KR100537386B1 - 신규의 친화성 리간드 및 그것의 사용 - Google Patents

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케네스 스프로울
롱슈 리
데이비드 제이. 스튜어트
제임즈 씨. 피어슨
스티븐 제이. 버튼
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노보 노르디스크 에이/에스
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Abstract

본 발명은, 화학식 a을 갖는 리간드를 함유하는, 신규의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트에 관한 것이고, 리간드는 임의로 매트릭스와 리간드사이에 기재된 스페이서 아암을 통해서, 위치(A)에서 지지매트릭스에 부착된다. 또한 발명은 이들 신규의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트에 관한 것이고, 그것들의 제조법 및 예를 들면 면역글로불린, 인슐린, 인자 VII, 또는 사람성장호르몬, 또는 그 유사체, 유도체, 단편 및 전구체와 같은 단백질성 물질의 정제에서의 사용에 관한 것이다.

Description

신규의 친화성 리간드 및 그것의 사용{NOVEL AFFINITY LIGANDS AND THEIR USE}
본 발명은 신규의 친화성 리간드, 그것의 제조법 및 고체, 반고체, 입상 또는 콜로이드상 물질 또는 가용성 중합체로 구성될 수 있는 매트릭스에 대한 부착에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 신규의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트와 그것의 제조법 및 예를 들면 면역글로불린, 인슐린, 인자 VII 또는 사람성장호르몬 또는 그 유사체, 유도체와 단편, 및 전구체와 같은 단백질성 물질의 정제에서의 사용에 관한 것이다.
현대의 단백질정제 원리는 겔투과 크로마토그래피(GPC), 이온교환 크로마토그래피(IEC), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 역상 고압 크로마토그래피(RP-HPLC) 및 친화성 크로마토그래피(AC)와 같은 크로마토그래피 분리기법에 매우 많이 의존하고 있다. 이들 기법은 연구 및 과학적 실험을 통해 순수한 생물학적 활성 물질을 얻고자 하는 펩티드 및 단백질의 실험실규모 정제에 쉽게 적용되고 있다. 이 물질이 임상 실험에서는 거의 사용되지 않게 되고 노동 비용이 장치 및 매트릭스 비용을 훨씬 초과하기 때문에, 대개의 경우 공정경제성, 공정유효성 또는 적소 세정법에는 관심을 거의 갖지 않거나 전혀 전혀 갖지 않고 있다. 그러나, 대규모의 공업적 하류 처리에서는 경제성, 매트릭스의 강성(robustness) 및 예를들면 NaOH, 우레아 또는 에탄올에 의한 적소 세정과 같은 인자를 고려해야 한다. 현재, 1M NaOH, 7M 우레아 또는 80중량% v/v 에탄올에서 안정한 값싸고 강한 매트릭스에 대한 요구는 GPC, IEC, HIC 및 RP-HPLC 분야의 많은 시중공급자에 의해 충족되고 있다. 여러 해 동안 이들 원리의 조합으로 거의 순수한 단백질 벌크 물질이 얻어지게 되었지만, 과다한 완충액과 많은 정제단계의 사용으로 회수율이 불량하게 되고 비용이 증가하게 되고 벌크 제제의 안정성이 의심스럽게 되었다.
친화성 크로마토그래피의 원리도 또한 대규모 조작에 적용될 수 있다는 것은 밝혀진지 오래다. 공교롭게도, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체와 같은 천연의 생물학적 리간드에 의해 형성되는 흡착체는 그 자체가 종종 고가의 정제를 필요로 하기 때문에 제조 비용이 많이 드는 경향이 있고, 생물학적, 화학적으로 불안정하여 그것의 생물학적 활성을 보유하면서 고정화시키기가 어려운 경향이 있다. 따라서, 고가의 화학적, 생물학적으로 불안정한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 항체의 특이성을 의사하는 덜 비싸고 더 강한 리간드로 대체할 것이 장기간 요구되어 왔다.
정제할 단백질은 항체 분자와 같은 상보적 결합물질에 선택적, 가역적으로 흡착되기 때문에 친화성 크로마토그래피는 분리기법에서 각별한 위치를 차지하고 있다. 5-50배의 인자를 제공하는 종래의 정제방법과 달리, 종종 수천배의 정제인자가 고회수율로 관찰된다. 친화성 크로마토그래피에서는 고정제 인자가 얻어지므로 하류공정에서의 정제단계 수가 극적으로 감소된다. 또한 친화성 크로마토그래피에서는 비특이적 결합이 매우 적게 관찰되기 때문에, 복잡한 생물학적 혼합물로부터 소정 단백질을 정제하여 천연분자로부터 부정확하게 폴딩된 형태를 분리하고 훨씬 큰 부피의 조직 추출물 또는 발효 배양물로부터 단백질을 확실하게 회수하는 것이 가능하게 된다.
친화성 흡수체는 통상의 크로마토그래피 칼럼에 함유되는, 적당한 리간드가 공유부착된, 보통은 투과성인 고체 지지 매트릭스로 이루어진다. 상보적 생체중합체를 함유하는 미정제 샘플을, 고정화된 리간드와의 특이적 결합 상호작용을 촉진시키는 조건하에 이 지지 매트릭스상에 보낸다. 칼럼을 완충액으로 세척하여 지연되지 않은 분자를 제거하고 이어서 용리단계에서 단백질을 순수한 형태로 용리한다. 전형적인 친화성 흡착체는 고체 지지체, 스페이서 아암 및 리간드를 기재로 한다. 고체 지지체는 열린 다공 구조를 갖는 비드 형성 아가로스로 제조될 수 있다. 스페이서 아암은 리간드를 보다 접근가능하게 만듦으로써 단백질 결합을 도모할 수 있다. 스페이서 아암의 길이 및 성질은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 리간드는 고정화 후에도 정제할 단백질에 대해 특이적이고 가역적인 결합을 나타내야 한다. 친화성 리간드로서는 항체외에 효소적 보조인자, 아미노산, 펩티드, 단백질, 콘카나발린 A, 렉틴, 티올 및 염료를 포함하여 많은 화합물이 사용되어 왔다.
친화성 크로마토그래피는 많은 용도에 사용되어 왔다. 한 종합 목록이 예를 들면 "Affinity Chromatography A Practical Approach" (IRL Press, 1985) 및 "Affinity Chromatography, Principles and Methods" (Pharmacia Fine Chemicals 1979)에 제공되어 있다.
특정 효소 또는 효소군의 대규모 정제에는 통상의 기질 또는 기질 유사 친화성 리간드, 특히 염료가 사용되어 왔다(Scawen M.D. and Atkinson T. 1987, Reactive Dyes in Protein and Enzyme Technology, Ed. Clonis Y.D. et al; Macmillan Press, pp. 51-85).
이러한 매트릭스는 비교적 저가이고 강하며 NaOH, 우레아 및 에탄올에 견디는 능력이 있기 때문에 염료 친화성 크로마토그래피는 여러 해에 걸쳐 많은 관심을 불러일으켜 왔다. 이러한 유형의 친화성 크로마토그래피에 보다 광범위하게 사용된 리간드 중 일부는 아가로스 및 기타 지지체에 고정화된 다양한 반응성 트리아진계 직물 염료였다. 고정화된 염료상에서의 친화성 크로마토그래피의 사용은 검토되었다(Lowe C.R. and Pearson J.C. 1984, Methods in Enzymology 104, pp. 97-113). 말 간 알코올 탈수소효소의 NAD+ 결합부위와의 선택적 상호작용은 염료 유사체 Cibacron Blue F3G-A에 의해 밝혀졌다(Lowe C.R. et al 1986; Journal of Chromatography 376, pp 121-130). 선택적 정제 접근법은 돼지 췌장 칼리크레인의 정제를 위한, 페닐-아르기닌 디펩티드 기질을 의사하는 신규의 친화성 흡착체의 컴퓨터 원조 설계로 더 설명되었다(Burton N.P. and Lowe C.R. 1992, Journal of Molecular Recognition 5, pp 55-58).
미국특허 제4,562,252호에는 당단백질 분리를 위한, 트리아진 고리에 부착된 2개의 m-아미노페닐보론산기로 구성되는 특정 리간드 구조물이 개시되어 있다.
그러나, 지난 몇 년에 걸쳐 친화성 기술이 급속히 진보되었음에도 불구하고, 예를 들면 천연 공급원으로부터 유도되든 재조합 공급원으로부터 유도되든, 면역글로불린, 인슐린, 인자 VII 또는 사람성장호르몬 또는 그 유사체, 유도체와 단편, 및 전구체와 같은 단백질성 물질의 분리 및 정제시에 상기 단백질을 반복해서 대규모로정제할 수 있는 값싸고 안정한 친화성 칼럼을 제조하기 위해서는 일종의 단백질에 대해 특정의 의사 리간드를 동정할 수 있는 기술을 개발할 필요가 있다.
본 발명은 신규의 친화성 리간드, 그것의 제조법 및 매트릭스에 대한 부착, 및 단백질성 물질 정제에서의 이들 신규의 친화성 리간드-매트릭스의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 소수성 성분의 복잡성 및 공간기하학과, 정전결합 및 수소결합 상호작용에 관여하여 단백질결합 부위와의 선택적 상호작용을 촉진시킬 수 있는 여러 가지 작용기의 혼입을 증가시킴으로써 소수성 리간드의 선택성을 증가시킬 수 있다는 개념에 의거하고 있다. 이러한 연구에 의해 일반적인 신규의 친화성 리간드군을 발견하기에 이르렀는데, 이것은 뜻밖에도 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질 분리 및 정제에 일반적으로 적용가능함을 알았다.
효소 기질, 그 유사체 또는 기질 유사체를 리간드로서 사용한 상기의 선택적 접근법과 달리, 본원에서 규정된 리간드는 단백질 분자의 어느 표면으로든 향하기 때문에 그 원리를 어느 단백질에든 적용할 수 있게 된다. 본 리간드는 의사 리간드 라이브러리의 컴퓨터 모델링 기법 및/또는 스크리닝에 의해 설계된다. 또한 본 발명은 리간드를 설계 및 개발하는 데 단백질결합부위 구조의 구조물을 필요로 하지 않고, 그 결과 본 명세서에 기재된 재료 및 기법은 상당히 큰 유용성을 갖는다는 이점을 갖는다.
본 발명의 특징은 단백질의 분해, 분리 및 정제를 위한 일반 수단을 제공하는 것이다. 다른 단백질과 상호작용하는 능력을 갖는 미묘하게 다른 화학 구조물군을 합성하였다. 본 발명에 의해 적당한 결합특성이 제공된 한 범위의 리간드를 스크리닝함으로써, 소정 단백질에 특히 유효한 리간드 구조물을 동정하였다.
예로서, 면역글로불린의 분리 및 정제에 현재 이용가능한 높은 선택성 및 특이성의 친화성 리간드는 흔히 박테리아 또는 재조합 공급원으로부터 유도되는 단백질성 물질이며, 단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L과 같은 물질을 포함한다. 이들 단백질 및 유사 단백질을 고정화시키면 종종 생리학적 활성이 현저히 손실된다. 고정화된 단백질을 친화성 매질로서 연속적으로 반복 사용하면, 생리학적 활성이 더 감소된다. 또한 이들 생물학적 거대분자의 고유의 성질 때문에 친화성 크로마토그래피 및 관련 기법에 완충염, 유기용매 및 pH 레벨을 사용하는 것에 대해서는 엄격한 제한이 가해진다.
본 발명에 의해 제공되는 신규의 친화성 리간드는 단백질 A 및 단백질 G 대신에 사용될 수 있고, 상당히 융통성 있게 사용되며, 제조 비용 및 대등한 수준의 정제 제공 비용이 덜 들고 더 강하다.
또 다른 예는 본 발명에 의해 제공되는 신규의 친화성 매트릭스의 생물공학에서의 사용이다.
본 발명은 다음 화학식 a를 갖는 리간드를 포함하는 리간드 매트릭스 콘쥬게이트에 관한 것이다.
상기 식에서,
R1은 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 시클로헥실기, 아미노기, 페닐기, 나프틸기, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸기, 벤즈옥사졸기 또는 벤즈이미다졸기를 나타내고, 이 벤젠, 나프탈렌, 페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리는 각각 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 아미노기, 히드록실기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일기, 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 또는 할로겐원자로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
Y는 산소원자, 황원자 또는 기 N-R2를 나타내고;
Z는 산소원자, 황원자 또는 기 N-R3을 나타내고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 벤질기 또는 β-페닐에틸기를 나타내고;
R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소원자, 히드록실기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 아미노기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일 또는 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 또는 할로겐원자를 나타내고;
기호 X 중 하나는 질소원자를 나타내고 다른 기호 X는 염소원자 또는 시아노기를 갖는 질소원자 또는 탄소원자를 나타내고;
Q는 벤젠, 나프탈렌, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸, 1-페닐피라졸, 인다졸 또는 벤즈이미다졸 고리를 나타내고;
n은 0 내지 6의 정수이고;
p는 0 내지 20의 정수이고;
이 리간드는 임의로 매트릭스와 리간드 사이에 개재된 스페이서 아암을 통해 위치 A에서 지지 매트릭스에 부착된다.
임의의 스페이서 아암은 바람직하게는 화학식 b로 표시된다:
-T-[-L-V-]m-
상기식에서 T는 산소원자, 황원자 또는 기 N-R7을 나타내고;
R7은 수소원자 또는 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기를 나타내고;
V는 산소원자, 황원자, -COO-기, CONH기 또는 NHCO기 또는 -PO3H-기, NH-아릴렌-SO2-CH2-CH2기 또는 N-R8기를 나타내고; R8은 수소원자 또는 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기를 나타내고;
L은 2 내지 20개의 탄소원자를 함유하는 임의로 치환된 탄화수소 결합을 나타내고; 그리고
m은 0 또는 1이다.
지지 매트릭스는 어떤 화합물 또는 물질, 입자 또는 비입자, 용해성 또는 불용성, 다공성 또는 비다공성일 수 있고 친화성 리간드와의 결합에 사용되어 친화성 리간드 매트릭스 콘쥬게이트를 형성할 수 있고, 접촉용액중의 용질로부터 친화성 리간드를 분리하는 용이한 수단을 제공한다.
본 발명은 신규의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트를 제공하고, 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트는 천연공급원에서 유도되든 재조합공급원에서 유도되든 면역글로불린, 인슐린, 인자 VII 또는 사람 성장 호르몬 또는 그 유사체, 유도체와 단편, 및 전구체와 같은 단백질성 물질의 분리 및 정제에 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 화학식 Ⅰ로 표시되는 신규의 친화성 리간드 매트릭스 콘쥬게이트를 제공한다:
상기식에서
R1, Y, Z, R2, R3, R4, R5, R6, X, Q, n 및 p는 상기한 의미를 갖고,
T는 산소원자, 황원자 또는 기 N-R7을 나타내고;
V는 산소원자, 황원자, -COO-기, CONH기 또는 NHCO기 또는 -PO3H-기, NH-아릴렌-SO2-CH2-CH2기 또는 N-R8기를 나타내고;
R7 및 R8은 각각 독립적으로 수소원자 또는 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기를 나타내고;
L은 2 내지 20개의 탄소원자를 함유하는 임의로 치환된 탄화수소 결합을 나타내고;
m은 0 또는 1이고; 그리고
M은 지지 매트릭스의 잔기를 나타낸다.
본문에서 사용된 용어 "1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기"는 단독으로 또는 조합하여 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 4-메틸펜틸, 네오펜틸, n-헥실 및 2,2-디메틸프로필과 같은 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는 선형 또는 분지된 포화 탄수화물쇄로 언급된다.
본문에서 사용된 용어 "1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기"는 단독으로 또는 조합하여 예를들면, 히드록시메틸, 2-히드록시에틸, 3-히드록시프로필, 2-히드록시프로필, 4-히드록시부틸, 5-히드록시펜틸, 6-히드록시헥실과 같은, 하나이상의 히드록실기, 바람직하게는 하나의 히드록실기로 치환된 선형 또는 분지된 포화 탄수화물쇄로 언급된다.
본문에서 사용된 용어 "1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기"는 단독으로 또는 조합하여 예를들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소프로폭시, 부톡시, 펜톡시와 같은 1 내지 6개의 탄소원자를 갖는, 에테르 산소로부터 자유원자가결합을 갖는 에테르 산소를 통해 결합된 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기로 이루어지는 선형 또는 분지된 1가의 치환기로 언급된다.
용어 "할로겐"은 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미한다.
본문에서 사용된 용어 "1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노"는 메틸카르보닐옥시, 에틸카르보닐옥시, 메틸옥시카르보닐 또는 에틸옥시카르보닐기와 같은 카르보닐옥시 또는 옥시카르보닐기를 통해 결합되거나 또는 메틸카르보닐아미노, 에틸카르보닐아미노, 메틸아미노카르보닐 또는 에틸아미노카르보닐기와 같은 카르보닐아미노 또는 아미노카르보닐기를 통해 결합된 1 내지 5개의 탄소원자를 함유하는 알킬기로 이루어지는 1가의 치환기로 언급된다.
본문에서 사용된 용어 "1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐"은 예를들면, 메틸술포닐, 에틸술포닐, n-프로필술포닐, 이소프로필술포닐, n-부틸술포닐, sec-부틸술포닐, 이소부틸술포닐, tert-부틸술포닐, n-펜틸술포닐, 2-메틸부틸술포닐, 3-메틸부틸술포닐, n-헥실술포닐, 4-메틸펜틸술포닐, 네오펜틸술포닐, n-헥실술포닐 및 2,2-디메틸프로필술포닐과 같은, 술포닐기를 통해 결합된 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기로 이루어지는 1가의 치환기로 언급된다.
용어 "독립적으로 선택된 하나이상의 치환기"는 보다 바람직하게는 1-3 치환기를 형성하는 것으로 언급될 것이다. 용어는 더욱 바람직하게는 1-2 치환기로, 가장 바람직하게는 하나의 치환기로 언급될 것이다.
본 명세서에서, 용어 인슐린이 복수 또는 총칭적 의미로 사용될 때마다 천연발생 인슐린과 그 인슐린 유사체와 유도체, 및 전구체 둘다를 포함하도록 의도된다. 또한 용어 인슐린은 어떤 종으로부터의 인슐린, 예를들면 사람 인슐린을 의미한다. 본문에서 사용된 용어 "인슐린 유사체"는 하나 또는 여러 아미노산 치환, 하나 또는 여러 아미노산 결실, 하나 또는 여러 아미노산 첨가 또는 그 조합인 사람 인슐린을 의미한다. 용어 "인슐린 유도체"는 하나 또는 여러 잔기중에서 화학적으로 변형된 인슐린을 의미한다. 본문에서 사용된 "인슐린 전구체"는 효소학적 또는 화학적 전환에 의해 인슐린, 인슐린 단편, 예를들면 데스-Thr(B30)-인슐린, 인슐린 유사체, 또는 인슐린 유도체를 형성하는 어떤 분자를 의미한다.
본문에서 사용된 용어 "2 내지 20개의 탄소원자를 함유하는 임의로 치환된 탄화수소 결합"은 예를들면, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시 또는 알콕시기로 임의로 치환되고 2 내지 20개의 탄소원자를 함유하는 사슬을 제공하는 아미노, 에테르, 티오에테르, 에스테르, 아미드 또는 술폰아미드 결합에 의해 함께 임의로 결합된 하나이상의 선형 또는 분지된 알킬쇄로 언급된다. 구조물은 바람직하게는 가동성이 있다. 그러한 임의로 치환된 탄화수소 결합의 구조물은, 예를들면 참고로 본문에 포함되는 Lowe, C. R. and Dean, P. D. G, 1974, Affinity Chromatography, John Wiley & Sons, London에 기술되어 있다.
바람직한 구체예에서, 이들 콘쥬게이트는 화학식 Ⅰ로 표시된다:
(화학식 Ⅰ)
상기식에서
R1은 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 시클로헥실기, 아미노기, 페닐기 또는 나프틸기를 나타내고, 이것은 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 아미노기, 히드록실기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일기, 술파모일기, 알킬술포닐기 또는 할로겐원자에 의해 벤젠 또는 나프탈렌고리상에서 치환될 수 있고;
T는 산소원자, 황원자 또는 기 N-R7을 나타내고;
Y는 산소원자, 황원자 또는 기 N-R2를 나타내고;
Z는 산소원자, 황원자 또는 기 N-R3을 나타내고;
R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기; 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 벤질기 또는 β-페닐에틸기를 나타내고;
R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소원자, 히드록실기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 아미노기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일 또는 술파모일기, 알킬술포닐기 또는 할로겐원자를 나타내고;
기호 X 중 하나는 질소원자를 나타내고 다른 기호 X는 염소원자 또는 시아노기를 갖는 탄소원자 또는 질소원자를 나타내고;
V는 산소원자, 황원자, -COO-기, CONH기 또는 NHCO기 또는 -PO3H-기, NH-아릴렌-SO2-CH2-CH2기 또는 N-R8기를 나타내고;
R7 및 R8은 각각 독립적으로 수소원자 또는 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기를 나타내고;
L은 2 내지 20개의 탄소원자를 함유하는 임의로 치환된 탄화수소 결합을 나타내고;
Q는 벤젠 또는 나프탈렌 고리를 나타내고;
n은 0 내지 6의 정수이고;
p는 0 내지 20의 정수이고
m은 0 또는 1이고; 그리고
M은 어떤 화합물 또는 물질, 입자 또는 비입자, 용해성 또는 불용성, 다공성 또는 비다공성일 수 있는 지지 매트릭스의 잔기를 나타내고 친화성 리간드와의 결합에 사용될 수 있어 화학식 I의 신규의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트를 형성하고 접촉용액중의 용질로부터 친화성 리간드를 분리하는 용이한 수단을 제공한다.
본 발명은 특히 T-[L-V]0-1-M 치환기 및 헤테로원자에 의해 고리에 결합된 다른 치환기를 갖는 피리딘, 디아진 또는 트리아진인 화합물 또는 그 전구체의 사용에 관한 것을 이해한다.
그러한 치환기는 0내지 10 또는 20탄소 원자를 함유하는 어떤 비간섭(non-interfering)기를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, R1은 페닐 또는 나프틸기를 나타내고 각각은 히드록실기 또는 카르복실산기로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택된 하나이상으로 벤젠 또는 나프탈렌고리상에서 임의로 치환된다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, R2는 수소원자를 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, R3은 수소원자를 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, R4는 수소원자, 히드록실기, 카르복실산기 또는 아미노기를 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, R5는 수소원자, 히드록실기, 카르복실산기 또는 아미노기를 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, R6은 수소원자, 히드록실기, 카르복실산기 또는 아미노기를 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, R7은 수소원자를 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, T는 산소원자 또는 NH기를 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, Y는 R2가 상기한 바와같은 N-R2를 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, Z는 R3이 상기한 바와같은 N-R3을 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 두 X는 질소원자를 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, Q는 벤젠 또는 나프탈렌 고리를 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, n은 0 또는 2를 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, p는 0 또는 2를 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, m은 0 또는 1을 나타낸다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, L은 에틸, 프로필, 히드록시프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 옥틸 또는 데실기를 나타내고 V 및 m은 상기한 바와같다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, V는 산소원자, -COO-기, -PO3H-기, 또는 N-R8기를 나타내고; 산소원자 또는 NH기가 보다 바람직하고 L 및 m은 상기한 바와같다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, m은 1을 나타내고 L 및 V는 상기한 바와같다.
용어 "x 내지 y 의 정수"는 x값(0 포함) 및 y값을 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 신규의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트의 제조방법을 제공하고 이것은 화학식 II
(상기식에서, 기호 X는 상기한 의미를 갖고 W는 할로겐원자를 나타낸다)의 할로게노헤테로고리 화합물을
(i) 화학식 III
R1-(CH2)p-Y-H
(상기식에서, 기호 R1, Y 및 p는 상기한 의미를 갖고 H는 수소이다)의 화합물,
(ii) 화학식 IV
(상기식에서, 기호 R4, R5, R6, Q, Z 및 n은 상기한 의미를 갖는다)의 화합물 및
(iii) 화학식 V
H-T-[-L-V-]m-M
(상기식에서, 기호 L, M, V, T 및 m은 상기한 의미를 갖는다)의 임의로 유도화된 지지 매트릭스 또는 화학식 VI
H-T-L-V-H
(상기식에서, 기호 H, L, V 및 T는 상기한 의미를 갖는다)의 결합단위중 어느 하나와 어떤 순서로든 반응시켜 화학식 VII
(상기식에서, R1, R4, R5, R6, Q, L, T, V, X, Y, Z, m, n 및 p는 상기한 의미를 갖는다)의 화합물을 얻고; 다음에 본 기술분야의 숙련자에게 공지된 활성화 및 커플링 방법을 사용하여 화학식 VII의 화합물을 잔기를 M으로 나타내는 지지 매트릭스와 더 반응시키는 것으로 이루어진다.
화학식 II의 할로게노헤테로고리 화합물의 예로서 5-클로로-2,4,6-트리플루오로피리미딘, 5-시아노-2,4,6-트리클로로피리미딘, 플루오르화 시아눌, 브롬화 시아눌, 무엇보다도 염화시아눌을 들수 있다.
화학식 III의 화합물의 예로서 암모니아, 메틸아민, 에틸아민, 프로필아민, 이소프로필아민, 디이소프로필아민, 이소부틸아민, 아밀아민, 헥실아민, 에탄올아민, 디에탄올아민, 아닐린, N-메틸아닐린, N-에틸아닐린, N-이소프로필아닐린, 1,4-디아미노부탄, 1,6-디아미노헥산, N-tert-부틸아닐린, p-톨루이딘, p-부틸아닐린, 2,4-디메틸아닐린, p-아니시딘, p-에톡시아닐린, p-아미노아세트아닐리드, p-아미노페놀, p-클로로아닐린, 오르타닐산, 메타닐산, 술프아닐산, 4-메틸아닐린-2-술폰산, 4-메톡시아닐린-2-술폰산, 아닐린-2,5-디술폰산, N-메틸메타닐산, o-, m- 및 p-아미노벤조산, p-아미노벤즈아미드, p-아미노벤젠술폰아미드, 1-아미노-2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 및 8- 나프톨, 2-아미노-3-, 4-, 5-, 6-, 7- 및 8- 나프톨, 5-, 6- 및 7- 아미노-1-나프톨-3-술폰산, N-벤질아닐린, 벤질아민, 4-메틸벤질아민, 4-히드록시벤질아민, 4-메톡시벤질아민, 4-아세톡시벤질아민, 4-아세틸아미노벤질아민, N-메틸벤질아민, β-페닐에틸아민, N-부틸-벤질아민, N-벤질-β-페닐에틸아민, N-(β-히드록시에틸)-벤질아민, N-tert-부틸-벤질아민, N-벤질티라민 및 티라민같은 아민; 페놀 o-, m- 및 p-크레졸, 카테콜, 레조르시놀, 히드로퀴논, p-클로로페놀, 1-나프톨과 2-나프톨, 1-나프톨-4-술폰산, 2-나프톨-6-술폰산 및 2-히드록시-3-나프토산같은 페놀; 에틸티올, 티오글리콜산, 티오페놀 및 티오-p-크레졸같은 티올 및 5-아미노-1-페닐피라졸, 6-아미노인다졸, 2-아미노벤즈이미다졸, 2-아미노벤즈티아졸 및 2-아미노-5-클로로벤즈옥사졸같은 방향족 헤테로고리 화합물을 들수 있다.
화학식 IV의 화합물의 예로서 아닐린, N-메틸아닐린, N-에틸아닐린, N-이소프로필아닐린, N-tert-부틸아닐린, p-톨루이딘, p-부틸아닐린, 2,4-디메틸아닐린, p-아니시딘, p-에톡시아닐린, p-아미노아세트아닐리드, p-아미노페놀, p-클로로아닐린, 오르타닐산, 메타닐산, 술파닐산, 4-메틸아닐린-2-술폰산, 4-메톡시아닐린-2-술폰산, 아닐린-2,5-디술폰산, N-메틸메타아닐산, o-, m- 및 p-아미노벤조산, 1-아미노-2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 및 8- 나프톨, 2-아미노-3-, 4-, 5-, 6-, 7- 및 8- 나프톨, 5-, 6- 및 7- 아미노-1-나프톨-3-술폰산,p-아미노벤즈아미드, p-아미노벤젠술폰아미드, N-벤질아닐린, 벤질아민, 4-메틸벤질아민, 4-히드록시벤질아민, 4-메톡시벤질아민, 4-아세톡시벤질아민, 4-아세틸아미노벤질아민, N-메틸벤질아민, β-페닐에틸아민, N-부틸-벤질아민, N-벤질-β-페닐에틸아민, N-(β-히드록시에틸)-벤질아민, N-tert-부틸-벤질아민, N-벤질티라민 및 티라민같은 아민; 페놀 o-, m- 및 p-크레졸, 카테콜, 레조르시놀, 히드로퀴논, p-클로로페놀, 1-과 2-나프톨, 1-나프톨-4-술폰산, 2-나프톨-6-술폰산 및 2-히드록시-3-나프토산같은 페놀; 티오페놀 및 티오-p-크레졸같은 티올 및 5-아미노-1-페닐피라졸, 6-아미노인다졸, 2-아미노벤즈이미다졸, 2-아미노벤즈티아졸 및 2-아미노-5-클로로벤즈옥사졸같은 방향족 헤테로고리 화합물을 들수 있다.
잔기가 M으로 표시된 지지매트릭스의 예로서 천연중합체, 예를들어 가교결합된 알부민같은 폴리펩티드 또는 단백질 또는 아가로오스, 알긴산 염류, 카라기난, 키틴, 셀룰로스, 덱스트란 또는 전분같은 다당류; 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리아크롤레인, 폴리비닐 알콜, 폴리메틸 아크릴레이트, 퍼플루오로카본 같은 합성중합체; 실리카,유리, 규조토, 알루미나, 산화철 또는 그외 금속 산화물 같은 무기화합물 또는 2개 이상의 천연중합체, 합성중합체 또는 무기화합물의 모든 조합물로 구성된 공중합체 같은 불용성 지지물을 들수 있다. 또한 잔기가 M으로 표시된 지지매트릭스의 정의내에는 액체 분리에 사용하기 위한 친화성-리간드 매트릭스 콘쥬게이트를 제공하는 덱스트란, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐알콜 또는 가수분해된 전분 같은 중합체로 이루어진 가용성 지지매트릭스; 또는 친화성 에멀젼의 형성에 사용하기 위한 친화성-리간드 매트릭스 콘쥬게이트를 제공하는 퍼플루오로데칼린같은 화합물로 이루어진 지지 매트릭스가 포함된다. 불명확함을 피하기 위하여 여기서 지지 매트릭스는 본발명에 따른 신규의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트를 형성하는데 사용될수 있고 접촉용액중의 용질로부터 친화성 리간드를 분리하는 종래의 방법을 제공하는 입상 또는 비입상, 가용성 또는 불용성, 다공성 또는 비다공성인 어떤 화합물 또는 물질로 정의된다.
또한 잔기가 M으로 표시된 지지 매트릭스의 정의에는 리간드의 부착전 또는 부착중 활성제로 처리함으로써 변성되었거나 변성되는 아가로오스, 셀룰로스, 덱스트란, 전분, 일긴산 염류, 카라기난, 합성중합체, 실리카, 유리 및 금속산화물 같은 지지 매트릭스가 포함된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 M은 임의로 활성화된 아가로오스, 실리카, 셀룰로스, 유리, 토요펄, 히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 스티렌디비닐벤젠, 하이퍼 D, 퍼플루오로 카본을 나타낸다.
바람직한 M은 임의로 트레실 활성화된, 술포닐클로라이드 활성화된, 토실 활성화된, 비닐술폰 활성화된 또는 에폭시 활성화된 아가로오스를 나타낸다.
본발명에 따른 바람직한 친화성 리간드 매트릭스 콘쥬게이트는 다음 화학식의 화합물이다.
상기식에서 M은 상기 정의된 바와같은 것이다.
리간드를 지지 매트릭스에 부착시키는 일반적 사용 목적을 위하여 사용하는 활성제가 상당량 존재한다. 이러한 화합물들과 그것들의 사용방법이 본 분야에 숙련된 사람에게 잘 알려져 있고 본 발명의 요지는 매트릭스에 부착된 리간드의 성질에 있고, 부착방법에 있지 않기 때문에 이 활성제들중 어떤 것도 본 발명의 신규의 매트릭스-리간드 콘쥬게이트의 제조에 쓰일 것이다. 그런 활성제의 비제한적인 예로서 브롬화 사안, 염화 시아눌, 에피클로로히드린, 디비닐술폰, p-톨루엔술포닐클로라이드, 1,1'-카르보닐디이미다졸, 소듐 메타-퍼요오데이트, 2-플루오로-1-메틸피리디늄 톨루엔-4-술포네이트, 글리시드옥시프로필트리메톡시실란 및 2,2,2-트리플루오로에탄술포닐 클로라이드같은 다양한 화합물을 들수 있다. 상기한 바와같이 그런 활성화 단계를 수행하는 방법이 본 분야에 숙련된 사람에게 잘 알려져 있다.
비슷하게, 폭넓게 다양한 축합제가 아가로오스, 셀룰로스, 덱스트란, 전분, 알긴산염류, 카라기난, 실리카 또는 유리같은 지지 매트릭스에 화학식 VI의 화합물을 부착시키는데 사용될수 있다. 또한 이러한 화합물들과 그것들의 사용방법은 본 분야에 숙련된 사람에게 잘 알려져 있고 또한 본 발명의 요지는 리간드의 성질에 있고 부착방법에 있지 않기 때문에, 이 축합제들중 어떤 것도 본 발명의 신규의 매트릭스-리간드 콘쥬게이트의 제조에 쓰일 것이다. 그런 축합제의 비제한적인 예로서 N-에톡시 카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드로퀴놀린, 디시클로헥실 카르보 디이미드 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드를 들수 있다.
화학식 VII의 화합물을 제조하는데 사용될수 있는 화학식 VI의 결합 단위의 예로서 에틸렌 디아민, N,N'-디메틸에틸렌 디아민, N-에틸에틸렌 디아민, N-(β-히드록시에틸)-에틸렌 디아민, 프로필렌 디아민, N-메틸프로필렌 디아민, N-(β-히드록시에틸)에틸)-프로필렌 디아민, 1,4-디아미노부탄, 1,5-디아미노펜탄, 1,6-디아미노헥산, 1,7-디아미노헵탄, 1,8-디아미노옥탄, 1,9-디아미노노난, 1,10-디아미노데칸, 1,12-디아미노도데칸, 피페라진, 3-히드록시-1,5-디아미노펜탄, m-와 p-페닐렌 디아민, m- 와 p-아미노 벤질아민같은 디아민; 에탄올아민, N-메틸에탄올아민, N-프로필에탄올아민, 디에탄올아민, 3-히드록시프로필아민, 2,3-디히드록시프로필아민, 이소프로판올아민, 5-아미노펜탄-1-올 및 6-아미노헥산-1-올 같은 아미노알콜; o-, m- 및 p-아미노페놀 같은 아미노페놀; 글리신, N-메틸글리신, 3-와 4-아미노부티르산, 3-아미노이소부티르산, 5-아미노발레르산, 6-아미노카프로산, 7-아미노헵탄산, m-와 p-아미노벤조산 같은 아미노카르복실산 ; m-아미노벤젠 포스폰산 및 p-아미노벤질 포스폰산같은 아미노포스폰산 ; 및 아닐린-3-β-술파토에틸술폰 및 아닐린-4-β-술파토에틸술폰같은 아미노아릴렌 비닐술폰 전구체를 들 수 있다.
화학식 III, IV 및 V 또는 VI의 화합물과 화학식 Ⅱ의 할로게노헤테로고리 화합물의 반응은 물과 혼합될 수 없는 유기용매에서 ; 또는 물과 혼합될 수 있는 유기용매에서, 또는 물과 혼합될 수 있는 유기용매와 물의 혼합물에서 수행될 수 있다. 물과 혼합될 수 없는 적당한 유기용매의 예로는 톨루엔, 크실렌 또는 클로로벤젠이 있고 ; 물과 혼합될 수 있는 적당한 유기용매의 예로는 아세톤, 메틸에틸케톤 또는 디옥산이 있다. 할로게노헤테로고리 화합물의 첫 번째 반응은 0℃ 내지 25℃, 이상적으로는 0℃ 내지 5℃의 온도에서 수행되고 ; 두 번째 반응은 20℃ 내지 50℃, 이상적으로는 30℃ 내지 45℃의 온도에서 수행되고 ; 세 번째 반응은 20℃ 내지 100℃의 온도에서 수행된다. 그런 반응동안, 제조된 염산 또는 플루오르산같은 무기산은 수산화나트륨, 탄산나트륨, 중탄산나트륨, 수산화칼슘 또는 탄산칼슘같은 산결합제를 사용함으로써 중화된다.
또한, 화학식 VII의 화합물은 반응성의 중합가능 단량체와 반응되어 화학식 VIII의 중합가능 화합물을 형성한다 :
상기 식에서 R1, R4, R5, R6, Q, L, T, V, X, Y, Z, m, n 및 p는 상기에서 명기된 의미를 갖고 ; R9는 수소원자 또는 1 내지 6개 탄소원자를 함유하는 알킬기를 나타내고 ; R10은 카르보닐기, 메틸렌기, -NH-CH2-기 또는 -S-CH2-기를 나타낸다. 반응성의 중합가능 단량체의 예에는 아크릴로일 클로라이드, 메타크릴로일 클로라이드, 알릴브로마이드, 알릴아민 또는 3,4-에폭시부텐이 포함된다. 화학식 Ⅷ의 중합가능 화합물은 임의로 다른 중합가능 단량체의 존재하에 중합되어 화학식 I의 친화성 리간드 매트릭스 콘쥬게이트를 형성한다. 그런 중합방법은 본 분야에 숙련된 사람에게 잘 알려져 있다.
본 발명은 게다가 면역글로불린, 인슐린, 인자 Ⅶ, 또는 사람 성장호르몬 또는 그 유사체, 유도체 및 단편 및 전구체 같은 단백질성 물질의 분리, 단리, 정제, 정량화, 동정 및 특성화에서 그런 모든 친화성 리간드-지지 매트릭스의 사용을 다룬다.
면역글로불린들은 일반적 구조를 공유하는 종종 Ig로 약기되는 단백질군이다. 면역글로불린들은 또한 항체로서 집합적으로 알려져 있고 어느 하나의 단어는 이 단백질군을 기술하는데 사용될 수 있다. 면역글로불린은 수많은 이형, 예를 들어 가장 중요한 항체형인 IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 및 IgY와 그것의 여러 가지 하위 부류가 존재한다. 면역글로불린은 플라스마, 복수, 침, 우유 또는 난황같은 체액에서 발생할 수도 있고 또는 유전공학방법론을 사용하여 제조될 수도 있다. 면역글로불린은 이것에 바람직한 성질을 주기 위해 여러 가지 기술에 의해 바꿔질 수도 있다. 그런 방법은 본 분야에 숙련된 사람에게 잘 알려져 있고 결과의 변성된 항체 또한 본 발명의 청구범위에 속한다. 항체변성기술의 비제한적인 예로서 항체 단편, 표지된 항체, 항체 콘쥬게이트 또는 항체융합단백질은 화학적 변성을 통하여 하나 이상의 효소로의 처리에 의해 또는 두가지 기술의 조합에 의해 얻어질 수 있다. 항체변성에 사용되는 화학적 변성제와 효소가 상당수 존재하고 이 화합물들과 그것들의 사용은 본 분야에 숙련된 사람에게 잘 알려져 있다. 변성된 또는 신규의 항체를 얻는 추가의 방법은 유전공학방법론을 사용하여 그것들을 제조하는 것이다. 그런 방법론과 그것들의 사용은 본 분야에 숙련된 사람에게 잘 알려져 있고 예를 들어 항체단편 또는 항체융합생성물을 제조하는데 사용될 수도 있다. 유전공학방법론에 의해 유도된 변성된 또는 신규의 항체는 또한 본 발명의 청구범위에 속한다.
친화성 리간드-지지 매트릭스의 가치있는 군은 화학식 Ⅸ로 표시된다 :
상기 식에서 R1, R4, R5, R6, M, Q, n 및 p는 상기 명기된 의미를 갖고 j는 2 내지 20의 정수이다.
친화성 리간드-지지 매트릭스의 특히 가치있는 군은 화학식 Ⅹ로 표시한다 :
상기 식에서 j와 M은 상기에서 명기된 의미를 갖는다.
전형적으로 화학식 XI
의 화합물을 산 결합제의 존재하에 10℃ 내지 30℃의 온도에서 3-프로폭시-(1,2-에폭시)-아가로오스를 반응시킴으로써 단백질성 물질의 정제에서 현저하게 가치가 있는 신규의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트가 만들어진다. 이 신규의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트는 단백질의 면역글로불린군에 대하여 높은 친화성을 갖는다. 이 특유한 성질은 그것들을 이 부류의 단백질의 분리, 단리, 정제, 정량화, 동정 및 특징화에서 우수한 가치가 있게 한다.
또다른 구체예에서 본 발명은 화학식 XII의 신규의 친화성 리간드에 관한 것이다 :
상기 식에서 R1, R4, R5, R6, Q, X, Y, z, n 및 p는 상기 명기된 의미를 갖고 할로겐은 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 나타낸다.
게다가, 본 발명은 -20℃ 내지 121℃의 온도에서 임의로 산결합제의 존재하에 신규의 친화성 리간드를 매트릭스와 반응시킴으로써 상기 정의된 바와 같은 화학식 Ⅴ의 매트릭스에 상기 정의한 바와 같은 화학식 XII의 신규의 친화성 리간드를 부착시키는 방법에 관한 것이다.
또다른 구체예에 있어서, 본 발명은 화학식 XIII의 신규의 친화성 리간드에 관한 것이다.
상기 식에서, R1, R4, R5, R6, Q, X, Y, Z, m, n 및 p는 상기 구체화한 의미를 갖고, j는 2 내지 20의 정수이다.
또한 발명은, 상기 화학식 XII의 화합물을 화학식 H2N-(CH2)j-NH2의 알킬렌디아민과, 0℃ 내지 100℃의 온도에서, 산결합제의 존재하에서 반응시켜 화학식 XIII의 상기의 신규의 친화성 리간드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XIV의 신규의 친화성 리간드에 관한 것이다.
상기 식에서, R1, R4, R5, Q, X, Y, Z, m, n 및 p는 상기 구체화한 의미를 갖고, q는 0 또는 1 이고, j는 2 내지 20의 정수이다.
또한 발명은, 상기 화학식 XII의 화합물을 화학식 H2N-(CH2)j-(CO)q-OH의 아미노히드록시 화합물과, 0℃ 내지 100℃의 온도에서, 산결합제의 존재하에서 반응시켜 화학식 XIV의 상기의 신규의 친화성 리간드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 상기 화학식 VIII의 신규의 친화성 리간드에 관한 것이고, 상기 식에서, R1, R4, R5, R6, L, Q, T, V, X, Y, Z, m, n 및 p는 상기 구체화한 의미를 갖고; R9는 수소원자, 또는 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기이고; R10은 카르보닐기, 메틸렌기, -NH-CH2-기 또는 -S-CH2-기를 나타내고; 바람직하게는, L은 에틸, 부틸, 또는 헥실기이고, 바람직하게는 T는 -NH-기를 나타내고, 바람직하게는 V는 -NH-기를 나타내고, m은 1이 바람직하다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XV의 신규의 친화성 리간드에 관한 것이다.
상기 식에서, R1, R4, R5, R6, Q, n 및 p는 상기 구체화된 의미를 갖는다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XVI의 신규의 친화성 리간드에 관한 것이다.
상기 식에서, R1, R4, R5, R6, Q, n 및 p는 상기 구체화한 의미를 갖고, j는 2 내지 20의 정수이다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XII, XIII, XIV, VIII, XV 및 XVI의 친화성 리간드에 관한 것이고, 상기 식에서, R1은, 각각이 벤젠 또는 나프탈렌 고리상에서 히드록실기 또는 카르복실산기에서 독립적으로 선택되는 하나이상으로 임의로 치환된, 페닐 또는 나프틸기를 나타낸다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XII, XIII, XIV, VIII, XV 및 XVI의 친화성 리간드에 관한 것이고, 상기 식에서, R4는 수소원자, 히드록실기, 카르복실산기 또는 아미노기를 나타낸다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XII, XIII, XIV, VIII, XV 및 XVI의 친화성 리간드에 관한 것이고, 상기 식에서, R5는 수소원자, 히드록실기, 카르복실산기 또는 아미노기를 나타낸다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XII, XIII, XIV, VIII, XV 및 XVI의 친화성 리간드에 관한 것이고, 상기 식에서, R6은 수소원자, 히드록실기, 카르복실산기 또는 아미노기를 나타낸다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XII, XIII, XIV, VIII, XV 및 XVI의 친화성 리간드에 관한 것이고, 상기 식에서, Q는 벤젠 또는 나프탈렌고리를 나타낸다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XII, XIII, XIV 및 VIII의 친화성 리간드에 관한 것이고, 상기 식에서, X는 질소원자를 나타낸다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XII, XIII, XIV 및 VIII의 친화성 리간드에 관한 것이고, 상기 식에서, Y는 -NH-기를 나타낸다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XII, XIII, XIV 및 VIII의 친화성 리간드에 관한 것이고, 상기 식에서, Z는 -NH-기를 나타낸다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XII, XIII, XIV, VIII, XV 및 XVI의 친화성 리간드에 관한 것이고, 상기 식에서, n은 0 또는 2이다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XII, XIII, XIV, VIII, XV 및 XVI의 친화성 리간드에 관한 것이고, 상기 식에서, p는 0 또는 2이다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XIII, XIV 및 XVI의 친화성 리간드에 관한 것이고, 상기 식에서, j는 2, 4 또는 6이다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은 화학식 XI의 친화성 리간드에 관한 것이고, 상기 식에서, j는 2 내지 20의 정수이다.
발명에 따른 바람직한 친화성 리간드는
또한 발명은, 선택적으로 산결합제의 존재하에, 탄수화물나 유기폴리머 매트릭스를 활성제와 함께 반응시키고, 이어서, 신규의 친화성 리간드와 활성매트릭스의 반응에 의해서, 상기한 바와 같은 화학식 VII, 상기한 바와 같은 화학식 XIII, 상기한 바와 같은 화학식 XVI, 그리고 상기한 바와 같은 화학식 XI의 신규의 친화성 리간드를, 탄수화물나 유기폴리머 매트릭스에 부착하는 방법에 관한 것이다. 또한 발명은 매트릭스와의 축합에 의해서, 상기한 바와 같은 화학식 XIV의 신규의 친화성 리간드를 탄수화물나 유기 폴리머 매트릭스에 부착하는 하는 방법에 관한 것이다. 또한 발명은, 선택적으로 산결합제의 존재하에서, 선택적으로 코팅된 금속산화물, 유리 또는 실리카 매트릭스를 활성제와 함께 반응시키고, 이어서 활성화된 매트릭스를 신규의 친화성 리간드와 함께 반응시켜서, 상기한 바와 같은 화학식 VII, 상기한 바와 같은 화학식 XIII, 상기한 바와 같은 화학식 XVI, 그리고 상기한 바와 같은 화학식 XI의 신규의 친화성 리간드를, 유기폴리머로 선택적으로 코팅된 금속산화물, 유리 또는 실리카 매트릭스에 부착하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 구체예는 매트릭스와의 축합에 의해서, 상기한 바와 같은 화학식 XIV의 신규의 친화성 리간드를 유기폴리머로 선택적으로 코팅된 금속산화물, 유리 또는 실리카 매트릭스에 부착하는 하는 방법에 관한 것이다. 또다른 구체예에 있어서, 발명은, 선택적으로 산결합제의 존재하에, 신규의 친화성 리간드를 매트릭스와 -20℃ 내지 121℃의 온도에서 반응시켜, 상기한 바와 같은 화학식 XV 및 상기한 바와 같은 화학식 XII의 신규의 친화성 리간드를 상기한 바와 같은 화학식 V의 메트릭스에 부착하는 방법에 관한 것이다. 또한 발명은 상기의 방법에 기술된 바와 같이 제조된, 모든 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트에 관한 것이다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은, 예를 들면, 천연공급원이든 또는 재조합공급원으로부터 유도되는, 면역글로불린G(IgG), 면역글로불린M(IgM), 면역글로불린A(IgA) 또는 그 서브클라스, 단편, 전구체 또는 유도체인, 천연공급원이든 또는 재조합공급원으로부터 유도되는 면역글로불린 또는 그 서브클라스, 단편, 전구체 또는 유도체들과 같은 단백질 또는 단백질성 물질의 분리, 단리, 정제, 특성화, 동정, 정량화를 위한, 발명에 따른 친화성 리간드 및 발명에 따른 상기 리간드를 포함하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트의 사용에 관한 것이다. 또다른 구체예에 있어서, 발명은, 상기 면역글로불린을, 5.0 내지 12.0 범위내의 pH에서, 발명에 따른 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트에 적용시키고, 이어서, pH를 4.9 이하로 감소시켜, 제거하거나, 용리시키거나 또는 탈착시키는 방법에 의한, 면역글로불린의 분리, 단리, 정제, 특성화, 동정 또는 정량화에 관한 것이다.
또한 발명은 생물특이성 리간드로서, 상기한 바와 같은 화학식 a의 리간드를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 실시하는 것을 포함하는 단백질성 물질의 분리 또는 정제를 위한 방법에 관한 것이다.
발명의 또다른 구체예는, 천연공급원이든지 재조합공급원으로부터 유도되는, 인슐린 및 그 유사체, 유도체와 단편, 및 전구체 그리고 인자 VII, 또는 사람성장호르몬이나 그 유사체, 유도체와 단편, 및 전구체의 분리, 단리, 정제, 특성화, 동정 또는 정량화를 위한, 발명에 따른 친화성 리간드, 그리고 발명에 따른 상기 리간드를 함유하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트의 사용에 관한 것이다.
실시예의 방식으로, 60가지의 상이한 리간드를 포함하는 라이브러리가 디자인되었다. 라이브러리를 부분적 정제된 인슐린 전구체로 스크리닝하였고, 선택된 리간드를 고상 합성에 의해 아가로오스에 고정화하였다. 매트릭스를 커플링기술, 스페이서 아암의 길이 및 성질, 리간드 밀도 등과 관련해서 최적화하여, 동적결합용량이 2 내지 5 mg/ml인 3 프로토타입으로 하였다. 재조합적으로 유도된 인슐린 전구체를, 식별된 효모발효액으로부터, 단일의사친화성정제단계로, 매우 온화한 조건하에서, 95중량% 순도 이상으로 정제하였다.
발명에 따른 친화성 리간드, 그리고 발명에 따른 상기 리간드를 함유하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트의 특히 바람직한 사용은, 천연공급원이든지 또는 재조합공급원으로부터 유도된, 인슐린과 그 유사체, 유도체와 단편, 및 전구체의 정제이다. 이러한 사용을 위한 특히 바람직한 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트는 하기의 것들 중에서 선택되는 리간드를 포함한다.
리간드는 상기 구체화한 바와 같이 위치 A에서 지지매트릭스에 선택적으로, 상기한 화학식 b로 표시되는, 매트릭스와 리간드 사이에 개재된 스페이서 아암을 통해서 부착된다. 바람직하게는, 리간드는 11a 이고, 지지매트릭스는 바람직하게는 선택적으로 활성화된 아가로오스, 셀룰로즈, 실리카 또는 유리이다.
또다른 구체예에 있어서, 발명은,
상기 인슐린, 인슐린유도체, 유사체, 및 전구체를, 4.0 내지 9.0범위의 pH에서, 발명에 따른 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트에 적용하고, 이어서 pH를 3.99이하 또는 9.01이상으로 감소시켜 제거하거나, 용리시키거나 또는 탈착시키는어떤 방법에 의한, 인슐린이나 인슐린 유사체 또는 그 유도체 및 전구체의 분리, 단리, 정제, 특성화, 동정 또는 정량화에 관한 것이다. 용리방법은 다르게는, 예를 들면 이온강도를 낮추거나, 유기용매와 같은 공동용매를 첨가하여 실시할 수 있다.
발명은 이제 하기의 실시예와 관련하여 더욱 상세히 기술될 것이다. 실시예는 설명의 목적으로 제공되고, 어떤 방법으로든, 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지는 않아야 한다.
실시예 1
본 실시예는 화학식 Ⅱ의 할로게노헤테로고리 화합물과 화학식 Ⅲ 및 Ⅳ의 화합물의 반응으로 정의된 전형적 친화성 리간드의 합성을 예시한다.
아닐린 19.8중량부를 아세톤 50중량부에 용해시키고 얼음 50중량부와 물 50중량부의 혼합물에 아세톤 200중량부의 일부중의 염화시아눌 36.8중량부의 용액을 부음으로써 형성된 현탁액과 이 용액을 합한다. 혼합물을 2시간동안 교반하고 이 시간동안 물 300중량부중의 탄산수소나트륨 16.8중량부의 용액을 가함으로써 pH를 6 내지 7로 유지하였다. 마지막에, 2-아닐리노-4,6-디클로로-1,3,5-트리아진의 침전물을 여과제거하고, 물로 세척하고 진공에서 건조시키고 디클로로메탄으로부터 결정화하였다.
아세톤 50중량부와 물 10중량부의 혼합물중의 티라민 2.74중량부의 용액을 아세톤 100중량부중의 2-아닐리노-4,6-디클로로-1,3,5-트리아진 4.82중량부의 용액에 가하였다. 혼합물을 50℃에서 가열하고 물 30중량부중의 탄산수소나트륨 1.68중량부의 용액을 가함으로써 pH를 6 내지 7로 유지하면서 2시간동안 이 온도에서 유지하였다. 마지막에, 2-아닐리노-4-[β-(4'-히드록시페닐)-에틸아미노]-6-클로로-1,3,5-트리아진의 침전물을 여과제거하고, 물로 세척하고 진공에서 건조시켰다.
실시예 2
본 실시예는 고체상 지지체상으로의 실시예 1의 생성물의 고정화를 예시한다.
아미노기를 지니는 아가로오스 10중량부를 30중량% 수성 아세톤 100중량부, 다음에 70중량% 수성 아세톤 100중량부 그후 아세톤 100중량부를 사용한 용매교환에 의해 아세톤 용매로 옮겼다. 2-아닐리노-4-[β-(4'-히드록시페닐)-에틸아미노]-6-클로로-1,3,5-트리아진 1부를 아세톤 20중량부에 용해시키고 50℃까지 가온하였다. 이 가온한 아세톤 용액을 아미노기를 가지는 아가로오스 유도체의 아세톤 현탁액에 가하였다. 물 5중량부중의 탄산수소나트륨 0.42중량부의 용액을 결과의 현탁액에 가한후 그 혼합물을 50℃에서 16시간동안 교반하였다. 마지막에, 아가로오스 지지체 매트릭스를 아세톤으로 결합되지 않은 2-아닐리노-4-[β-(4'-히드록시페닐)-에틸아미노]-6-클로로-1,3,5-트리아진이 없게 세척하였다. 그후 결과의 유도화된 친화성 지지체를 먼저 70중량% 수성 아세톤, 그후 30중량% 수성 아세톤 그리고 마지막으로 물로 세척함으로써 물로 다시 옮겼다.
실시예 3
본 실시예는 면역글로불린을 위한 특이 크로마토그래피 매트릭스로서 실시예 2에서 기술한 신규의 친화성 매트릭스의 사용을 제시한다.
사람 혈장 1과 1/4중량부를 pH 7, 리터당 10 밀리몰 농도를 가지는 수성 포스페이트 완충액 3.75중량부로 희석시키고 실시예 2에 기술된 제조법에 의한 친화성 매트릭스 1중량부로 구성되는 칼럼에 적용시켰다. 그후 친화성 칼럼을 세척액의 UV 모니터링이 모든 비결합 단백질이 제거되었음을 나타낼 때까지 포스페이트 완충액으로 세척하였다. 그후 친화성 매트릭스를 pH 3.8, 리터당 0.2 밀리몰의 농도를 가지는 시트레이트 완충액으로, 세척액의 UV 모니터링에 의해 결합된 단백질의 제거가 끝났음이 나타날 때까지 세척하였다. 이 세척액에 함유된 단백질은 면역글로불린 G인 것으로 나타났다.
표 1은 실시예 1에서 사용된 염화시아눌 36.8중량부를 표의 칼럼 Ⅱ에 열거된 할로게노헤테로고리 화합물의 대응량으로 교환; 실시예 1에서 사용된 아닐린 19.8중량부를 표의 칼럼 Ⅲ에 열거된 아민의 대응량으로 교환 및 실시예 1에서 사용된 티라민 2.74중량부를 표의 칼럼 Ⅳ에 열거된 아민의 대응량으로 교환하는 것을 제외하고 실시예 1의 방법으로 제조될 수 있는 본 발명의 신규의 친화성 리간드의 실시예를 또한 제공한다. 실시예들의 번호는 표의 칼럼 Ⅰ에 제공되어 있다.
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
4 5-시아노-2,4,6-트리클로로피리미딘 아닐린 티라민
5 5-클로로-2,4,6-트리플루오로피리미딘 아닐린 티라민
6 염화시아눌 티라민 티라민
7 염화시아눌 아닐린 4-히드록시-벤질아민
8 염화시아눌 아닐린 벤질아민
9 염화시아눌 N-메틸-아닐린 4-히드록시-벤질아민
10 염화시아눌 p-아니시딘 p-아미노페놀
11 염화시아눌 아닐린 4-아세틸아미노-벤질아민
12 염화시아눌 p-톨루이딘 티라민
13 염화시아눌 p-클로로-아닐린 티라민
14 염화시아눌 p-아미노페놀 티라민
15 염화시아눌 시클로헥실-아민 티라민
16 염화시아눌 β-페닐-에틸아민 티라민
17 염화시아눌 4-히드록시-벤질아민 티라민
18 염화시아눌 4-히드록시-벤질아민 4-히드록시-벤질아민
19 염화시아눌 벤질아민 티라민
20 염화시아눌 티라민 3-메틸술포닐-아닐린
21 염화시아눌 N-tert-부틸-벤질아민 티라민
22 염화시아눌 N-이소프로필-벤질아민 티라민
23 염화시아눌 p-아미노-아세트아닐리드 티라민
24 염화시아눌 디-이소프로필-아민 티라민
25 염화시아눌 아닐린 N-벤질티라민
26 염화시아눌 티라민 N-벤질티라민
27 염화시아눌 p-아미노-벤즈아미드 티라민
28 염화시아눌 p-아미노벤젠술폰아미드 티라민
29 염화시아눌 p-아미노-벤조산 티라민
30 염화시아눌 p-아미노-벤조산 1-아미노-4-나프톨
31 염화시아눌 p-아미노페놀 1-아미노-5-나프톨
32 염화시아눌 p-아미노-벤조산 1-아미노-5-나프톨
33 염화시아눌 p-아미노페놀 p-아미노페놀
34 염화시아눌 m-아미노-벤조산 아닐린
35 염화시아눌 m-아미노-벤조산 티라민
36 염화시아눌 1-아미노-5-나프톨 1-아미노-5-나프톨
37 염화시아눌 m-아미노페놀 1-아미노-5-나프톨
38 염화시아눌 1-아미노-4-나프톨 1-아미노-5-나프톨
실시예 4-38에 기술된 이들 리간드는 실시예 2에서 기술된 과정에 의해 아가로오스 매트릭스에 부착될 수 있으며 실시예 3에서 제공된 과정에 의해 면역글로불린 G의 정제에 사용될 수 있다.
실시예 39
에틸렌 디아민 6중량부를 톨루엔 20중량부중의 2-아닐리노-4-[β-(4'-히드록시페닐)-에틸아미노]-6-클로로-1,3,5-트리아진 2.5중량부의 용액에 가하고 그 혼합물을 16시간동안 100℃에서 가열하였다. 그후 톨루엔을 감압하에서 혼합물로부터 증발시켜 제거하고 그 잔사를 물 100중량부로 5번 세척한 후 70℃에서 건조시켰다.
표 2는 실시예 39에서 사용된 2-아닐리노-4-[β-(4'-히드록시페닐)-에틸아미노]-6-클로로-1,3,5-트리아진 2.5부를 표 2의 칼럼 Ⅱ에 열거된 클로로트리아진의 대응량으로 교환하고 실시예 39에서 사용된 에틸렌 디아민을 표 2의 칼럼 Ⅲ에 열거된 디아민 또는 아미노 히드록시 화합물의 대응량으로 교환하는 것을 제외하고 실시예 39의 방법으로 제조될 수 있는 본 발명의 신규의 친화성 리간드의 실시예를 또한 제공하고 있다.
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
40 실시예 1에 기술된 클로로트리아진 프로필렌 디아민
41 실시예 1에 기술된 클로로트리아진 1,6-디아미노헥산
42 실시예 1에 기술된 클로로트리아진 1,8-디아미노옥탄
43 실시예 1에 기술된 클로로트리아진 1,9-디아미노노난
44 실시예 1에 기술된 클로로트리아진 1,10-디아미노데칸
45 실시예 1에 기술된 클로로트리아진 1,12-디아미노도데칸
46 실시예 14에 기술된 클로로트리아진 1,6-디아미노헥산
47 실시예 30에 기술된 클로로트리아진 1,6-디아미노헥산
48 실시예 31에 기술된 클로로트리아진 1,6-디아미노헥산
49 실시예 33에 기술된 클로로트리아진 1,6-디아미노헥산
50 실시예 35에 기술된 클로로트리아진 1,6-디아미노헥산
51 실시예 38에 기술된 클로로트리아진 1,6-디아미노헥산
52 실시예 1에 기술된 클로로트리아진 N,N'-디메틸에틸렌 디아민
53 실시예 1에 기술된 클로로트리아진 N-β-히드록시에틸에틸렌 디아민
54 실시예 1에 기술된 클로로트리아진 피페라진
55 실시예 1에 기술된 클로로트리아진 에탄올아민
56 실시예 1에 기술된 클로로트리아진 디에탄올아민
57 실시예 1에 기술된 클로로트리아진 이소프로판올아민
실시예 58
본 실시예는 고체상 지지체상으로의 실시예 39에서 제조한 화합물의 고정화를 예시한다.
에폭시드기를 가지는 아가로오스 60중량부를 물 300중량부로 세척한후 메탄올 180중량부에 용해된 탄산수소칼륨 5.95중량부와 물 120중량부로 구성되는 용액 300중량부로 세척하였다. 실시예 39에 따라서 제조된 화합물 1중량부를 메탄올 60중량부에 용해시키고 탄산수소칼륨 수용액 40중량부의 용액에 가하였다. 그후 이 메탄올 수용액 100중량부를 에폭시기를 가지는 아가로오스 60중량부의 제조된 현탁액에 가하고 결과적인 현탁액을 16시간동안 주위 실온에서 부드럽게 교반하였다. 얻어진 아가로오스계 매트릭스를 먼저 메탄올 360중량부와 물 240중량부의 혼합물로 세척한후, 물 600중량부로 세척하였다.
실시예 59
실시예 2에 기술된 제조법에 의한 친화성 매트릭스 1중량부로 구성되는 칼럼을 실시예 58에 기술된 제조법에 의한 친화성 매트릭스 1중량부로 구성되는 칼럼으로 교환하는 것을 제외하고 실시예 3을 반복한다. pH 3.8의 세척액에 함유된 단백질은 면역글로불린 G인 것으로 나타났다.
실시예 60
본 실시예는 고체상 지지체상으로의 실시예 39에서 얻어진 생성물의 고정화를 예시한다.
아가로오스 80중량부를 물 1050중량부로 세척한후, 30중량% 수성 아세톤 1050중량부, 그후 70중량% 수성 아세톤 1050중량부, 마지막으로 아세톤 1425중량부로 세척하였다. 그후 아가로오스 80중량부를 아세톤 100중량부에 현탁하고 그 현탁액을 37℃로 가온하였다. p-톨루엔술포닐 클로라이드 15중량부를 피리딘 15중량부에 용해시키고 아세톤 25중량부를 아가로오스 현탁액에 가하고 그 혼합물을 8시간동안 37℃에서 유지하였다. 그후 활성화된 아가로오스를 아세톤 225중량부로 세척한 후, 70중량% 수성 아세톤 225중량부, 그후 30중량% 수성 아세톤 225중량부, 마지막으로 물 225중량부로 세척하였다.
이 활성화된 매트릭스 55중량부를 메탄올 178중량부와 물 47중량부의 혼합물에 용해된 탄산수소칼륨 2.3중량부로 구성된 용액 225중량부로 세척하였다. 탄산수소칼륨 1.5중량부를 함유하는 메탄올 45중량부와 물 30중량부의 혼합물중의 실시예 39에 따라 제조된 화합물 0.75중량부의 용액을 활성화된 아가로오스 현탁액에 가한 후 그 혼합물을 실온에서 16시간동안 방치하였다. 결과적인 친화성 매트릭스를 탄산수소칼륨 9중량부를 함유하는 메탄올 270중량부와 물 180중량부로 세척한 후, 물 450중량부로 세척하였다.
사용전에, 결과적인 친화성 매트릭스 115중량부를 물 45중량부중의 수산화나트륨 0.36중량부의 용액에 현탁하였다.
실시예 61
실시예 2에 기술된 제조법에 의한 친화성 매트릭스 1중량부로 구성되는 칼럼을 실시예 60에 기술된 제조법에 의한 친화성 매트릭스 1중량부로 구성되는 칼럼으로 교환하는 것을 제외하고 실시예 3을 반복할 때, pH 3.8의 세척액에 함유된 단백질이 면역글로불린 G인 것으로 나타났다.
실시예 62
실시예 60에 따라 제조된 친화성 매트릭스 10중량부를 16시간동안 pH 8.0인 포스페이트 완충액에 방치하였다. 실시예 3에서 사용된 매트릭스를 이 신규의 친화성 매트릭스의 대응량으로 교환하고 실시예 3에서 사용된 사람 혈장 대신에 쥐 면역글로불린 세포 배양으로부터의 세포 없는 상층액을 사용하여 실시예 3을 반복하였다. pH 3.8의 세척액에 함유된 단백질은 또한 쥐 면역글로불린 M인 것으로 나타났다.
표 3은 실시예 58에서 사용된 신규의 친화성 리간드를 표 3의 칼럼 Ⅱ에 명시된 신규의 친화성 리간드의 대응량으로 교환하고 실시예 58에서 사용된 에피클로로히드린 활성화된 아가로오스 39중량부를 표 3의 칼럼 Ⅳ에 열거된 시약으로 활성화된 표 3의 칼럼 Ⅲ에 열거된 탄수화물의 대응량으로 교환하는 것을 제외하고 실시예 58의 방법으로 제조될 수 있는 본 발명의 신규의 친화성 리간드 부착의 실시예를 또한 제공한다.
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ
61 실시예 39의 리간드 아가로오스 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르
62 실시예 39의 리간드 아가로오스 브롬화시안
63 실시예 39의 리간드 아가로오스 에피클로로히드린
64 실시예 39의 리간드 아가로오스 메타과요오드산나트륨
65 실시예 39의 리간드 아가로오스 2,2,2-트리플루오로-에탄술포닐-클로라이드
66 실시예 39의 리간드 아가로오스 1,1'-카르보닐디이미다졸
67 실시예 39의 리간드 아가로오스 2-플루오로-1-메틸-피리디늄 톨루엔-4-술포네이트
68 실시예 39의 리간드 아가로오스 디비닐 술폰
69 실시예 39의 리간드 아가로오스 염화시아눌
실시예 70
2-아닐리노-4,6-디클로로-1,3,5-트리아진 4.82중량부 대신에 2-페녹시-4,6-디클로로-1,3,5-트리아진 4.84중량부와 티라민 2.74중량부를 반응시키는 것을 제외하고 실시예 1에 기술된 리간드의 제조를 반복하면, 2-페녹시-4-[β-(4'-히드록시페닐)-에틸아미노]-6-클로로-1,3,5-트리아진이 얻어지고, 이것을 실시예 2의 방법에 의한 친화성 매트릭스의 제조시 2-아닐리노-4-[β-(4'-히드록시페닐)-에틸아미노]-6-클로로-1,3,5-트리아진 대신에 사용할 수 있다. 또한, 면역글로불린 G가 실시예 3에 기술된 기법으로 인간 혈장으로부터 편리하게 단리될 수 있다.
실시예 71
실시예 70에서 사용된 2-페녹시-4,6-디클로로-1,3,5-트리아진 4.84중량부 대신에 2-페닐티오-4,6-디클로로-1,3,5-트리아진 5.16중량부를 사용하여 2-페닐티오-4-[β-(4'-히드록시페닐)-에틸아미노]-6-클로로-1,3,5-트리아진을 얻고 이것은 면역글로불린 G를 정제하는데 유사하게 사용될 수 있다.
실시예 72
본 실시예는 실시예 2 및 실시예 58에 예시된 바와 같이 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트를 제조하는 대안적 접근을 예시한다.
아미노에틸아미노기를 가지는 아가로오스 10중량부를 아세톤 5중량부 및 pH 7, 리터당 0.5몰의 농도를 가지는 수성 포스페이트 완충액 5중량부로 0-5℃에서 교반하였다. 이 현탁액에 아세톤 10중량부중의 염화시아눌 1부로 이루어지는 용액 2.5부를 가한 후 그 혼합물을 0-5℃의 온도에서 1시간동안 교반하였다. 결과적인 디클로로트리아진 활성화된 아가로오스를 연속적으로 50중량% 수성 아세톤 50중량부, 물 50중량부, 50중량% 수성 아세톤 50중량부 및 물 100중량부로 세척하였다. 세척된 디클로로트리아진 활성화된 아가로오스 20중량부를 물 200중량부중의 티라민 1중량부로 이루어진 수용액 20중량부에 가하고 결과의 현탁액을 주위 실온에서 16시간동안 교반하였다. 마지막에, 결과적인 유도화된 매트릭스를 물 200중량부로 세척하고 물 200중량부중에 용해된 아닐린 0.55중량부로 이루어진 수용액 20중량부에 가하였다. 결과의 현탁액을 90℃에서 16시간동안 교반한 후 유도화된 매트릭스를 물 200중량부로 세척하였다.
실시예 73
실시예 2에 기술된 제조법에 의한 친화성 매트릭스 1중량부로 구성되는 칼럼을 실시예 72에 기술된 제조법에 의한 친화성 매트릭스 1중량부로 구성되는 칼럼으로 교환하는 것을 제외하고 실시예 3을 반복했을 때, pH 3.8의 세척액에 함유된 단백질은 또한 면역글로불린 G인 것으로 나타났다.
실시예 74
본 실시예는 단백질 결합 특성을 결정하기 위해 연속적으로 검색할 수 있는 본 발명의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트 라이브러리 합성을 예시한다.
아미노기를 가지는 아가로오스 1중량부를 1M 인산칼륨 완충액, pH 7.0, 1중량부와 혼합하고 중력하에서 침전시켰다. 완충 아민 아가로오스를 반응 용기로 옮기고 0-5℃에서 0.5M 인산칼륨 완충액, pH 7.0, 0.5중량부 및 아세톤 0.5중량부와 혼합하였다. 아세톤 10중량부중의 염화시아눌 1중량부로 이루어진 용액 1/4부를 가하고 그 혼합물을 1시간동안 0-5℃에서 교반한후, 혼합물을 여과하고 연속적으로 50중량% 아세톤 10중량부, 물 6중량부, 50중량% 아세톤 6중량부 및 물 10중량부로 세척하여 2,4-디클로로-s-트리아진-6-일 활성화된 아가로오스를 제공하였다.
2,4-디클로로-s-트리아진-6-일 활성화된 아가로오스 1중량부를 아세톤 1중량부와 물 1중량부로 이루어진 용액 2 내지 3중량부에 용해된 표 4의 칼럼 Ⅱ에 열거된 아민 화합물의 5몰 당량에 가하고 수산화나트륨를 첨가함으로써 중성 pH로 조정하였다. 현탁액을 30℃에서 24시간동안 혼합하였다. 결과의 모노클로로-s-트리아진-6-일 활성화된 아가로오스를 연속적으로 디메틸포름아미드 10중량부, 프로판-2-올 3중량부와 0.2M 수산화나트륨 7중량부로 이루어진 용액 10중량부, 물 10중량부로 세척하고, 중력하에서 침전시켰다.
모노클로로-s-트리아진-6-일 활성화된 아가로오스 1중량부를 디메틸포름아미드 1중량부와 물 1중량부로 이루어진 용액 2 내지 3중량부에 용해된 표 4의 칼럼 Ⅲ에 열거된 아민 화합물의 5몰 당량에 가하고 수산화나트륨을 가함으로써 중성 pH로 조정하였다. 현탁액을 85-95℃에서 72시간동안 혼합하였다. 결과의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트를 연속적으로 디메틸포름아미드 10중량부, 프로판-2-올 3중량부와 0.2M 수산화나트륨 7중량부로 이루어진 용액 10중량부, 물 10중량부로 세척하고, 중력하에서 침전시켰다. 본 발명의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트 라이브러리를 합성하였으며, 이것의 실시예가 표 4의 칼럼 Ⅰ에 동정되어 있다.
Ⅰ Ⅱ Ⅲ
75 1,3-디아미노프로판 티라민
76 1,3-디아미노프로판 N-벤질펜에틸아민
77 1,4-디아미노부탄 3-아미노페놀
78 1,4-디아미노부탄 티라민
79 1,4-디아미노부탄 1-아미노-5-나프톨
80 1,4-디아미노부탄 N-이소프로필벤질아민
81 1,4-디아미노부탄 N-벤질펜에틸아민
82 아닐린 디아미노프로판
83 아닐린 아닐린
84 아닐린 3-아미노페놀
85 아닐린 3-아미노벤조산
86 아닐린 티라민
87 아닐린 1-아미노-4-나프톨
88 아닐린 1-아미노-2-나프톨
89 아닐린 3-아미노-2-나프톨
90 아닐린 1-아미노-6-나프톨
91 아닐린 N-이소프로필벤질아민-4-페닐부틸아민
92 아닐린 N-벤질펜에틸아민
93 3-아미노페놀 3-아미노페놀
94 3-아미노페놀 1-아미노-5-나프톨
95 1,6-디아미노헥산 티라민
96 1,6-디아미노헥산 4-페닐부틸아민
97 3-아미노벤조산 1-아미노-5-나프톨
98 티라민 티라민
99 티라민 1-아미노-5-나프톨
100 티라민 1-아미노-7-나프톨
101 티라민 1-아미노-6-나프톨
102 1-아미노-5-나프톨 아닐린
103 1-아미노-5-나프톨 3-아미노페놀
104 1-아미노-5-나프톨 4-아미노벤조산
105 1-아미노-5-나프톨 3,5-디아미노벤조산
106 1-아미노-5-나프톨 벤질아민
107 1-아미노-5-나프톨 티라민
108 1-아미노-5-나프톨 1-아미노-5-나프톨
109 1-아미노-7-나프톨 3-아미노페놀
110 1-아미노-7-나프톨 1-아미노-7-나프톨
111 1-아미노-4-나프톨 3-아미노페놀
112 1-아미노-4-나프톨 1-아미노-4-나프톨
113 1-아미노-2-나프톨 3-아미노페놀
114 1-아미노-2-나프톨 1-아미노-2-나프톨
115 3-아미노-2-나프톨 3-아미노페놀
116 3-아미노-2-나프톨 3-아미노-2-나프톨
117 1-아미노-6-나프톨 3-아미노페놀
118 1-아미노-6-나프톨 1-아미노-6-나프톨
119 2-아미노-1-나프톨 3-아미노페놀
120 2-아미노-1-나프톨 2-아미노-1-나프톨
121 6-아미노-1-나프톨 3-아미노페놀
122 6-아미노-1-나프톨 6-아미노-1-나프톨
123 1-아미노-6-나프탈렌술폰산 3,5-디아미노벤조산
124 1-아미노-6-나프탈렌술폰산 벤질아민
125 1-아미노-6-나프탈렌술폰산 티라민
126 3-아미노-2-나프토산 3-아미노페놀
127 3-아미노-2-나프토산 3-아미노-2-나프토산
실시예 128
이 실시예는 실시예 74에 기술된 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트의 단백질결합성질을 확인할 수 있는 스크리닝방법을 설명한다.
총부피 1ml의 크로마토그래피칼럼을 실시예 75-127의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트로 채웠다. 상기 칼럼을 50mM 인산나트륨 완충액, pH 8.0으로 플러싱하여 평형화하였다. 50mM 인산나트륨 완충액, pH 8.0 1ml당 사람 IgG 1.5mg으로 이루어지는 용액 1ml를 각 크로마토그래피 칼럼에 적용하고 이어서 이 칼럼을 50mM 인산나트륨 완충액, pH 8.0 10ml로 세척하여 비결합IgG를 제거하였다. 각 칼럼을 50mm 시트르산나트륨 완충액, pH3.0 5ml로 플러싱하여 결합 IgG를 용리하였다. 세척 및 용리분획의 IgG함량을 버퍼블랭크에 대하여 280nm에서의 흡광도의 측정에 의해 측정하였다. 그 결과의 분석이 실시예75 내지 127의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트 모두가 사람 IgG결합을 나타내는 것을 드러냈다. 이들중 실시예 92, 99, 101, 102, 103, 111, 113 및 119의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트에 대하여 결합IgG의 대부분 양의 용리를 달성했고, 이것은 사람 IgG의 분리, 단리, 정제에서 예외적인 값으로 고려된다.
실시예 129
세포배지로부터 실시예 181에 따른 친화성 매트릭스에 적용된 재조합 응집인자 VIIa(rFVIIa)의 선택적인 결합 및 용리
절차:
실시예 181에서와 같이 제조된 친화성 매트릭스의 침전부피 0.85ml를 5×50mm 칼럼(Pharmacia HR5/5)에 채우고 20mL의 완충액 A: 20mM 트리스, 50mM NaCl, 5mM CaCl2, pH 8.0으로 평형화하였다. rFVIIa 1.4mg으로 집적화된 BHK세포배양 상징액 5ml를 상기 채워진 칼럼에 적용했다.
완충액 A 10mL로 비결합단백질을 세척해낸후, 5mL의 완충액 B: 20mM 시트르산삼나트륨, 5mM 트리스 pH 8.0를 적용하여 rFVIIa를 용리하였다.
크로마토그래피절차동안 유량은 0.3mL/min 이었다.
칼럼유출물을 인 라인 UV-모니터를 통해 통과시키고 1mL 분획으로 수집하고, 분석 역상 고성능액체크로마토그래피(RP-HPLC)으로 rFVIIa 및 총 단백질의 함량에 대해 각 분획을 분석하였다.
결과:
UV-모니터출력은 대부분의 UV(280nm)흡수물질이 상징액의 적용 및 뒤이어지는 버퍼 A로의 세척동안 밖으로 나오는 것을 보여주었다. 뒤이어지는 완충액 B로의 용리동안 뚜렷한 피크가 모니터링되었고, 이것은 rFVIIa의 적용량에 대한 기대크기와 조화되었다.
수집된 분획의 RP-HPLC분석은 rFVIIa의 적용량의 90중량%가 완충액 B로의 용리동안 분획에서 밖으로 나오는 것을 제시했다. 이 분획에서 rFVIIa의 순도는 95중량%이상이었다.
그 결과는 집적배양 배지로부터 사용된 리간드로 rFVIIa의 선택적인 결합이 달성되는 것을 나타낸다.
실시예 130
실시예 171에 따른 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트상에서 인슐린 B-사슬 1-29 -A-A-K-인슐린 A-사슬 1-21 의 정제
인슐린 B-사슬1-29-Ala-Ala-Lys-인슐린 A-사슬1-21, (배치 A202558) 255mg을 H20 51ml중에 현탁시켰다. 1M 아세트산 10방울을 첨가하여 전구체를 가용화하였다. 0.2M 시트르산칼륨 pH5.5를 첨가하여 총부피 510ml로 만든 결과 0.12mg/ml의 용액이 되었다(RP-HPLC분석). pH는 5.53으로 측정되었고, 이온세기는 30.0mS/cm로 산화환원전위는 273mV로 측정되었다.
주위온도에서 1.8ml/min으로 상기 매트릭스 콘쥬게이트 12ml로 채워지고 0.2M 시트르산 칼륨 pH5.5에서 평형화된 Pharmacia K16(1.6×6cm)칼럼에 상기 용액 400ml를 적용하였다. 상기 칼럼을 0.2M 시트르산 칼륨 pH 5.5 50ml에서 세척한다음에 1.8ml/min으로 0.1M 아세트산으로 용리하였다. 5.0ml의 12분획을 수집하였다.
상기 칼럼을 0.5M NaOH 50ml로 세정하고 0.1M 시트르산, 60중량% v/v 에탄올 50ml로 재생하였다.
RP-HPLC분석을 위한 샘플을 분석전에 2M 아세트산으로 희석하였다.
샘플 동정 MI3농도 부피 양 중량%
적용 E091b 0.12 mg/ml 400ml 48.8 mg 100
런스루 E091c 0.00 mg/ml 0.0 mg 0
세척 E093a 0.00 mg/ml 0.0 mg 0
분획 3 E093b 0.01 mg/ml 5.0 ml 0.1 mg
분획 4 E093c 5.00 mg/ml 5.0 ml 25.0 mg
분획 5 E093d 2.62 mg/ml 5.0 ml 13.1 mg
분획 6 E093e 0.52 mg/ml 5.0 ml 2.6 mg
분획 40.8 mg 83
그래서 83중량%의 총회수율을 얻었다.
생성물의 순도는 RP-HPCL분석에 의해 94중량%로 측정되었다. 나머지 불순물은 인슐린 관련물이었다.
실시예 131
실시예 171에 따른 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트상에서 des-Thr B30 -인슐린의 정제:
des-ThrB30-인슐린(INS-J-009)침전물 150mg을 50ml H20중에 현탁시켰다. 2M 아세트산 5방울을 상기 현탁액에 첨가하여 용해시켰다. 0.2M 시트르산칼륨 pH5.5 을 첨가하여 500ml의 부피로 만든 결과 0.076mg/ml의 농도가 되었다(RP-HPLC분석). pH는 5.52로 측정되었고, 이온세기는 30.0mS/cm 그리고 산화환원전위는 264mV로 측정되었다. 상기 용액 400ml를 주위온도에서 1.8ml/min으로, 상기 매트릭스 콘쥬게이트 12ml로 채워지고, 0.2M 시트르산칼륨 pH 5.5에서 평형화된 Pharmacia K16(1.6×6cm)칼럼에 적용하였다. 상기 칼럼을 0.2M 시트르산칼륨 pH5.5 50ml으로 세척한 다음에 1.8ml/min의 속도로 0.1M 아세트산으로 용리했다. 5.0ml 10분획을 수집했다.
상기 칼럼을 0.5M NaOH 50ml로 세정하고 0.1M 시트르산, 60중량% v/v 에탄올 50ml로 재생했다.
RP-HPLC분석을 위한 샘플을 분석전에 2M 아세트산으로 희석했다.
샘플 동정 MI3농도 부피 양 중량%
적용 E105a 0.076 mg/ml 400ml 30.0 mg 100
런 스루 E105b 0.00 mg/ml 0.0 mg 0
세척 E105d 0.00 mg/ml 0.0 mg 0
분획 3 E105e 0.00 mg/ml 5.0 ml 0.0 mg 0
분획 4 E105f 0.41 mg/ml 5.0 ml 2.1 mg
분획 5 E105n 1.93 mg/ml 5.0 ml 9.7 mg
분획 6 E105o 1.14 mg/ml 5.0 ml 5.7 mg
분획 7 E105p 0.48 mg/ml 5.0 ml 2.4 mg
분획 8 E105j 0.31 mg/ml 5.0 ml 1.6 mg
분획 21.5 mg 71중량%
그래서 71중량%의 총회수율을 얻었다.
생성물의 순도는 RP-HPLC분석에 의해 91중량%로 측정되었다. 나머지 불순물은 인슐린관련물이었다.
실시예 132
실시예 145에 따른 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트상에서 인슐린 B-사슬 1-29 -A-A-K-인슐린 A-사슬 1-21 의 정제:
원심분리한 배양액(배치 628) 2l를 5M NaOH로 pH5.5로 조절하고 Leitz Tiefenfilter(Seitz EK)필터를 통해 여과하고 이어서 Leitz Tiefenfilter(Seitz EKS)필터를 통해 여과하였다. 농도는 RP-HPLC에 의해 0.006mg/ml로 측정되었다. 이온세기는 12.2mS/cm 그리고 산화환원전위는 316mV로 측정되었다.
상기 용액 1000ml를, 상기 매트릭스 콘쥬게이트 12ml로 채워지고, 0.2M 시트르산칼륨 pH5.5에서 평형화된 Pharmacia K16(1.6×6cm)칼럼에 주위온도에서 1.8ml/min의 속도로 적용하였다. 상기 칼럼을 0.2M 시트르산칼륨 pH5.5 50ml에서 세척한 다음에 1.8ml/min으로 0.1M 아세트산으로 용리했다. 5.0ml 11분획을 수집했다.
상기 칼럼을 0.5M NaOH 50ml로 세정하고 0.1M 시트르산, 60중량% v/v 에탄올 50ml로 재생했다.
RP-HPLC분석을 위한 샘플을 분석전에 2M 아세트산으로 희석했다.
샘플 동정 MI3농도 부피 양 중량%
적용 E111e 0.006 mg/ml 1000ml 6.0 mg 100
런 스루 E115a 0.00 mg/ml 0.0 mg 0
세척 E115b 0.00 mg/ml 0.0 mg 0
분획 3 E115c 0.00 mg/ml 5.0 ml 0.0 mg 0
분획 4 E115d 0.58 mg/ml 5.0 ml 2.9 mg
분획 5 E115e 0.11 mg/ml 5.0 ml 0.6 mg
분획 6 E115f 0.04 mg/ml 5.0 ml 0.2 mg
분획 7 E115g 0.02 mg/ml 5.0 ml 0.1 mg
분획 3.8 mg 63중량%
그래서 63중량%의 총회수율을 얻었다.
생성물의 순도는 RP-HPLC분석에 의해 88중량%로 측정되었다. 나머지 불순물은 인슐린관련물이었다.
실시예 133
실시예 171에 따른 친화성 리간드 매트릭스 콘쥬게이트상에서 인슐린 B-사슬 1-29 -A-A-K-인슐린 A-사슬 1-21 의 정제:
원심분리한 배양액(배치 628) 2l를 5M NaOH로 pH5.5로 조절하고 Leitz Tiefenfilter(Seitz EK)필터를 통해 여과하고 이어서 Leitz Tiefenfilter(Seitz EKS)필터를 통해 여과하였다. 농도는 RP-HPLC에 의해 0.006mg/ml로 측정되었다. 이온세기는 12.2mS/cm 그리고 산화환원전위는 316mV로 측정되었다.
상기 용액 1000ml를, 상기 매트릭스 콘쥬게이트 12ml로 채워지고, 0.2M 시트르산칼륨 pH5.5에서 평형화된 Pharmacia K16(1.6×6cm)칼럼에 주위온도에서 1.8ml/min의 속도로 적용하였다. 상기 칼럼을 0.2M 시트르산칼륨 pH5.5 50ml에서 세척한 다음에 1.8ml/min으로 0.1M 아세트산으로 용리했다. 5.0ml 11분획을 수집했다.
상기 칼럼을 0.5M NaOH 50ml로 세정하고 0.1M 시트르산, 60중량% v/v 에탄올 50ml로 재생했다.
RP-HPLC분석을 위한 샘플을 분석전에 2M 아세트산으로 희석했다.
샘플 동정 MI3농도 부피 양 중량%
적용 E111e 0.006 mg/ml 830ml 5.0 mg 100
런 스루 E113a 0.00 mg/ml 0.0 mg 0
세척 E113b 0.00 mg/ml 0.0 mg 0
분획 3 E113c 0.00 mg/ml 5.0 ml 0.0 mg 0
분획 4 E113d 0.58 mg/ml 5.0 ml 2.9 mg
분획 5 E113e 0.10 mg/ml 5.0 ml 0.5 mg
분획 6 E113f 0.04 mg/ml 5.0 ml 0.2 mg
분획 7 E113g 0.02 mg/ml 5.0 ml 0.1 mg
분획 3.7 mg 74중량%
그래서 74중량%의 총회수율을 얻었다.
생성물의 순도는 RP-HPLC에 의해 86중량%로 측정되었다. 나머지 불순물은 인슐린 관련물이었다.
실시예 134
실시예 171에 따른 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트상에서 EEAEPK-인슐린 B-사슬(1-29)-AAK-인슐린 A-사슬(1-21)의 정제:
원심분리한 효모배양액(배치 Y44)을 Leitz Tiefenfilter(Seitz EK)필터를 통해 여과한 결과 농도가 0.35mg/ml로 측정되었다(RP-HPLC). pH는 5.27로 측정되고, 이온세기는 7.38mS/cm 그리고 산화환원전위는 221mV로 측정되었다.
상기 용액 120ml를, 상기 매트릭스 콘쥬게이트 12ml로 채워지고, 0.2M 시트르산칼륨 pH5.5에서 평형화된 Pharmacia K16(1.6×6cm)칼럼에 주위온도에서 1.8ml/min의 속도로 적용하였다. 상기 칼럼을 0.2M 시트르산칼륨 pH5.5 50ml에서 세척한 다음에 1.8ml/min으로 0.1M 아세트산으로 용리했다. 5.0ml 11분획을 수집했다.
상기 칼럼을 0.5M NaOH 50ml로 세정하고 0.1M 시트르산, 60중량% v/v 에탄올 50ml로 재생했다.
RP-HPLC분석을 위한 샘플을 분석전에 2M 아세트산으로 희석했다.
샘플 동정 MI3농도 부피 양 중량%
적용 E127b 0.35 mg/ml 120ml 42.0 mg 100
런 스루 E127c 0.00 mg/ml 0.0 mg 0
세척 E127d 0.00 mg/ml 0.0 mg 0
분획 3 E127e 2.26 mg/ml 5.0 ml 11.3 mg
분획 4 E127f 2.07 mg/ml 5.0 ml 10.4 mg
분획 5 E127g 1.12 mg/ml 5.0 ml 5.6 mg
분획 6 E127h 1.27 mg/ml 5.0 ml 6.4 mg
분획 33.6 mg 79중량%
그래서 총회수율 79중량%를 얻었다.
생성물의 순도는 RP-HPLC분석에 의해 93중량%로 측정되었다. 나머지 불순물은 인슐린관련물이었다.
실시예 135
실시예 171에 따른 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트상에서 [Asp B28 ]-인슐린-B-사슬 1-29 -A-A-K-인슐린-A-사슬 1-21 의 정제:
원심분리한 배양액(배치 GSG9414)을 5M NaOH로 pH5.5로 조절하고 Leitz Tiefenfilter(Seitz EK)필터를 통해 여과하고 이어서 Leitz Tiefenfilter(Seitz EKS)필터를 통해 여과하였다. 농도는 RP-HPLC에 의해 0.02mg/ml로 측정되었다. 이온세기는 17.0mS/cm 그리고 산화환원전위는 308mV로 측정되었다.
상기 용액 800ml를, 상기 매트릭스 콘쥬게이트 12ml로 채워지고, 0.2M 시트르산칼륨 pH5.5에서 평형화된 Pharmacia K16(1.6×6cm)칼럼에 주위온도에서 1.8ml/min의 속도로 적용하였다. 상기 칼럼을 0.2M 시트르산칼륨 pH5.5 50ml에서 세척한 다음에 1.8ml/min으로 0.1M 아세트산으로 용리했다. 5.0ml 12분획을 수집했다.
상기 칼럼을 0.5M NaOH 50ml로 세정하고 0.1M 시트르산, 60중량% v/v 에탄올 50ml로 재생했다.
RP-HPLC분석을 위한 샘플을 분석전에 2M 아세트산으로 희석했다.
샘플 동정 MI3농도 부피 양 중량%
적용 E107b 0.02 mg/ml 800ml 16.0 mg 100
런 스루 E107c 0.00 mg/ml 0.0 mg 0
세척 E107d 0.00 mg/ml 0.0 mg 0
분획 2 E109a 0.00 mg/ml 5.0 ml 0.0 mg 0
분획 3 E109b 0.12 mg/ml 5.0 ml 0.6 mg
분획 4 E109c 0.76 mg/ml 5.0 ml 3.8 mg
분획 5 E109d 1.04 mg/ml 5.0 ml 5.2 mg
분획 6 E109e 0.31 mg/ml 5.0 ml 1.6 mg
분획 7 E109f 0.10 mg/ml 5.0 ml 0.5 mg
분획 8 E109g 0.06 mg/ml 5.0 ml 0.3 mg
분획 12 mg 75중량%
그래서 총회수율 75중량%를 얻었다.
생성물의 순도는 RP-HPLC분석에 의해 84중량%로 측정되었다. 나머지 불순물은 인슐린관련물이었다.
실시예 136
이 실시예는 본발명의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트의 단백질결합성질이 확인될 수 있는 스크리닝 방법을 더욱 설명한다.
표 4의 칼럼II에 열거된 아민화합물 5몰당량을 표 5의 칼럼II에 열거된 아민화합물 대응량으로 대체하고 표 4의 칼럼III에 열거된 아민화합물 5몰당량을 표 5의 칼럼III에 열거된 아민화합물의 대응량으로 대체한 것을 제외하고는 실시예 74에 따라 본 발명의 친화성 리간드 매트릭스 콘쥬게이트의 라이브러리를 합성했다. 본발명의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트의 라이브러리를 합성했고 이것의 예가 표 5의 칼럼I에서 확인된다.
총부피 1ml의 크로마토그래피칼럼을 실시예 137-180의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트로 채웠다. 상기 칼럼을 0.2M 아세트산나트륨, 0.1M 염화나트륨 완충액, pH5.0 10ml로 플러싱하여 평형화했다. 사람 인슐린전구체 50mg/ml를 함유하는 정화된 발효배양액 12ml를 각 크로마토그래피칼럼에 적용하고 이어서 이 칼럼을 0.2M 아세트산나트륨, 0.1M 염화나트륨 완충액, pH5.0 12ml로 세척하여 비결합물질을 제거하였다. 각 칼럼을 2M 아세트산 3ml로 플러싱하여 결합 사람인슐린전구체를 용리하였다. 통과유동, 세척 및 용리분획의 사람인슐린 전구체함량을, C18 역상 실리카 칼럼(4×250mm)과, 완충액 A 55중량% 대 완충액 B 45중량%의 비율로 1분당 1ml의 유량으로 전달되는 완충액 A(0.2M 황산나트륨, 40mM 인산 및 10중량%(v/v)아세토니트릴, pH2) 및 완충액 B((50중량%(v/v) 아세토니트릴)로 이루어지는 용매시스템을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 측정하였다. 사람인슐린 전구체의 용리시간을 참고표준과 비교하여 측정하였다.
결과의 분석이 실시예 139, 140, 145, 148, 153, 159, 162, 163, 164, 166, 167, 170, 171, 173의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트가 모두 이 실시예에 기술된 조건하에서 용리된 결합사람인슐린 전구체인 것을 드러냈다. 그 결과로, 실시예 139, 140, 145, 148, 153, 159, 162, 163, 164, 166, 167, 170, 171, 173의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트는 사람인슐린 전구체의 분리, 단리, 또는 정제에서 예외적인 값인 것으로 고려된다.
I II III
137 1-아미노-6-나프탈렌술폰산 벤질아민
138 1-아미노-6-나프탈렌술폰산 3,5-디아미노벤조산
139 1-아미노-5-나프톨 벤질아민
140 1-아미노-5-나프톨 3,5-디아미노벤조산
141 벤질아민 3-아미노벤조산
142 벤질아민 4-아미노벤조산
143 티라민 3-아미노벤조산
144 티라민 4-아미노벤조산
145 1-아미노-5-나프톨 1-아미노-5-나프톨
146 1-아미노-5-나프톨 3-아미노벤조산
147 1-아미노-5-나프톨 4-아미노벤조산
148 1-아미노-5-나프톨 티라민
149 1-아미노-6-나프탈렌술폰산 티라민
150 1-아미노-5-나프톨 3-아미노-1,2-프로판디올
151 1-아미노-5-나프톨 3-아미노프로판-1-올
152 1-아미노-5-나프톨 5-아미노프로판-1-올
153 1-아미노-5-나프톨 3-아미노페놀
154 1-아미노-5-나프톨 6-아미노카프로산
155 1-아미노나프탈렌 벤질아민
156 1-아미노나프탈렌 3,5-디아미노벤조산
157 1-아미노나프탈렌 3-아미노벤조산
158 1-아미노나프탈렌 4-아미노벤조산
159 3-아미노-2-나프토산 3-아미노페놀
160 4-아미노-1-나프톨 3-아미노페놀
161 1-아미노-2-나트폴 3-아미노페놀
162 3-아미노-2-나프톨 3-아미노페놀
163 1-아미노-6-나프톨 3-아미노페놀
164 1-아미노-7-나프톨 3-아미노페놀
165 2-아미노-1-나프톨 3-아미노페놀
166 6-아미노-1-나프톨 3-아미노페놀
167 3-아미노-2-나프토산 3-아미노-2-나프토산
168 4-아미노-1-나프톨 4-아미노-1-나프톨
169 1-아미노-2-나프톨 1-아미노-2-나프톨
170 3-아미노-2-나프톨 3-아미노-2-나프톨
171 1-아미노-7-나프톨 1-아미노-7-나프톨
172 2-아미노-1-나프톨 2-아미노-1-나프톨
173 6-아미노-1-나프톨 6-아미노-1-나프톨
174 3-아미노-2-나프토산 1-아미노-5-나프톨
175 3-아미노-2-나프토산 4-아미노-1-나프톨
176 3-아미노-2-나프토산 2-아미노-1-나프톨
177 1-아미노-7-나프톨 1-아미노-5-나프톨
178 1-아미노-7-나프톨 3-아미노-2-나프토산
179 1-아미노-7-나프톨 4-아미노-1-나프톨
180 1-아미노-7-나프톨 2-아미노-1-나프톨
실시예 181
이 실시예는 인자 VII의 정제를 위해 가치가 있는 본 발명의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트가 합성될 수 있는 방법을 설명한다.
본 발명의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트를 표 4의 칼럼II에 열거된 아민화합물 5몰당량을 2-아미노벤즈이미다졸의 대응량으로 대체하고 표 4의 칼럼II에 열거된 아민화합물 5몰당량을 3-아미노-2-나프토산의 대응량을 대체한 것을 제외하고는 실시예 74에 따라 합성하였다. 이 친화성 리간드- 매트릭스 콘쥬게이트는 본 발명의 실시예 129에 따라 인자 VIIa의 정제를 위해 사용될 수 있다.
실시예 182
실시예 171에 따른 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트상에서 EEAEPK-인슐린 B-사슬 1-29 -A-A-K-인슐린 A-사슬 1-21 의 정제:
이온교환 정제 인슐린 전구체(EEAEPK-인슐린 B-사슬1-29-A-A-K-인슐린 A-사슬1-21 2.2mg/ml) 50ml를 상기 매트릭스 콘쥬게이트 12ml로 채워지고, 0.2M 시트르산칼륨 pH5.5에서 평형화된 Pharmacia K16(1.6×6cm)칼럼에 주위온도에서 1.8ml/min의 속도로 적용하였다. 상기 칼럼을 0.1M 시트르산칼륨, 0.2M 황산칼륨 pH 5.5 50ml에서 세척한 다음에 1.8ml/min으로 0.1M 아세트산으로 용리했다. 5.0ml 분획을 수집했다.
상기 칼럼을 0.5M NaOH 50ml로 세정하고 0.1M 시트르산, 60중량% v/v 에탄올 50ml로 재생했다.
RP-HPLC분석을 위한 샘플을 분석전에 2M 아세트산으로 희석했다.
샘플 동정 농도 ㎎/㎖ 부피 ㎖ 양 ㎎ 중량%
적용 R-029e 2.27 50 114 100
런 스루 R-033a 0.03 50 1.4 1.2
세척 R-033b 0.09 50 4.3 3.8
푸울 1 R-033c 5.61 15 84.2 74
푸울 2 R-033d 0.55 10 5.5 4.8
9.5mg/ml 매트릭스의 동적결합용량은 전구체의 88중량%의 수율로 설명되었다.

Claims (63)

  1. 화학식 a를 갖는 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드 매트릭스 콘쥬게이트.
    (화학식 a)
    상기 식에서,
    R1은 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 시클로헥실기, 아미노기, 페닐기, 나프틸기, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸기, 벤즈옥사졸기 또는 벤즈이미다졸기를 나타내고, 이들의 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리 각각은 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 아미노기, 히드록실기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일기, 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 및 할로겐원자로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환기로 치환되어 있거나 치환되어 있지 않고;
    Y는 산소원자, 황원자 또는 N-R2기를 나타내고;
    Z는 산소원자, 황원자 또는 N-R3기를 나타내고;
    R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 벤질기 또는 β-페닐에틸기를 나타내고;
    R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소원자, 히드록실기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 아미노기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일 또는 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 또는 할로겐원자를 나타내고;
    기호 X 중 하나는 질소원자를 나타내고 다른 기호 X는 염소원자 또는 시아노기를 갖는 질소원자 또는 탄소원자를 나타내고;
    Q는 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리를 나타내고;
    n은 0 내지 6의 정수이고;
    p는 0 내지 20의 정수이고;
    이 리간드는 매트릭스와 리간드 사이에 개재된 스페이서 아암을 통해 위치 A에서 지지 매트릭스에 부착되며,
    단, 화학식 a는, 화합물들 4-클로로-2,6-디(페닐-아미노)-1,3,5-트리아진-3'-술폰산, 4-클로로-2,6-디(페닐-아미노)-1,3,5-트리아진-3',2''-디술폰산, 및 4-클로로-2-(4''-아미노-페닐-아미노)-1,3,5-트리아진-3',2''-디술폰산과 덱스트란 T500과의 반응생성물은 포함하지 않는다.
  2. 제1항에 있어서, 리간드와 매트릭스 사이에 개재된 스페이서 아암은 화학식 b로 표시되는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
    (화학식 b)
    -T-[-L-V-]m-
    상기식에서 T는 산소원자, 황원자 또는 N-R7기를 나타내고;
    R7은 수소원자 또는 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기를 나타내고;
    V는 산소원자, 황원자, -COO-기, CONH기 또는 NHCO기 또는 -PO3H-기, NH-아릴렌-SO2-CH2-CH2기 또는 N-R8기를 나타내고; R8은 수소원자 또는 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기를 나타내고;
    L은 2 내지 20개의 탄소원자를 함유하는 탄화수소 결합을 나타내고; 그리고
    m은 0 또는 1이다.
  3. 화학식 Ⅰ로 표시되는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
    (화학식 Ⅰ)
    상기식에서, R1은 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 시클로헥실기, 아미노기, 페닐기, 나프틸기, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸기, 벤즈옥사졸기 또는 벤즈이미다졸기를 나타내고, 이들의 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리 각각은 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 아미노기, 히드록실기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일기, 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 및 할로겐원자로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환기로 치환되어 있거나 치환되어 있지 않고;
    Y는 산소원자, 황원자 또는 N-R2기를 나타내고;
    Z는 산소원자, 황원자 또는 N-R3기를 나타내고;
    R2 및 R3은 각각 독립적으로 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 벤질기 또는 β-페닐에틸기를 나타내고;
    R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소원자, 히드록실기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 아미노기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일 또는 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 또는 할로겐원자를 나타내고;
    기호 X 중 하나는 질소원자를 나타내고 다른 기호 X는 염소원자 또는 시아노기를 갖는 질소원자 또는 탄소원자를 나타내고;
    Q는 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리를 나타내고;
    n은 0 내지 6의 정수이고;
    p는 0 내지 20의 정수이고;
    T는 산소원자, 황원자 또는 기 N-R7을 나타내고;
    V는 산소원자, 황원자, -COO-기, CONH기 또는 NHCO기 또는 -PO3H-기, NH-아릴렌-SO2-CH2-CH2기 또는 N-R8기를 나타내고;
    R7 및 R8은 각각 독립적으로 수소원자 또는 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기를 나타내고;
    L은 2 내지 20개의 탄소원자를 함유하는 탄화수소 결합을 나타내고;
    m은 0 또는 1이고; 그리고
    M은 지지 매트릭스의 잔기를 나타낸다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, M은 입상 또는 비입상, 가용성 또는 불용성, 다공성 또는 비다공성인 어떤 화합물 또는 물질이고, 상기항 중 어느 한항에 따른 신규의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트를 형성하기 위해서 친화성 리간드와 조합하여 사용되고, 그리고 접촉하는 용액 중에서의 용질로부터 친화성 리간드를 분리하는 용이한 수단을 제공하는 지지매트릭스의 잔기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R1은, 각각이 히드록실기 및 카르복실산기에서 독립적으로 선택된 하나 이상으로 벤젠 또는 나프탈렌고리상에서 치환되어 있거나 치환되어 있지 않은 페닐 또는 나프틸기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R2는 수소원자를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R3는 수소원자를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R4는 수소원자, 히드록실기, 카르복실산기, 또는 아미노기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R5는 수소원자, 히드록실기, 카르복실산기, 또는 아미노기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R6은 수소원자, 히드록실기, 카르복실산기, 또는 아미노기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  11. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R7은 수소원자를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, T는 산소원자 또는 NH기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  13. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Y는, R2가 상기한 바와 같은, N-R2기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  14. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Z는, R3이 상기한 바와 같은, N-R3기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  15. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 두 X는 질소원자를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  16. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, Q는 벤젠 또는 나프탈렌고리를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  17. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, n은 0 또는 2를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, p는 0 또는 2를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  19. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, m은 0 또는 1을 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  20. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, L은 에틸, 프로필, 히드록시프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 옥틸 또는 데실기를 나타내고, V는 산소원자, 황원자, -COO-기, CONH기 또는 NHCO기 또는 -PO3H-기, NH-아릴렌-SO2-CH2-CH2기 또는 N-R8기를 나타내고; m은 0 또는 1인 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  21. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, V는 산소원자 또는 NH기를 나타내고, L은 에틸, 프로필, 히드록시프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 옥틸 또는 데실기를 나타내고, m 은 0 또는 1 인 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  22. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, m은 1을 나타내고, L은 에틸, 프로필, 히드록시프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 옥틸 또는 데실기를 나타내고, V는 산소원자, NH기를 나타내는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  23. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 지지매트릭스의 잔기 M은 활성화된 아가로오스, 실리카, 셀룰로즈, 유리, 토요펄, 히드록시에틸메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 스티렌디비닐벤젠, 하이퍼 D, 퍼플루오로카본을 나타내는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  24. 제23항에 있어서, M은 트레실활성화된, 술포닐클로라이드활성화된, 토실활성화된, 비닐술폰활성화된 또는 에폭시활성화된 아가로오스를 나타내는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  25. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
    (화학식 i)
    (화학식 ii)
    (화학식 iii)
    (화학식 iv)
    (화학식 v)
    (화학식 vi)
    (화학식 vii)
    (화학식 viii)
    상기식에서 M은 지지매트릭스 잔기를 나타낸다.
  26. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 정의된 신규의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트의 제조방법에 있어서, 화학식 II 의 할로게노헤테로고리 화합물을
    (화학식 II)
    (i) 화학식 III
    (화학식 III)
    R1-(CH2)p-Y-H 의 화합물,
    (ii) 화학식 IV
    (화학식 IV)
    의 화합물 및
    (iii) 화학식 V
    (화학식 V)
    H-T-[-L-V-]m-M 의 유도화된 지지 매트릭스와 어떤 순서로든 반응시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
    상기 화학식 II 에서, 기호 X 중 하나는 질소원자를 나타내고 다른 기호 X는 염소원자 또는 시아노기를 갖는 질소원자 또는 탄소원자를 나타내고, W는 할로겐원자를 나타내고;
    상기 화학식 III에서, 기호 R1은 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 시클로헥실기, 아미노기, 페닐기, 나프틸기, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸기, 벤즈옥사졸기 또는 벤즈이미다졸기를 나타내고, 이들의 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리 각각은 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 아미노기, 히드록실기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일기, 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 및 할로겐원자로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환기로 치환되어 있거나 치환되어 있지 않고; p 는 0 내지 20의 정수이고; Y 는 산소원자, 황원자 또는 N-R2기를 나타내고;
    상기 화학식 IV에서, 기호 R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소원자, 히드록실기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 아미노기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일 또는 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 또는 할로겐원자를 나타내고; Q는 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리를 나타내고; Z 는 산소원자, 황원자 또는 N-R3기를 나타내고; n은 0 내지 6의 정수이며;
    상기 화학식 V에서, L은 2 내지 20개의 탄소원자를 함유하는 탄화수소 결합을 나타내고; V는 산소원자, 황원자, -COO-기, CONH기 또는 NHCO기 또는 -PO3H-기, NH-아릴렌-SO2-CH2-CH2기 또는 N-R8기를 나타내고; T 는 산소원자, 황원자 또는 N-R7기를 나타내고; m 은 0 또는 1이고; M 은 지지 매트릭스의 잔기를 나타낸다.
  27. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 신규의 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트의 제조방법에 있어서, 제26항에 정의된 바와 같은 화학식 II의 할로게노헤테로고리 화합물을
    (i) 제26항에 정의된 화학식 III의 화합물,
    (ii) 제26항에 정의된 화학식 IV의 화합물, 그리고
    (iii) 화학식 VI의 결합단위
    (화학식 VI)
    H-T-L-V-H 와 어떤 순서로든 반응시켜 화학식 VII:
    (화학식 VII)
    의 화합물을 제공하고, 이어서 매트릭스 지지체와 화학식 VII의 화합물을 반응시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
    상기 화학식 VI에서, 기호 T는 산소원자, 황원자 또는 N-R7기를 나타내고; L은 2 내지 20개의 탄소원자를 함유하는 탄화수소 결합을 나타내고; V는 산소원자, 황원자, -COO-기, CONH기 또는 NHCO기 또는 -PO3H-기, NH-아릴렌-SO2-CH2-CH2기 또는 N-R8기를 나타내고;
    상기 화학식 VII에서, R1은 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 시클로헥실기, 아미노기, 페닐기, 나프틸기, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸기, 벤즈옥사졸기 또는 벤즈이미다졸기를 나타내고, 이들의 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리 각각은 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 아미노기, 히드록실기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일기, 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 및 할로겐원자로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환기로 치환되어 있거나 치환되어 있지 않고;
    R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소원자, 히드록실기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 아미노기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일 또는 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 또는 할로겐원자를 나타내고;
    Q는 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리를 나타내고; L은 2 내지 20개의 탄소원자를 함유하는 탄화수소 결합을 나타내고; T는 산소원자, 황원자 또는 기 N-R7을 나타내고; V는 산소원자, 황원자, -COO-기, CONH기 또는 NHCO기 또는 -PO3H-기, NH-아릴렌-SO2-CH2-CH2기 또는 N-R8기를 나타내고; 기호 X 중 하나는 질소원자를 나타내고 다른 기호 X는 염소원자 또는 시아노기를 갖는 질소원자 또는 탄소원자를 나타내고; Y는 산소원자, 황원자 또는 N-R2기를 나타내고; Z는 산소원자, 황원자 또는 기 N-R3기를 나타내고; m 은 0 또는 1 이고; n은 0 내지 6의 정수이고; p는 0 내지 20의 정수이다.
  28. 화학식 XII의 신규의 친화성 리간드.
    (화학식 XII)
    상기 식에서, R1은 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 시클로헥실기, 아미노기, 페닐기, 나프틸기, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸기, 벤즈옥사졸기 또는 벤즈이미다졸기를 나타내고, 이들의 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리 각각은 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 아미노기, 히드록실기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일기, 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 및 할로겐원자로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환기로 치환되어 있거나 치환되어 있지 않고;
    R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소원자, 히드록실기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 아미노기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일 또는 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 또는 할로겐원자를 나타내고;
    Q는 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리를 나타내고; 기호 X 중 하나는 질소원자를 나타내고 다른 기호 X는 염소원자 또는 시아노기를 갖는 질소원자 또는 탄소원자를 나타내고; Y는 산소원자, 황원자 또는 N-R2기를 나타내고; Z는 산소원자, 황원자 또는 N-R3기를 나타내고; n은 0 내지 6의 정수이고; p는 0 내지 20의 정수이고; 할로겐은 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 나타내며,
    단, 화학식 XII은, 화합물들 4-클로로-2,6-디(페닐-아미노)-1,3,5-트리아진-3'-술폰산, 4-클로로-2,6-디(페닐-아미노)-1,3,5-트리아진-3',2''-디술폰산, 및 4-클로로-2-(4''-아미노-페닐-아미노)-1,3,5-트리아진-3',2''-디술폰산은 포함하지 않는다.
  29. 제28항에 청구된 화학식 XII의 신규의 친화성 리간드를 제26항에 정의된 화학식 V의 매트릭스에 부착하는 방법에 있어서, 산결합제의 존재하에, -20℃ 내지 121℃의 온도에서 신규의 친화성 리간드를 매트릭스와 반응시켜 부착하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 화학식 XIII의 신규의 친화성 리간드.
    (화학식 XIII)
    상기식에서, R1은 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 시클로헥실기, 아미노기, 페닐기, 나프틸기, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸기, 벤즈옥사졸기 또는 벤즈이미다졸기를 나타내고, 이들의 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리 각각은 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 아미노기, 히드록실기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일기, 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 및 할로겐원자로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환기로 치환되어 있거나 치환되어 있지 않고;
    R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소원자, 히드록실기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 아미노기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일 또는 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 또는 할로겐원자를 나타내고;
    Q는 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리를 나타내고; 기호 X 중 하나는 질소원자를 나타내고 다른 기호 X는 염소원자 또는 시아노기를 갖는 질소원자 또는 탄소원자를 나타내고; Y는 산소원자, 황원자 또는 기 N-R2를 나타내고; Z는 산소원자, 황원자 또는 기 N-R3을 나타내고; m 은 0 또는 1 이고; n은 0 내지 6의 정수이고; p는 0 내지 20의 정수이고; j는 2 내지 20의 정수이다.
  31. 제 30 항에 청구된 화학식 XIII의 신규의 친화성 리간드를 제조하는 방법에 있어서, 산결합제의 존재하에, 0℃ 내지 100℃의 온도에서, 제28항에 청구된 화학식 XII의 화합물을 화학식 H2N-(CH2)j-NH2의 알킬렌디아민과 반응시켜 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 화학식 XIV의 신규의 친화성 리간드.
    (화학식 XIV)
    상기식에서, R1은 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 시클로헥실기, 아미노기, 페닐기, 나프틸기, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸기, 벤즈옥사졸기 또는 벤즈이미다졸기를 나타내고, 이들의 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리 각각은 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 아미노기, 히드록실기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일기, 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 및 할로겐원자로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환기로 치환되어 있거나 치환되어 있지 않고;
    R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소원자, 히드록실기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 아미노기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일 또는 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 또는 할로겐원자를 나타내고;
    Q는 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리를 나타내고; 기호 X 중 하나는 질소원자를 나타내고 다른 기호 X는 염소원자 또는 시아노기를 갖는 질소원자 또는 탄소원자를 나타내고; Y는 산소원자, 황원자 또는 N-R2기를 나타내고; Z는 산소원자, 황원자 또는 기 N-R3을 나타내고; m 은 0 또는 1 이고; n은 0 내지 6의 정수이고; p는 0 내지 20의 정수이고; q는 0 또는 1이고, j는 2 내지 20의 정수이다.
  33. 제32항에 청구된 화학식 XIV의 신규의 친화성 리간드를 제조하는 방법에 있어서, 산결합제의 존재하에, 0℃ 내지 100℃의 온도에서, 제28항에 청구된 화학식 XII의 화합물을 화학식 H2N-(CH2)j-(CO)q-OH의 아미노히드록시 화합물과 반응시켜 제조하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 화학식 VIII의 신규의 친화성 리간드.
    (화학식 VIII)
    상기식에서, R1은 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 시클로헥실기, 아미노기, 페닐기, 나프틸기, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸기, 벤즈옥사졸기 또는 벤즈이미다졸기를 나타내고, 이들의 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리 각각은 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 아미노기, 히드록실기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일기, 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 및 할로겐원자로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환기로 치환되어 있거나 치환되어 있지 않고;
    R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소원자, 히드록실기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 아미노기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일 또는 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 또는 할로겐원자를 나타내고; L은 2 내지 20개의 탄소원자를 함유하는 탄화수소 결합을 나타내고; Q는 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리를 나타내고; T는 산소원자, 황원자 또는 기 N-R7을 나타내고; V는 산소원자, 황원자, -COO-기, CONH기 또는 NHCO기 또는 -PO3H-기, NH-아릴렌-SO2-CH2-CH2기 또는 N-R8기를 나타내고; 기호 X 중 하나는 질소원자를 나타내고 다른 기호 X는 염소원자 또는 시아노기를 갖는 질소원자 또는 탄소원자를 나타내고; Y는 산소원자, 황원자 또는 N-R2기를 나타내고; Z는 산소원자, 황원자 또는 N-R3기를 나타내고; m 은 0 또는 1 이고; n은 0 내지 6의 정수이고; p는 0 내지 20의 정수이고; R9는 수소원자 또는 1 내지 6개 탄소원자를 함유하는 알킬기를 나타내고; R10은 카르보닐기, 메틸렌기, -NH-CH2-기 또는 -S-CH2-기를 나타낸다.
  35. 화학식 XV의 신규의 친화성 리간드.
    (화학식 XV)
    상기식에서, R1은 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 시클로헥실기, 아미노기, 페닐기, 나프틸기, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸기, 벤즈옥사졸기 또는 벤즈이미다졸기를 나타내고, 이들의 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리 각각은 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 아미노기, 히드록실기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일기, 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 및 할로겐원자로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환기로 치환되어 있거나 치환되어 있지 않고;
    R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소원자, 히드록실기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 아미노기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일 또는 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 또는 할로겐원자를 나타내고;
    Q는 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리를 나타내고; n은 0 내지 6의 정수이고; p는 0 내지 20의 정수이며;
    단, 화학식 XV는, 화합물들 4-클로로-2,6-디(페닐-아미노)-1,3,5-트리아진-3'-술폰산, 4-클로로-2,6-디(페닐-아미노)-1,3,5-트리아진-3',2''-디술폰산, 및 4-클로로-2-(4''-아미노-페닐-아미노)-1,3,5-트리아진-3',2''-디술폰산은 포함하지 않는다.
  36. 화학식 XVI의 신규의 친화성 리간드.
    (화학식 XVI)
    상기 식에서, R1은 수소원자, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 히드록시알킬기, 시클로헥실기, 아미노기, 페닐기, 나프틸기, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸기, 벤즈옥사졸기 또는 벤즈이미다졸기를 나타내고, 이들의 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리 각각은 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 아미노기, 히드록실기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일기, 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 및 할로겐원자로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환기로 치환되어 있거나 치환되어 있지 않고;
    R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 수소원자, 히드록실기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알콕시기, 아미노기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 아실옥시 또는 아실아미노기, 카르복실산기, 술폰산기, 카르바모일 또는 술파모일기, 1 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알킬술포닐기 또는 할로겐원자를 나타내고;
    Q는 벤젠, 나프탈렌, 1-페닐피라졸, 인다졸, 벤즈티아졸, 벤즈옥사졸 또는 벤즈이미다졸 고리를 나타내고; n은 0 내지 6의 정수이고; p는 0 내지 20의 정수이고; j는 2 내지 20의 정수이다.
  37. 제28항, 제30항, 제32항, 제34항, 제35항 또는 제36항중 어느 한항에 있어서, R1은 페닐 또는 나프틸기를 나타내고, 이들의 벤젠 또는 나프탈렌 고리 각각은 히드록실기 또는 카르복실산기에서 독립적으로 선택된 1개 이상의 치환기로 치환되어 있거나 치환되어 있지 않은 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  38. 제28항, 제30항, 제32항, 제34항, 제35항 또는 제36항중 어느 한항에 있어서, R4는 수소원자, 히드록실기, 카르복실산기, 또는 아미노기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  39. 제28항, 제30항, 제32항, 제34항, 제35항 또는 제36항중 어느 한항에 있어서, R5는 수소원자, 히드록실기, 카르복실산기, 또는 아미노기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  40. 제28항, 제30항, 제32항, 제34항, 제35항 또는 제36항중 어느 한항에 있어서, R6은 수소원자, 히드록실기, 카르복실산기, 또는 아미노기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  41. 제28항, 제30항, 제32항, 제34항, 제35항 또는 제36항중 어느 한항에 있어서, Q는 벤젠 또는 나프탈렌고리를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  42. 제28항, 제30항, 제32항 또는 제34항중 어느 한항에 있어서, X는 질소원자를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  43. 제28항, 제30항, 제32항, 제34항 또는 제35항중 어느 한항에 있어서, Y는 -NH-기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  44. 제28항, 제30항, 제32항, 제34항 또는 제35항중 어느 한항에 있어서, Z는 -NH-기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  45. 제28항, 제30항, 제32항, 제34항, 제35항 또는 제36항중 어느 한항에 있어서, n은 0 또는 2인 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  46. 제28항, 제30항, 제32항, 제34항, 제35항 또는 제36항중 어느 한항에 있어서, p는 0 또는 2인 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  47. 제30항, 제32항 또는 제36항중 어느 한항에 있어서, j는 2, 4 또는 6인 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  48. 제34항에 있어서, L은 에틸, 부틸 또는 헥실기인 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  49. 제34항에 있어서, T는 -NH-기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  50. 제34항에 있어서, V는 -NH-기를 의미하는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  51. 제34항에 있어서, m은 1인 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
  52. 화학식 XI의 신규의 친화성 리간드.
    (화학식 XI)
    상기식에서 j는 2 내지 20의 정수이다.
  53. 제28항, 제30항, 제32항, 제34항, 제35항, 제36항, 및 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 다음에서 선택되는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드.
    (화학식 1)
    (화학식 2)
    (화학식 3)
    (화학식 4)
    (화학식 5)
    (화학식 6)
    (화학식 7)
    (화학식 8)
    (화학식 9)
    (화학식 10)
    (화학식 11)
    (화학식 12)
    (화학식 13)
  54. 제27항에 정의된 화학식 VII, 제30항에 정의된 XIII, 제36항에 정의된 XVI, 제52항에 정의된 XI의 신규의 친화성 리간드를 탄수화물 또는 유기폴리머 매트릭스에 부착하는 방법에 있어서, 산결합제의 존재하에, 탄수화물 또는 유기폴리머 매트릭스를 활성제와 반응시키고, 이어서 활성화된 매트릭스를 신규의 친화성 리간드와 반응시켜 부착하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제32항에 정의된 화학식 XIV의 신규의 친화성 리간드를 탄수화물 또는 유기폴리머 매트릭스에 부착하는 방법에 있어서, 매트릭스와 축합시켜 응축시켜 부착하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제27항에 정의된 화학식 VII, 제30항에 정의된 XIII, 제36항에 정의된 XVI, 제52항에 정의된 XI의 신규의 친화성 리간드를 유기폴리머로 코팅된 금속산화물, 유리 또는 실리카매트릭스에 부착하는 방법에 있어서, 산결합제의 존재하에, 코팅된 금속산화물, 유리 또는 실리카매트릭스를 활성제와 반응시키고, 이어서 활성화된 매트릭스를 신규의 친화성 리간드와 반응시켜 부착하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제32항에 정의된 화학식 XIV의 신규의 친화성 리간드를, 유기폴리머로 코팅된 금속산화물, 유리 또는 실리카매트릭스에 부착하는 방법에 있어서, 매트릭스와 축합시켜 부착하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제35항에 정의된 화학식 XV, 제28항에 정의된 XII의 신규의 친화성 리간드를 제26항에 정의된 화학식 V의 매트릭스에 부착하는 방법에 있어서, 산결합제의 존재하에, -20℃ 내지 121℃의 온도에서, 신규의 친화성 리간드를 매트릭스와 반응시켜 부착하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제26항, 제27항, 제29항, 제54항, 제55항, 제56항 및 제57항에서 청구된 바와 같이 제조되는 것을 특징으로 하는 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트.
  60. 단백질성 물질의 분리 또는 정제방법에 있어서, 생물특이적 리간드로서 상기 정의된 화학식 a의 리간드를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 실시하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 5.0 내지 12.0 범위의 pH에서, 면역글로불린을 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트에 적용하고, 이어서 pH를 0.01 내지 4.9 로 감소시켜 제거, 용리, 또는 탈착시키는 어떤 방법에 의한, 면역글로불린의 분리, 단리, 정제, 특성화, 동정 또는 정량화.
  62. 4.0 내지 9.0 범위의 pH에서, 인슐린, 인슐린유도체, 유사체, 및 전구체를 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 정의된 바와 같은 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트에 적용하고, 이어서 pH를 0.01 내지 3.99 로 감소시키거나 9.01 내지 14.0 으로 증가시켜 제거, 용리, 또는 탈착시키는 어떤 방법에 의한, 인슐린 또는 인슐린유사체 또는 그 유도체 및 전구체의 분리, 단리, 정제, 특성화, 동정 또는 정량화.
  63. 5 mM Ca2+의 존재하에 재조합 FVIIa를 상기 친화성 리간드-매트릭스 콘쥬게이트에 적용시키고, 이어서 용리시켜, FVIIa를 세포배양 배지 유래의 다음 화학식의 친화성 매트릭스에 선택적으로 결합시키는 것에 의한 재조합 FVIIa의 분리.
    화학식
    상기식에서, M 은 아가로스 함유 아미노기이다.
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