CN1089617C - 新亲合配位体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的亲合配位体-基质结合物，包括通式(a)的配位体，该配位体在位置(A)联接至一种载体基质上，选择性地通过基质和配位体之间插入的间隔臂进行所述联接。本发明还涉及这些新的亲合配位体-基质结合物及其制备方法和在纯化诸如免疫球蛋白、胰岛素、因子VII或人生长激素或其类似物、衍生物及片段和前体的蛋白类物质中的应用。

Description

新亲合配位体及其应用
本发明涉及新的亲合配位体及其制备方法，以及这些亲合配位体在可由固体、半固体、颗粒或胶体材料，或可溶性聚合物构成的基质上联接的方法。本发明还涉及这些新的亲合配位体-基质结合物及其制备方法和在纯化诸如免疫球蛋白、胰岛素、因子VII或人生长激素或其类似物、衍生物及片段和前体的蛋白类物质中的应用。
发明背景
现代蛋白质纯化原理主要依靠色谱分离技术，比如凝胶渗透色谱(GPC)、离子交换色谱(IEC)、疏水作用色谱(HIC)、反相高压色谱(RP-HPLC)及亲合色谱(AC)。这些技术易于适用于实验室规模内对研究和科学试验用的肽和蛋白质的纯化，得到纯的且有生物活性的物质。在多数情况下，基本不考虑处理的经济性、处理的有效性，或者适当的清洗过程，这是因为这些物质仅仅很少用于临床试验而且劳动力费用远远超过设备和基质的费用。但是，在进行大规模的工业下游加工时就要考虑诸如经济性、基质的耐久性以及用例如氢氧化钠、尿素或乙醇进行适宜的清洗等因素。在GPC、IEC、HIC以及RP-HPLC领域许多的供应商可满足现在对便宜且在1M氢氧化钠、7M尿素或80v/v的乙醇中稳定的耐用基质的需求。多年来这些方法的结合产生了大量几乎纯的蛋白质，尽管采用极端缓冲液及大量纯化步骤导致回收率低，费用增加以及大量制备时稳定性差。
长期以来一直认为亲合色谱法也可应用于大规模生产。但不幸的是，由于配位体本身需要被纯化，所以用像单克隆或多克隆抗体一样的天然生物配位体制备的吸附剂往往使得生产费用高，且由于其生化性质的不稳定而使在保持其生物活性的情况下固定化是较困难的。所以长期以来一直需要用一种价廉且更耐用的模拟抗体特性的配位体来代替化学和生物上不稳定的单克隆或多克隆抗体。
由于将要纯化的蛋白质选择性地且可逆地吸附像抗体分子这样的互补结合物，所以亲合色谱在分离技术中具有独特的地位。与常规纯化方法所能提供的5-50倍的纯化因子比较，现在在高回收率的情况下，纯化因子是几千倍。亲合色谱法所能达到的高纯化因子大大减少了下游加工过程中的纯化步骤数量。而且，在亲合色谱中非特异性结合很少，使其能够从复杂的生物混合物中纯化已知蛋白质，将叠加形式不正确的蛋白与天然分子分离开，以及甚至从大量的组织提取物或发酵培养物中特异性地回收蛋白质。
亲合吸附剂包含一种通常可通透的固体载体基质，适宜的配位体可共价地联接在其上，这种固体载体基质装在常规的色谱柱中。将一种包含附加生物聚合物的粗样品在促进与固定化的配位体特异性结合作用的条件下通过载体基质。用缓冲液洗涤色谱柱，以除去未阻滞(unretarded)的分子，随后进行洗脱步骤，从而使蛋白质以纯化形式洗脱出来。一种典型的亲合吸附剂是基于固体载体、间隔臂和配位体。固体载体可由粒状形式的具有开孔结构的琼脂糖制成。间隔臂可通过使配位体更易接近而促进蛋白质结合。间隔臂的长度和性能可由本领域的技术人员确定。配位体在固定化后，应当显示出特异性地和可逆地结合欲纯化的蛋白质。除了抗体外，大量化合物均可用作亲合配位体，这些化合物包括酶辅因子、氨基酸、肽、蛋白质、伴刀豆球蛋白A、卵磷脂、硫醇和染料。
亲合色谱法可在许多领域使用。在例如下述文献中具体给出了有关内容，亲合色谱实际研究，IRL Press，1985；亲合色谱原理和方法，Pharmacia Fine Chemicals 1979。常规底物或底物类似物亲合配位体，特别是染料可用于大规模地纯化特异性酶或酶类(Scawen M.D.和Atkinson T.1987，Reactive Dyes in Protein and Enzyme Technology Ed.Clonis Y.D.et al；Macmillan Press，pp.51-85)。
近些年来，由于染料亲合色谱法所用基质具有相对低廉的价格并具有耐受氢氧化钠、尿素和乙醇的能力，因而引起人们极大的兴趣。某些该类亲合色谱中更广泛采用的配位体是各种固定化于琼脂糖和其它载体上的基于活性三嗪的织物染料。已有文献对这类固定化染料上进行的亲合色谱进行了综述(Lowe C.R.和Pearson J.C.1984，Methods in Enzymology 104，pp.97-113)。Cibacron Blue F3G-A染料类似物表现出与马肝醇脱氢酶的NAD+结合位点的选择性相互作用(Lowe C.R.等人1986；Journal ofChromatography 376，pp.121-130)。选择性纯化研究进一步说明，用新亲合吸附剂计算机辅助设计模拟苯基-精氨酸二肽底物以用于纯化猪胰激肽释放酶(Burton N.P.and Lowe C.R.1992，Journal of MolecularRecongnition 5，pp.55-58)。
美国专利4,562,252公开了一种特殊的配位体结构，其由联接于三嗪环的两种间氨基苯基硼酸基团组成，可用于糖蛋白分离。
尽管在过去的几年里亲合技术已有了很大的进步，但人们仍需要开发对于蛋白质而言特异性模拟配位体可被鉴别的技术，以生产一种能够重复进行大规模纯化所说蛋白质的价廉且稳定的亲合柱，如用于分离和纯化蛋白类物质如免疫球蛋白、胰岛素、因子VII或人生长激素或其类似物、衍生物及片段和前体，而不论其来自天然来源还是重组来源。
对本发明的详细描述
本发明涉及新的亲合配位体，其制备方法及联接至基质的方法，还涉及这些新亲合配位体-基质结合物在纯化蛋白类物质中的应用。
本发明是基于如下的见解：疏水配位体的选择性可以增强，即可通过增加疏水组分的复杂性和空间几何形状而增加，及通过引入各种能够参与静电和氢键作用的官能团，从而促进了与蛋白质结合位点的选择性作用。这一工作导致发现了新的亲合配位体的同属基团，并出人意料地发现其可用于由亲合色谱来分离和纯化蛋白质。
与上述选择性研究相反，当酶底物、其类似物或底物模拟物用作配位体时，本申请中定义的配位体可指向蛋白质分子的任一表面，使得该原理可用于任一种蛋白质。通过计算机模拟技术和/或通过筛选模拟的配位体库可设计配位体。此外，本发明的优点是为设计和开发配位体无需蛋白质结合位点的建造结构，从而，本文所述的材料和技术具有特别巨大的实用性。
本发明的特征是提供了用于蛋白质解吸、分离和纯化的通用手段。合成了一族微细差异的化学结构，其能够与不同的蛋白质作用。对于给定的蛋白质而言，特别有效的配位体结构可通过筛选由本发明提供用于适宜结合性能的一系列配位体来确定。
作为实例，目前可用于分离和纯化免疫球蛋白的高选择性和特异性的亲合配位体通常为得自细菌来源或重组来源的蛋白类物质，其包括诸如蛋白质A、蛋白质G和蛋白质L的物质。这些免疫球蛋白及类似物的固定化经常会导致蛋白质生物活性的极大损失。继续使用和重复使用固定化蛋白作为亲合介质会进一步降低生物活性。进而，这些生物大分子的内在性能在亲合色谱和相关技术中对于所用缓冲盐、有机溶剂和pH值均有严格的限制。
本发明提供的新的亲合配位体可用于代替蛋白质A和蛋白质G，并且其应用性具有非常大的适应性，耐用性更好，生产更低廉，并且纯化效果相当。
另一实例是本发明提供了新的亲合基质在生物技术中的应用。
本发明涉及亲合配位体-基质结合物，其包含一种具有下述式(a)的配位体：
Figure C9619784900191
其中
R1为氢原子、1-6个碳原子的烷基、1-6个碳原子的羟基烷基、环己基、氨基、苯基、萘基、1-苯基吡唑基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并噁唑基或苯并咪唑基，苯、萘、1-苯基吡唑、吲唑、苯并噻唑、苯并噁唑或苯并咪唑环的每一个可被一个或多个取代基取代或未被取代，所述取代基独立地选自1-6个碳原子的烷基、1-6个碳原子的烷氧基、1-6个碳原子的酰氧基或酰氨基、氨基、羟基、羧酸基、磺酸基、氨基甲酰基、氨磺酰基、1-6个碳子的烷基磺酰基和卤原子；
Y为氧原子、硫原子或基团N-R2；
Z为氧原子、硫原子或基团N-R3；
R2和R3彼此独立地为氢原子、1-6个碳原子的烷基、1-6个碳原子的羟基烷基、苄基或β-苯基乙基；
R4、R5和R6彼此独立地为氢原子、羟基、1-6个碳原子的烷基、1-6个碳原子的烷氧基、氨基、1-6个碳原子的酰氧基或酰氨基、羧酸基、磺酸基、氨基甲酰基、氨磺酰基、1-6个碳原子的烷基磺酰基和卤原子；
X之一表示氮原子，而其它X表示氮原子或携带氯原子或氰基的碳原子；
Q为苯、萘、1-苯基吡唑、吲唑、苯并噻唑、苯并噁唑或苯并咪唑环；
n为整数0-6；
p为整数0-20；该配位体在位置(A)处联接至载体基质，选择性地通过在基质与配位体间插入的间隔臂进行所述联接。
选择性间隔臂优选由通式(b)表示：
      -T-[-L-V-]m-  (b)其中
T为氧原子、硫原子或基团N-R7；
R7为氢原子或1-6个碳原子的烷基；
V为氧原子、硫原子、-COO-基团、CONH基团或NHCO基团或-PO3H-基团、NH-亚芳基-SO2-CH2-CH2基团或N-R8基团；其中R8为氢原子或1-6个碳原子的烷基；
L为2-20个碳原子的取代或未取代的烃链；而
m为0或1。
载体基质可为任一种颗粒或非颗粒、可溶性或不溶性、多孔或无孔的化合物或物料，其可与亲合配位体结合以形成亲合配位体-基质结合物，其可提供一种使亲合配位体从接触溶液的溶质中分离的便利手段。
本发明提供了新的亲合配位体-基质结合物，该亲合配位体-基质结合物可用于分离及纯化蛋白类物质，如免疫球蛋白、胰岛素、因子VII或人生长激素或类似物，其衍生物、其片段及前体，不论其来自天然来源或重组来源。
在优选实施方案中，本发明提供了由通式(I)表示的亲合配位体-基质结合物：其中
R1、Y、Z、R2、R3、R4、R5、R6、X、Q、n和p定义同前
T为氧原子、硫原子或基团N-R7；
V为氧原子、硫原子、-COO-基团、CONH基团或NHCO基团或-PO3H-基团、NH-亚芳基-SO2-CH2-CH2基团或N-R8基团；
R7和R8彼此独立地为氢原子或1-6个碳原子的烷基；
L为2-20个碳原子的取代或未取代的烃链；
m为0或1；而
M为载体基质的残基。
本文中单独采用或组合采用的术语“1-6个碳原子的烷基”是指具有1-6个碳原子的直链或支链的饱和烃基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、4-甲基戊基、新戊基、正己基和2，2-二甲基丙基。
本文中单独采用或组合采用的术语“1-6个碳原子的羟基烷基”是指具有1-6个碳原子的、被1个或多个羟基取代但优选1个羟基取代的、直链或支链的饱和烃基，如羟甲基、2-羟基乙基、3-羟基丙基、2-羟基丙基、4-羟基丁基、5-羟基戊基、6-羟基己基。
本文中单独采用或组合采用的术语“1-6个碳原子的烷氧基”是指包含1-6个碳原子的烷基的直链或支链的一价取代基，其包含通过醚氧连接的1-6个碳原子的烷基，并且该醚氧具有游离价键，如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、戊氧基、
 术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
本文中术语“1-6个碳原子的酰氧基或酰氨基”是指包含一个1-5个碳原子的烷基并通过一个羰氧基或氧羰基连接的一价取代基，如甲基羰氧基、乙基羰氧基、甲氧羰基或乙氧羰基，或通过一个羰氨基或氨基羰基连接，如甲基羰氨基、乙基羰氨基、甲氨基羰基或乙氨基羰基。
本文中术语“1-6个碳原子的烷基磺酰基”是指包含一个1-6个碳原子的烷基并通过一个磺酰基连接的一价取代基，如甲磺酰基、乙磺酰基、正丙磺酰基、异丙磺酰基、正丁磺酰基、仲丁磺酰基、异丁磺酰基、叔丁磺酰基、正戊磺酰基、2-甲基丁磺酰基、3-甲基丁磺酰基、正己磺酰基、4-甲基戊基磺酰基、新戊磺酰基、正己磺酰基和2，2-二甲基丙磺酰基。
术语“一个或多个独立地选择的取代基”优选1-3个取代基。该术语更优选1-2个取代基，首选1个取代基。
在本发明中，不论术语胰岛素是单数或复数形式，其均包含了天然胰岛素和胰岛素类似物和其衍生物及前体。因此，术语胰岛素也指来源于任何种属的胰岛素，如人胰岛素。而本文中术语“胰岛素类似物”是指具有1个或几个氨基酸取代基、缺失1个或几个氨基酸、增加1个或几个氨基酸或其结合。而术语“胰岛素衍生物”是指在1个或几个残基被化学改性的胰岛素。本文中术语“胰岛素前体”是指通过酶或化学转化形成胰岛素、胰岛素片段的任一种分子，如des-Thr(B30)-胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素衍生物。
本文中术语“2-20个碳原子的取代或未取代的烃链”是指一种或多种直链或支链烷基链，它可被例如羟基或具有1-6个碳原子的烷氧基选择性取代，它可选择性地与氨基、醚、硫醚、酯、酰胺或磺酰胺键连接，只要其包含2-20个碳原子。其结构优选为柔性的。这种取代或未取代的烃链的结构的实例可参见：Lowe，C.R.and Dean，P.D.G，1974，亲合色谱，John Wiley & Sons，London，该文献引入本文作参考。
在优选实施方案中，这些结合物可通过下述通式(I)表示：
Figure C9619784900221
其中
R1为氢原子、1-6个碳原子的烷基、1-6个碳原子的羟基烷基、环己基、氨基、苯基或萘基，其可在苯或萘环上被取代，所述取代基独立地选自1-6个碳原子的烷基、1-6个碳原子的烷氧基、1-6个碳原子的酰氧基或酰氨基、氨基、羟基、羧酸基、磺酸基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基磺酰基或卤原子；
T为氧原子、硫原子或基团N-R7；
Y为氧原子、硫原子或基团N-R2；
Z为氧原子、硫原子或基团N-R3；
R2和R3彼此独立地为氢原子、1-6个碳原子的烷基、1-6个碳原子的羟基烷基、苄基或β-苯基乙基；
R4、R5和R6彼此独立地为氢原子、羟基、1-6个碳原子的烷基、1-6个碳原子的烷氧基、氨基、1-6个碳原子的酰氧基或酰氨基、羧酸基、磺酸基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基磺酰基和卤原子；
X之一表示氮原子，而其它X表示氮原子或携带氯原子或氰基的碳原子；
V为氧原子、硫原子、-COO-基团、CONH基团或NHCO基团或-PO3H-基团、NH-亚芳基-SO2-CH2-CH2基团或N-R8基团；
R7和R8分别独立地为氢原子或1-6个碳原子的烷基；
L为2-20个碳原子的取代或未取代的烃链；和
Q为苯或萘环；
n为整数0-6；
p为整数0-20；
m为0或1；而
M为载体基质的残基，所述载体基质可为任一种颗粒或非颗粒、可溶性或不溶性、多孔或无孔的化合物或物料，其可与亲合配位体结合以形成新的通式(I)的亲合配位体-基质结合物，其可提供一种使亲合配位体与在接触溶液中的溶质分离的便利手段。
可以理解，本发明还涉及负载T-[L-V]0.1-M取代基，或其前体，和其它经杂原子与环相连的取代基的吡啶、二嗪、三嗪化合物的用途。这种取代基可包括任一种包含0-10或20C原子的非干扰基团。
在本发明的一个优选实施方案中，R1为苯基或萘基，它们任一苯环或萘环可被一种或多种独立地选自羟基和羧酸基的取代基取代或未被取代。
在本发明的另一个优选实施方案中，R2为氢原子。
在本发明的另一个优选实施方案中，R3为氢原子。
在本发明的另一个优选实施方案中，R4为氢原子、羟基、羧酸基或氨基。
在本发明的另一个优选实施方案中，R5为氢原子、羟基、羧酸基或氨基。
在本发明的另一个优选实施方案中，R6为氢原子、羟基、羧酸基或氨基。
在本发明的另一个优选实施方案中，R7为氢原子。
在本发明的另一个优选实施方案中，T为氧原子或NH基。
在本发明的另一个优选实施方案中，Y为N-R2，其中R2定义如前。
在本发明的另一个优选实施方案中，Z为N-R3，其中R3定义如前。
在本发明的另一个优选实施方案中，两个X均为氮原子。
在本发明的另一个优选实施方案中，Q为苯或萘环。
在本发明的另一个优选实施方案中，n为0或2。
在本发明的另一个优选实施方案中，p为0或2。
在本发明的另一个优选实施方案中，m为0或1。
在本发明的另一个优选实施方案中，L为乙基、丙基、羟丙基、丁基、戊基、己基、辛基、或癸基，V和m定义如前。
在本发明的另一个优选实施方案中，V为氧原子、-COO-基团、-PO3H-基团或N-R8基团；更优选氧原子或NH基团，L和m定义如前。
在本发明的另一个优选实施方案中，m为1，L和V定义如前。
术语整数x-y可包括x值(包括0)和y值。
本发明也提供了一种新的亲合配位体-基质结合物的生产方法，该方法包括以任何次序使通式(II)的卤代杂环化合物
Figure C9619784900241
其中X与前述定义相同，W为卤原子与下述化合物反应：
(i)通式(III)的化合物：
   R1-(CH2)p-Y-H           (III)其中R1、p和Y与前述定义相同，H为氢，
(ii)通式(IV)的化合物：
Figure C9619784900251
其中R4、R5、R6、Q、Z和n与前述定义相同，
(iii)选择性得到的通式V的载体基质
     H-T-[-L-V-]m-M      (V)
其中L、M、V、T和m与前述定义相同，
或与通式(VI)的连接单元
     H-T-L-V-M         (VI)其中H、L、V和T与前述定义相同，得到通式(VII)的化合物：其中R1、R4、R5、R6、Q、L、T、V、X、Y、Z、m、n和p与前述定义相同；再使通式(VII)的化合物载体与基质反应，载体基质的残基用M表示，采用本领域公知的活化方法和偶合方法反应。
通式(II)的卤代杂环化合物的实例为5-氯-2，4，6-三氟嘧啶、5-氰基2，4，6-三氯嘧啶、氰尿酰氟、氰尿酰溴及氰尿酰氯。
通式(III)的化合物的实例为胺，如氨、甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、二异丙胺、异丁胺、戊胺、己胺、乙醇胺、二乙醇胺、苯胺、N-甲基苯胺、N-乙基苯胺、异丙基苯胺、1，4-二氨基丁烷、1，6-二氨基己烷、N-叔丁基苯胺、对甲苯胺、对丁基苯胺、2，4-二甲基苯胺、对甲氧基苯胺、对乙氧基苯胺、对氨基N-乙酰苯胺、对氨基苯酚、对氯苯胺、邻氨基苯磺酸、间胺酸、磺胺酸、4-甲基苯胺-2-磺酸、4-甲氧基苯胺-2-磺酸、苯胺-2，5-二磺酸、N-甲基间胺酸，邻、间和对氨基苯甲酸、对氨基苯甲酰胺、对氨基苯磺酰胺、1-氨基-2-，3-，4-，5-，6-，7-和8-萘酚、2-氨基-3-，4-，5-，6-，7-和8-萘酚、5-、6-和7-氨基-1-萘酚-3-磺酸、N-苄基苯胺、苄基胺、4-甲基苄基胺、4-羟基苄基胺、4-甲氧基苄基胺、4-乙酰氧基苄基胺、4-乙酰基氨基苄基胺、N-甲基苄基胺、β-苯基乙基胺、N-丁基苄基胺、N-苄基-β-苯基乙基胺、N-(β-羟基乙基)-苄基胺、N-叔丁基苄基胺、N-苄基酪胺和酪胺；酚，如苯酚，邻、间和对甲酚、儿茶酚、间苯二酚、对苯二酚、对氯苯酚、1-萘酚和2-萘酚、1-萘酚-4-磺酸、2-萘酚-6-磺酸和2-羟基-3-萘甲酸；硫醇，如乙硫醇、硫代乙醇酸、硫代苯酚、硫代对甲酚、和芳族杂环，如5-氨基-1-苯基吡唑、6-氨基吲唑、2-氨基苯并咪唑、2-氨基苯并噻唑、2-氨基-5-氯苯并噁唑。
通式(IV)的化合物的实例为胺，如苯胺、N-甲基苯胺、N-乙基苯胺、N-异丙基苯胺、N-叔丁基苯胺、对甲苯胺、对丁基苯胺、2，4-二甲基苯胺、对甲氧基苯胺、对乙氧基苯胺、对氨基N-乙酰苯胺、对氨基苯酚、对氯苯胺、邻氨基苯磺酸、间胺酸、磺胺酸、4-甲基苯胺-2-磺酸、4-甲氧基苯胺-2-磺酸、苯胺-2，5-二磺酸、N-甲基间胺酸，邻、间和对氨基苯甲酸、1-氨基-2-，3-，4-，5-，6-，7-和8-萘酚、2-氨基-3-，4-，5-，6-，7-和8-萘酚、5-、6-和7-氨基-1-萘酚-3-磺酸、对氨基苯并酰胺、对氨基苯磺酰酰胺、N-苄基苯胺、苄基胺、4-甲基苄基胺、4-羟基苄基胺、4-甲氧基苄基胺、4-乙酰氧基苄基胺、4-乙酰基氨基苄基胺、N-甲基苄基胺、β-苯基乙基胺、N-丁基苄基胺、N-苄基-β-苯基乙基胺、N-(β-羟基乙基)-苄基胺、N-叔丁基苄基胺、N-苄基酪胺和酪胺；酚，如苯酚、邻、间和对甲酚、儿茶酚、间苯二酚、对苯二酚、对氯苯酚、1-萘酚和2-萘酚、1-萘酚-4-磺酸、2-萘酚-6-磺酸和2-羟基-3-萘甲酸；硫醇，如硫代苯酚、硫代对甲酚、和芳族杂环，如5-氨基-1-苯基吡唑、6-氨基吲唑、2-氨基苯并咪唑、2-氨基苯并噻唑、2-氨基-5-氯苯并噁唑。
残基由M表示的载体基质的实例为不溶性载体基质，如天然聚合物，例如多肽或蛋白质，如交联血清蛋白或多糖，如琼脂糖、藻酸盐、角叉藻聚糖、壳多糖、纤维素、葡聚糖或淀粉；合成聚合物，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯醛、聚乙烯基醇、聚丙烯酸甲酯、全氟碳；无机化合物，如二氧化硅、玻璃、硅藻土、氧化铝、氧化铁或其它金属氧化物或两种或多种天然聚合物、合成聚合物或无机化合物任一种组合组成的共聚物。残基由M表示的载体基质的实例还可为可溶性载体基质，其包含聚合物诸如葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯基醇或水解淀粉，其提供了用于液体分配的亲合配位体-基质结合物；或包含诸如全氟萘烷的化合物的载体基质，其提供了用于形成亲合乳液的亲合配位体-基质结合物。为消除疑问，本文中载体基质定义为任一种可用于形成本发明新的亲合配位体-基质结合物并且提供使亲合配位体与在接触溶液中的溶质分离的便利手段的化合物或材料，不论其为颗粒状或非颗粒状、可溶性或不溶性、多孔或无孔。
其残基由M表示的载体基质还包括诸如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、淀粉、藻酸盐、角叉藻聚糖，合成聚合物、二氧化硅、玻璃、和金属氧化物，它们可用活化剂在配位体联接前或联接过程中进行处理而修饰。
在本发明的优选实施方案中，M表示选择性地活化的活化的琼脂糖、二氧化硅、纤维素、玻璃、toyopearl、羟乙基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、苯乙烯二乙烯基苯、Hyper D、全氟碳。
M优选为选择性tresyl活化的、磺酰氯活化的、甲苯磺酰基活化的、乙烯基砜活化的或环氧活化的琼脂糖。
本发明优选的亲合配位体基质结合物为：
Figure C9619784900271
Figure C9619784900291
其中，M定义如前。
已知有多种活化剂可用于联接配位体至载体基质。这些化合物和其使用方法是本领域技术人员公知的，并且，由于本发明的注意力集中于与基质联接的配位体而不是其联接方式，因而，这些活化剂中的任一种都可用于制备本发明的新的基质-配位体结合物。活化剂的非限定性实例为各种化合物，如溴化氰、氰尿酸氯、表氯醇、二乙烯基砜、对甲苯磺酰氯、1，1′-羰基二咪唑、偏高碘酸钠、2-氟-1-甲基吡啶翁甲苯-4-磺酸盐、缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷和2，2，2-三氟乙烷磺酰氯。如上所述，实施该活化步骤的过程也是本领域技术人员公知的。
类似地，多种缩合剂可用于将通式(VI)的化合物联接至载体基质上，如琼脂糖、葡聚糖、淀粉、藻酸盐、角叉藻聚糖、二氧化硅或玻璃。而这些化合物及它们的使用方法也是本领域的技术人员公知的；同样，本发明的注意力集中于配位体的性能而非联接方式，因而，这些缩合剂中的任一种都可用于制备本发明的新的基质-配位体结合物。缩合剂的非限定性实例为N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉、二环己基碳化二亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳化二亚胺。
可用于制备通式(VII)化合物的通式(VI)的连接单元实例可为二胺，如乙二胺、N，N′-二甲基乙二胺、N-乙基乙二胺、N-(β-羟基乙基)乙二胺、丙二胺、N-甲基丙二胺、N-(β-羟基乙基)-丙二胺、1，4-二氨基丁烷、1，5-二氨基戊烷、1，6-二氨基己烷、1，7-二氨基庚烷、1，8-二氨基辛烷、1，9-二氨基壬烷、1，10-二氨基癸烷、1，12-二氨基十二烷、哌嗪、3-羟基-1，5-二氨基戊烷、间和对亚苯基二胺、间和对氨基苄基胺；氨基醇，如乙醇胺、N-甲基乙醇胺、N-丙基乙醇胺、二乙醇胺、3-羟基丙基胺、2，3-二羟基丙基胺、异丙醇胺、5-氨基戊-1-醇和6-氨基己-1-醇；氨基苯酚，如邻、间和对氨基苯酚、氨基羧酸如甘氨酸、N-甲基甘氨酸、3-和4-氨基丁酸、3-氨基异丁酸、5-氨基戊酸、6-氨基己酸、7-氨基庚酸、间和对氨基苯甲酸；氨基膦酸，如间氨基苯膦酸和对氨基苄基膦酸；和氨基亚芳基乙烯基砜前体，如苯胺-3-β-硫酸根合(sulphato)乙基砜和苯胺-4-β-硫酸根合乙基砜。
通式(II)的卤代杂环化合物与通式(III)、(IV)和(V)或(VI)的反应可以在与水不混溶的有机溶剂、与水混溶的有机溶剂以及水和与水混溶的有机溶剂的混合物中进行。适宜的与水不混溶的有机溶剂的实例为甲苯、二甲苯或氯苯；适宜的与水混溶的有机溶剂的实例为丙酮、甲乙酮或二噁烷。卤代杂环化合物第一种反应在0-25℃下进行，优选0-5℃；第二种反应在20-50℃下进行，优选30-45℃；第三种反应在20-100℃下进行。在反应过程中，使用诸如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钙或碳酸钙这些酸结合剂中和产生的无机酸如氢氯酸或氢氟酸。
此外，通式(VII)的化合物可与活性可聚合单体反应形成通式(VIII)的可聚合化合物：
Figure C9619784900311
其中R1、R4、R5、R6、Q、L、T、V、X、Y、Z、m、n和p与前述定义相同；R9为氢原子或1-6个碳原子的烷基；R10为羰基、亚甲基、-NH-CH2-基团或-S-CH2-基团。活性可聚合单体的实例包括丙烯酰氯、甲丙烯酰氯、烯丙基溴、烯丙基胺或3，4-环氧丁烯。通式(VIII)的可聚合化合物可在其它可聚合单体存在或不存在下进行聚合，形成通式(I)的亲合配位体-基质结合物。该聚合方法是本领域技术人员公知的。
本发明还涉及所有亲合配位体-基质结合物在分离、提取、纯化、表征鉴定、鉴别或定量蛋白类物质如免疫球蛋白、胰岛素、因子VII或人生长激素，或其类似物、其衍生物、其片段及前体中的应用。
免疫球蛋白为一族蛋白质，通常简写为Ig，其具有共同的结构。免疫球蛋白总体来说也被称之为抗体，这两个词均可用于描述该族蛋白质。免疫球蛋白以许多种不同形式存在，例如最重要的抗体类型为IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgY和其各种亚类。免疫球蛋白可存在于诸如血浆、腹水、唾液、奶或蛋黄等体液中，或者可以使基因工程方法生产。免疫球蛋白可通过各种技术进行修饰以赋予其所需性能。这些方法是本领域的技术人员公知的，形成的改性的抗体也属于本发明的保护范围。作为抗体改性技术的非限定性实例，可以通过化学改性，通过一种或多种酶处理，或者通过上述两种技术组合得到抗体片段、标记抗体、抗体结合体或抗体-融合蛋白质。已发现有多种化学改性剂和酶可用于抗体改性，这些化合物和其用途均是本领域技术人员公知的。另一种得到改性或新抗体的途径是使用基因工程方法生产它们。这种方法和其应用也是本领域技术人员公知的，它们可用于生产诸如抗体片段或抗体-融合产物。由基因工程方法得到的改性或新的抗体也属于本发明的保护范围。
一组有价值的亲合配位体-载体基质结合物用通式(IX)表示：
Figure C9619784900321
其中，R1、R4、R5、R6、M、Q、n和p定义与前述相同，j为整数2-20。
一组特别有价值的亲合配位体-载体基质结合物可用通式(X)表示：
Figure C9619784900322
其中j和M与前述定义相同。
通常，将通式(XI)的化合物与3-丙氧基-(1，2-环氧)琼脂糖在10-30℃及酸结合剂存在下反应得到新的亲合配位体-基质结合物，其在纯化蛋白类物质中有杰出的价值。这些新的亲合配位体-基质结合物对免疫球蛋白族蛋白质具有很高的亲合性。这种独特的性能使其在分离、提取、纯化、表征鉴定、鉴别或定量此类蛋白质中具有独特的价值。
在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及通式(XII)的新亲合配位体(XII)：其中R1、R4、R5、R6、Q、X、Y、Z、n和p与前述定义相同，卤素为氟、氯、溴或碘原子。
进而，本发明涉及一种上述通式(XII)的新亲合配位体联接至上述通式(V)的基质的方法，该方法是将新亲合配位体与基质在-20℃至121℃下进行反应，反应中可存在或不存在酸结合剂。
在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及通式(XIII)的新亲合配位体：其中R1、R4、R5、R6、Q、X、Y、Z、m、n和p与前述定义相同，j为整数2-20。
此外，本发明涉及一种上述通式(XIII)的新亲合配位体的制备方法，该方法是将上述通式(XII)的化合物与通式H2N-(CH2)j-NH2的亚烷基二胺在0-100℃及酸结合剂存在下进行反应。
在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及通式(XIV)的新亲合配位体：
Figure C9619784900333
其中R1、R4、R5、Q、X、Y、Z、m、n和p与前述定义相同，q为0或1，j为整数2-20。
进而，本发明涉及一种上述通式(XIV)的新亲合配位体的制备方法，该方法是将上述通式(XII)的化合物与通式H2N-(CH2)j-(CO)q-OH氨基羟基化合物在0-100℃下进行反应，反应中可存在或不存在酸结合剂。
在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及上述通式(VIII)的新亲合配位体，其中R1、R4、R5、R6、L、Q、T、V、X、Y、Z、m、n和p与前述定义相同；R9为氢原子或1-6个碳原子的烷基；R10为羰基、亚甲基、-NH-CH2-基团或-S-CH2-；优选L为乙基、丁基或己基，优选T为-NH-基团，优选V为-NH-基团，m优选为1。
在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及通式(XV)的新亲合配位体：其中R1、R4、R5、R6、Q、n和p与前述定义相同。
在本发明的另一个实施方案中，本发明涉及通式(XVI)的新亲合配位体：
Figure C9619784900342
其中R1、R4、R5、R6、Q、n和p与前述定义相同，j为整数2-20。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明涉及通式(XII)、(XIII)、(XIV)、(VIII)、(XV)和(XVI)的亲合配位体，其中R1为苯基或萘基，它们任一种的苯环或萘环可被一种或多种独立地选自羟基和羧酸基的取代基取代或未被取代。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明涉及通式(XII)、(XIII)、(XIV)、(VIII)、(XV)和(XVI)的亲合配位体，其中R4氢原子、羟基、羧酸基或氨基。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明涉及通式(XII)、(XIII)、(XIV)、(VIII)、(XV)和(XVI)的亲合配位体，其中R5为氢原子、羟基、羧酸基或氨基。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明涉及通式(XII)、(XIII)、(XIV)、(VIII)、(XV)和(XVI)的亲合配位体，其中R6为氢原子、羟基、羧酸基或氨基。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明涉及通式(XII)、(XIII)、(XIV)、(VIII)、(XV)和(XVI)的亲合配位体，其中Q为苯环或萘环。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明涉及通式(XII)、(XIII)、(XIV)和(VIII)的亲合配位体，其中X为氮原子。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明涉及通式(XII)、(XIII)、(XIV)和(VIII)的亲合配合体，其中Y为-NH-基团。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明涉及通式(XII)、(XIII)、(XIV)和(VIII)的亲合配位体，其中Z为-NH-基团。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明涉及通式(XII)、(XIII)、(XIV)、(VIII)、(XV)和(XVI)的亲合配位体，其中n为0或2。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明涉及通式(XII)、(XIII)、(XIV)、(VIII)、(XV)和(XVI)的亲合配位体，其中p为0或2。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明涉及通式(XIII)、(XIV)和(XVI)的亲合配位体，其中j为2、4或6。
在本发明的另一个优选实施方案中，本发明涉及通式(XI)的亲合配位体，其中j为整数2-20。
本发明优选的亲合配位体为：
Figure C9619784900351
Figure C9619784900361
Figure C9619784900371
Figure C9619784900381
进而，本发明涉及一种将上述通式(VII)的亲合配位体、上述通式(XIII)的亲合配位体、上述通式(XVI)的亲合配位体或上述通式(XI)的亲合配位体联接至碳水化合物或有机聚合物基质的方法，该方法包括使碳水化合物或有机聚合物基质与活化剂反应，再将活化的基质与新的亲合配位体反应，反应过程中存在或不存在酸结合剂。本发明也涉及一种将上述通式(XIV)的新亲合配位体联接至碳水化合物或有机聚合物基质的方法，该方法是通过与基质缩合。本发明还涉及一种将上述通式(VII)的亲合配位体、上述通式(XIII)的亲合配位体、上述通式(XVI)的亲合配位体或上述通式(XI)的亲合配位体联接至选择性地用有机聚合物涂覆的金属氧化物、玻璃或二氧化硅基质的方法，该方法包括使选择性地涂覆过的金属氧化物、玻璃或二氧化硅基质与活化剂反应，再将活化的基质与新的亲合配位体反应，反应过程中存在或不存在酸结合剂。本发明的另一个实施方案涉及一种将上述通式(XIV)的新亲合配位体联接至选择性地用有机聚合物涂覆的金属氧化物、玻璃或二氧化硅基质的方法，该方法是通过与基质缩合。本发明还涉及一种将上述通式(XV)的亲合配位体、上述通式(XII)的亲合配位体联接至上述通式(V)的基质的方法，该方法通过使新亲合配位体基质在-20℃至121℃下反应，反应过程中存在或不存在酸结合剂。本发明还涉及如上述方法中所述制备的所有亲合配位体-基质结合物。
本发明还涉及本发明的亲合配位体和包含这种本发明的亲合配位体的的亲合配位体-基质结合物在分离、提取、纯化、表征鉴定、鉴别或定量蛋白质或蛋白类物质中的应用，蛋白类物质如免疫球蛋白或其亚类、片段、前体或衍生物，不论其来自天然来源或重组来源，其实例如免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)或其亚类、片段、前体或衍生物，不论其来自天然来源或重组来源。本发明还涉及对免疫球蛋白进行分离、提取、纯化、表征鉴定、鉴别或定量的方法，该方法包括通过任一种方法在pH值为5.0-12.0的条件下将免疫球蛋白与本发明的亲合配位体-基质结合物结合，随后通过将pH值降至4.9或更低而将其除去、洗脱或解吸。
本发明还涉及分离或纯化蛋白类物质的方法，该方法包括使用如上定义的通式配位体作为生物特异性配位体来进行亲合色谱处理。
本发明还涉及本发明的亲合配位体和包含这种本发明的亲合配位体的的亲合配位体-基质结合物在分离、提取、纯化、表征鉴定、鉴别或定量胰岛素、其类似物、衍生物、片段和前体，不论其来自天然来源或重组来源，以及因子VII或人生长激素，或其类似物、其衍生物、其片段及前体中的应用。
作为实例，设计了包含超过60种不同配位体的一系列物质。用部分纯化了的胰岛素前体对其进行筛选，并通过固定相合成而将选择的配位体固体在琼脂糖上。根据偶合技术、间隔臂长度和性质、配位体密度等对基质进行优化，使3原型动态结合容量为2-5mg/ml。在相当温和的条例下，通过单一模拟亲合纯化步骤，从澄清的酵母发酵培养基中纯化重组得到的胰岛素前体至纯度超过95％。
因此，本发明的亲合配位体和包含本发明这种亲合配位体的亲合配位体-基质结合物的特别优选的用途是纯化胰岛素和其类似物、衍生物和片段及前体，而不论其来自天然来源或重组来源。用于此用途的特别优选的亲合配位体-基质结合物包括选自下述的配位体：
Figure C9619784900401
如上所述配位体在位置(A)处联接至载体基质，选择性地通过如上定义的通式(b)表示的间隔臂进行所述联接。优选配位体为11a，优选载体基质为选择性地活化的琼脂糖、纤维素、二氧化硅或玻璃。
本发明还涉及对胰岛素或胰岛素类似物，其衍生物、其前体进行分离、提取、纯化、表征鉴定、鉴别或定量的方法，该方法是通过任一种方法在pH值为4.0-9.0的条件下将胰岛素胰岛素衍生物、类似物、其前体与本发明的亲合配位体-基质结合物结合，随后通过将pH值降至3.99或更低，或者增至9.01或更高而将其除去、洗脱或解吸。洗脱过程例如也可通过降低离子强度或加入溶剂如有机溶剂实现。
参考下述实施例，进一步详细说明本发明。这些实施例仅用于说明目的，而非对本发明保护范围的限定。
                         实施例1
本实施例说明通过使通式(II)的卤代杂环化合物与通式(III)和(IV)化合物反应合成典型的所定义的亲合配位体。
将苯胺(19.8份)溶解于丙酮(50份)中，将另一种溶液倾入该溶液形成悬浮液，所说另一种溶液其是通过将氰尿酰氯(36.8份)的丙酮(200份)溶液加入冰(50份)与水(50份)的混合物中形成的。将得到的混合物搅拌2小时，期间通过加入碳酸氢钠(16.8份)的水(300份)溶液保持pH值在6-7。最后，滤出沉淀2-苯胺基-4，6-二氯-1，3，5-三嗪，用水洗涤，真空干燥，用二氯甲烷结晶。
将酪胺(2.74份)的丙酮(50份)和水(10份)溶液加入2-苯胺基-4，6-二氯-1，3，5-三嗪(4.82份)的丙酮(100份)溶液。将混合物加热至50℃，保温2小时，同时通过加入碳酸氢钠(1.68份)的水(30份)溶液保持pH值在6-7。最后，滤出沉淀2-苯胺基-4-[β-(4′-羟基苯基)-乙氨基]-6-氯-1，3，5-三嗪，用水洗涤，真空干燥。
                        实施例2
本实施例说明实施例1的产物对固相载体的固定化过程。
通过溶剂交换，使用30％丙酮的水溶液(100份)，再用70％丙酮的水溶液(100份)，再用丙酮(100份)，将负载氨基的琼脂糖(10份)转移至丙酮溶剂中。将2-苯胺基-4-[β-(4′-羟基苯基)-乙氨基]-6-氯-1，3，5-三嗪(1份)溶解于丙酮(20份)中，并升温至50℃。将这种热丙酮溶液加入负载氨基的琼脂糖衍生物的丙酮悬浮液中。向形成的悬浮液中加入碳酸氢钠(0.42份)的水(5份)溶液，将混合物在50℃下搅拌16小时。最后，洗涤琼脂糖载体基质至无未与丙酮键合的2-苯胺基-4-[β-(4′-羟基苯基)-乙氨基]-6-氯-1，3，5-三嗪。形成的衍生亲合载体再转移回水中，这是通过首先用70％的丙酮水溶液洗涤，再用30％的丙酮水溶液洗涤，最后用水洗涤。
                       实施例3
本实施例说明实施例2所述新亲合基质作为对免疫球蛋白特异的色谱基质的应用。
用pH值为7且浓度为10mmol/l的磷酸缓冲水溶液(3.75份)稀释人血浆(1.25份)，并将其施加至含由实施例2所述过程制备的亲合基质(1份)的柱子上。该亲合柱用磷酸缓冲液进行洗涤，直至洗液的UV检测值表明所有未键合的蛋白质已除去。然后，用pH值为3.8且浓度0.2mmol/l的柠檬酸缓冲液洗涤亲合基质，直至洗液的UV检测值表明除去已结合的蛋白质的过程已停止。包含于洗液中的蛋白质显示出为免疫球蛋白G。
表1给出了本发明的新亲合配位体的进一步实施例，这些实施例可以按照实施例1的方法制备，只是实施例1中采用的氰尿酰氯(36.8份)用列于表中第II列相应量的卤代杂环化合物代替；实施例1中采用的苯胺(19.8份)用列于表中第III列相应量的胺代替；实施例1中采用的酪胺(2.74份)用列于表中第IV列相应量的胺代替。实施例的序列数列于表的第I列。
                          表1
    I     II     III     IV
    4  5-氰基-2，4，6-三氯嘧啶     苯胺     酪胺
    5  5-氰基-2，4，6-三氟嘧啶   苯胺   酪胺
    6     氰尿酰氯   酪胺   酪胺
    7     氰尿酰氯   苯胺   4-羟基苄基胺
    8     氰尿酰氯   苯胺   苄基胺
    9     氰尿酰氯   N-甲基-苯胺   4-羟基苄基胺
   10     氰尿酰氯   对茴香胺   对氨基苯酚
   11     氰尿酰氯   苯胺   4-乙酰氨基苄基胺
   12     氰尿酰氯   对甲苯胺   酪胺
   13     氰尿酰氯   对氯苯胺   酪胺
   14     氰尿酰氯   对氨基苯酚   酪胺
   15     氰尿酰氯   环己基胺   酪胺
   16     氰尿酰氯   β-苯基乙基胺   酪胺
   17     氰尿酰氯   4-羟基苄基胺   酪胺
   18     氰尿酰氯   4-羟基苄基胺   4-羟基苄基胺
   19     氰尿酰氯   苄基胺   酪胺
   20     氰尿酰氯   酪胺   3-甲基磺酰苯胺
   21     氰尿酰氯   N-叔丁基-苄基胺   酪胺
   22     氰尿酰氯   N-异丙基苄基胺   酪胺
   23     氰尿酰氯   对氨基-N-乙酰苯胺   酪胺
   24     氰尿酰氯   二异丙基胺   酪胺
   25     氰尿酰氯   苯胺   N-苄基酪胺
   26     氰尿酰氯   酪胺   N-苄基酪胺
   27     氰尿酰氯   对氨基苯甲酰胺   酪胺
   28     氰尿酰氯   对氨基苯磺酰胺   酪胺
   29     氰尿酰氯   对氨基苯甲酸   酪胺
   30     氰尿酰氯   对氨基苯甲酸   1-氨基-4-萘酚
    31     氰尿酰氯 对氨基苯酚 1-氨基-5-萘酚
    32     氰尿酰氯 对氨基苯甲酸 1-氨基-5-萘酚
    33     氰尿酰氯 对氨基苯酚 对氨基苯酚
    34     氰尿酰氯 对氨基苯甲酸 苯胺
    35     氰尿酰氯 间氨基苯甲酸 酪胺
    36     氰尿酰氯 1-氨基-5-萘酚 1-氨基-5-萘酚
    37     氰尿酰氯 间氨基苯酚 1-氨基-5-萘酚
    38     氰尿酰氯 1-氨基-4-萘酚 1-氨基-5-萘酚
通过实施例2所述的方法，可将实施例4-38所述的配位体联接至琼脂糖基质，并可用于根据实施例3所述过程纯化免疫球蛋白G。
                    实施例39
将乙二胺(6份)加至2-苯胺基-4-[β-(4′-羟基苯基)-乙基氨基]-6-氯-1，3，5-三嗪(2.5份)的甲苯(20份)溶液中，将混合物在100℃下搅拌16小时。然后通过减压蒸馏蒸出混合物中的甲苯，残余物用水(100份)洗涤5次，在70℃下干燥。
表2给出了本发明的新亲合配位体的进一步实施例，这些实施例可以按照实施例39的方法制备，只是实施例39中采用的2-苯胺基-4-[β-(4′-羟基苯基)-乙基氨基]-6-氯-1，3，5-三嗪(2.5份)用列于表2中第II列相应量的氯代三嗪代替；实施例39中采用的乙二胺用列于表2中第III列相应量的二胺或氨基羟基化合物代替。
                                 表2
    I     II     III
    40 实施例1所述的氯代三嗪     丙二胺
    41 实施例1所述的氯代三嗪     1，6-二氨基己烷
    42 实施例1所述的氯代三嗪     1，8-二氨基辛烷
    43 实施例1所述的氯代三嗪     1，9-二氨基壬烷
    44 实施例1所述的氯代三嗪     1，10二氨基癸烷
    45 实施例1所述的氯代三嗪     1，12-二氨基十二烷
    46 实施例14所述的氯代三嗪     1，6-二氨基己烷
    47 实施例30所述的氯代三嗪     1，6-二氨基己烷
    48 实施例31所述的氯代三嗪     1，6-二氨基己烷
    49 实施例33所述的氯代三嗪     1，6-二氨基己烷
    50 实施例35所述的氯代三嗪     1，6-二氨基己烷
    51 实施例38所述的氯代三嗪     1，6-二氨基己烷
    52 实施例1所述的氯代三嗪     N，N′-二甲基乙二胺
    53 实施例1所述的氯代三嗪     N-β-羟乙基乙二胺
    54 实施例1所述的氯代三嗪     哌嗪
    55 实施例1所述的氯代三嗪     乙醇胺
    56 实施例1所述的氯代三嗪     二乙醇胺
    57 实施例1所述的氯代三嗪     异丙醇胺
                      实施例58
本实施例说明实施例39生产的化合物对固相载体的固定化过程。
用水(300份)洗涤负载环氧基团的琼脂糖(60份)，再用由碳酸氢钾(5.95份)溶于甲醇(180份)和水(120份)组成的溶液(300份)洗涤。将实施例39制备的化合物(1份)溶解于甲醇(60份)中，并加到碳酸氢钾的水溶液(40份)中。将该甲醇水溶液(100份)加入制备的负载环氧基团的琼脂糖悬浮液(60份)中，将形成的悬浮液在室温下进行温和搅拌16小时。得到的基于琼脂糖的基质用甲醇(360份)与水(240份)的混合物洗涤，再用水(600份)洗涤。
                         实施例59
重复实施例3，只是含实施例2所述过程制备的亲合基质(1份)的柱用含实施例58所述过程制备的亲合基质(1份)的柱代替。包含在pH值3.8洗液中的蛋白质表明为免疫球蛋白G。
                           实施例60
本实施例说明实施例39生产的产品对固相载体的固定化过程。
用水(1050份)洗涤负载环氧基团的琼脂糖(80份)，再用30％丙酮水溶液(1050份)洗涤，再用70％丙酮水溶液(1050份)洗涤，最后用丙酮(1425份)洗涤。然后，将琼脂糖(80份)悬浮于丙酮(100份)中，将悬浮液升温至37℃。将溶于吡啶(15份)和丙酮(25份)中的对甲苯磺酰氯(15份)加至琼脂糖悬浮液中，将混合物在37℃下保温8小时。然后，将活化的琼脂糖用丙酮(225份)洗涤，再用70％的丙酮水溶液(225份)洗涤，再用30％的丙酮水溶液(225份)洗涤，最后用水(225份)洗涤。
将这种活化的基质(45份)用由碳酸氢钾(2.3份)溶于甲醇(178份)和水(47份)组成的溶液(225份)洗涤。将实施例39制备的化合物(0.75份)溶解于甲醇(45份)和包含碳酸氢钾(1.5份)的水(30份)的混合物中，制得的溶液加至活化的琼脂糖悬浮液中，将形成的混合物在室温下放置16小时。得到的亲合基质用甲醇(270份)和包含碳酸氢钾(9份)的水(180份)洗涤，再用水(450份)洗涤。
在使用之前，将所得亲合基质(115份)悬浮于氢氧化钠(0.36份)于水(45份)的溶液中。
                        实施例61
重复实施例3，只是含实施例2所述过程制备的亲合基质(1份)的柱用含实施例60所述过程制备的亲合基质(1份)的柱代替。包含在pH值3.8洗液中的蛋白质表明为免疫球蛋白G。
                      实施例62
将实施例60制备的亲合基质(10份)置于pH值为8.0的磷酸缓冲液中16小时。重复实施例3，只是所用的基质用等当量的新的亲合基质代替，采用得自鼠免疫球蛋白细胞培养基的无细胞上清液代替实施例3所用的人血浆。包含在pH值3.8洗液中的蛋白质表明也是鼠免疫球蛋白M。
表3给出了本发明的新亲合配位体的联接实施例，这些配位体可以按照实施例58的方法制备，只是实施例58中采用的新亲合配位体用列于表3中第II列相应量的新亲合配位体代替；实施例58中采用的表氯醇活化的琼脂糖(39份)用列于表3中第III列相应量的用表3第IV列的试剂活化的碳水化合物代替。
                            表3
   I     II   III     IV
  61 实施例39的配位体 琼脂糖    1，4-丁二醇二环氧甘油基醚
  62 实施例39的配位体 琼脂糖    溴化氰
  63 实施例39的配位体 琼脂糖    表氯醇
  64 实施例39的配位体 琼脂糖    偏高碘酸钠
  65 实施例39的配位体 琼脂糖    2，2，2-三氟乙磺酰氯
  66 实施例39的配位体 琼脂糖    1，1′-羰基二咪唑
  67 实施例39的配位体 琼脂糖    2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4-磺酸盐
  68 实施例39的配位体 琼脂糖    二乙烯基砜
  69 实施例39的配位体 琼脂糖    氰尿酰氯
                         实施例70
重复实施例1所述配位体的制备过程，只是用酪胺(2.74份)与2-苯氧基-4，6-二氯-1，3，5-三嗪(4.84份)的反应代替与2-苯胺基-4，6-二氯-1，3，5-三嗪(4.82份)反应，得到2-苯氧基-4-[β-(4′-羟基苯基)-乙基氨基]-6-氯-1，3，5-三嗪，它可用于用实施例2的方法制备亲合基质的过程中代替2-苯胺基-4-[β-(4′-羟基苯基)-乙氨基]-6-氯-1，3，5-三嗪。同样，通过实施例3所述的技术从人血浆中可便利地分离免疫球蛋白G。
                       实施例71
使用2-苯硫基-4，6-二氯-1，3，5-三嗪(5.16份)代替实施例70中采用的2-苯氧基-4，6-二氯-1，3，5-三嗪(4.84份)，得到2-苯硫基-4-[β-(4′-羟基苯基)-乙氨基]-6-氯-1，3，5-三嗪，它可类似地用于纯化免疫球蛋白G。
                       实施例72
本实施例说明了如实施例2和实施例58的亲合配位体-基质结合物的另一种生产方法。
在0℃下，将负载氨基乙基氨基基团的琼脂糖(10份)与丙酮(5份)及pH值为7且浓度为0.5mol/l的磷酸缓冲水溶液(5份)搅拌。向该悬浮液中加入一种溶液(2.5份，该溶液每10份丙酮含氰尿酰氯1份)，然后，将混合物在0-5℃下搅拌1小时。随后用50％的丙酮水溶液(50份)、水(50份)、50％的丙酮水溶液(50份)和水(100份)洗涤形成的二氯代三嗪活化的琼脂糖。向一种水溶液(20份，该溶液每200份水含1份的酪胺)中加入经洗涤的二氯代三嗪活化的琼脂糖，在室温下搅拌形成的悬浮液16小时。最后，用水(200份)洗涤衍生的基质，并将其加至一种水溶液(20份，该水溶液中0.55份的苯胺溶解于200份水中)中。形成的悬浮液在90℃下搅拌16小时，此后，用水(200份)洗涤得到的基质。
                      实施例73
重复实施例3，只是用含实施例2所述的制备过程中的亲合基质(1份)的柱用含实施例72所述的制备过程中的亲合基质(1份)的柱代替，包含在pH值3.8洗液中的蛋白质表明为免疫球蛋白G。
                       实施例74
本实施例说明一系列本发明的亲合配位体-基质结合物的合成，随后可进行筛选以确定它们的蛋白质结合性能。
将负载氨基的琼脂糖(1份)与pH值为7.0的1M的磷酸钾缓冲液混合在重力下沉降。将缓冲的胺化琼脂糖转移至一个反应容器中，并与pH值为7.0的0.5M的磷酸钾缓冲液(0.5份)及丙酮(0.5份)在0-5℃下混合。加入一种溶液(0.25份，该溶液中10份丙酮中包含1份氰尿酰氯)，将混合物在0-5℃下搅拌1小时，此后，过滤混合物，再用50％丙酮(10份)、水(6份)、50％丙酮(6份)和水(10份)洗涤，得到2，4-二氯-s-三嗪-6-基活化的琼脂糖。
将2，4-二氯-s-三嗪-6-基活化的琼脂糖(1份)加至5摩尔当量的表4第II列给出的胺化合物，该胺化合物溶解于2-3份的一种溶液中，所说溶液包含1份丙酮和1份水，并通过加入氢氧化钠调节pH至中性。将悬浮液在30℃下混合24小时。将形成的一氯代-s-三嗪-6-基活化的琼脂糖依次用二甲基甲酰胺(10份)、一种溶液(10份，其包含3份丙-2-醇和7份0.2M的氢氧化钠)及水(10份)洗涤，在重力下沉降。
将一氯-s-三嗪-6-基活化的琼脂糖(1份)加至5摩尔当量的表4第III列给出的胺化合物，该胺化合物溶解于2-3份的一种溶液中，所说溶液包含1份二甲基甲酰胺和1份水，并通过加入氢氧化钠调节pH至中性。将悬浮液在85-95℃下混合72小时。将形成的亲合配位体-基质结合物依次用二甲基甲酰胺(10份)、一种溶液(10份，其包含3份丙-2-醇和7份0.2M的氢氧化钠)及水(10份)洗涤，在重力下沉降。合成了一系列本发明的亲合配位体-基质结合物，其实施例在表4的第1列中列出。
                                 表4
    I     II     III
    75     1，3-二氨基丙烷     酪胺
    76     1，3-二氨基丙烷     N-苄基苯乙基胺
    77     1，4-二氨基丁烷     3-氨基苯酚
    78     1，4-二氨基丁烷     酪胺
    79     1，4-二氨基丁烷     1-氨基-5-萘酚
    80     1，4-二氨基丁烷     N-异丙基苄基胺
    81     1，4-二氨基丁烷     N-苄基苯乙基胺
    82     苯胺     二氨基丙烷
    83     苯胺     苯胺
    84     苯胺     3-氨基苯酚
    85     苯胺     3-氨基苯甲酸
    86     苯胺     酪胺
    87     苯胺     1-氨基-4-萘酚
    88     苯胺     1-氨基-2-萘酚
    89     苯胺     3-氨基-2-萘酚
    90     苯胺     1-氨基-6-萘酚
    91     苯胺     N-异丙基苄基胺-4-苯基丁基胺
    92     苯胺     N-苄基苯乙基胺
    93     3-氨基苯酚     3-氨基苯酚
    94     3-氨基苯酚     1-氨基-5-萘酚
    95     1，6-二氨基己烷     酪胺
    96     1，6-二氨基己烷     4-苯基丁基胺
    97     3-氨基苯甲酸     1-氨基-5-萘酚
    98     酪胺     酪胺
    99     酪胺     1-氨基-5-萘酚
   100     酪胺     1-氨基-7-萘酚
   101     酪胺     1-氨基-6-萘酚
   102     1-氨基-5-萘酚     苯胺
   103     1-氨基-5-萘酚     3-氨基苯酚
   104     1-氨基-5-萘酚     4-氨基苯甲酸
   105     1-氨基-5-萘酚     3，5-二氨基苯甲酸
   106     1-氨基-5-萘酚     苄基胺
   107     1-氨基-5-萘酚     酪胺
   108     1-氨基-5-萘酚     1-氨基-5-萘酚
   109     1-氨基-7-萘酚     3-氨基苯酚
   110     1-氨基-7-萘酚     1-氨基-7-萘酚
   111     1-氨基-4-萘酚     3-氨基苯酚
   112     1-氨基-4-萘酚     1-氨基-4-萘酚
   113     1-氨基-2-萘酚     3-氨基苯酚
   114     1-氨基-2-萘酚     1-氨基-2-萘酚
   115     -3-氨基-2-萘酚     3-氨基苯酚
   116     3-氨基-2-萘酚     3-氨基-2-萘酚
   117     1-氨基-6-萘酚     3-氨基苯酚
   118     1-氨基-6-萘酚     1-氨基-6-萘酚
   119     2-氨基-1-萘酚     3-氨基苯酚
   120     2-氨基-1-萘酚     2-氨基-1-萘酚
   121     6-氨基-1-萘酚     3-氨基苯酚
   122     6-氨基-1-萘酚     6-氨基-1-萘酚
   123     1-氨基-6-萘磺酸     3，5-二氨基苯甲酸
   124     1-氨基-6-萘磺酸     苄基胺
  125     1-氨基-6-萘磺酸     酪胺
  126     3-氨基-2-萘甲酸     3-氨基苯酚
  127     3-氨基-2-萘甲酸     3-氨基-2-萘甲酸
                        实施例128
本实施例说明了筛选方法，采用该方法可以鉴别实施例74所述的亲合配位体-基质结合物的蛋白结合性能。
在总体积为1ml的色谱柱中填充入实施例75-127的亲合配位体-基质结合物。这些柱通过用pH值为8.0的50mM的磷酸钠缓冲溶液10ml冲洗而平衡。向每个色谱柱中施加一种1ml溶液，该溶液为pH值为8.0，50mM的磷酸钠缓冲溶液，包含1.5mg/ml的人IgG，随后用10ml pH值为8.0的50mM的磷酸钠缓冲溶液洗涤色谱柱以除去未结合的IgG。用pH值为3.0，50mM的柠檬酸钠缓冲溶液5ml冲洗每个色谱柱以洗脱结合的IgG。通过测量280nm处基于缓冲基底的吸收率来确定洗液和洗脱液馏分中IgG的含量。分析结果表明，实施例75-127的亲合配位体-基质结合物均展示出人IgG结合性。其中，实施例92、99、101、102、103、111、113和119的亲合配位体-基质结合物均达到对结合的IgG的几乎定量洗脱，因而，这些亲合配位体-基质结合物被认为在人IgG的分离、提取或纯化方法具有独特的价值。
                      实施例129
对来自细胞培养基并施加于实施例181的亲合基质上的重组凝固因子
                VIIa(rFVIIa)的选择性结合和洗脱过程：
将实施例181制备的沉降体积0.85ml的亲合基质填充入5×50mm的柱子(Pharmacia HR 5/5)中，用20ml的缓冲液A进行平衡，缓冲液A为20mMTris，50mM NaCl，5mM CaCl2，pH 8.0。
向填充柱中施加富含1.4mg rFVIIa的5ml的调制的BHK细胞培养上清液。
用10ml缓冲液A洗去未结合的蛋白质后，用5ml缓冲液B洗脱rFVIIa，缓冲液B为20mM柠檬酸三钠，50mM Tris pH 8.0。
在色谱处理过程中的流速为0.3ml/分钟。
将柱流出物通入在线型UV检测仪中，并以1ml为单位收集流出物，采用分析反相高效液相色谱(RP-HPLC)对每一份流出物分析其rFVIIa含量和总蛋白质含量。结果：
UV检测结果表明，在施加上清液过程中及随后用缓冲液A进行洗涤期间，大多数UV(280nm)吸收物质排出。而在随后用缓冲液B的洗脱过程中，检测出特殊峰，这与施加的rFVIIa含量预期值相匹配。
对收集到的流出物的RP-HPLC分析表明，在用缓冲液B洗脱过程中，90％施加的rFVIIa排出进入流出物中。在这些流出物中rFVIIa的纯度大于95％。
结果表明，实现了来自富集培养基的rFVIIa对所用的配位体的选择性结合。
                         实施例130实施例171的亲合配位体-基质结合物对胰岛素B-链1-29-A-A-K-胰岛素A-
                     链1-21的纯化
将225mg的胰岛素B-链1-29-Ala-A1a-Lys-胰岛素A-链1-21(批次A202558)悬浮于51ml的水中。加入10滴1M的乙酸以增溶该前体。加入pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾至总体积为510ml，形成一种0.12mg/ml(用RP-HPLC分析)的溶液。测得的pH值为5.53，离子强度为30.0mS/cm，氧化还原电位为273mV。
将上述溶液400ml施加至Pharmacia K16(1.6×6cm)柱中，该柱中填充有12ml的上述基质结合物，在室温下用pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾以1.8ml/分钟进行平衡。色谱柱用pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾50ml洗涤，再用0.1M乙酸洗脱，速度为1.8ml/分钟。收集每份5.0ml的12份流出物。
用50ml的0.5M NaOH清洁色谱柱，用50ml的0.1M柠檬酸，60％体积/体积乙醇再生色谱柱。
分析之前用2M乙酸稀释用于RP-HPLC分析的样品。
样品 鉴定 M13浓度 体积 含量 ％
  施加物   E091b  0.12mg/ml   400ml  48.8mg     100
  流通液   E091c  0.00mg/ml  0.0mg     0
  洗涤液   E093a  0.00mg/ml  0.0mg     0
  流出物3   E093b  0.01mg/ml   5.0ml  0.1mg
  流出物4   E093c  5.00mg/ml   5.0ml  25.0mg
流出物5   E093d  2.62mg/ml   5.0ml  13.1mg
流出物6   E093e  0.52mg/ml   5.0ml  2.6mg
所有流出物  40.8mg     83
总回收率为83％。
经RP-HPLC分析，产物的纯度为94％。其余的杂质为相关的胰岛素。
                       实施例131
实施例171的亲合配位体-基质结合物对des-ThrB30胰岛素的纯化
将150mg的des-ThrB30胰岛素(INS-J-009)沉淀悬浮于50ml的水中。加入5滴2M的乙酸以增溶该悬浮液。加入pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾至总体积为500ml，形成一种0.076mg/ml(用RP-HPLC分析)的溶液。测得的pH值为5.52，离子强度为30.0mS/cm，氧化还原电位为264mV。
将上述溶液400ml施加至Pharmacia K16(1.6×6cm)柱中，该柱中填充有12ml的上述基质结合物，在室温下用pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾以1.8ml/分钟进行平衡。色谱柱用pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾50ml洗涤，再用0.1M乙酸洗脱，速度为1.8ml/分钟。收集每份为5.0ml的10份流出物。
用50ml的0.5M NaOH清洁色谱柱，用50ml的0.1M柠檬酸，60％体积/体积乙醇再生色谱柱。
分析之前用2M乙酸稀释用于RP-HPLC分析的样品。
  样品   鉴定  M13浓度   体积    含量     ％
  施加物   E105a  0.076mg/ml   400ml   30.0mg     100
  流通液   E105b  0.00mg/ml   0.0mg     0
  洗涤液   E105d  0.00mg/ml   0.0mg     0
  流出物3   E105e  0.00mg/ml   5.0ml   0.0mg     0
  流出物4   E105f  0.41mg/ml   5.0ml   2.1mg
  流出物5   E105n  1.93mg/ml   5.0ml   9.7mg
  流出物6   E105o  1.14mg/ml   5.0ml   5.7mg
  流出物7   E105p  0.48mg/ml   5.0ml   2.4mg
  流出物8   E105j  0.31mg/ml   5.0ml   1.6mg
  所有流出物   21.5mg   71％
总回收率为71％。
经RP-HPLC分析，产物的纯度为91％。其余的杂质为相关的胰岛素。
                        实施例132实施例145的亲合配位体-基质结合物对胰岛素B-链1-29-A-A-K-胰岛素A-
                    链1-21的纯化
用5M NaOH将21经离心的培养液(批次628)调节至pH值为5.5，用Leitz Teifenfilter(Seitz EK)过滤器对其过滤，再用Leitz Teifenfilter(Seitz EKS)过滤器对其过滤。用RP-HPLC测得其浓度0.006mg/ml。测量的离子强度为12.2mS/cm，氧化还原电位为316mV。
将上述溶液1000ml施加至Pharmacia K16(1.6×6cm)柱中，该柱中填充有12ml的上述基质结合物，在室温下用pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾以1.8ml/分钟进行平衡。色谱柱用pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾50ml洗涤，再用0.1M乙酸洗脱，速度为1.8ml/分钟。收集每份为5.0ml的11份流出物。
用50ml的0.5M NaOH清洁色谱柱，用50ml的0.1M柠檬酸，60％体积/体积乙醇再生色谱柱。
分析之前用2M乙酸稀释用于RP-HPLC分析的样品。
  样品   鉴定  M13浓度   体积   含量     ％
  施加物   E111e  0.006mg/ml  1000ml   6.0mg     100
  流通液   E115a  0.00mg/ml   0.0mg     0
  洗涤液   E115b  0.00mg/ml   0.0mg     0
  流出物3   E115c  0.00mg/ml   5.0ml   0.0mg     0
  流出物4   E115d  0.58mg/ml   5.0ml   2.9mg
  流出物5   E115e  0.11mg/ml   5.0ml   0.6mg
  流出物6   E115f  0.04mg/ml   5.0ml   0.2mg
  流出物7   E115g  0.02mg/ml   5.0ml   0.1mg
  所有流出物   3.8mg     63
总回收率为63％。
经RP-HPLC分析，产物的纯度为88％。其余的杂质为相关的胰岛素。
                     实施例133实施例171的亲合配位体-基质结合物对胰岛素B-链1-29-A-A-K-胰岛素A-
                     链1-21的纯化
用5M NaOH将21经离心的培养液(批次628)调节至pH值为5.5，用Leitz Teifenfilter(Seitz EK)过滤器对其过滤，再用Leitz Teifenfilter(Seitz EKS)过滤器对其过滤。用RP-HPLC测得其浓度为0.006mg/ml。测量的离子强度为12.2mS/cm，氧化还原电位为316mV。
将上述溶液1000ml施加至Pharmacia K16(1.6×6cm)柱中，该柱中填充有12ml的上述基质结合物，在室温下用pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾以1.8ml/分钟进行平衡。色谱柱用pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾50ml洗涤，再用0.1M乙酸洗脱，速度为1.8ml/分钟。收集每份为5.0ml的11份流出物。
用50ml的0.5M NaOH清洁色谱柱，用50ml的0.1M柠檬酸，60％体积/体积乙醇再生色谱柱。
分析之前用2M乙酸稀释用于RP-HPLC分析的样品。
    样品    鉴定   M13浓度   体积   含量     ％
  施加物   E111e  0.006mg/ml   830ml   5.0mg     100
  流通液   E113a  0.00mg/ml   0.0mg     0
  洗涤液   E113b  0.00mg/ml   0.0mg     0
  流出物3   E113c  0.00mg/ml   5.0ml   0.0mg     0
  流出物4   E113d  0.58mg/ml   5.0ml   2.9mg
  流出物5   E113e  0.10mg/ml   5.0ml   0.5mg
  流出物6   E113f  0.04mg/ml   5.0ml   0.2mg
  流出物7   E113g  0.02mg/ml   5.0ml   0.1mg
所有流出物   3.7mg     74
总回收率为74％。
经RP-HPLC分析，产物的纯度为86％。其余的杂质为相关的胰岛素。
                        实施例134实施例171的亲合配位体-基质结合物对EEAEPK-胰岛素B-链1-29-A-A-K-胰
                  岛素A-链1-21的纯化
经离心的酵母培养液(批次Y44)用Leitz Teifenfilter(Seitz EK)过滤器对其过滤，RP-HPLC测得其浓度为0.35mg/ml。测得pH值为5.27，离子强度为7.38mS/cm，氧化还原电位为221mV。
将上述溶液120ml施加至Pharmacia K16(1.6×6cm)柱中，该柱中填充有12ml的上述基质结合物，在室温下用pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾以1.8ml/分钟进行平衡。色谱柱用pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾50ml洗涤，再用0.1M乙酸洗脱，速度为1.8ml/分钟。收集每份为5.0ml的11份流出物。
用50ml的0.5M NaOH清洁色谱柱，用50ml的0.1M柠檬酸，60％体积/体积乙醇再生色谱柱。
分析之前用2M乙酸稀释用于RP-HPLC分析的样品。
  样品   鉴定  M13浓度   体积   含量     ％
  施加物   E127b  0.35mg/ml   120ml   42.0mg     100
  流通液   E127c  0.00mg/ml   0.0mg     0
  洗涤液   E127d  0.00mg/ml   0.0mg     0
  流出物3   E127e  2.26mg/ml   5.0ml   11.3mg
  流出物4   E127f  2.07mg/ml   5.0ml   10.4mg
  流出物5   E127g  1.12mg/ml   5.0ml   5.6mg
  流出物6   E127h  1.27mg/ml   5.0ml   6.4mg
  所有流出物   33.6mg   79％
总回收率为79％。
经RP-HPLC分析，产物的纯度为93％。其余的杂质为相关的胰岛素。
                     实施例135实施例171的亲合配位体-基质结合物对[AspB28]-胰岛素B-链1-29-A-A-K-胰
                  岛素A-链1-21的纯化
用5M NaOH将经离心的培养液(批次GSG9414)调节至pH值为5.5，用Leitz Teifenfilter(Seitz EK)过滤器对其过滤，再用Leitz Teifenfilter(Seitz EKS)过滤器对其过滤。用RP-HPLC测得其浓度为0.06mg/ml。测得离子强度为17.0mS/cm，氧化还原电位为308mV。
将上述溶液800ml施加至Pharmacia K16(1.6×6cm)柱中，该柱中填充有12ml的上述基质结合物，在室温下用pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾以1.8ml/分钟进行平衡。色谱柱用pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾50ml洗涤，再用0.1M乙酸洗脱，速度为1.8ml/分钟。收集每份为5.0ml的11份流出物。
用50ml的0.5M NaOH清洁色谱柱，用50ml的0.1M柠檬酸，60％体积/体积乙醇再生色谱柱。
分析之前用2M乙酸稀释用于RP-HPLC分析的样品。
样品 鉴定 M13浓度 体积 含量 ％
  施加物   E107b  0.02mg/ml   800ml   16.0mg     100
  流通液   E107c  0.00mg/ml   0.0mg     0
  洗涤液   E107d  0.00mg/ml   0.0mg     0
  流出物2   E109a  0.00mg/ml   5.0ml   0.0mg     0
  流出物3   E109b  0.12mg/ml   5.0ml   0.6mg
  流出物4   E109c  0.76mg/ml   5.0ml   3.8mg
  流出物5   E109d  1.04mg/ml   5.0ml   5.2mg
  流出物6   E109e  0.31mg/ml   5.0ml   1.6mg
  流出物7   E109f  0.10mg/ml   5.0ml   0.5mg
  流出物8   E109g  0.06mg/ml   5.0ml   0.3mg
所有流出物   12mg   75％
总回收率为75％。
经RP-HPLC分析，产物的纯度为84％。其余的杂质为相关的胰岛素。
                       实施例136
本实施例进一步说明了筛选方法，采用该方法可以鉴别本发明的亲合配位体-基质结合物的蛋白结合性能。
按照实施例74合成一系列的亲合配位体-基质结合物，只是5摩尔当量表4第II列的胺化合物被相当量的表5第II列的胺化合物代替，5摩尔当量表4第III列的胺化合物被相当量的表5第III列的胺化合物代替。合成了一系列本发明的亲合配位体-基质结合物，其实例在表5的第I列得到鉴别。
在总体积为1ml的色谱柱中填充入实施例137-180的亲合配位体-基质结合物。这些柱通过用pH值为5.0的0.2M的乙酸钠，0.1M的氯化钠缓冲溶液10ml冲洗而平衡。向每个色谱柱中施加一种12ml澄清的含50mg/ml人胰岛素前体的发酵培养液，随后用12ml pH值为5.0的0.2M的乙酸钠，0.1M的氯化钠缓冲溶液洗涤色谱柱以除去未结合的物质。用2M的乙酸3ml冲洗每个色谱柱以洗脱结合的人胰岛素前体。流通液、洗涤液和洗脱流出物中人胰岛素前体的含量用高效液相色谱(HPLC)测定，使用C18反相硅胶柱(4×25mm)，溶剂体系包括缓冲液A(0.2M硫酸钠，40mM磷酸和10％(体积/体积)乙腈，pH2)和缓冲液B(50％(体积/体积乙腈))，流速为1ml/分钟，缓冲液A与缓冲液B的比例为55％∶45％。人胰岛素前体的洗脱时间经比较参考标准而确定。
分析结果表明，实施例139、140、145、148、153、159、162、163、164、166、167、170、171、173的亲合配位体-基质结合物均可结合人胰岛素前体，它们可在本实施例所述的条件下洗脱。因此，实施例139、140、145、148、153、159、162、163、164、166、167、170、171、173的亲合配位体-基质结合物被认为在分离、提取或纯化人胰岛素前体方面具有独特的价值。
                                   表5
    I     II     III
    137     1-氨基-6-萘磺酸     苄基胺
    138     1-氨基-6-萘磺酸     3，5-二氨基苯甲酸
    139     1-氨基-5-萘酚     苄基胺
    140     1-氨基-5-萘酚     3，5-二氨基苯甲酸
    141     苄基胺     3-氨基苯甲酸
    142     苄基胺     4-氨基苯甲酸
    143     酪胺     3-氨基苯甲酸
    144     酪胺     4-氨基苯甲酸
    145     1-氨基-5-萘酚     1-氨基-5-萘酚
    146     1-氨基-5-萘酚     3-氨基苯甲酸
    147     1-氨基-5-萘酚     4-氨基苯甲酸
    148     1-氨基-5-萘酚     酪胺
    149     1-氨基-6-萘磺酸     酪胺
    150     1-氨基-5-萘酚     3-氨基-1，2-丙二醇
    151     1-氨基-5-萘酚     3-氨基丙-1-醇
    152     1-氨基-5-萘酚     5-氨基戊-1-醇
    153     1-氨基-5-萘酚     3-氨基苯酚
    154     1-氨基-5-萘酚     6-氨基己酸
    155     1-氨基萘     苄基胺
    156     1-氨基萘     3，5-二氨基苯甲酸
    157     1-氨基萘     3-氨基苯甲酸
    158     1-氨基萘     4-氨基苯甲酸
    159     3-氨基-2-萘甲酸     3-氨基苯酚
    160     4-氨基-1-萘酚     3-氨基苯酚
    161     1-氨基-2-萘酚     3-氨基苯酚
    162     3-氨基-2-萘酚     3-氨基苯酚
    163     1-氨基-6-萘酚     3-氨基苯酚
    164     1-氨基-7-萘酚     3-氨基苯酚
    165     2-氨基-1-萘酚     3-氨基苯酚
    166     6-氨基-1-萘酚     3-氨基苯酚
    167     3-氨基-2-萘甲酸     3-氨基-2-萘甲酸
    168     4-氨基-1-萘酚     4-氨基-1-萘酚
    169     1-氨基-2-萘酚     1-氨基-2-萘酚
    170     3-氨基-2-萘酚     3-氨基-2-萘酚
    171     1-氨基-7-萘酚     1-氨基-7-萘酚
    172     2-氨基-1-萘酚     2-氨基-1-萘酚
    173     6-氨基-1-萘酚     6-氨基-1-萘酚
    174     3-氨基-2-萘甲酸     1-氨基-5-萘酚
    175     3-氨基-2-萘甲酸     4-氨基-1-萘酚
    176     3-氨基-2-萘甲酸     2-氨基-1-萘酚
    177     1-氨基-7-萘酚     1-氨基-5-萘酚
    178     1-氨基-7-萘酚     3-氨基-2-萘甲酸
    179     1-氨基-7-萘酚     4-氨基-1-萘酚
    180     1-氨基-7-萘酚     2-氨基-1-萘酚
                       实施例181
本实施例说明了本发明的亲合配位体-基质结合物的合成方法，这些亲合配位体-基质结合物对于纯化因子VII是有益的。
按照实施例74合成一系列本发明的亲合配位体-基质结合物，只是5摩尔当量表4第II列的胺化合物被相当量的2-氨基苯并咪唑取代，5摩尔当量表4第III列的胺化合物被相当量的3-氨基-2-萘甲酸取代。这种亲合配位体-基质结合物可用于按照本发明的实施例129纯化因子VIIa。
                      实施例182实施例171的亲合配位体-基质结合物对EEAEPK-胰岛素B-链1-29-A-A-K-胰
                   岛素A-链1-21的纯化
将50ml经离子交换纯化的胰岛素前体(EEAEPK-胰岛素B-链1-29-A-A-K-胰岛素A-链1-21，2.2mg/ml)施加至Pharmacia K16(1.6×6cm)柱中，该柱中填充有12ml的上述基质结合物，在室温下用pH值为5.5的0.2M的柠檬酸钾以1.8ml/分钟进行平衡。色谱柱用pH值为5.5的0.1M的柠檬酸钾、0.2M硫酸钾50ml洗涤，再用0.1M乙酸洗脱，速度为1.8ml/分钟。收集5.0ml流出物。
用50ml的0.5M NaOH清洁色谱柱，用50ml的0.1M柠檬酸，60％v/v乙醇再生色谱柱。
分析之前用2M乙酸稀释用于RP-HPLC分析的样品。
  样品   鉴定  M13浓度   体积   含量     ％
施加物 R-029e  2.27mg/ml   50ml   114mg     100
流通液 R-033a  0.03mg/ml   50ml   1.4mg     1.2
洗涤液 R-033b  0.09mg/ml   50ml   4.3mg     3.8
池(pool)1 R-033c  5.61mg/ml   15ml   84.2mg     74
    池2 R-033d  0.55mg/ml   10ml   5.5mg     4.8
结果表明，基质的动态结合容量为9.5mg/ml，前体的回收率为88％。

Claims (63)

1、亲合配位体-基质结合物，包含一种具有下述式(a)的配位体：
Figure C9619784900021
其中
R1为氢原子、1-6个碳原子的烷基、1-6个碳原子的羟基烷基、环己基、氨基、苯基、萘基、1-苯基吡唑基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并茲唑基或苯并咪唑基，苯、萘、1-苯基吡唑、吲唑、苯并噻唑、苯并茲唑或苯并咪唑环的每一个可被一个或多个取代基取代或未被取代，所述取代基独立地选自1-6个碳原子的烷基、1-6个碳原子的烷氧基、1-6个碳原子的酰氧基或酰氨基、氨基、羟基、羧酸基、磺酸基、氨基甲酰基、氨磺酰基、1-6个碳原子的烷基磺酰基和卤原子；
Y为氧原子、硫原子或基团N-R2；
Z为氧原子、硫原子或基团N-R3；
R2和R3彼此独立地为氢原子、1-6个碳原子的烷基、1-6个碳原子的羟基烷基、苄基或β-苯基乙基；
R4、R5和R6彼此独立地为氢原子、羟基、1-6个碳原子的烷基、1-6个碳原子的烷氧基、氨基、1-6个碳原子的酰氧基或酰氨基、羧酸基、磺酸基、氨基甲酰基、氨磺酰基、1-6个碳原子的烷基磺酰基和卤原子；
X之一表示氮原子，而其它X表示氮原子或携带氯原子或氰基的碳原子；
Q为苯、萘、1-苯基吡唑、吲唑、苯并噻唑、苯并茲唑或苯并咪唑环；
n为整数0-6；
p为整数0-20；该配位体在位置(A)处联接至载体基质，选择性地通过在基质与配位体间插入的间隔臂进行所述联接，
但需式(a)不包括化合物4-氯-2，6-二(苯基-氨基)-1，3，5-三嗪-3′-磺酸、4-氯-2，6-二(苯基-氨基)-1，3，5-三嗪-3′，2″-二磺酸、和4-氯-2-(4″-氨基-苯基-氨基)-1，3，5-三嗪-3′，2″-二磺酸与葡聚糖T500的反应产物。
2、根据权利要求1的亲合配位体-基质结合物，其中在基质与配位体间插入的选择性间隔臂由通式(b)表示：
       -T-[-L-V-]m    (b)其中
T为氧原子、硫原子或基团N-R7；其中R7为氢原子或1-6个碳原子的烷基；
V为氧原子、硫原子、-COO-基团、CONH基团或NHCO基团或-PO3H-基团、NH-亚芳基-SO2-CH2-CH2基团或N-R8基团；其中R8为氢原子或1-6个碳原子的烷基；
L为2-20个碳原子的取代或未取代的烃链；而
m为0或1。
3、根据权利要求1的亲合配位体-基质结合物，具有下列通式(I)
Figure C9619784900031
其中
R1、Y、Z、R2、R3、R4、R5、R6、X、Q、n和p定义同前
T为氧原子、硫原子或基团N-R7；
V为氧原子、硫原子、-COO-基团、CONH基团或NHCO基团或-PO3H-基团、NH-亚芳基-SO2-CH2-CH2基团或N-R8基团；
R7和R8彼此独立地为氢原子或1-6个碳原子的烷基；
L为2-20个碳原子的取代或未取代的烃链；
m为0或1；而
M为载体基质的残基。
4、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中M为载体基质的残基，所述载体基质可为任一种颗粒或非颗粒、可溶性或不溶性、多孔或无孔的化合物或物料，其可与亲合配位体结合以形成新的前述任一项权利要求的亲合配位体-基质结合物，其可提供一种使亲合配位体与在接触溶液中的溶质分离的便利手段。
5、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中R1为苯基或萘基，它们任一种的苯环或萘环可被一种或多种独立地选自羟基和羧酸基的取代基取代或未被取代。
6、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中R2为氢原子。
7、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中R3为氢原子。
8、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中R4为氢原子、羟基、羧酸基或氨基。
9、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中R5为氢原子、羟基、羧酸基或氨基。
10、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中R6为氢原子、羟基、羧酸基或氨基。
11、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中R7为氢原子。
12、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中T为氧原子或NH基团。
13、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中Y为N-R2，其中R2定义如前。
14、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中Z为N-R3，其中R3定义如前。
15、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中两个X均为氮原子。
16、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中Q为苯或萘环。
17、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中n为0或2。
18、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中p为0或2。
19、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中m为0或1。
20、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中L为乙基、丙基、羟丙基、丁基、戊基、己基、辛基、或癸基，V和m定义如前。
21、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中V为氧原子或NH基团，L和m定义如前。
22、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中m为1，L和V定义如前。
23、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，其中载体基质M的残基为选择性活化的琼脂糖、二氧化硅、纤维素、玻璃、toyopearl、羟乙基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、苯乙烯二乙烯基苯、HyperD、全氟碳。
24、根据权利要求23的亲合配位体-基质结合物，其中M为选择性tresyl活化的、磺酰氯活化的、甲苯磺酰基活化的、乙烯基砜活化的或环氧活化的琼脂糖。
25、根据权利要求1-3中任一项的亲合配位体-基质结合物，该结合物选自：
Figure C9619784900051
Figure C9619784900071
其中M定义如前。
26、一种权利要求1-3中任一项的新的亲合配位体-基质结合物的生产方法，该方法包括以任何次序使通式(II)的卤代杂环化合物
Figure C9619784900072
其中X与前述任一项权利要求中的定义相同，W为卤原子与下述化合物反应：
(i)通式(III)的化合物：
  R1-(CH2)p-Y-H       (III)其中R1、p和Y定义与前述任一项权利要求中的相同，
(ii)通式(IV)的化合物：其中R4、R5、R6、Q、Z和n定义与前述任一项权利要求中的相同，
(iii)选择性衍生的通式V的载体基质
       H-T-[-L-V-]m-M         (V)其中L、M、V、T和m定义与前述任一项权利要求中的相同；
或者，与通式(VI)的连接单元反应，
       H-T-L-V-M         (VI)其中L、V、T定义与前述任一项权利要求中的相同，得到通式(VII)的化合物：其中R1、R4、R5、R6、T、Q、L、V、X、Y、Z、m、n和p定义与前述任一项权利要求中的相同，再使通式(VII)的化合物与基质载体反应。
27、通式(XII)的新亲合配位体：
Figure C9619784900082
其中R1、R4、R5、R6、Q、X、Y、Z、n和p定义与前述任一项权利要求相同，卤素为氟、氯、溴或碘原子，
但需式(II)不包括化合物4-氯-2，6-二(苯基-氨基)-1，3，5-三嗪-3′-磺酸、4-氯-2，6-二(苯基-氨基)-1，3，5-三嗪-3′，2″-二磺酸、和4-氯-2-(4″-氨基-苯基-氨基)-1，3，5-三嗪-3′，2″-二磺酸。
28、通式(XIII)的新亲合配位体：
Figure C9619784900083
其中R1、R4、R5、R6、Q、X、Y、Z、m、n和p定义与前述任一项 中的相同，j为整数2-20。
29、通式(XIV)的新亲合配位体：其中R1、R4、R5、Q、X、Y、Z、m、n和p定义与前述任一项权利要求中的相同，q为0或1，j为整数2-20。
30、通式(VIII)的新亲合配位体：
Figure C9619784900092
其中R1、R4、R5、R6、L、Q、T、V、X、Y、Z、m、n和p定义与前述任一项权利要求中的相同；R9为氢原子或1-6个碳原子的烷基；R10为羰基、亚甲基、-NH-CH2-基团或-S-CH2-。
31、通式(XV)的新亲合配位体：
其中R1、R4、R5、R6、Q、n和p定义与前述任一项权利要求中的相同，但需式(XV)不包括化合物4-氯-2，6-二(苯基-氨基)-1，3，5-三嗪-3′-磺酸、4-氯-2，6-二(苯基-氨基)-1，3，5-三嗪-3′，2″-二磺酸、和4-氯-2-(4″-氨基-苯基-氨基)-1，3，5-三嗪-3′，2″-二磺酸。
32、通式(XVI)的新亲合配位体：
Figure C9619784900101
其中R1、R4、R5、R6、Q、n和p定义与前述任一项权利要求中的相同，j为整数2-20。
33、根据权利要求27至32任一项的亲合配位体，其中R1为苯基或萘基它们任一种的苯环或萘环可被一种或多种独立地选自羟基和羧酸基的取代基取代或未被取代。
34、根据权利要求27至32任一项的亲合配位体，其中R4为氢原子，羟基、羧酸基或氨基。
35、根据权利要求27至32任一项的亲合配位体，其中R5为氢原子，羟基、羧酸基或氨基。
36、根据权利要求27至32任一项的亲合配位体，其中R6为氢原子、羟基、羧酸基或氨基。
37、根据权利要求27至32任一项的亲合配位体，其中Q为苯或萘环。
38、根据权利要求27至30任一项的亲合配位体，其中X为氮原子。
39、根据权利要求27至31任一项的亲合配位体，其中Y为-NH-。
40、根据权利要求27至31任一项的亲合配位体，其中Z为-NH-。
41、根据权利要求27至32任一项的亲合配位体，其中n为0或2。
42、根据权利要求27至32任一项的亲合配位体，其中p为0或2。
43、根据权利要求28、29或32任一项的亲合配位体，其中j为2、4或6。
44、根据权利要求30的亲合配位体，其中L为乙基、丁基或己基。
45、根据权利要求30的亲合配位体，其中T为-NH-。
46、根据权利要求30的亲合配位体，其中V为-NH-。
47、根据权利要求30的亲合配位体，其中m为1。
48、通式(XI)的新亲合配位体：
Figure C9619784900111
其中，j为整数2-20。
49、根据权利要求27至47的亲合配位体，其选自：
Figure C9619784900112
50、根据权利要求26的方法，其中将通式(VII)的亲合配位体联接至碳水化合物或有机聚合物基质上，该方法包括使碳水化合物或有机聚合物基质与活化剂反应，然后将活化的基质与新的亲合配位体反应，反应过程中存在或不存在酸结合剂。
51、根据权利要求26的方法，其中将通式(VII)的亲合配位体联接至选择性地用有机聚合物涂覆的金属氧化物、玻璃或二氧化硅基质上，该方法包括使选择性地涂覆过的金属氧化物、玻璃或二氧化硅基质与活化剂反应，然后将活化的基质再与新的亲合配位体反应，反应过程中存在或不存在酸结合剂。
52、前述权利要求1至25任一项的亲合配位体-基质结合物在蛋白质分离、提取、纯化、表征鉴定、鉴别或定量中的应用。
53、根据权利要求52的应用，其中蛋白类物质为IgG、IgM、IgA、胰岛素、因子VII或人生长激素，或其类似物、其衍生物、其片段及前体。
54、根据权利要求52的应用，其中蛋白类物质为免疫球蛋白或其亚类、其片段、其前体或其衍生物，不论其来自天然来源或重组来源。
55、根据权利要求52的应用，其中蛋白类物质为免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)或其亚类、其片段、其前体或其衍生物，不论其来自天然来源或重组来源。
56、根据权利要求52的应用，其中蛋白类物质为胰岛素或胰岛素类似物，其衍生物、其片段和前体，不论其来自天然来源或重组来源。
57、根据权利要求52的应用，其中蛋白质类物质为FVII或其类似物，衍生物其片段和前体，不论其来自天然来源或重组来源。
58、根据权利要求52的应用，其中亲合配位体-基质结合物包含选自下述的配位体：
Figure C9619784900141
其中，配位体在位置(A)处联接至载体基质，选择性地通过如上定义的通式(b)表示的间隔臂进行所述联接。
59、根据权利要求58的应用，其中配位体为11a。
60、根据权利要求58或59的应用，其中载体基质为选择性地活化的琼脂糖、纤维素、二氧化硅或玻璃。
61、根据权利要求54或55的应用，其中通过任一种方法在pH值为5.0-12.0的条件下将免疫球蛋白与亲合配位体-基质结合物结合，随后通过将pH值降至4.9或更低而将其除去、洗脱或解吸，所述的亲合配位体-基质结合物为上述任一项亲合配位体-基质结合物权利要求所定义的亲合配位体-基质结合物。
62、根据权利要求56的应用，其中通过任一种方法在pH值为4.0-9.0的条件下将胰岛素与亲合配位体-基质结合物结合，随后通过将pH值降至3.99或更低，或者增至9.01或更高而将其除去、洗脱或解吸，所述的亲合配位体-基质结合物为上述任一项亲合配位体-基质结合物权利要求所定义的亲合配位体-基质结合物。
63、根据权利要求57的应用，其中通过将FVIIa与实施例181中的亲合基质选择性结合使之从细胞培养物中分离，即在5mMCa2+存在下将所述FVIIa与所述亲合配位体一基质结合物结合，随后洗脱。
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