugt 1-10 Alkylenoxidbausteine anpolymerisiert sind. Beispielhaft seien Alkylenoxide, Äthylenoxid, Propylenoxid, Butylenoxid, Trimethylenoxid, Tetramethylenoxid, Bis-chlormethyl-oxacyclobutan, Styroloxid, vorzugsweise Äthylenoxid und Propylenoxid genannt. Es ist auch durchaus möglich, Umsetzungsprodukte von Verbindungen mit mindestens 2 Zerewitinoff-aktiven Wasserstoffatomen, die sich nicht von Alkoholen oder Phenolen ableiten, mit den obengenannten Alkylenoxiden zur Herstellung der Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylate zu verwenden.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Di- und Poly-(Meth)Acrylate von Di- und Polyolen werden nach bekannten. Methoden, beispielsweise durch Umsetzung der Di- und/oder Polyole mit (Meth)Acrylsäurechlorid in Gegenwart von in etwa äquimolaren Mengen, bezogen auf Säurechlorid, an tert. Aminen wie Triäthylamin, bei Temperaturen unter 20°C, in Anwesenheit von Benzol gewonnen (vgl. deutsche Offenlegungsschrift 1 907 666)«, Als Di- bzw. Polyole mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise 2-12 Kohlenstoffatomen kommen z.B. in Frage % Äthylenglykol, Propandiol-1,2, Propandiol-1,3, Butandiole insbesondere Butandiol-1,4, Hexandiole, Dekandiole, Glyzerin, Trimethylolpropan, Pentaerythrit, Sorbit, Sucrose und deren Umsetzungsprodukte mit Alkylenoxiden, wie vorstehend angegeben. Auch Poly- bis-chlormethyl-oxacyclobutan oder Polystyroloxid sind geeignet. Es können auch Gemische aus Di- und Polyolen eingesetzt werden.

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Vorzugsweise werden Diacrylate bzw. Dimethacrylate von Diolen mit 2-4 Kohlenstoffatomen und/oder Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1-10 Molen Alkylenoxid mit 2-4 Kohlenstoffatomen bzw. Trimethylolpropantrimethacrylat verwendet.

Besonders vorteilhaft sind die Dimethacrylate von Äthylenglykol, Diäthylenglykol, Triäthylenglykol, Tetraäthylenglykol oder höheren Polyalkylglykolen mit Molgewichten bis 500 oder deren Gemische.

Die dritte Gruppe der Copolymerisationskomponenten besteht aus einfach ungesättigten, hydrophilen Monomeren. Als solche können alle polymerisierbaren, einfach ungesättigten Verbindungen, welche keine gegen Anhydridgruppen reaktiven funktioneilen Gruppen besitzen und hydrophile Polymere bilden, verwendet werden.

Die hydrophilen Monomeren besitzen vorzugsweise mindestens eine Carboxyl-, Aminocarbonyl-, SuIfo- oder SuIfamoylgruppe, wobei die Aminogruppen des Aminocarbonyl- oder Sulfamoylrestes ggf. durch Alkylgruppen mit 1-4 Kohlenstoffatomen oder durch Alkoxymethyl mit 1-4 Kohlenstoffatomen im Alkoxyrest substituiert sein können.

Beispielhaft seien Acrylsäure, Methacrylsäure, Maleinsäurehalbester mit 1-8 Kohlenstoffatomen im Alkoholrest, N-Vinyllactame wie N-Vinylpyrrolidon, Methacrylamid, N-substituierte (Meth)Acrylamide wie N-Methyl- und N-Methoxymethyl-(meth)-acrylamid und N-Acryloyl-dimethyltaurin genannt.

Sie werden je nach der gewünschten Hydrophilie und Quellbarke it der Copolymeren und der Länge der Polyalkylenoxidkette (n) des mehrwertigen (Meth)-acrylesters in Mengen von 5-60

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Gew.-% der Monomerenmischung zugesetzt. 22156 Oj/

Außer der Hydrophilie beeinflußt der Zusatz dieser Monomeren überraschenderweise auch die Struktur der Polymeren, was bei der Herstellung von Perlpolymerisaten von ganz besonderem Vorteil ist, da hier die Auswahl der zur Monomerenmischung zufügbaren Verdünnungsmittel durch die Bedingungen der Unlöslichkeit in Paraffinkohlenwasserstoffen und der Inertheit gegen Anhydridgruppen stark eingeschränkt wird.

Aufgrund der Variationsbreite in der Zusammensetzung der Monomerenmischung können innerhalb eines sehr weiten Bereiches Hydrophilie, Vernetzungsdichte, Quellbarkeit and Anhydridgruppengehalt der erfindungsgemäßen Copolymerisate dem jeweiligen Verwendungszweck optimal angepaßt werden.

Falls gewünscht, können neben den erfindungsgemäß zu verwendenden Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylaten auch üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel mit mindestens 2 nichtkonjugierten Doppelbindungen, etwa Divinyladipat, Methylenbisacrylamid, Triacrylformal oder Triallylcyanurat in Mengen von etwa 0,01 - 30 Gew.-% der Monomerenmischung zugesetzt werden.

Die Polymerisation kann z.B. in einem organischen Lösungsmittel als Fällungspolymerisation durchgeführt werden, wobei die Polymeren bereits kurz nach dem Einsetzen der Polymerisation auszufallen beginnen. An sich sind alle gegen Anhydridgruppen inerten Lösungsmittel geeignet. Besonders günstige Lösungsmittel sind aliphatische, cycloaliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe, sowie halogensubstituierte Kohlenwasserstoffe, Alkylaromaten und Carbonsäureester.

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Beispielhaft seien genannt: Heptan, Octan, Isooctan, Benzinfraktionen mit Siedepunkten von etwa 60 bis 200⁰C, Cyclo- hexan, Benzol, Toluol, Xylole, Chlorbenzol, Dichlorbenzole, Äthylacetat, Butylacetat.

Die Lösungsmittel sollen vorzugsweise einen Siedepunkt von mindestens 60⁰C besitzen und im Vakuum gut aus dem Fällungspolymerisat entfernbar sein. Für 1 Teil der Monomerenmischung verwendet man etwa 2-50, bevorzugt 5-20 Gew.-TIe, des Lösungsmittels. Die Eigenschaften der Copolymerisate, besonders das Schüttgewicht und die spezifische Oberfläche werden durch Art und Menge des Lösungsmittels wesentlich beeinflußt.

In vielen Fällen ist es vorteilhaft, Gemische der obengenannten Lösungsmittel zu verwenden, oder die Polymerisation in einem Lösungsmittel für das Polymere zu beginnen und im Verlauf der Polymerisation kontinuierlich ein Fällungsmittel für das Polymere zuzugeben. Das Fällungsmittel kann auch zu bestimmten Zeitpunkten in einer oder mehreren Portionen zugegeben werden. Außerdem kann die Monomerenmischung zusammen mit einem geeigneten Initiator als Lösung oder ohne Lösungsmittel in eine vorgelegte Lösungsmittelmenge eingespeist werden, so daß während der Polymerisation eine gleichmäßige, geringe Monomerkonzentration aufrecht erhalten wird. Durch Verwendung von (Meth)-Acrylmonomeren unterschiedlicher Hydrophilie und Variation der Polymerisationsbedingungen lassen sich innerhalb eines sehr weiten Bereiches Produkte mit dem jeweiligen Verwendungszweck angepaßter Quellbarkeit, Dichte und spezifischer Oberfläche bei guter mechanischer Stabilität herstellen.

Die erfindungsgemäßen Copolymerisate werden vorzugsweise durch Suspensionspolymerisation hergestellt. Die ge-

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bräuchlichste Art der Perlpolymerisation, bei der die Monomeren, ggf. unter Zusatz eines organischen Lösungsmittels, in Wasser suspendiert werden, läßt sich in diesem Fall nur mit geringem Erfolg anwenden, da das Anhydrid sehr rasch hydrolysiert, die entstehende Dicarbonsäure hauptsächlich in die Wasserphase übergeht und nur in ge- ' ringer Menge in das Polymere eingebaut wird. Daher wird die Suspensionspolymerisation zweckmäßig in organischem Medium durchgeführt. Als zusammenhängede Phase eignen sich besonders Paraffinkohlen Wasserstoffe wie Hesian, Heptan, Octan und höhere Homologe, Cycloaliphaten wie Cyclohexan, sowie Paraffingemische wie Benzinfraktionen oder Paraffinöl. Die Monomeren und der Initiator- werden in einem mit Paraffinen nicht mischbaren, gegen Anliydridgruppen inerten Lösungsmittel wie z.B.· Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid gelöst und meistens unter Zusatz von Dispergatoren in der zusammenhängende Phase verteilt. Das VolumenverfcSltnis, zusammenhängende Phases K^nonorpfease beträgt lsi "bis 10si, vorzugsweise 2:1 bis 5:1.

Zur Stabilisierung der Suspension kßnm©m beispielsweise Glycerin-mono- und dioleate, sowie Gemisch© dieser Verbindungen, Sorbitan-mono- vnä trioleate bzw. -stearate, Polyäthylenglykolmonoäther sit Stearyl- bzw. 'Laurylalkohql oder Nonylphenol, ' Polyätbylenglykolmonoester mit ölsäure_?.' " Stearinsäure und anderen Fettsäuren mit mehr als 10 C-Atomen, sowie das Na-SaIz des Sulfoberasteinsäuredioctylesters verwendet werden. Diese Stoffe werden in Mengen von vorzugsweise 0,1 - 109ί, bezogen auf die Morioaerenmischung, eingesetzt und im allgemeinen in der Kohlenwasserstoffphase gelöst. Die Partikelgröße der Suspensionspolymerisate kann außer durch Vergrößerung der Riüsrgeschwin&igkeit durch Zugabe von 0,01- 2%, bezogen auf Monomere, einer weiteren obern.schanaktiven Substanz, ζ·Β· einas Alkylsulfonates verringert warden. . __

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Die Polymerisation wird durch radikalische Initiatoren ausgelöst. Geeignete Initiatoren sind z.B. Azoverbindungen oder Perverbindungen. Die zur Polymerisationsauslösung gebräuchlichste Azoverbindung ist das Azoisobuttersäurenitril. Als Perverbindungen kommen hauptsächlich Diacylperoxide wie Dibenzoylperoxid oder Percarbonate wie DiXsopropyl- und Dicyclohexylpercarbonat infrage, es können Jedoch auch Dialkylperoxide, Hydroperoxide und in organischen Lösungsmitteln wirksame Redoxsysteme zur Initiierung verwendet werden.

Die Initiatoren werden in Mengen von 0,01 - 10#, vorzugsweise 0,1 - 3%t bezogen auf die Gewichtsmenge der Monomermischung zugesetzt.

Die Polymerisation wird bei Temperaturen von etwa 20 - 200 C, vorzugsweise 50 - 100⁰C in Abhängigkeit von der Zerfallsgeschwindigkeit der Initiatoren und meistens unterhalb des Siedepunktes der Lösungsmittel und bei Perlpolymerisationen unterhalb der Mischungstemperatur der beiden Phasen durchgeführt. Außerdem ist es in der Regel vorteilhaft,' in inerter Atmosphäre unter Abwesenheit von Sauerstoff zu polymerisieren.

Die durch Fällungspolymerisation erhaltenen Copolymerisate sind farblose bis schwach gelb gefärbte, pulvrige Substanzen mit Schuttvolumina von 1,5 - 30 ml/g, vorzugsweise 2-20 ml/g und spezifischen Oberflächen von 0,1 - 500 m /g, bevorzugt 1 - 400 m /g. Der nach Verseifung der Anhydridgruppen tltrimetrisch bestimmte Gehalt an Carboxylgruppen liegt bei 0,01 - 14 mXquiv/g, vorzugsweise bei 0,02 - 11 mÄquiv/g.

Die Suspensionspolymerisate sind weiße oder schwach gefärbte Perlen, die in einigen Fällen unregelmäßig geformt sein können und einen Durchmesser von 0,03 - 3 mm, vorzugsweise

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0,05 - 0,5 nun und Schüttvolumina von etwa 1,4-8 ml/g, vorzugsweise 1,4-5 ml/g, besitzen* Ihr nach der Hydrolyse der Anhydridgruppen bestimmter Carboxyi-gruppengehalt beträgt 0,01 - 14 mÄquiv/g, vorzugsweise 0,02 - 11 m/Äquiv/g.

Die erfindungsgemäßen Copolymerisate enthalten die copolymer isierten Einheiten im wesentlichen statistisch verteilt. ■· Aufgrund ihrer hohen Vernetzungsdichte sind die Copolymerisate in allen Lösungsmitteln unlöslich. Molekulargewichte sind daher nicht bestimmbar.

Die Copolymerisate können in Wasser auf das 1,1-bis 5-fache ihres Schüttvolumens quellen. Sis eignen sich vorzüglich *xl a Trägerharze zur Fixierung von Substanzen, die mit den Anhydridgruppen der Copolymerisate reagieren können. Außerdem besitzen sie eine ausgezeichnete mechanische Stabilität und damit praktisch keinen Abrieb.

Die oben beschriebenen Trägerharze binden alle Substanzen, die eine funktioneile Gruppe tragen, die befähigt ist mit der Anhydridgruppe des Polymeren zu reagieren. Bei den Proteinen und Peptiden sind dies vor allem die endständigen Aminogruppen des Lysins und die freien Aminogruppen der Peptidkettenenden. Man geht hierbei so vor, daß man zu einer gerührten wäßrigen Lösung des Proteins bei einer Temperatur zwischen 0 und 30⁰C die benötigte Polymerenmenge zugibt. Das Gewichtsverhältnis von Protein zu Trägerharz kann in weiten Grenzen variiert und dem späteren Verwendungszweck angepaßt werden. Gute Ausbeuten erhält man bei einem Verhältnis von 1 Gew.-Teil Protein zu 4 bis 10 Gew.-Teilen polymerem Träger. Die optimalen Verhältnisse sind jedoch sowohl von der Zusammensetzung und der Struktur des Polymeren als auch von der Art des Proteins abhängig.

Bei zahlreichen Enzymen ist es auch zweckmäßig, Stabilisatoren zuzusetzen. Als solche kommen Polyäthylenglykole

τ λ λι ,/* -μ 309841/1 129

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oder nichtionische Netzmittel zur Abschwächung von Denaturierung an Oberflächen in Frage, sowie die bekannten SH-Reagentien oder Metallionen bei speziellen Enzymen. Das pH wird zweckmäßig mit einem pH-Staten auf dem für die betreffende Bindung optimalen pH-Wert gehalten. Dieser pH-Wert liegt in einem Bereich von 2 bis 9, vorzugsweise 5 bis 7. Beim Einsatz von Penicillinacylase hat es sich als zweckmäßig erwiesen, zwischen pH 5,7 und pH 6,8 zu arbeiten. Dabei .müssen zur Konstanthaltung des pH-Wertes anorganische Basen (z.B. Alkalilaugen)oder organische Basen (z.B. tert. organ. Amine) zugesetzt werden. Der Fortschritt der Reaktion ist am Verbrauch der zur pH-Konstanthaltung nötigen Menge an Base ersichtlich. Bei Raumtemperatur werden bis zur Beendigung der Reaktion etwa 16 Stunden bei 4⁰C bis zu 40 Stunden benötigt. Das Harz wird hierauf abgesaugt und zur Ablösung eines kleinen Anteils an ionogen gebundenem Protein mit Puffern bzw. Salzen im Konzentrationsbereich von 0,2 bis 1 M gewaschen.

Die gebundene Substanz wird entweder durch Elementaranalyse oder bei Enzymen oder Inhibitoren durch die enzymatische Aktivität bzw. die Hemmung der enzymatischen Aktivität bestimmt. Die Ausbeuten an gebundener Substanz sind von der Art der Substanz und der Zusammensetzung des Polymeren abhängig. So wurden z.B. Aminosäuren und niedermolekulare Peptide praktisch vollständig angekoppelt; aber auch bei den Proteinen liegen die Ausbeuten an gebundener enzymatischer Aktivität bei 20 bis über 90% der eingesetzten Aktivität.

Nach dem Stand der Technik (deutsche OffenlegungsSchriften 1 935 711 und 2 008 990 wird die Ankoppelung der Proteine in Pufferlösungen in Konzentrationen von 0,05 M bis 0,2 M vorgenommen. Arbeitet man ohne Puffer, so steigt der Anteil des ionogen gebundenen Proteins (deutsche Offenlegungsschrift 1 935 711). Überraschenderweise zeigte sich, daß bei den erfindungsgemäßen Harzen die_ Kopplung injnöglichst ionenfreiem

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Medium maximale Ausbeuten an covalent gebundenem Enzym ergibt. Das pH kann bei dieser Arbeitsweise durch einen pH-Staten sehr genau auf dem optimalen Wert konstant gehalten werden.

Die Anwendung von Enzymharzen ist technisch von besonderer Bedeutung, da mit ihrer Hilfe technisch wertvolle Produkte hergestellt werden können. Die vorherige Bindung der biologischen Katalysatoren nach dem vorliegenden Verfahren gestattet durch ganz einfache Separationsprozesse ihre vollständige Abtrennung aus der Reaktionsmischung und ermöglicht die, aus wirtschaftlichen Gründen entscheidende, vielfache Wiederverwendung. Darüberhinaus wird in den meisten Fällen die Stabilität der empfindlichen und teuren Proteine entscheidend verbessert.

Im folgenden werden einige Beispiele der Anwendung von trägergebundenen Substanzen angegeben, die nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können.

Die Gruppe der Proteasen, wie Trypsin, Chymotrypsin, Papain,Elastase kann z.B. zur Herstellung von Proteinhydrolysaten für mikrobiologische Prozesse, verwendet werden. Außerdem können die Enzyme auch zur Entfernung von antigenen Proteinen aus pharmazeutischen Wirkstoffen dienen.

Acylasen werden technisch zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillinen oder zur Trennung von Racematen acylierter Aminosäuren verwendet. Trägergebundene Amylase kann zun hydrolytischen Abbau von Stärke verwendet werden.

Spezielle Hydrolasen, wie Asparaginase oder Urease können in gebundener Form im extrakorporalen Kreislauf therapeutisch eingesetzt werden.

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Diese und zahlreiche andere Anwendungsmöglichkeiten sind in der Literatur beschrieben worden. Siehe dazu z.B. die Zusammenfassungen in Chem. Eng. News v. 15.2.1971, Seite 86 und Rev. Pure a. Appl. Chem. 21, 83 (1971).

Ein weiteres großes Anwendungsgebiet von an Trägern fixierten Substanzen ist die Affinitätschromatographie. So kann man mit gebundenen Antigenen oder auch Haptenen Antikörper und umgekehrt mit fixierten Antikörpern ( /"-Globuline) Antigene isolieren. Ebenso lassen sich Enzyme mit Hilfe gebundener Inhibitoren oder Substratanalogen spezifisch anreichern. Bekannt ist z.B. die Gewinnung von Trypsin und Chymotrypsin durch gebundene pflanzliche oder tierische Inhibitoren. Andere Beispiele sind die Gewinnung von Peptidasen an speziellen, gebundenen Peptiden oder die Isolierung von Plasmin mit an einem Träger gebundenem Lysin. Zusammenfassende Arbeiten über dieses Anwendungsgebiet sind von G. Feinstein in Naturwissenschaften 58, 389, (1971) und F. Fried in Chromatographie Reviews 14» ¹²¹» (1971) erschienen.

Zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure (6 APS) können Penicilline mit Hilfe von Acylasen aus Mikroorganismen wie zum Beispiel Bakterien, insbesondere E.coli, Erwinia oder Actinomyceten wie Streptomyces, Micromonospora, Nocardia und Pilzen wie Fusarium und Hefen gespalten werden. Gemäß dem Verfahren der Deutschen Patentschrift 1 111 778 zur Herstellung von 6-APS wird eine Penicillin G-Lösung mit einem Bakterienschlamm versetzt, der das Enzym Penicillinacylase (E.C. 3.5.1.11) enthält. Durch die Einwirkung des Enzyms wird die seitenstandige Carbonamidgruppierung des Penicillins abgespalten, ohne daß der ß-Lactamring geöffnet wird.

Die Verwendung von Suspensionen von Mikroorganismen hat folgende Nachteile:

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a. Die Suspension von Mikroorganismen enthält außer der intracellulären Penicillinacylase weitere Proteine und Enzyme, sowie Bestandteile aus dem Nälirmedlum oder deren Umwandlungsprodukte, die "bei der Fermentation entstanden sind. Diese Verunreinigungen lassen sich bei der Aufarbeitung nicht vollständig aus der kristallisierten 6-APS auswaschen.

b. Die Suspension von Mikroorganismen kann wirtschaftlich zweckmäßig nur einmal eingesetzt werden.

o. Die Suspension von Mikrorganismen enthält Verunreinigungen und andere Enzyme, die Penicillin und/oder 6-APS durch Öffnung des ß-Lactamringes inaktivieren.

d. Die Suspension enthält nur kleine Mengen an Penicillinacylase. Der Einsatz von mehr Enzymmaterial, z.B. zur"Erzielung kurzer Reaktionszeiten und damit besserer 6-APS-Aus~ beuten bei geringerem Gehalt von Fremdprodukten ist praktisch nicht möglich.

e. Die Betriebsausbeuten an 6-APS hängen von der schwankenden Penicillinacylase-Bildung in den jeweiligen Fermentationsansätzen ab.

f. Die vollständige Abtrennung suspendierter Mikroorganismen erfordert bei der Aufarbeitung der 6-APS-Ansätze einen zusätzlichen Arbeitsvorgang, der Ausbeuteeinbußen bedingt. Zur Entfernung von proteinartigen Verunreinigungen, die allergene Reaktionen hervorrufen können, sind weitere Reinigungsschritte nötig (Britische Patente 1.169.696; 1.078.847; 1.114.311).

Alle genannten Nachteile werden vermieden, wenn man anstelle einer Suspension von Mikroorganismen eine Penicillinacylase

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verwendet, die durch kovalente Bindung an einen wasserunlöslichen Träger erhalten wird.

Versuche, 6-APS durch enzymatische Spaltung von Penicillinen mit trägergebundener Penicillinacylase herzustellen, sind zwar bekannt (siehe dazu DOS 1 917 057, DOS 1 907 365), konnten jedoch nicht in einen technischen Maßstab übergeführt werden. Die Gründe dafür liegen einmal bei den mechanischen Eigenschaften des verwendeten Trägermaterials, das zu hohem Abrieb führt, zum anderen konnten bei mäßigen Verfahrensausbeuten nur geringe spezifische Aktivitäten an trägergebundener Penicillinacylase erreicht werden..

Auch das in der Deutschen Patentanmeldung P 2 157 970,4 (DBP ) verwendete unlösliche Enzym, das durch kovalente Bindung der Penicillinacylase an ein Mischpolymerisat aus Acrylamid, Ν,Ν'-Methylenbisacrylamid und Maleinsäureanhydrid gewonnen wurde, hat für die Spaltung von Penicillin im technischen Maßstab Nachteile, da es stark quillt und mechanisch nicht stabil ist. Diese Nachteile beeinträchtigen die mehrmalige Wiederverwendung des so hergestellten Harzes im technischen Maßstab. Es wurde nun gefunden, daß die genannten Nachteile vermieden werden, wenn eine an einen erfindungsgemäßen wasserunlöslichen Träger gebundene Penicillinacylase zur Spaltung von Penicillinen verwendet wird.

Die Spaltung von Penicillinen mit erfindungsgemäßer trägergebundener Penicillinacylase läßt sich einfach und auch im großtechnischen Maßstab durchführen. Das trägergebundene unlösliche Enzym wird in einer Lösung mit 75000 - 150000 IU/ml Penicillin, z.B. Penicillin G oder Penicillin V suspendiert. Die enzymatische Spaltung wird bei konstantem pH-Wert im Bereich von 6-9 vornehmlich im Bereich des pH-Optimums der jeweils gebundenen Penicillinacylase z. B. bei pH 7,8 durchgeführt. Zur Neutralisation des abgespaltenen Acylrestes

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z.B. der Phenylessigsäure oder der Phenoxyessigsäure verwendet man wäßrige Alkalilösungen z.B. Kali- oder Natronlauge oder or ganische Amine, vorzugsweise Triäthylamin. Aus dem Verbrauch der Base ist die Reaktionsgeschwindigkeit und die Beendigung der Spaltung zu ersehen. Die Penicillinacylase katalysiert sowohl die Spaltung von Penicillin zur 6-APS als auch die Resynthese der Penicilline aus den Spaltprodukten. Das Gleichgewicht ist abhängig vom pH-Wert des Mediums. Bei kleineren pH-Werten verschiebt sich das Gleichgewicht zugunsten des Ausgangsproduktes Penicillin. Dies kann zur Umacylierung von Penicillinen in Gegenwart anderer Acylre.ste oder zur Synthese von Penicillinen aus 6-APS ausgenutzt werden.

Die Reaktionstemperatur der enzymatischen Spaltung beträgt vorzugsweise 38⁰C. Bei niedrigeren Temperaturen nimmt die Aktivität des Enzyms ab. Wird die Spaltung z.B. bei 25° C durchgeführt, muß doppelt soviel Enzym wie bei 38° C eingesetzt werden, wenn gleiche Reaktionszeiten erzielt werden sollen.

Die Reaktionsgeschwindigkeit hängt bei gegebener Temperatur von der spezifischen Aktivität und der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase ab. Außerdem ist die Reaktionsgeschwindigkeit abhängig von dem Verhältnis der Menge der trägergebundenen Penicillinacylase zur Konzentration des Penicillins. Ein Spaltungsansatz mit einer Konzentration von 100.000 IU/ml Penicillin G-Kalium ist nach 10 Std. bei pH 7,8

und 38 C vollständig zu 6-APS und Phenylessigsäure hydrolyse

siert, wenn pro Einheit Penicillinacylase 10 - Einheiten Penicillin G eingesetzt werden (eine Enzymeinheit (E) ist definiert als die Aktivität, die 1 pMol Penicillin G pro Minute bei 37° C zu 6-APS und Phenylessigsäure hydrolysiert). Der Anteil an trockenem Enzymharz beträgt nur 0,5 - 1 % des Reaktionsgemisches. Werden pro 1Cr IU Penicillin G, 5 Einheiten Penicillinaclase eingesetzt, so dauert die vollständige

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3 0 9 8 4 1/112 9

Spaltung nur zwei Stunden. Es sind auch noch kürzere Reaktionszeiten bei Einsatz von noch mehr gebundener Penicillinacylase, bei Verwendung z.B. von trägergebundener Penicillinacylase aus kristallisiertem Enzym, möglich.

Die erfindungsgemäß hergestellte trägergebundene Penicillinacylase ist perlförmig, zeichnet sich durch eine hohe mechanische Stabilität und ein vergleichsweise hohes spezifisches Gewicht aus. Diese Eigenschaften ermöglichen bei vielfachem Einsatz eine Verwendung über lange Zeiträume. Diese Eigenschaften ermöglichen ferner bei Batch-Prozessen eine intensive Rührung und eine einfache Abtrennung durch Zentrifugieren ohne Verlust durch mechanische Beanspruchung z.B. durch Abrieb, Somit werden in Batch-Prozessen klare Filtrate erhalten, die ohne zusätzliche Filtration zur Gewinnung des Endproduktes, der 6-APS, weiterverarbeitet werden können. Die erfindungsgemäß hergestellte trägergebundene Penicillinacylase erlaubt ebenso eine schnelle und einfache Filtration,, da durch die mechanische Stabilität keine die Filterfläche verstopfenden Feinstanteile entstehen. Weitere Vorteile bietet das Harz im Batch-Prozeß wegen des vergleichsweise hohen spezifischen Gewichts, das ein schnelles Absetzen des Harzes bedingt, so daß nach Beendigung des Prozesses die überstehende Lösung leicht abgehebert werden kann. Daraus ergibt sich eine Vereinfachung der Verfahrensführung, da das Harz beim Batch-Prozeß im Reaktionsgefäß verbleiben und direkt für die nächste Spaltung verwendet werden kann.

Die Eigenschaften des Polymerisates ermöglichen ferner die Verwendung der trägergebundenen Penicillinacylase nicht nur in Batch-Prozessen, sondern auch in kontinuierlichen Verfahren z.B. in Reaktionssäulen, wobei die Perlform die erforderliche, hohe Durchflußgeschwindigkeit erlaubt.

Die bei der enzymatischen Spaltung gebildete 6-APS wird nach Abtrennung des Enzymharzes aus der Reaktionslösung nach

Le A 14 346 -18- 309U1/.1129

bekannten Verfahren gewonnen (siehe z.B. Deutsche Patentschrift 1 111 778) und bei pH 4,3 kristallisiert. Bei der erfindungsgemäßen Spaltung von Penicillin mit der erfindungsgemäß hergestellten trägergebundenen Penicillinacylase werden wesentlich höhere Ausbeuten an 6-APS erhalten, als bei Verwendung von E.coli-Schlamm aber auch höhere Ausbeuten, als bei der Verwendung des Enzymharzes nach der Deutschen Patentanmeldung P 2 157 970,4. So wurde, wie in den Beispielen 8 und 9 gezeigt'wird, 6-APS in einer Ausbeute von.ca. 90 % d. Th. isoliert. Die so hergestellte 6-APS enthält keine Proteine als Verunreinigung. Die so hergestellte 6-APS enthält auch praktisch keine Polymeren, die bei anderen Verfahrensweisen entstehen können. Allergene Nebenwirkungen, die auf Proteine oder Polymere zurückgeführt werden, sind bei der erfindungsgemäß hergestellten 6-APS ausgeschlossen.

Die erfindungsgemäß hergestellte trägergebundene Penicillinacylase gestattet einen vielfachen Einsatz über einen langen Zeitraum. Auch hiernach ist die Enzymaktivität noch praktisch vollständig erhalten.

309341 /1129 Le A 14 346 - 19 -

Die Siedepunkte in den Beispielen wurden bei Normaldruck "bestimmt.

Beispiel 1 a)

70 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 1 1 Benzol gelöst und zunächst 4 Stunden bei 60° C polymerisiert. Dann gibt man 1 g Azoisobuttersäurenitril und 200 ml Benzin (Kp 100 - 140⁰C) zu und polymerisiert 2 Stunden bei 70⁰C und 2 Stunden bei 8O⁰C.

Das pulvrige Polymere wird gründlich mit Petroläther (Kp 30 50° C) gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 96 g

Schüttvolumen: 8,8 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 12,4 ml/g

spez. Oberfläche: 8,6 m /g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 3,85 m Äquiv/g

Beispiel 1 b)

6 g des nach Beispiel 1a) hergestellten Trägerharzes werden in einer Lösung von 610 U Penicillinacylase in 150 ml Wasser suspendiert. Durch Zugabe von 1 N-NaOH mit einem pH-Staten wird der pH-Wert auf 6,3 gehalten und die Suspension 20 h bei 25⁰C gerührt.

Dann saugt man über eine Glasfritte G 3 ab und wäscht mit Je 300 ml 0,05 M-Phosphatpuffer pH 7,5, der 1 M-Natriumchlorid enthält, und mit demselben Puffer"ohne Natriumchlorid. Durch weiteres Waschen kann keine Aktivität mehr eluiert werden. Überstand und Waschlösungen werden vereinigt und ihre enzymatische Aktivität bestimmt. In einer aliquoten Menge wird die enzymatische Aktivität des feuchten Harzes gemessen.

Le A 14 346 -20- 309841 /1129

Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 610 U -_t|

Überstand + Waschlösungen 112 U

Trägerharz nach der Umsetzung 561 U

d.s. 92 % der Ausgangsaktivität ■—

Die enzymatische Aktivität der Penicillinacylase wird colorimetrisch oder, titrimetrisch mit 0,002 M-6-Nitro-3-(N-phenylacetyl)-aminobenzoesäure (NIPAB) als Substrat bei pH 7,5 und 25° C gemessen. Der molare Extinktionskoeffizient der-entstehenden 6-Nitro-3-aminobenzoesäure beträgt E^_{05 nm} = 9090. 1 Einheit (U) entspricht dem Umsatz von 1 /uMol Substrat pro Minute.

Beispiel 1 c)

In einer Lösung von 40 ml Urease" in 32 ml Wasser werden 400 mg des nach Beispiel 1 a.) hergestellten Trägerharzes suspendiert. Bei ständigem Rühren bei Raumtemperatur wird· der pH-Wert durch Zugabe von 1 N-Natronlauge auf pH 6,0 konstant gehalten. Nach 16 Stunden ist die Reaktion beendet, das Harz wird abgesaugt und wie in Beispiel 1 b mit Puffer gewaschen,

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität

Aupgangslösung 168 U

überstand + Waschlösungen 64,5 U

Trägerharz nach der Umsetzung 87 U

d.s. 5? % der Ausgangsaktivität

Die enzymatische Aktivität der Urease wird titrimetrisch mit 0,17 M-Harnstoff als Substrat, bei 25⁰C und pH 6,1 bestimmt. 1 Einheit (U) entspricht der Enzymmenge, die 1 yuMol Harnstoff d.h. 2 /uMol Salzsäure pro Minute verbraucht.

Le A 14 346 .^₁ . 309841/1.129

In einer Lösung von 100 mg Trypsin in 32 ml 0,02 M-Calciumchlorid werden 500 mg des nach Beispiel 1 a) hergestellten

Trägerharzes suspendiert. Unter ständigem Rühren bei 4° C ' wird der pH-Wert durch Zugabe von 1 N-Natronlauge

auf pH'6,3 konstant gehalten. Nach 16 Stunden wird das Harz abgesaugt und wie in Beispiel 1 b) mit Puffer gewaschen. ·'

Ergebnis;

Enzymatische Aktivität

Ausgangslösung 110 U

überstand + Waschlösungen 15,6 U Trägerharz nach der Umsetzung 64 U d.s. 58 % der Ausgangsaktivität

Die enzymatische Aktivität wurde colorimetrisch nach Tuppy, Z. Physiol. Chem. 329 (1962) 278, mit Benzol-arginin-p-nitroanilid (BAPNA) als Substrat gemessen. 1 Einheit (U) entspricht der Spaltung von 1 /uMol Substrat pro Minute bei 25⁰C und pH 7,8 Beispiel 2 a)

Eine Lösung von.80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 10 g Methacrylsäure, 10g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 1 1 Benzol wird unter langsamem Rühren 4 Stunden bei 60° C, 2 Stunden bei 70<> C und 1 Stunde bei 80° C polymerisiert. Das Polymere wird abfiltriert, dreimal in Benzol ausgerührt, mit Petroläther gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 70 g

Schüttvolumen: 7,0 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 8,2 ml/g

spez. Oberfläche: 5,3 m²/g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen ■ 2,55 mÄquiv/g

_Le A 14 346 - 22 - 309841/1 129

1 g des nach Beispiel 2a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel 1 t>) mit Penicillinacylas© in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Ergebnis: _:

Enzymatische Aktivitäten (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 118 U

Überstand + Waschlösungen 21 U

Trägerharz nach der Umsetzung ' 82 U d.s. 69 % der Ausgangsaktivität

Beispiel 3 a)

60 g Tetraäthylenglykoldimethaorylat, 30 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril werden in 300 ml Acetonitril gelöst. Diese Lösung wird· in 1 1 Benzin (Xp 100 - 14q° C), welches 5 g eines Gemisches von Glycerinmono- und -dioleat enthält, suspendiert und 22 Stunden bei 60° C polymerisiert.

Die Polymerperlen vsrden abfiltriert, dreimal in Benzol und anschließend zweimal in Petroläther (Kp- 30 - 50° C) suspendiert und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: Sk- g weiBe Kugeln

Schüttvolumen: 4,4 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 5,5 ml/g

spez. Oberfläche: 6,6 in²/g

mittlerer Partikeldurchmesserί /ν 200 /u .

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen «4,3 mlquiv/g

Le A 14 346 -23» 309841/1129

Beispiel 3 b) " '· 221568

1 g des nach Beispiel 3 a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel 1 b) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Ergebnis:
■ Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 118 U

überstand + Waschlösungen 43 U

Trägerharz nach der Umsetzung 96 U d.s. 81 % der Ausgangsaktivität

Beispiel 4 a)

Eine Lösung von 2100 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 600 g Methacrylsäure, 300 g Maleinsäureanhydrid und 30 g Azoisobuttersäurenitril in 7,5 1 Acetonitril wird in 21 1 Benzin (Kp 100 i4o° C), in dem 150 g eines Gemisches von Glycerinmono- und -dioleat gelöst wurden, suspendiert und 1 Stunde bei 50° C und 20 Stunden bei 60° C polymerisiert.

Das Perlpolymerisat wird abgesaugt, zweimal mit Toluol und einmal mit Petroläther (Kp 30 - 50° C) ausgerührt und bei 60° C getrocknet.

Ausbeute: 2,95 kg

Schüttvolumen: 4,7 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 5,4 ml/g

mittlerer Partikeldurchmesser: ca. 0,3 mm Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen =4,0 mÄquiv/g

Beispiel 4 b)

1 g des nach Beispiel 4 a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel 1 b) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

309841/1129

Le A 14 346 - 24 -

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

in der Ausgangslösung 107 U

überstand und Waschlösungen 27 Ü

Trägerharz nach der Umsetzung" 67 U d.s. 63 % der Ausgangsaktivität

Beispiel 4 c)

20 g des nach Beispiel 4 a) hergestellten Polymeren werden bei Raumtemperatur in 600 ml einer Lösung von 1,0 g unspezifischer Elastase aus Schweinepankreas unter Rühren eingetragen. Das pH wird hierbei auf 5,8 konstant gehalten. Nach einer Reaktionszelt von 16 Stunden wird das Harz abgesaugt und in .der in Beispiel 1 b) beschriebenen Weise' aufgearbeitet.

Ergebnis: · .

Enzymatische Aktivität (Casein-Test)

Ausgangslösung 2180 E ^

Überstand + Waschlösungen 993 E

Trägerharz nach der Umsetzung ' 1225 E d.s. 56 % der Ausgangsaktivität·

Die enzymatische Aktivität der unspezifischen Elastase wird titrimetrisch mit Casein als Substrat (Konzentration 11,9 mg/ml) bei pH 8,0 und 25° C bestimmt. 1 Einheit (E) entspricht einem Verbrauch von 1 /uMol Kalilauge pro Minute.

Beispiel 5 a)

Eine Lösung von 80 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 10 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 300 ml Acetonitril wird analog zu Beispiel 3a) polymerisiert.

τ λ λ, *,z o^ 309841/1 129

Le A 14 346 - 25 -

Ausbeute: 92 g weiße, eiförmige Partikel

Quellvolumen in Wasser: 3,2 ml/g·

spez. Oberfläche: 1,7 nr/g

mittlerer Partikeldurchmesser: 125 /u

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen « 3,5 mXquiv/g

Beispiel 5 b)

1 g des nach Beispiel 5 a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel 1 b) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 118 U

Überstand + Waschlösungen 34 U

Trägerharz nach der Umsetzung 61 U d.s. 52 % der Ausgangsaktivität

Beispiel 6 a)

Eine Lösung von 5CX-g Äthylenglykoldimethacrylat, 40 g Methacrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 300 ml Acetonitril wird in 1 1 Benzin (Kp 100 14O⁰C), in welchem 5 g eines Gemisches von Glycerinmonooleat und - dioleat gelöst sind, suspendiert und 20 Stunden bei 60° C polymerisiert. Das Perlpolymerisat wird abfiltriert, dreimal in Benzol und zweimal in Petroläther (Kp 30 - 50° C) suspendiert und im Vakuum bei 50° C getrocknet.

Ausbeute: 87 g

Schüttvolumen: 4,8 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 5,6 ml/g

spez. Oberfläche: 13,2 m²/g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen =4,2 mÄquiv/g

LeA14346 -26- 3 0 9 β 4 1 / 1 1 2 9

97

1 g des nach Beispiel 6 a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel 1 b) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung. 118 U

Überstand und Waschlösungen 29 U

Trägerharz nach der Umsetzung " 55 U d.s. 47 % der Ausgangsaktivität

Beispiel. 7a)

Eine Lösung von 50 g Trimethylolpropan-trimethacrylat, 30 g Methacrylsäure, 20 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 300 ml Acetonitril wird analog zu Beispiel 6 a) polymerisiert.

Ausbeute: 86 g ,,

Schüttvolumen: 2,0 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 2,2 ml/g mittlerer Partikeldurchmesser: rj 30/U Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 4,1 mÄquiv/g.

Beispiel 7 b)

1 g des nach Beispiel 7 a) hergestellten Polymeren wird bei Raumtemperatur und ständigem Rühren zu einer Lösung von 100 mg Lysin in 32 ml Wasser gegeben. Der pH-Wert wird auf 6,3 konstant gehalten. Nach 16 Stunden wird das Harz abgesaugt, in 50 ml 1 M-Natriumchloridlösung suspendiert, abgesaugt und mit 100 ml Wasser nachgewaschen. Der Rückstand wird im Vakuum bei 100⁰C getrocknet und der Stickstoffgehalt nach Kjeldahl bestimmt.

_Le a 14 346 - 27 - 309841/1129

Ergebnis: ***

Stickstoffgehalt: 1,596 entsprechend einem Gehalt des

Harzes von 65 mg Lysin. Das sind 6596 der eingesetzten Menge an Lysin.

Beispiel 8

Analog zu Beispiel 6a) wurden polymerisiert (Variation der Maleinsäureanhydrid-Menge) :

Versuch Nr.	a	75	b	C	d	e	f	g
TGDM (g)	20	70	65	60	55	50	45
MAS (g)	5	20	20	20	20	20	20
MSA (g)	1	10	15	20	25	30	35
AIBN (g)		1	1	1	1	1	1
•Acetonitril	250
(ml)	1000	. 250	250	250	250	250	250
Benzin (ml)	5	1000	1000	1000	1000	1000	1000
Emulgator (g)	95	2,5	5	5	5	5	5
Ausbeute (g)	3,4	93	86	88	80	79	70
V_S (ml/g)	4,4-	3,4	3,6	2,6	.. 3,0	3,2	2,5
Vq (ml/g)	3,1.	6,0	4,5	3,5	4,0	4,3	3,4
Säure (mXq./g)	4,2	3,6	. 3,8	3,9	4,7	4,3

TGDM = Tetraäthylenglykoldimethacrylat MAS = Methacrylsäure

MSA = Maldnsäureanhydrid

AIBN = Azoisobuttersäurenitrll

Emulgator = Gemisch aus Glycerin-mono- und dioleaten V₃ = SchUttvolumen

Vq = Quellvolumen in Wasser

Säure = Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen

Le A 14 346 -28- 309841/1129

Beispiel 9 a) «" 221568/

Eine Lösung von 70 g Tet'raäthylenglykoldimethacrylat, 20 g Acrylsäure, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 1 1 Benzol wird unter Luftausschluß und langsamem Rühren 4 Stunden auf 60° C, 2 Stunden auf 70° und 2 Stunden auf 80° C erwärmt. Das feinteilige Fällungspolymerisat wird dreimal in Benzol und zweimal in Acetonitril suspendiert, abgesaugt und im Vakuum getrocknet. '

Ausbeute: 94 g

Schüttvolumen: 6,8 ml/g

Quellvolumen in Wasser: 7,6 ml/g

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 1,64 mÄquiv/g

Beispiel 9 b)

1 g des nach Beispiel 9 a) hergestellten Polymeren wird, analog zu Beispiel 1b) mit Penicilliriacylase in 32 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 107 U

Überstand■+ Waschlösung ' 26 U

Trägerharz nach der Umsetzung 38 U d.s. 36% der Ausgangsaktivität

Beispiel 10 a)

i Eine Lösung von 50 g Tetraäthylenglykoldimethacrylät, 40 g N-

Vinylpyrrolidon, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Dicyclohexylpercarbonat in 200 ml Acetonitril wird in 1 1 Benzin (Kp "100 140 C), welches 5g eines Gemisches von Glycerinmono- und dioleaten enthält, suspendiert und unter Rühren zunächst 18 Stunden auf 50° C erwärmt. Dann gibt man 1 g des Initiators nach und rührt weitere 8 Stunden bei 60° C. Die Polymerkugeln werden Z 309841/1129

Le A 14 346 - 29 -

so

rait Benzol und Petroläther gründlich gewaschen und im Vakuum getrocknet. . . . " ·

Ausbeute: 54 g klare Perlen Schüttvolumen: 1,6 ml/g
Quellvolumen in Wasser: 2,4 ml/g mittlerer Partikeldurchmesser:^ 0,3 nun

Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen = 3,3 mXquiv/g Gehalt an Stickstoff: 3,4 % £ 2.7 % N-Vinylpyrrolidon.

Beispiel 10 b)

1 g des nach Beispiel 10 a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel 1 b) mit Penicillinacylase in 33 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Ergebnis: .

Enzymatische Aktivität (NIEAB-Test)

Ausgangslösung .. 107 U

Überstand + Waschlösungen 26 U

Trägerharz nach der Umsetzung 82 U d.s. 77 % der Ausgangsaktivität

Beispiel 11 a) .

Eine Lösung von 70 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat^ 20 g Methacrylamid, 10 g Maleinsäureanhydrid, 1 g Azolsobuttersäurenitril und 200 ml Acetonitril werden analog .zu Beispiel 5 a) in Benzin suspendiert und polymerisiert.

Ausbeute: 93 g

Schüttvolumen: 2,0 ml/g

Guellvolumen in Wasser: 3,3 ml/g Säuregehalt nach Verseifung der Anhydridgruppen: 1,7 mÄquiv/g

Le A 14 346 - 30 - 3 ₀ 9 8 4 1 / 1 1 2

$1

Beispiel 11 b)

1 g des nach Beispiel 11 a) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel 1 b) mit Penicillinacylase in 32 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Ergebnis:

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 107 U

Überstand und Waschlösungen 42 U

Trägerharz nach der Umsetzung 33 U

d.s. 31 % der Ausgangsaktivität '

Beispiel 12 a)

Eine Lösung von-60 g Tetraäthylenglykoldimethacrylat, 30 g N-Kethoxymethyl-acrylamid, 10 g Maleinsäureanhydrid und 1 g Azoisobuttersäurenitril in 200 ml Acetonitril wird in 1 1 Benzin, in welchem 5 g eines Gemisches von Glycerin-mono- und dioleat gelöst verden aispendiert und 20 Stunden bei 60° C polymerisiert.

Das Perlpolymerisat wird abfiltriert, dreimal in Essigester suspendiert und im Vakuum bei 50° C getrocknet.

Ausbeute: 97 g Schüttvolumen: 1,6 ml/g Quellv-olumen in Wasser: 3»1 ml/g mittlerer Teilchendurchmesser: /vO,3 mm

Beispiel 12 b)

1 g des nach Beispiel 12 a) hergestellten Polymeren wird'analog zu Beispiel 1 b) mit Penicillinacylase in 32 ml Wasser bei pH 6,3 umgesetzt.

Le a 1/, 3^6 - 31 - 309841/1129

Enzymatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung. 107 U *

überstand + Waschlösungen 49 U

Trägerharz nach der Umsetzung 25 U d.s. 23 % der Ausgangsaktivität

Beispiel 13 a)

Setzt man im Ansatz von 12 a) statt N-Methoxymethyl-acrylamid 30 g N-Methoxymethylmethacrylamid ein, so erhält man folgendes Ergebnis:

Ausbeute: Sk g
Schüttvolumen: 2,4 ml/g
.Quellvolumen in Wasser: 3,9 ml/g mittlerer·Partikeldurchmesser: λ/0,6 mm

Beispiel 13 b)

1 g des nach Beispiel 13 ε) hergestellten Polymeren wird analog zu Beispiel 1 b) mit Penicillinacylase in 32 ml Wasser bei pH 6,3 ungesetzt.

Ergebnis:.

Enzyisatische Aktivität (NIPAB-Test)

Ausgangslösung 107 U

überstand und Waschlösungen 60 U Trägerharz nach der Umsetzung 24 U d.s. 22 % der Ausgangsaktivität

_T. „ ;. _., „ 309 841/1

Le A 14 346 - 32 -

Beispiel 14

76,1 kg (Feuchtgewicht) trägergebundener Penicillinacylase dargestellt gemäß Beispiel 4 (NIPAB-Test) mit einer Aktivität von 737 OOO υ und 125 kg Penicillin G-Kalium (Reinheit 98 %) werden nacheinander zu 2000 1 Wasser gegeben und bei 38° C gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsansatzes wird durch laufende Zugabe von Triäthylamin konstant bei 7,8 gehalten. Nach 8 Stunden wird kein Triäthylamin mehr aufgenommen. Die trägergebundene Penicillinacylase wird abzentrifugiert, mit jeweils 60 1 Wasser und 80 1 0,2 m Phosphatpuffer, pH 6,5, nachgewaschen und für weitere Spaltungsansätze erneut eingesetzt. Das Filtrat einschließlich Waschwasser wird im Vakuum auf 300 1 eingeengt. Die 6-APS wird durch Zugabe von halbkonzentrierter Salzsäure am isoelektrischen Punkt bei pH 4,3 in Gegenwart von 200 1 Methylisobutylketon ausgefällt. Nach einer Stunde wird abfiltriert, mit 200 1 Wasser und dann mit 200 1 Aceton nachgewaschen. Getrocknet wird im Vakuum bei 40° C; Schmelzpunkt 208° C; Ausbeute 66,7 kg, das sind 91,9 % d. Th.; Reinheit 98 %.

Die trägergebundene Penicillinacylase wurde nacheinander zu insgesamt 30 Ansätzen eingesetzt. Auch nach 30 Spaltungen ist die trägergebundene Penicillinacylase nicht verbraucht. Die Reaktionszeit verändert sich nicht.. Aufgearbeitet wurde wie vorstehend beschrieben. Die erzielten 6-APS-Ausbeuten sind nachstehend zusammengestellt:

Spaltung 91,9 % d. Th.

1.	Spal
2.	Il
3.	Il
4.	It
5.	Il
6.	Il
7.	If
8.	It
9.	Il
10	Il

91,4	II	Il	Il
91,6	ti	Il	It
91,0	It	Il	Il
91,2	Il	Il	Il
90,3	Il	Il	It
91,5	Il	Il	It
90,9	II	Il	It
91,9	Il	It	It
an «7	If	Il	It

Le A 14 346 -33- 309841/1129

11.	Spaltung	0 =	91,2	%	?	d.	Th	τ:
12.	ti	Beispiel 15	90,1	It		tf	tt
13.	Il	90,9	ft	If	ft
14.	Il	90,7	If	tt	It
15.	Il	91,0	It	It	It
16.	It	90,2	ft	Il	tt
17.	Il	90,3	It	tt	ff
18.	tf	89,9	It	tt	tt
19.	ti	89,8	It	It	tt
20.	tt	89,1	tf	tf	tt
21.	It	91,7	tt	It	It
22.	If	91,9	ft	tt	tf
23.	If	91,6	tt	tt	ft
24.	ft	91,1	It	tt	It
25.	It	91,8	ft	tt	It
26.	tt	90,7	It	tt	Il
27.	It	91,7	tt	tf	It
28.	Il	91,4	ff	tt	Il
29.	Il	90,8	It	It	Il
30.	tt	90,3	ft	ft	It
	90,95	i d.

330 g trägergebunden Penicillinacylase dargestellt gemäß Beispiel 1_?mit einer enzymatischen Aktivität von 3410 U(NIPAB-Teet) und 129 g Penicillin G-Kalium werden nacheinander zu 2000 ml Wasser gegeben und wie im Beispiel 14 beschrieben bei 38° C und pH 7,8 gerührt. Das Penicillin G wird in 2 Stunden vollständig zu 6-APS und Phenylessigsäure gespalten. Die 6-APS wird, wie im Beispiel 14 beschrieben, isoliert. Die trägergebundene Penicillinacylase wird zwanzigmal nacheinander eingesetzt. Auch nach der zwanzigsten Spaltung muß zur vollständigen Spaltung die Reaktionszeit nicht verlängert werden.

6-APS-Ausbeuten:

Spaltung 67.5 g 68.4 " 68.7 " 68.6 » 68.4 " 68.1 »

Il It Il Il Il Il

68.7

90,1 % d. Th.

91,	1	If	tt	It
91,	9	tt	tt	ti
91,	5	It	ti	tt
91,	O	tf	tt	tt
90,	8	ft	It	tt
Qt		ti	tt	It

Le A 14

- 34 -

309841/1129

8.	Spaltung	68.4	g	91,2	%	d.	Th.
9.	ti	68.5	tt	91,5	If	tf	tt
10	If	68.1	tt	90,9	It	tt	It
11	It •	68.5	tt	91,3	tt	It	It
12	It	68.6	It	91,7	It	tf	It
13	It •	68.5	tt .	91,3	tt	tt	Il
14	It •	68.1	It	90,8	tt	tt	tt
15	ti •	68.3	tt	91,1	It	tt	tf
16	ti «	67.8	tt	90,5	It	It	It
17	ti •	68.0	It	90,6	It	It	It
18	It •	67.4	II	89,9	tt	tt	tt
19		67.5	It	90,0	If	It	It
20	St	66.8	Il	89,1	tf	tt	It
			0 =	90,89		% d	. Th
Beispiel 16

120g trägergebundene Penicillinacylase (Feuchtgewicht) gemäß Beispiel 4 mit einer Aktivität von 1160 U(NIPAB-Test) werden mit 120 g Penicillin G-Kalium in 1300 ml Wasser gegeben und 9 Stunden bei 38° C und pH 7,8 wie im Beispiel 14 beschrieben gerührt. Aufgearbeitet wird wie im Beispiel "!4 beschrieben, Die trägergebundene Penicillinacylase wird fünfmal nacheinander zur enzymatischen Spaltung eingesetzt. Die erzielten Ausbeuten an 6-APS sind nachstehend zusammengestellt;

87,6 % d. Th.

88,9 " " "

90,6 » » w

89,9 " " " }

90,4 » » " ;

290 er träeerbebundene Penicillinacylase gemäß Beispiel 4 mit einer enzymatischen Aktivität von 2803 U(NIPAB-Test) werden mit 138 g Penicillin V-Kalium zu 2000 ml Wasser gegeben und 9 Stunden bei 38° C gerührt. Der pH-Wert xvird durch laufende Zugabe von Triäthylamin konstant bei 7,8 gehalten. Aufgearbeitet wird wie im Beispiel 1 beschrieben. Ausbeute an 6-APS 64,3 g, (86,1 % d. Th.); Reinheit 97,4 %.

1.	Spaltung	61.2	g
2.	It	62.0	ti
3.	tt	63.3	Il
4.	It	62.7	tt
5.	II	63.1	tt
Beispiel 17

Le A 14 346

- 35 -

30 9841/1129

Claims

Patentansprüche

1) Wasserunlösliches Proteinpräparat, dadurch gekennzeichnet, daß.es sich um ein Protein handelt, welches an ein vernetztes Copqlymerisat gebunden ist, das aus copolymerisierten Einheiten von

A 0.1-30 Gew.-% (/,ß-monoolefinisch ungesättigten

Dicarbonsaureanhydriden mit 4-9 Kohlenstoffatomen,

B 35 - 90 Gew.-# Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylaten von

Di- und/oder Polyolen und

C 5 - 60 Gew.-% mindestens eines nicht unter A und B

genannten hydrophilen Monomeren,

wobei die Summe der Prozentgehalte A bis C 100 beträgt und wobei die vernetzten Copolymerisate Schüttvolumina von 2-20 ml/g und spezifische Oberflächen von 1-400 m²/g besitzen und nach der Verseifung der Anhydridgruppen 0.02-11 Milliäquivalente Säure pro Gramm enthalten, besteht.

2) Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die copolymerisierten Einheiten der Komponente A des Copolymerisates aus Maleinsäure-, Itaconsäure- oder Citraconsäureanhydrid, die copolymerisierten Einheiten der Komponente B des Copolymerisates aus Di (Meth) Acrylaten von Diolen mit 2-4 Kohlenstoffatomen und/oder Umsetzungsprodukten von einem Mol dieser Diole mit 1-10 Molen Alkylenoxid mit 2-4 Kohlenstoffatomen bzw. aus Trimethylolpropantrimethacrylat und die copolymerisierten Einheiten der Komponente C des Copolymerisates aus mindestens einem hydrophilen Monomeren mit mindestens einer Carboxyl-, Aminocarbonyl-, SuIfo- oder Sulfamoylgruppe bestehen.

Le A 14 346 - 36.309841/1129

3) Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die copolymerisierten Einheiten der Komponente A des Copolymer!sates aus Maleinsäureanhydrid, die der Komponente B aus Äthylenglykol-, Diäthylenglykol-, Triäthylenglykol- oder Tetraäthylenglykoldimethacrylat bzw. Trimethylolpropantrimethacrylat oder deren Mischungen und die der Komponente C aus Methacrylsäure, Acrylsäure, Methacrylamid, N-Methoxymethylacrylamid, N-Methoxymethylmethacrylamid oder N-Vinylpyrrolidon oder deren Mischungen bestehen.

4) Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich· bei dem gebundenen Protein um ein Enzym handelt.

5) Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem g.ebundenen Protein um einen Enzyminhibitor handelt»

6) Wasserunlösliches Proteinpräparat gemäß der Ansprüche 1· bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem gebundenen Protein um Penicillinacylase handelt«

Verfahren zur Herstellung von wasserunlöslichen Proteinpräparaten gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet ₉ daß man - bezogen auf Gesamtmonomere des C©polymerisates -

A 0.1-50 Gew.-% ot,ß-monoolefinisch ungesättigte

Dicarbonsäureanhydride mit 4-9 Kohlenstoffatomen,

B 35 - 90 Gew.-% Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylate von

Di- und/oder Polyölen und

C 5 - 60 Gew.-#> mindestens eines hydrophilen Monomeren - die Summe der Prozentgehalte A bis C beträgt 100 -

Le Λ 14 346 . -37- 309841/1129

nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 20 - 200° C in Gegenwart Radikale bildender Verbundungen polymerisiert und anschließend das Copolymerisat in einer wäßrigen Suspension mit einer Proteinlösung zu wasserunlöslichen Proteinpräparaten umsetzt.

8) Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Penicillinacylasepräparates, dadurch gekennzeichnet, daß man - bezogen auf Gesamtmonomere des C©polymerisates -

A 0.1-50 Ge-w,-Yo «,ß-monoolefinisch ungesättigte

Dicarbonsäureanhydride mit 4-9 Kohlenstoffatomen,

B 35 - 90 Gew.-?6 Di- und/oder Poly-(Meth)Acrylate von

Di- und/oder Polyolen und

C 5 - 60 Gew.-% mindestens eines hydrophilen Monomeren - die Summe der Prozentgehalte A bis C beträgt 100 -

nach der Methode der Fällungspolymerisation oder der Perlpolymerisation in Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, die gegen Anhydridgruppen inert sind, bei Temperaturen von 20 - 200° c in Gegenwart Radikale bildender Verbindungen polymerisiert und anschließend mit wäßriger salzarmer Penicillinacylaselösung in einem pH-Bereich von 5,7 bis 6,8 zu einem unlöslichen Penicillinacylasepräparat umsetzt.

9) Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Penicillinacylasepräparates gemäß Anspruch 8), dadurch gekennzeichnet, daß die Salzkonzentration des Reaktionsmediums zu Beginn der Umsetzungsreaktion des Copolymerisates mit der Penicillinacylaselösung weniger als 0,02 Mol/l beträgt.

τ¹ α-./ */* » 30984 1/1129

Le A 14 346 - 38 -

10) Verwendung eines wasserunlöslichen Enzympräparates gemäß Anspruch 4 zur Durchführung einer durch Enzyme katalysierbaren Reaktion.

11) Verwendung eines wasserunlöslichen Enzympräparates gemäß Anspruch 4 zur hydrolytischen Spaltung von Substraten.

12) Verwendung von wasserunlöslicher Penicillinacylase gemäß Anspruch 6 zur Spaltung von Penicillinen unter Bildung von 6-Aminopenicillansäure.

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