ES2236748T3 - Nuevos ligandos de afinidad y su uso. - Google Patents

Nuevos ligandos de afinidad y su uso.

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ES2236748T3
ES2236748T3 ES96930037T ES96930037T ES2236748T3 ES 2236748 T3 ES2236748 T3 ES 2236748T3 ES 96930037 T ES96930037 T ES 96930037T ES 96930037 T ES96930037 T ES 96930037T ES 2236748 T3 ES2236748 T3 ES 2236748T3
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ligand
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ES96930037T
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Christopher R. Lowe
Kenneth Sproule
Rongxiu Li
David J. Stewart
James C. Pearson
Steven J. Burton
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Novo Nordisk AS
Prometic Bioseparations Ltd
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Novo Nordisk AS
Prometic Biosciences Ltd
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Abstract

ESTA INVENCION SE RELACIONA CON NOVEDOSOS CONJUNTOS DE LIGANDO - MATRIZ DE AFINIDAD QUE CONSTAN DE UN LIGANDO CUYA FORMULA GENERAL ES (A), ESTANDO UNIDO EL LIGANDO A UNA MATRIZ DE SOPORTE EN POSICION (A), OPTATIVAMENTE A TRAVES DE UN BRAZO ESPACIADOR INTERPUESTO ENTRE LA MATRIZ Y EL LIGANDO. ADEMAS, LA INVENCION SE RELACIONA CON ESTOS CONJUNTOS Y SU PREPARACION Y EMPLEO EN LA DEPURACION DE MATERIAS PROTEINACEAS COMO, P.EJ., INMUNOGLOBULINA, INSULINAS, FACTOR VII U HORMONA DEL CRECIMIENTO HUMANO O ANALOGAS, DERIVADOS Y FRAGMENTOS DE LOS MISMOS Y PRECURSORES.

Description

Nuevos ligandos de afinidad y su uso.
La presente invención se refiere a nuevos ligandos de afinidad, a su preparación y a su unión a matrices que pueden consistir en materiales sólidos, semisólidos, en partículas o coloidales, o polímeros solubles. La invención se refiere además a estos nuevos conjugados de matriz con ligando de afinidad, y a la preparación y uso de los mismos en la purificación de materiales proteinosos tales como, por ejemplo, inmunoglobulinas, insulinas, Factor VII, u hormona del crecimiento humana, o análogos, derivados y fragmentos de los mismos, y precursores.
Antecedentes de la invención
Los principios modernos de purificación de proteínas se apoyan fundamentalmente en técnicas de separación cromatográfica tales como cromatografía de exclusión molecular (GPC), cromatografía de intercambio iónico (IEC), cromatografía de interacción hidrófoba (HIC), cromatografía a alta presión de fase inversa (RP-HPLC), y cromatografía de afinidad (AC). Estas técnicas se adaptan fácilmente a la purificación a escala de laboratorio de péptidos y proteínas destinados a la investigación y a experimentos científicos, dando como resultado sustancias puras y biológicamente activas. En la mayoría de los casos, se presta poca o ninguna atención a la economía del procedimiento, a la validación del procedimiento, o a la limpieza en los procedimientos del lugar, puesto que el material se usará sólo rara vez para experimentos clínicos, y debido a que los costes de la mano de obra superan con mucho los costes de equipo y de matrices.
Sin embargo, el procesamiento industrial en dirección aguas abajo a gran escala debe tener en cuenta factores tales como la economía, la robustez de las matrices y la limpieza en el sitio con, por ejemplo, NaOH, urea, o etanol. Actualmente, la demanda de matrices baratas y robustas, estables en 1 M de NaOH, 7 M de urea, o en 80% v/v de etanol, se satisface mediante un número de proveedores comerciales en el campo de GPC, IEC, HIC, y RP-HPLC. Una combinación de estos principios ha dado como resultado, durante muchos años, sustancias proteínicas brutas casi puras, aunque el uso de tampones extremos y muchas etapas de purificación han dado como resultado malas recuperaciones, aumentos de costes, y estabilidad cuestionable de las preparaciones brutas.
Desde hace tiempo se ha observado que el principio de cromatografía de afinidad también se podría aplicar a operaciones a gran escala. Desafortunadamente, los adsorbentes creados con ligandos biológicos naturales, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales, tienden a ser caros para producirlos, debido a que los propios ligandos requieren a menudo una amplia purificación, son biológica y químicamente lábiles, y tienden a ser difíciles de inmovilizar con retención de su actividad biológica. Por lo tanto, desde hace tiempo ha existido la necesidad de sustituir los anticuerpos monoclonales o policlonales química y biológicamente lábiles caros por ligandos menos caros y más robustos que imiten la especificidad de los anticuerpos.
La cromatografía de afinidad ocupa un lugar único en la tecnología de la separación puesto que la proteína a purificar se adsorbe selectiva y reversiblemente a la sustancia de unión complementaria, tal como a una molécula de anticuerpo. A menudo se observan factores de purificación de varios miles de veces, con recuperaciones elevadas, en contraste con los procedimientos de purificación convencionales que ofrecen factores de 5-50 veces. Los elevados factores de purificación obtenidos en la cromatografía de afinidad reducen dramáticamente el número de etapas de purificación en el proceso aguas abajo. Además, la poquísima unión no específica observada en la cromatografía de afinidad hace posible purificar una proteína dada a partir de mezclas biológicas complejas, separar de las moléculas nativas las formas incorrectamente plegadas, y recuperar la proteína específicamente a partir de incluso grandes volúmenes de extractos tisulares o de cultivos de fermentación.
El sorbente de afinidad comprende una matriz soporte sólida, habitualmente permeable, a la que se une covalentemente un ligando adecuado, contenida en una columna cromatográfica convencional. Sobre la matriz soporte se hace pasar, en condiciones que promuevan las interacciones de unión específica con el ligando inmovilizado, una muestra bruta que contiene el biopolímero complementario. La columna se lava con tampón para eliminar las moléculas no retrasadas, seguido de una etapa de elución en la que la proteína se eluye en su forma pura. Un adsorbente de afinidad típico se basa en un soporte sólido, un brazo espaciador y un ligando. El soporte sólido puede estar formado de agarosa en forma de perlas, con una estructura de poros abiertos. El brazo espaciador puede favorecer la unión de la proteína haciendo al ligando más accesible. La longitud y la naturaleza del brazo espaciador se puede determinar por una persona experta en la técnica. El ligando debe mostrar una unión específica y reversible a la proteína a purificar, incluso después de la inmovilización. Además de los anticuerpos, como ligandos de afinidad se han usado un número de compuestos que incluyen cofactores enzimáticos, aminoácidos, péptidos, proteínas, concanavalina A, lectina, tioles, y colorantes.
La cromatografía de afinidad se ha usado en muchas aplicaciones. Por ejemplo, en "Affinity Chromatography A Practical Approach" de IRL Press, 1985, y en "Affinity Chromatography, Principles and Methods" de Pharmacia Fine Chemicals, 1979, se da una lista comprensible.
Los ligandos de afinidad por sustratos o análogos de sustratos convencionales, especialmente los colorantes, se han usado para la purificación a gran escala de enzimas específicas o grupos de enzimas (Scawen M.D. y Atkinson T. 1987, Reactive Dyes in Protein and Enzyme Technology, Ed. Clonis Y.E. et al; Macmillan Press, p. 51-85).
La cromatografía de afinidad con colorantes ha ganado mucho interés a lo largo de los años debido al precio relativamente bajo de tales matrices, a su robustez y a su capacidad para soportar NaOH, urea y etanol. Algunos de los ligandos más ampliamente usados en este tipo de cromatografía de afinidad han sido una variedad de colorantes textiles a base de triazinas reactivas, inmovilizados a agarosa y a otros soportes. Se ha estudiado el uso de la cromatografía de afinidad sobre colorantes inmovilizados (Lowe C.R. y Pearson J.C. 1984, Methods in Enzymology 104, p. 97-113). Se han mostrado interacciones selectivas con el sitio de unión a NAD^{+} de alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo con análogos de colorantes de Cibacron Blue F3G-A (Lowe C.R. et al. 1986; Journal of Chromatography 376, p. 121-130). En la investigación de soportes para la unión no covalente de interferón entre derivados 1,3,5-triazínicos de dextrano, se sintetizaron compuestos de una estructura similar a Cibacron Blue y se unieron a dextrano de diverso peso molecular con unión covalente (éter). Los compuestos de elevado peso molecular obtenidos se sometieron a ensayos biológicos que indicaron que el enlace con el sistema quinónico en su molécula es un agente indispensable pero no suficiente para la afinidad a interferón (Mieczyslaw Konieczny et al. 1982, Arch. Immunol. Ther. Exp. 30, p. 1-9). El enfoque de purificación selectiva se ilustró posteriormente con el diseño asistido por ordenador de un nuevo adsorbente de afinidad que imita al sustrato dipeptídico de fenil-arginina para la purificación de calicreína pancreática porcina (Burton N.P. y Lowe C.R. 1992, Journal of Molecular Recognition 5, p. 55-58).
La patente US nº 4.562.252 describe una estructura de ligando particular que consiste en dos grupos de ácido m-aminofenilborónico unidos a un anillo de triazina, para la separación de glicoproteínas.
Sin embargo, a pesar del rápido progreso en la tecnología de afinidad durante los últimos años pasados, existe la necesidad de desarrollar una tecnología mediante la cual se pueda identificar un ligando mimético específico para una proteína, a fin de producir una columna de afinidad barata y estable capaz de la purificación repetida a gran escala de dicha proteína, por ejemplo en la separación y purificación de materiales proteinosos, tales como inmunoglobulinas, insulinas, Factor VII, u hormona del crecimiento humana, o análogos, derivados y fragmentos de los mismos, y precursores, ya sea que deriven de fuentes naturales o recombinantes.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a nuevos ligandos de afinidad, a su preparación y unión a matrices, y al uso de estos nuevos complejos de ligando de afinidad con matrices, en la purificación de materiales proteinosos.
La actual invención se basa en la noción de que la selectividad de los ligandos hidrófobos se puede aumentar incrementando la complejidad y la geometría espacial del componente hidrófobo, y la incorporación de diversos grupos funcionales capaces de tomar parte en interacciones de enlace electrostático y de hidrógeno que promueven de este modo las interacciones selectivas con sitios de unión a proteínas. Este trabajo condujo al descubrimiento de un grupo genérico de nuevos ligandos de afinidad, los cuales se ha encontrado inesperadamente que son aplicables de forma general al aislamiento y purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad.
En contraste con el enfoque selectivo mencionado anteriormente, en el que se usaron como ligandos sustratos enzimáticos, análogos de los mismos o miméticos de sustratos, los ligandos definidos en esta solicitud se dirigen a cualquier superficie de la molécula de proteína, haciendo aplicable el principio a cualquier proteína. Los ligandos se diseñan mediante técnicas de formación de modelos por ordenador y/o mediante detección sistemática de librerías de ligandos miméticos. Además, la actual invención tiene la ventaja de que no se requiere la estructura de la arquitectura del sitio de unión a la proteína para el diseño y desarrollo del ligando, y en consecuencia los materiales y las técnicas descritos en este documento tienen una utilidad significativamente mayor.
Una característica de la presente invención es la provisión de una herramienta general para la resolución, aislamiento y purificación de proteínas. Se ha sintetizado una familia de estructuras químicas sutilmente diferentes, que tienen la capacidad de interaccionar con diferentes proteínas. Una estructura de ligando particularmente eficaz para una proteína dada se identifica mediante detección sistemática de un intervalo de ligandos proporcionado por la invención en busca de las propiedades de unión adecuadas.
A título de ejemplo, los ligandos de afinidad de selectividad y especificidad elevadas, que están actualmente disponibles para la separación y purificación de inmunoglobulinas, a menudo son materiales proteinosos derivados de fuentes bacterianas o recombinantes, e incluyen materiales tales como Proteína A, Proteína G y Proteína L. La inmovilización de estas proteínas y de proteínas similares a menudo da como resultado una pérdida significativa de la actividad biológica. El uso continuado y repetido de proteínas inmovilizadas, como medios de afinidad, conduce a una disminución posterior de la actividad biológica. Además, la naturaleza inherente de estas macromoléculas biológicas impone limitaciones estrictas con respecto al uso de sales de tampones, disolventes orgánicos y niveles de pH en la cromatografía de afinidad y en técnicas relacionadas.
Los nuevos ligandos de afinidad proporcionados por esta invención se pueden usar en lugar de proteína A y proteína G, y son significativamente más flexibles en su uso, son más robustos, menos caros de producir, y ofrecen niveles equivalentes de purificación.
Otro ejemplo es el uso de nuevas matrices de afinidad proporcionadas mediante esta invención, en biotecno-
logía.
La presente invención se refiere a conjugados de matriz con ligando de afinidad que comprenden un ligando con la fórmula general (a):
1
en la que
R_{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo hidroxialquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo ciclohexilo, un grupo amino, un grupo fenilo, grupo naftilo, 1-fenilpirazol, indazol, grupo benzotiazol, grupo benzoxazol, o un grupo bencimidazol, estando cada anillo de benceno, naftaleno, fenilpirazol, indazol, benzotiazol, benzoxazol o bencimidazol opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, grupos alcoxi que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, grupos aciloxi o acilamino que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos ácido carboxílico, grupos ácido sulfónico, grupos carbamoílo, grupos sulfamoílo, grupos alquilsulfonilo que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, o átomos de halógeno;
Y representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo N-R_{2};
Z representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo N-R_{3};
R_{2} y R_{3} representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo hidroxialquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo bencilo o un grupo \beta-feniletilo;
R_{4}, R_{5} y R_{6} representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo alcoxi que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo amino, un grupo aciloxi o acilamino que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo ácido carboxílico, un grupo ácido sulfónico, un grupo carbamoílo o sulfamoílo, un grupo alquilsulfonilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, o un átomo de halógeno;
uno de los símbolos X representa un átomo de nitrógeno, y el otro símbolo X representa un átomo de nitrógeno o un átomo de carbono que tiene un átomo de cloro o un grupo ciano;
Q representa un anillo de benceno; naftaleno, benzotiazol, benzoxazol, 1-fenilpirazol, indazol o bencimidazol;
n es un número entero entre 0 y 6;
p es un número entero entre 0 y 20;
y
ligando el cual está unido a una matriz soporte en la posición A, opcionalmente a través de un brazo espaciador interpuesto entre la matriz y el ligando,
con la condición de que la fórmula (a) no comprenda los productos de reacción de los compuestos ácido 4-cloro-2,6-di-(fenilamino)-1,3,5-triazin-3'-sulfónico, ácido 4-cloro-2,6-di(fenilamino)-1,3,5-triazin-3',2''-disulfónico, y ácido 4-cloro-2(4''-amino-fenil-amino)-1,3,5-triazin-3',2''-disulfónico, con Dextran T 500.
El brazo espaciador opcional está representado preferiblemente mediante la fórmula general (b)
(b)-T-[-L-V-]_{m}-
en la que T representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo -N-R_{7}; en el que R_{7} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono;
V representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo -COO-, un grupo CONH o un grupo NHCO o un grupo -PO_{3}H-, un grupo NH-arileno-SO_{2}-CH_{2}-CH_{2} o un grupo N-R_{8}; en el que R_{8} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono;
L representa un enlace hidrocarbonado opcionalmente sustituido que contiene de 2 a 20 átomos de carbono; y
m es 0 ó 1.
La matriz soporte puede ser cualquier compuesto o material, en partículas o no en partículas, soluble o insoluble, poroso o no poroso, que se puede usar en combinación con ligandos de afinidad para formar un conjugado de matriz con ligando de afinidad, y que proporciona un medio conveniente para separar los ligandos de afinidad de los solutos en una disolución de contacto.
La presente invención proporciona nuevos conjugados de matriz con ligando de afinidad, que se pueden usar en la separación y purificación de materiales proteinosos, tales como inmunoglobulinas, insulinas, Factor VII, u hormona de crecimiento humana, o análogos, derivados y fragmentos de los mismos, y precursores, ya sea que deriven de fuentes naturales o recombinantes.
En una realización preferida, la invención proporciona nuevos conjugados de matriz con ligando de afinidad, que se representan mediante la Fórmula General (I):
\vskip1.000000\baselineskip
2
en la que
R_{1}, Y, Z, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, X, Q, n y p tienen los significados especificados anteriormente,
T representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo N-R_{7};
V representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo -COO-, un grupo CONH o un grupo NHCO o un grupo -PO_{3}H-, un grupo NH-arileno-SO_{2}-CH_{2}-CH_{2} o un grupo N-R_{8};
R_{7} y R_{8} representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono;
L representa un enlace hidrocarbonado opcionalmente sustituido que contiene de 2 a 20 átomos de carbono;
m es 0 ó 1; y
M representa el resto de una matriz soporte.
La expresión "grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono", como se usa aquí, sola o en combinación, se refiere a una cadena hidrocarbonada saturada, lineal o ramificada, que tiene 1 a 6 átomos de carbono, tal como, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, n-pentilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, n-hexilo, 4-metilpentilo, neo-pentilo, n-hexilo y 2,2-dimetilpropilo.
La expresión "grupo hidroxialquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono", como se usa aquí, sola o en combinación, se refiere a una cadena hidrocarbonada saturada, lineal o ramificada, que tiene 1 a 6 átomos de carbono, sustituida con uno o más grupos hidroxi, preferiblemente un grupo hidroxi, tal como, por ejemplo, hidroximetilo, 2-hidroxietilo, 3-hidroxipropilo, 2-hidroxipropilo, 4-hidroxibutilo, 4-hidroxipentilo, 6-hidroxihexilo.
La expresión "grupo alcoxi que contiene de 1 a 6 átomos de carbono", como se usa en este documento, sola o en combinación, se refiere a un sustituyente monovalente lineal o ramificado que comprende un grupo alquilo, que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, enlazado a través de un oxígeno de tipo éter, que tiene su enlace de valencia libre del oxígeno de tipo éter, y que tiene 1 a 6 átomos de carbono, por ejemplo metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, butoxi, pentoxi.
El término "halógeno" significa flúor, cloro, bromo o yodo.
La expresión "aciloxi o acilamino que contiene de 1 a 6 átomos de carbono", como se usa en este documento, se refiere a un sustituyente monovalente que comprende un grupo alquilo que contiene de 1 a 5 átomos de carbono enlazado a través de un grupo carboniloxi u oxicarbonilo, tal como un grupo metilcarboniloxi, etilcarboniloxi, metiloxicarbonilo o etiloxicarbonilo, o enlazado a través de un grupo carbonilamino o aminocarbonilo, tal como un grupo metilcarbonilamino, etilcarbonilamino, metilaminocarbonilo o etilaminocarbonilo.
La expresión "alquilsulfonilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono", como se usa aquí, se refiere a un sustituyente monovalente que comprende un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono enlazado a través de un grupo sulfonilo, tal como, por ejemplo, metilsulfonilo, etilsulfonilo, n-propilsulfonilo, isopropilsulfonilo, n-butilsulfonilo, sec-butilsulfonilo, isobutilsulfonilo, terc-butilsulfonilo, n-pentilsulfonilo, 2-metilbutilsulfonilo, 3-metilbutilsulfonilo, n-hexilsulfonilo, 4-metilpentilsulfonilo, neopentilsulfonilo, n-hexilsulfonilo y 2,2-dimetilpropilsulfonilo.
La expresión "uno o más sustituyentes seleccionados independientemente de" se debe referir más preferiblemente a 1-3 sustituyentes. El término se debe referir preferiblemente además a 1-2 sustituyentes, y lo más preferible se refiere a un sustituyente.
En la presente memoria descriptiva, siempre que se use el término insulina en plural o en sentido genérico, se pretende que englobe tanto a insulinas de origen natural como a análogos de insulina y derivados de los mismos y precursores. Mediante el término insulina también se quiere decir de este modo insulina procedente de cualquier especie, por ejemplo insulina humana. Mediante la expresión "análogo de insulina", como se usa aquí, se quiere decir insulina humana con una o varias sustituciones de aminoácidos, una o varias eliminaciones de aminoácidos, una o varias adiciones de aminoácidos, o combinaciones de los mismos. La expresión "derivado de insulina" significa insulina químicamente modificada en uno o varios restos. Mediante "precursor de insulina", como se usa aquí, se quiere decir cualquier molécula que, mediante conversión enzimática o química, da como resultado la formación de insulina, fragmentos de insulina, por ejemplo des-Thr(B30)-insulina, análogos de insulina, o derivados de insulina.
La expresión "enlace hidrocarbonado opcionalmente sustituido que contiene de 2 a 20 átomos de carbono", como se usa aquí, se refiere a una o más cadenas alquílicas lineales o ramificadas, opcionalmente sustituidas con, por ejemplo, grupos hidroxi o alcoxi que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, y opcionalmente enlazadas juntas mediante enlaces de tipo amino, éter, tioéter, éster, amida o sulfonamida proporcionando una cadena que contiene de 2 a 20 átomos de carbono. La construcción es preferiblemente flexible. La construcción de tales enlaces hidrocarbonados opcionalmente sustituidos se describe, por ejemplo, en Lowe, C. R. y Dean, P.D. G. 1974, Affinity Chromatography, John Wiley & Sons, Londres, que se incorpora aquí como referencia.
En una realización preferida, estos conjugados se representan mediante la Fórmula General (I):
3
en la que
R_{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo hidroxialquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo ciclohexilo, un grupo amino, un grupo fenilo o grupo naftilo, que puede estar sustituido en el anillo de benceno o de naftaleno con grupos alquilo que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, grupos alcoxi que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, grupos aciloxi o acilamino que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos ácido carboxílico, grupos ácido sulfónico, grupos carbamoílo, grupos sulfamoílo, grupos alquilsulfonilo, o átomos de halógeno;
T representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo N-R_{7};
Y representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo N-R_{2};
Z representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo N-R_{3};
R_{2} y R_{3} representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono; un grupo hidroxialquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo bencilo o un grupo \beta-feniletilo;
R_{4}, R_{5} y R_{6} representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo alcoxi que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo amino, un grupo aciloxi o acilamino que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo ácido carboxílico, un grupo ácido sulfónico, un grupo carbamoílo o sulfamoílo, un grupo alquilsulfonilo, o un átomo de halógeno;
uno de los símbolos X representa un átomo de nitrógeno, y el otro símbolo X representa un átomo de nitrógeno o un átomo de carbono que tiene un átomo de cloro o un grupo ciano;
V representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo -COO-, un grupo CONH o un grupo NHCO o un grupo -PO_{3}H-, un grupo NH-arileno-SO_{2}-CH_{2}-CH_{2} o un grupo N-R_{8};
R_{7} y R_{8} representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono;
L representa un enlace hidrocarbonado opcionalmente sustituido que contiene de 2 a 20 átomos de carbono;
Q representa un anillo de benceno o de naftaleno;
n es un número entero entre 0 y 6;
p es un número entero entre 0 y 20;
m es 0 ó 1; y
M representa el resto de una matriz soporte que puede ser cualquier compuesto o material, en partículas o no partículas, soluble o insoluble, poroso o no poroso, que se puede usar en combinación con ligandos de afinidad para formar un nuevo conjugado de matriz con ligando de afinidad de la Fórmula General (I), y que proporciona un medio conveniente para separar de los solutos a los ligandos de afinidad en una disolución de contacto.
Se apreciará que esta invención se refiere, entre otros, al uso de compuestos que son piridinas, diazinas o triazinas que tienen un sustituyente T-[L-V]_{0-1}-M, o su precursor, y otros sustituyentes enlazados al anillo vía un heteroátomo. Tales sustituyentes pueden incluir cualquier grupo que no interfiera que comprenda 0 a 10 ó 20 átomos de carbo-
no.
En una realización preferida de la invención, R_{1} representa un grupo fenilo o naftilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido en el anillo bencénico o naftalénico con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en grupos hidroxilo o grupos ácido carboxílico.
En otra realización preferida de la invención, R_{2} representa un átomo de hidrógeno.
En otra realización preferida de la invención, R_{3} representa un átomo de hidrógeno.
En otra realización preferida de la invención, R_{4} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo ácido carboxílico, o un grupo amino.
En otra realización preferida de la invención, R_{5} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo ácido carboxílico, o un grupo amino.
En otra realización preferida de la invención, R_{6} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo ácido carboxílico, o un grupo amino.
En otra realización preferida de la invención, R_{7} representa un átomo de hidrógeno.
En otra realización preferida de la invención, T representa un átomo de oxígeno o un grupo NH.
En otra realización preferida de la invención, Y representa N-R_{2}, en el que R_{2} es como se define anteriormente.
En otra realización preferida de la invención, Z representa N-R_{3}, en el que R_{3} es como se define anteriormente.
En otra realización preferida de la invención, ambos X representan un átomo de nitrógeno.
En otra realización preferida de la invención, Q representa un anillo bencénico o naftalénico.
En otra realización preferida de la invención, n representa 0 ó 2.
En otra realización preferida de la invención, p representa 0 ó 2.
En otra realización preferida de la invención, m representa 0 ó 1.
En otra realización preferida de la invención, L representa un grupo etilo, propilo, hidroxipropilo, butilo, pentilo, hexilo, octilo o decilo, y V y m son como se definen anteriormente.
En otra realización preferida de la invención, V representa un átomo de oxígeno, un grupo -COO-, un grupo
-PO_{3}H-, o un grupo N-R_{8}; y más preferiblemente un átomo de oxígeno o un grupo NH, y L y m son como se definen anteriormente.
En otra realización preferida de la invención, m representa 1, y L y V son como se definen anteriormente.
La expresión "número entero entre x e y" puede incluir los valores x (incluyendo el cero) e y.
La invención también proporciona procedimientos para la fabricación de los nuevos conjugados de matriz con ligando de afinidad según la invención, que comprenden hacer reaccionar, en cualquier orden, un compuesto halogenoheterocíclico de Fórmula General (II):
\vskip1.000000\baselineskip
4
en la que los símbolos X tienen los significados especificados aquí anteriormente, y W representan un átomo de halógeno, con
(i) un compuesto de Fórmula General (III):
(III)R_{1}-(CH_{2})_{p}-Y-H
en la que los símbolos R_{1}, Y y p tienen los significados especificados aquí anteriormente, y H es hidrógeno,
(ii) un compuesto de Fórmula General (IV)
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que los símbolos R_{4}, R_{5}, R_{6}, Q, Z y n tienen los significados especificados aquí anteriormente, y
(iii) una matriz soporte opcionalmente derivatizada de Fórmula General V
(v)H-T-[-L-V-]_{m}-M
en la que los símbolos L, M, V, T y m tienen los significados especificados aquí anteriormente,
o, con una unidad enlazante de Fórmula General (VI)
(VI)H-T-L-V-H
en la que los símbolos H, L, V y T tienen los significados especificados aquí anteriormente, para dar un compuesto de Fórmula General (VII):
\vskip1.000000\baselineskip
6
en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, Q, L, T, V, X, Y, Z, m, n y p tienen los significados especificados aquí anteriormente; el compuesto de Fórmula General (VII) se hace reaccionar entonces posteriormente con una matriz soporte cuyo resto se representa mediante M, usando procedimientos de activación y de acoplamiento bien conocidos por los expertos en la técnica.
Como ejemplos de compuestos halogenoheterocíclicos de Fórmula General (II) se pueden mencionar 5-cloro-2,4,6-trifluoropirimidina, 5-ciano-2,4,6-tricloropirimidina, fluoruro cianúrico, bromuro cianúrico y, por encima de todos, cloruro cianúrico.
Como ejemplos de compuestos de Fórmula General (III) se pueden mencionar aminas tales como amoníaco, metilamina, etilamina, propilamina, isopropilamina, diisopropilamina, isobutilamina, amilamina, hexilamina, etanolamina, dietanolamina, anilina, N-metilanilina, N-etilanilina, N-isopropilanilina, 1,4-diaminobutano, 1,6-diaminohexano, N-terc-butilanilina, p-toluidina, p-butilanilina, 2,4-dimetilanilina, p-anisidina, p-etoxianilina, p-aminoacetanilida, p-aminofenol, p-cloroanilina, ácido ortanílico, ácido metanílico, ácido sulfanílico, ácido 4-metilanilin-2-sulfónico, ácido 4-metoxianilin-2-sulfónico, ácido anilin-2,5-disulfónico, ácido n-metilmetanílico, ácido o-, m- y p-aminobenzoico, p-aminobenzamida, p-aminobencenosulfonamida, 1-amino-2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- y 8-naftol, 2-amino-3-, 4-, 5-, 6-, 7- y 8-naftol, ácido 5-, 6- y 7-amino-1-naftol-3-sulfónico, N-bencilanilina, bencilamina, 4-metilbencilamina, 4-hidroxibencilamina, 4-metoxibencilamina, 4-acetoxibencilamina, 4-acetilaminobencilamina, N-metilbencilamina, \beta-feniletilamina, N-butil-bencilamina, N-bencil-\beta-feniletilamina, N-(\beta-hidroxietil)-bencilamina, N-terc-butil-bencilamina, N-benciltiramina y tiramina; fenoles tales como fenol, o-, m- y p-cresol, catecol, resorcinol, hidroquinona, p-clorofenol, 1-naftol y 2-naftol, ácido 1-naftol-4-sulfónico, ácido 2-naftol-6-sulfónico y ácido 2-hidroxi-3-naftoico; tioles tales como etiltiol, ácido tioglicólico, tiofenol y tio-p-cresol, y heterociclos aromáticos tales como 5-amino-1-fenilpirazol, 6-aminoindazol, 2-aminobencimidazol, 2-aminobenzotiazol, y 2-amino-5-clorobenzoxazol.
Como ejemplos de compuestos de Fórmula General (IV), se pueden mencionar aminas tales como anilina, N-metilanilina, N-etilanilina, N-isopropilanilina, N-terc-butilanilina, p-toluidina, p-butilanilina, 2,4-dimetilanilina, p-anisidina, p-etoxianilina, p-aminoacetanilida, p-aminofenol, p-cloroanilina, ácido ortanílico, ácido metanílico, ácido sulfanílico, ácido 4-metilanilin-2-sulfónico, ácido 4-metoxianilin-2-sulfónico, ácido anilin-2,5-disulfónico, ácido n-metilmetanílico, ácido o-, m- y p-aminobenzoico, 1-amino-2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- y 8-naftol, 2-amino-3-, 4-, 5-, 6-, 7- y 8-naftol, ácido 5-, 6- y 7-amino-1-naftol-3-sulfónico, p-aminobenzamida, p-aminobencenosulfonamida, N-bencilanilina, bencilamina, 4-metilbencilamina, 4-hidroxibencilamina, 4-metoxibencilamina, 4-acetoxibencilamina, 4-acetilaminobencilamina, N-metilbencilamina, \beta-feniletilamina, N-butil-bencilamina, N-bencil-\beta-feniletilamina, N-(\beta-hidroxietil)-bencilamina, N-terc-butil-bencilamina, N-benciltiramina y tiramina; fenoles tales como fenol, o-, m- y p-cresol, catecol, resorcinol, hidroquinona, p-clorofenol, 1-naftol y 2-naftol, ácido 1-naftol-4-sulfónico, ácido 2-naftol-6-sulfónico y ácido 2-hidroxi-3-naftoico; tioles tales como tiofenol y tio-p-cresol; y heterociclos aromáticos tales como 5-amino-1-fenilpirazol, 6-aminoindazol, 2-aminobencimidazol, 2-aminobenzotiazol, y 2-amino-5-clorobenzoxazol.
Como ejemplos de matrices soporte cuyo resto se representa mediante M, se pueden mencionar matrices soportes insolubles tales como un polímero de origen natural, por ejemplo un polipéptido o proteína, tal como albúmina reticulada, o un polisacárido, tal como agarosa, alginato, carragenano, quitina, celulosa, dextrano o almidón; polímeros sintéticos tales como poliacrilamida, poliestireno, poliacroleina, poli(alcohol vinílico), poli(acrilato de metilo), perfluorocarbono; compuestos inorgánicos tales como sílice, vidrio, kieselguhr, alúmina, óxido de hierro u otros óxidos metálicos, o copolímeros que consisten en cualquier combinación de dos o más polímeros de origen natural, polímeros sintéticos o compuestos inorgánicos. También se incluyen en la definición de matrices soportes cuyo resto se representa mediante R las matrices soportes que comprenden polímeros tales como dextrano, polietilenglicol, poli(alcohol vinílico) o almidón hidrolizado, que proporcionan conjugados de matriz con ligando de afinidad para uso en el reparto de líquidos; o matrices soportes que comprenden compuestos tales como perfluorodecalina, que proporcionan conjugados de matriz con ligando de afinidad para uso en la formación de emulsiones de afinidad. Para evitar dudas, una matriz soporte se define aquí como cualquier compuesto o material, ya sea en partículas o no partículas, soluble o insoluble, poroso o no poroso, que se puede usar para formar un nuevo conjugado de matriz con ligando de afinidad según la invención, y que proporciona un medio conveniente para separar de los solutos al ligando de afinidad en una disolución de contacto.
También se incluyen en la definición de matrices soportes cuyo resto se representa mediante M las matrices soportes tales como agarosa, celulosa, almidón, alginato, carragenano, polímeros sintéticos, sílice, vidrio y óxidos metálicos que han sido o son modificadas mediante tratamiento con un agente activante antes o durante la unión del ligando.
En una realización preferida de la invención, M representa agarosa opcionalmente activada, sílice, celulosa, vidrio, toyopearl, metacrilato de hidroxietilo, poliacrilamida, estirendivinilbenceno, Hyper D, perfluorocarbonos.
Preferiblemente, M representa agarosa opcionalmente activada con tresilo, activada con cloruro de sulfonilo, activada con tosilo, activada con vinilsulfona o activada con epoxi.
Los conjugados de matriz con ligando de afinidad preferidos según la invención son
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i)
7
ii)
8
iii)
9
iv)
10
v)
11
vi)
12
vii)
13
viii)
14
en las que M es como se define anteriormente.
Existe un considerable número de agentes activantes que han encontrado uso para los fines generales de unir ligandos a matrices soportes. Estos compuestos y su procedimiento de uso son bien conocidos por los expertos en la técnica, y, puesto que el meollo de la presente invención descansa en la naturaleza del ligando unido a la matriz y no en el modo de unión, cualquiera de estos agentes activantes servirá en la preparación de los nuevos conjugados de la invención de matriz con ligando. Como ejemplos no limitantes de tales agentes activantes se pueden mencionar diversos compuestos tales como bromuro de cianógeno, cloruro cianúrico, epiclorhidrina, divinilsulfona, cloruro de p-toluenosulfonilo, 1,1'-carbonildiimidazol, metaperyodato de sodio, toluen-4-sulfonato de 2-fluoro-1-metilpiridinio, glicidoxipropiltrimetoxisilano, y cloruro de 2,2,2-trifluoroetanosulfonilo. Como se ha indicado anteriormente, los procedimientos mediante los cuales se llevan a cabo tales etapas de activación son bien conocidos por los expertos en la técnica.
De forma similar, se puede usar una amplia variedad de agentes de condensación para unir los compuestos de Fórmulas Generales (VI) a matrices soportes tales como agarosa, celulosa, dextrano, almidón, alginato, carragenano, sílice o vidrio. Nuevamente, estos compuestos y su procedimiento de uso son bien conocidos por los expertos en la técnica, y, nuevamente, puesto que el meollo de la presente invención descansa en la naturaleza del ligando y no en el modo de unión, cualquiera de estos agentes de condensación servirá en la preparación de los nuevos conjugados de la invención de matriz con ligando. Como ejemplos no limitantes de tales agentes de condensación se pueden mencionar N-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroquinolina, diciclohexilcarbodiimida y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida.
Como ejemplos de unidades enlazantes de Fórmula General (VI), que se pueden usar para producir compuestos de Fórmula General (VII), se pueden mencionar las diaminas tales como etilendiamina, N,N'-dimetiletilendiamina, N-etil-etilendiamina, N-(\beta-hidroxietil)-etilendiamina, propilendiamina, N-metilpropilendiamina, N-(\beta-hidroxietil)-propilendiamina, 1,4-diaminobutano, 1,5-diaminopentano, 1,6-diaminohexano, 1,7-diaminoheptano, 1,8-diaminooctano, 1,9-diaminononano, 1,10-diaminodecano, 1,12-diaminododecano, piperazina, 3-hidroxi-1,5-diaminopentano, m- y p-fenilendiamina, m- y p-aminobencilamina; aminoalcoholes tales como etanolamina, N-metiletanolamina, N-propiletanolamina, dietanolamina, 3-hidroxipropilamina, 2,3-dihidroxipropilamina, isopropanolamina, 5-aminopentan-1-ol y 6-aminohexan-1-ol; aminofenoles tales como o-, m- y p-aminofenol, ácidos aminocarboxílicos tales como glicina, N-metilglicina, ácido 3- y 4-aminobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 5-aminovalérico, ácido 6-aminocaproico, ácido 7-aminoheptanoico, ácido m- y p-aminobenzoico; ácidos aminofosfónicos tales como ácido m-aminobencenofosfónico y ácido p-aminobencilfosfónico; y precursores de aminoarilenvinilsulfonas tales como anilin-3-\beta-sulfatoetilsulfona y anilin-4-\beta-sulfatoetilsulfona.
La reacción de los compuestos halogenoheterocíclicos de Fórmula General (II) con los compuestos de Fórmulas Generales (III), (IV) y (V) o (VI) se puede llevar a cabo en un disolvente orgánico que no sea miscible con agua, o en un disolvente orgánico que sea miscible con agua, o en una mezcla de agua y un disolvente orgánico miscible en agua. Los ejemplos de disolventes orgánicos adecuados, que no son miscibles con el agua son tolueno, xileno o clorobenceno. Los ejemplos de disolventes orgánicos adecuados, que son miscibles con agua, son acetona, metiletilcetona o dioxano. La primera reacción del compuesto halogenoheterocíclico se puede llevar a cabo a temperaturas entre 0ºC y 25ºC, de forma ideal entre 0ºC y 5ºC; la segunda reacción se puede llevar a cabo a temperaturas entre 20ºC y 50ºC, de forma ideal entre 30ºC y 45ºC; y la tercera reacción se puede llevar a cabo a temperaturas entre 20ºC y 100ºC. Durante tales reacciones, el ácido inorgánico que se produce, tal como ácido clorhídrico o ácido fluorhídrico, se neutraliza mediante el uso de un agente de unión a ácidos, tal como hidróxido sódico, carbonato de sodio, bicarbonato de sodio, hidróxido cálcico o carbonato cálcico.
Adicionalmente, los compuestos de Fórmula General (VII) se pueden hacer reaccionar con un monómero polimerizable reactivo para formar un compuesto polimerizable de Fórmula General (VIII):
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en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, Q, L, T, V, X, Y, Z, m, n y p tienen los significados especificados aquí anteriormente; R_{9} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono; R_{10} representa un grupo carbonilo, un grupo metileno, un grupo -NH-CH_{2}- o un grupo -S-CH_{2}-. Los ejemplos de monómeros polimerizables reactivos incluyen cloruro de acriloilo, cloruro de metacriloilo, bromuro de alilo, alilamina o 3,4-epoxibuteno. Los compuestos polimerizables de Fórmula General (VIII) se pueden polimerizar, opcionalmente en presencia de otros monómeros polimerizables, para formar conjugados de matriz con ligando de afinidad de la Fórmula General (I). Tales procedimientos de polimerización son bien conocidos por los expertos en la técnica.
La invención cubre además el uso de tales matrices soportes con ligandos de afinidad en la separación, aislamiento, purificación, cuantificación, identificación y caracterización de materiales proteinosos, tales como inmunoglobulinas, insulinas, Factor VII u hormona del crecimiento humana, o análogos, derivados y fragmentos de los mismos, y precursores.
Las inmunoglobulinas son una familia de proteínas, a menudo abreviadas como I_{g}, que comparten una estructura común. Las inmunoglobulinas también son conocidas colectivamente como anticuerpos, y cualquiera de estas palabras se puede usar para describir este grupo de proteínas. Las inmunoglobulinas existen en un número de diferentes formas, por ejemplo, siendo los tipos de anticuerpos más significativos I_{g}A, I_{g}D, I_{g}E, I_{g}G, I_{g}M e I_{g}Y, y diversas subclases de los mismos. Las inmunoglobulinas pueden originarse en fluidos corporales, tales como plasma, ascitis, saliva, leche o yema de huevo, o se pueden producir usando metodologías de ingeniería genética. Las inmunoglobulinas se pueden alterar mediante una variedad de técnicas para conferirles propiedades deseables. Tales procedimientos son bien conocidos para los expertos en la técnica, y los anticuerpos resultantes modificados también son objeto de las reivindicaciones de esta invención. Como ejemplos no limitantes de las técnicas de modificación de anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos, los anticuerpos marcados, los conjugados de anticuerpos y las proteínas de fusión a anticuerpos se pueden obtener mediante modificación química, mediante tratamiento con una o más enzimas, o mediante combinación de ambas técnicas. Existe un número considerable de reactivos para la modificación química y de enzimas que han encontrado uso en la modificación de anticuerpos, y estos compuestos y su uso son bien conocidos para los expertos en la técnica. Una forma adicional de obtener anticuerpos modificados o nuevos es producirlos usando metodologías de ingeniería genética. Tales metodologías y su uso con bien conocidos por los expertos en la técnica, y se pueden usar para producir, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos o productos de fusión a anticuerpos. Los anticuerpos modificados o nuevos, derivados mediante metodologías de ingeniería genética, también son objeto de las reivindicaciones de esta invención.
Un grupo valioso de matrices soportes con ligandos de afinidad se representa mediante la Fórmula General (IX):
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en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, M, Q, n y p tienen los significados especificados aquí anteriormente, y j es un número entero entre 2 y 20.
Un grupo especialmente valioso de matrices soportes con ligandos de afinidad se representa mediante la Fórmula General (X):
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en la que j y M tienen los significados especificados aquí anteriormente.
Típicamente, la reacción de los compuestos de Fórmula General (XI)
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con 3-propoxi-(1,2-epoxi)-agarosa, a temperaturas entre 10ºC y 30ºC, en presencia de un agente de unión a ácidos, produce nuevos conjugados de matriz con ligando de afinidad que son de un valor importantísimo en la purificación de materiales proteinosos. Estos nuevos conjugados de matriz con ligando de afinidad poseen una elevada afinidad por el grupo de inmunoglobulinas de proteínas. Esta propiedad única les confiere un valor excepcional en la separación, aislamiento, purificación, cuantificación, identificación y caracterización de proteínas de esta clase.
En otra realización, la invención se refiere a nuevos ligandos de afinidad de Fórmula General (XII):
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en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, Q, X, Y, Z, n y p tienen los significados especificados anteriormente, y Halógeno representa un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo.
Además, la invención se refiere a un procedimiento para unir nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (XII), como se definen anteriormente, a una matriz de Fórmula General (V), como se define anteriormente, haciendo reaccionar los nuevos ligandos de afinidad con la matriz a temperaturas entre -20ºC y 121ºC, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos.
En otra realización, la invención se refiere a nuevos ligandos de afinidad de Fórmula General (XIII):
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en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, Q, X, Y, Z, m, n y p tienen los significados especificados anteriormente, y j es un número entero entre 2 y 20.
Además, la invención se refiere a un procedimiento para preparar los nuevos ligandos de afinidad anteriores de la Fórmula General (XIII) haciendo reaccionar un compuesto de la Fórmula General (XII) anterior con una alquilendiamina de Fórmula General H_{2}N-(CH_{2})_{j}-NH_{2}-, a temperaturas entre 0ºC y 100ºC en presencia de un agente de unión a ácidos.
En otra realización, la invención se refiere a nuevos ligandos de afinidad de Fórmula General (XIV):
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en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, Q, X, Y, Z, m, n y p tienen los significados especificados anteriormente, q es 0 ó 1, y j es un número entero entre 2 y 20.
Además, la invención se refiere a un procedimiento para preparar nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (XIV) anterior haciendo reaccionar un compuesto de la Fórmula General (XII) anterior con un compuesto aminohidroxílico de Fórmula General H_{2}N-(CH_{2})_{j}-(CO)_{q}-OH, a temperaturas entre 0ºC y 100ºC, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos.
En otra realización, la invención se refiere a nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (VIII) anterior, en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, L, Q, T, V, X, Y, Z, m, n y p tienen los significados especificados anteriormente; R_{9} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono; R_{10} representa un grupo carbonilo, un grupo metileno, un grupo -NH-CH_{2}- o un grupo -S-CH_{2}-; preferiblemente, L es un grupo etilo, butilo o hexilo; preferiblemente, T representa un grupo -NH-; preferiblemente V representa un grupo -NH-; y m es preferiblemente 1.
En otra realización, la invención se refiere a nuevos ligandos de afinidad de Fórmula General (XV):
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en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, Q, n y p tienen los significados especificados anteriormente.
En otra realización, la invención se refiere a nuevos ligandos de afinidad de Fórmula General (XVI):
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en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, Q, n y p tienen los significados especificados anteriormente, y j es un número entero entre 2 y 20.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (XII), (XIII), (XIV), (VIII), (XV) y (XVI), en las que R_{1} representa un grupo fenilo o naftilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido en el anillo bencénico o naftalénico con uno o más grupos seleccionados independientemente de grupos hidroxilo o grupos ácido carboxílico.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (XII), (XIII), (XIV), (VIII), (XV) y (XVI), en las que R_{4} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo ácido carboxílico o un grupo amino.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (XII), (XIII), (XIV), (VIII), (XV) y (XVI), en las que R_{5} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo ácido carboxílico o un grupo amino.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (XII), (XIII), (XIV), (VIII), (XV) y (XVI), en las que R_{6} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo ácido carboxílico o un grupo amino.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (XII), (XIII), (XIV), (VIII), (XV) y (XVI), en las que Q representa un anillo bencénico o naftalénico.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (XII), (XIII), (XIV) y (VIII), en las que X representa un átomo de nitrógeno.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (XII), (XIII), (XIV) y (VIII), en las que Y representa un grupo -NH-.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (XII), (XIII), (XIV) y (VIII), en las que Z representa un grupo -NH-.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (XII), (XIII), (XIV), (VIII), (XV) y (XVI), en las que n es 0 ó 2.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (XII), (XIII), (XIV), (VIII), (XV) y (XVI), en las que p es 0 ó 2.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (XIII), (XIV) y (XVI), en las que j es 2, 4 ó 6.
En otra realización preferida, la invención se refiere a ligandos de afinidad de las Fórmula General (XI), en la que j es un número entero entre 2 y 20.
Los ligandos de afinidad preferidos según la invención son:
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Además, la invención se refiere a un procedimiento para unir los nuevos ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (VII) como se define anteriormente, (XIII) como se define anteriormente, (XVI) como se define anteriormente y (XI) como se define anteriormente, a matrices de hidratos de carbono o de polímeros orgánicos haciendo reaccionar la matriz de hidrato de carbono o de polímero orgánico con un agente activante, seguido de la reacción de la matriz activada con el nuevo ligando de afinidad, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos. La invención también se refiere a un procedimiento para unir los nuevos ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (XIV) como se define anteriormente a matrices de hidratos de carbono o de polímeros orgánicos mediante condensación con la matriz. Además, la invención se refiere a un procedimiento para unir los nuevos ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (VII) como se define anteriormente, (XIII) como se define anteriormente, (XVI) como se define anteriormente y (XI) como se define anteriormente, a matrices de óxidos metálicos, de vidrio o de sílice, opcionalmente revestidas con un polímero orgánico, haciendo reaccionar a la matriz de óxidos metálicos, de vidrio o de sílice, opcionalmente revestida, con un agente activante, seguido de la reacción de la matriz activada con el nuevo ligando de afinidad, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos. Otra realización de la invención se refiere a un procedimiento para unir los nuevos ligandos de afinidad de Fórmulas Generales (XIV) como se define anteriormente a matrices de óxidos metálicos, de vidrio o de sílice, opcionalmente revestidas con un polímero orgánico, mediante condensación con la matriz. En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento para unir nuevos ligandos de afinidad de Fórmula General (XV) como se define anteriormente y (XII) como se define anteriormente a una matriz de Fórmula General (V) como se define anteriormente, haciendo reaccionar los nuevos ligandos de afinidad con la matriz a temperaturas entre -20ºC y 121ºC, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos. La invención también se refiere a todos los conjugados de matriz con ligando de afinidad, preparados como se describen en los procedimientos anteriores.
En otra realización, la invención se refiere al uso de ligandos de afinidad según la invención, y de los conjugados de matriz con ligando de afinidad, que comprenden tales ligandos, según la invención, para la separación, aislamiento, purificación, caracterización, identificación o cuantificación de proteínas o materiales proteinosos, tales como inmunoglobulinas o subclases, fragmentos, precursores o derivados de las mismas, ya sea que deriven de fuentes naturales o recombinantes, por ejemplo inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina A (IgA), o subclases, fragmentos, precursores o derivados de las mismas, ya sea que deriven de fuentes naturales o recombinantes. En otra realización, la invención se refiere a la separación, aislamiento, purificación, caracterización, identificación o cuantificación de inmunoglobulinas mediante cualquier procedimiento mediante el cual las citadas inmunoglobulinas se aplican a conjugados de matriz con ligando de afinidad según la invención, a un pH en el intervalo de 5,0 hasta 12,0, y después se eliminan, eluyen o desorben reduciendo el pH hasta 4,9 o menos.
La invención también se refiere a un procedimiento para la separación o purificación de materiales proteinosos, que comprende llevar a cabo una cromatografía de afinidad usando, como ligando bioespecífico, un ligando de fórmula general (a) como se define anteriormente.
Otra realización de la invención se refiere al uso de ligandos de afinidad según la invención, y de los conjugados de matriz con ligando de afinidad, que comprenden tales ligandos, según la invención, para la separación, aislamiento, purificación, caracterización, identificación o cuantificación de insulinas y análogos, derivados o fragmentos de las mismas, y precursores, ya sea que deriven de fuentes naturales o recombinantes, y de Factor VII, o de hormona del crecimiento humana, o análogos, derivados y fragmentos de los mismos, y precursores.
A título de ejemplo, se diseñó una librería que comprende más de 60 ligandos diferentes. La librería se identificó sistemáticamente con precursor de insulina parcialmente purificado, y los ligandos seleccionados se inmovilizaron mediante síntesis de fase sólida a agarosa. Las matrices se optimizaron con respecto a la tecnología de acoplamiento, a la longitud y naturaleza del brazo espaciador, a la densidad del ligando, etc., dando como resultado 3 prototipos de capacidad de unión dinámica de 2-5 mg/ml. Se purificó un precursor de insulina derivado recombinantemente hasta más del 95% de pureza a partir de caldo de fermentación de levadura aclarado, mediante una única etapa de purificación por afinidad mimética en condiciones muy suaves.
Un uso especialmente preferido de los ligandos de afinidad según la invención, y de los conjugados de matriz con ligando de afinidad, que comprenden a tales ligandos, según la invención, es de este modo la purificación de insulinas y análogos, derivados y fragmentos de la misma, y precursores, ya sea que deriven de fuentes naturales o recombinantes. Los conjugados de matriz con ligando de afinidad, especialmente preferidos para este uso, comprenden un ligando seleccionado de los siguientes:
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ligando el cual se une a una matriz soporte en posición A como se especifica anteriormente, opcionalmente a través de un brazo espaciador interpuesto entre la matriz y el ligando, representado por la fórmula general (b) como se define anteriormente. Preferiblemente, el ligando es 11a, y la matriz soporte es preferiblemente agarosa opcionalmente activada, celulosa, sílice o vidrio.
En otra realización, la invención se refiere a la separación, aislamiento, purificación, caracterización, identificación o cuantificación de insulinas o de análogos de insulina o derivados de la misma, y precursores, mediante cualquier procedimiento por el que las citadas insulinas, derivados de insulina, análogos y precursores se aplican a los conjugados de matriz con ligando de afinidad según la invención, a pH en el intervalo de 4,0 hasta 9,0, y después se eliminan, eluyen o desorben reduciendo el pH hasta 3,99 o menos, o hasta 9,01 o más. El procedimiento de elución se puede llevar a cabo alternativamente, por ejemplo, reduciendo la fuerza iónica, o mediante adición de codisolventes tales como disolventes orgánicos.
La invención se describirá ahora con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos, y no se deben interpretar como limitantes en ningún modo del alcance de la invención.
Ejemplo 1
Este Ejemplo ilustra la síntesis de un ligando de afinidad típico definido mediante la reacción de compuestos halogenoheterocíclicos de Fórmula General (II) con compuestos de Fórmulas Generales (III) y (IV).
Se disolvieron 19,8 partes de anilina en 50 partes de acetona, y la disolución se pasó a una suspensión formada vertiendo una disolución de 36,8 partes de cloruro cianúrico en partes de 200 partes de acetona en una mezcla de 50 partes de hielo y 50 partes de agua. La mezcla se agitó durante 2 horas, tiempo durante el cual el pH se mantuvo entre 6 y 7 mediante adición de una disolución de 16,8 partes de hidrogenocarbonato de sodio en 300 partes de agua. Al final de este tiempo, el precipitado de 2-anilino-4,6-dicloro-1,3,5-triazina se separó por filtración, se lavó con agua, se secó a vacío, y se cristalizó en diclorometano.
Se añadió una disolución de 2,74 partes de tiramina, en una mezcla de 50 partes de acetona y 10 partes de agua, a una disolución de 4,82 partes de 2-anilino-4,6-dicloro-1,3,5-triazina, en 100 partes de acetona. La mezcla se calentó a 50ºC, y se mantuvo a esta temperatura durante 2 horas mientras el pH se mantenía entre 6 y 7 por adición de una disolución de 1,68 partes de hidrogenocarbonato de sodio en 30 partes de agua. Al final de este tiempo, el precipitado de 2-anilino-4-[\beta-(4'-hidroxifenil)-etilamino]-6-cloro-1,3,5-triazina se separó por filtración, se lavó con agua y se secó a vacío.
Ejemplo 2
Este Ejemplo ilustra la inmovilización del producto del Ejemplo 1 sobre un soporte de fase sólida.
Se transfirieron 10 partes de agarosa que tiene grupos amino en un disolvente de acetona mediante intercambio de disolvente usando 100 partes de acetona acuosa al 30%, seguido de 100 partes de acetona acuosa al 70%, y después 100 partes de acetona. Se disolvió una parte de 2-anilino-4-[\beta-(4'-hidroxifenil)-etilamino]-6-cloro-1,3,5-triazina en 20 partes de acetona, y se calentó hasta 50ºC. Esta disolución de acetona caliente se añadió a la suspensión acetónica de un derivado de agarosa que tiene grupos amino. A la suspensión resultante se le añadió una disolución de 0,42 partes de hidrogenocarbonato de sodio en 5 partes de agua, y la mezcla se agitó entonces durante 16 horas a 50ºC. Al final de este tiempo, la matriz soporte de agarosa se lavó, libre de 2-anilino-4-[\beta-(4'-hidroxifenil)-etilamino]-6-cloro-1,3,5-triazina no enlazada, con acetona. El soporte de afinidad derivatizado resultante se transfirió entonces nuevamente a agua, lavando primero con acetona acuosa al 70%, después con acetona acuosa al 30%, y finalmente con agua.
Ejemplo 3
Este Ejemplo demuestra el uso de la nueva matriz de afinidad descrita en el Ejemplo 2 como una matriz cromatográfica específica para inmunoglobulinas.
Se diluyeron una y un cuarto partes de plasma humano con 3,75 partes de tampón de fosfato acuoso, que tiene un pH de 7 y una concentración de 10 milimoles por litro, y se aplicó a una columna que consiste en 1 parte de matriz de afinidad cuya preparación se describe en el Ejemplo 2. La columna de afinidad se lavó entonces con tampón de fosfato hasta que la monitorización con UV de los licores de lavado mostró que toda la proteína no unida se había eliminado. La matriz de afinidad se lavó entonces con un tampón de citrato, que tiene un pH de 3,8 y una concentración de 0,2 milimoles por litro, hasta que la monitorización con UV del licor de lavado mostró que la eliminación de la proteína enlazada había terminado. La proteína contenida en este licor de lavado mostró ser inmunoglobulina G.
La Tabla 1 da más Ejemplos de los nuevos ligandos de afinidad de la invención que se pueden preparar mediante el procedimiento del Ejemplo 1 pero sustituyendo las 36,8 partes de cloruro cianúrico usado en el Ejemplo 1 por la cantidad correspondiente del compuesto halogenoheterocíclico enumerado en la Columna II de la Tabla; sustituyendo las 19,8 partes de anilina usada en el Ejemplo 1 por la cantidad correspondiente de la amina enumerada en la Columna III de la Tabla; y sustituyendo las 2,74 partes de tiramina usada en el Ejemplo 1 por la cantidad correspondiente de la amina enumerada en la Columna IV de la Tabla. El número del Ejemplo se da en la Columna I de la Tabla.
TABLA 1
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Estos ligandos descritos en los Ejemplos 4-38 se pueden unir a una matriz de agarosa mediante el procedimiento detallado en el Ejemplo 2, y se pueden usar en la purificación de inmunoglobulina G mediante el procedimiento dado en el Ejemplo 3.
Ejemplo 39
Se añadieron 6 partes de etilendiamina a una disolución de 2,5 partes de 2-anilino-4-[\beta-(4'-hidroxifenil)-etilamino]-6-cloro-1,3,5-triazina, en 20 partes de tolueno, y la mezcla se calentó a 100ºC durante 16 horas. El tolueno se separó entonces por evaporación a partir de la mezcla a presión reducida, y el residuo se lavó 5 veces con 100 partes de agua, y después se secó a 70ºC.
La Tabla 2 da más Ejemplos de nuevos ligandos de afinidad de la invención que se pueden preparar mediante el procedimiento del Ejemplo 39 pero sustituyendo las 2,5 partes de 2-anilino-4-[\beta-(4'-hidroxifenil)-etilamino]-6-cloro-1,3,5-triazina usada en el Ejemplo 39 por la cantidad correspondiente de la clorotriazina enumerada en la Columna II de la Tabla 2; y sustituyendo la etilendiamina usada en el Ejemplo 39 por la cantidad correspondiente de la diamina o del compuesto aminohidroxílico enumerado en la Columna III de la Tabla 2.
TABLA 2 
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Ejemplo 58
Este Ejemplo ilustra la inmovilización del compuesto producido en el Ejemplo 39 sobre un soporte en fase sólida.
Se lavaron 60 partes de agarosa que tiene grupos epóxido con 300 partes de agua, seguido de 300 partes de una disolución que consiste en 5,95 partes de hidrogenocarbonato de potasio disuelto en 180 partes de metanol y 120 partes de agua. Se disolvió una parte del compuesto preparado según el Ejemplo 39 en 60 partes de metanol, y se añadió a una disolución de 40 partes de disolución acuosa de hidrogenocarbonato potásico. Entonces se añadieron cien partes de esta disolución metanólica acuosa a la suspensión preparada de 60 partes de agarosa que tiene grupos epoxi, y la suspensión resultante se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 16 horas. La matriz a base de agarosa obtenida se lavó primero con una mezcla de 360 partes de metanol y 240 partes de agua, y después con 600 partes de agua.
Ejemplo 59
Se repite el Ejemplo 3 pero sustituyendo la columna que consiste en 1 parte de matriz de afinidad, cuya preparación se describe en el Ejemplo 2, por una columna que consiste en 1 parte de matriz de afinidad, cuya preparación se describe en el Ejemplo 58. La proteína contenida en el licor de lavado de pH 3,8 nuevamente mostró ser inmunoglobulina G.
Ejemplo 60
Este Ejemplo ilustra la inmovilización del producto obtenido en el Ejemplo 39 sobre un soporte en fase sólida.
Se lavaron 80 partes de agarosa con 1050 partes de agua, seguido de 1050 partes de acetona acuosa al 30%, después 1050 partes de acetona acuosa al 70%, y finalmente 1425 partes de acetona. Las ochenta partes de agarosa se suspendieron entonces en 100 partes de acetona, y la suspensión se calentó hasta 37ºC. Se disolvieron quince partes de cloruro de p-toluenosulfonilo en 15 partes de piridina, y se añadieron 25 partes de acetona a la suspensión de agarosa, y la mezcla se mantuvo a 37ºC durante 8 horas. La agarosa activada se lavó entonces con 225 partes de acetona, seguido de 225 partes de acetona acuosa al 70%, después 225 partes de acetona acuosa al 30%, y finalmente 225 partes de agua.
Se lavaron 45 partes de esta matriz activada con 225 partes de una disolución que consiste en 2,3 partes de hidrogenocarbonato potásico disuelto en una mezcla de 178 partes de metanol y 47 partes de agua. Se añadió una disolución de 0,75 partes del compuesto preparado según el Ejemplo 39, en una mezcla de 45 partes de metanol y 30 partes de agua que contienen 1,5 partes de hidrogenocarbonato potásico, a la suspensión de agarosa activada, y la mezcla se dejó reposar entonces durante 16 horas a temperatura ambiente. La matriz de afinidad resultante se lavó con 270 partes de metanol y 180 partes de agua que contiene 9 partes de hidrogenocarbonato potásico, seguido de 450 partes de agua.
Antes del uso, se suspendieron 115 partes de la matriz de afinidad resultante en una disolución de 0,36 partes de hidróxido sódico en 45 partes de agua.
Ejemplo 61
Si se repite el Ejemplo 3 pero sustituyendo la columna que consiste en una parte de la matriz de afinidad cuya preparación se describe en el Ejemplo 2 por una columna que consiste en una parte de la matriz de afinidad cuya preparación se describe en el Ejemplo 60, nuevamente se demuestra que la proteína contenida en el licor de lavado de pH 3,8 es inmunoglobulina G.
Ejemplo 62
Se dejaron reposar 10 partes de la matriz de afinidad, preparada según el Ejemplo 60, en un tampón de fosfato que tiene un pH de 8,0, durante 16 horas. Se repitió el Ejemplo 3 pero sustituyendo la matriz usada allí con una cantidad equivalente de esta nueva matriz de afinidad, y usando sobrenadante libre de células, procedente de medio de cultivo celular de inmunoglobulina murina, en lugar del plasma humano usado en el Ejemplo 3. Nuevamente se demostró que la proteína contenida en el licor de lavado de pH 3,8 era inmunoglobulina M murina.
La Tabla 3 da más Ejemplos de la unión de los nuevos ligandos de afinidad de la invención que se pueden preparar mediante el procedimiento del Ejemplo 58 pero sustituyendo el nuevo ligando de afinidad usado en el Ejemplo 58 por la cantidad correspondiente del nuevo ligando de afinidad especificado en la Columna II de la Tabla 3, y sustituyendo las 39 partes de agarosa activada con epiclorhidrina, usada en el Ejemplo 58, por la cantidad correspondiente del hidrato de carbono enumerado en la Columna III de la Tabla 3, activado por el reactivo enumerado en la Columna IV de la Tabla 3.
TABLA 3 
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42 
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Ejemplo 70
Si se repite la preparación del ligando detallado en el Ejemplo 1, pero haciendo reaccionar las 2,74 partes de tiramina con 4,84 partes de 2-fenoxi-4,6-dicloro-1,3,5-triazina, en lugar de 4,82 partes de 2-anilino-4,6-dicloro-1,3,5-triazina, se obtiene 2-fenoxi-4-[\beta-(4'-hidroxifenil)-etilamino]-6-cloro-1,3,5-triazina, que se puede usar en lugar de 2-anilino-4-[\beta-(4'-hidroxifenil)-etilamino]-6-cloro-1,3,5-triazina en la preparación de una matriz de afinidad mediante el procedimiento del Ejemplo 2. Nuevamente, la inmunoglobulina G se puede aislar convenientemente a partir de plasma humano mediante la técnica descrita en el Ejemplo 3.
Ejemplo 71
El uso de 5,16 partes de 2-feniltio-4,6-dicloro-1,3,5-triazina en lugar de las 4,84 partes de 2-fenoxi-4,6-dicloro-1,3,5-triazina usada en el Ejemplo 70 da 2-feniltio-4-[\beta-(4'-hidroxifenil)-etilamino]-6-cloro-1,3,5-triazina, que se puede usar de forma similar para purificar inmunoglobulina G.
Ejemplo 72
Este Ejemplo ilustra un enfoque alternativo para producir conjugados de matriz con ligando de afinidad según se ejemplifica en el Ejemplo 2 y en el Ejemplo 58.
Se agitaron a 0-5ºC diez partes de agarosa que tiene grupos aminoetilamino con 5 partes de acetona y 5 partes de un tampón de fosfato acuoso que tiene un pH de 7 y una concentración de 0,5 moles por litro. A esta suspensión se añadieron 2,5 partes de una disolución que comprende 1 parte de cloruro cianúrico en 10 partes de acetona, y la mezcla se agitó entonces durante 1 hora a una temperatura de 0-5ºC. La agarosa activada con diclorotriazina resultante se lavó secuencialmente con 50 partes de acetona acuosa al 50%, con 50 partes de agua, con 50 partes de acetona acuosa al 50%, y con 100 partes de agua. Se añadieron 20 partes de la agarosa activada con diclorotriazina lavada a 20 partes de una disolución acuosa que comprende una parte de tiramina en 200 partes de agua, y la suspensión resultante se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. Al final de este período, la matriz derivatizada resultante se lavó con 200 partes de agua, y se añadió a 20 partes de una disolución acuosa que comprende 0,55 partes de anilina disuelta en 200 partes de agua. La suspensión resultante se agitó durante 16 horas a 90ºC, después de cuyo tiempo la matriz derivatizada se lavó con 200 partes de agua.
Ejemplo 73
Si se repite el Ejemplo 3 pero sustituyendo la columna que consiste en una parte de la matriz de afinidad, cuya preparación se describe en el Ejemplo 2, por una columna que consiste en 1 parte de la matriz de afinidad, cuya preparación se describe en el Ejemplo 72, nuevamente se demuestra que la proteína contenida en el licor de lavado de pH 3,8 es inmunoglobulina G.
Ejemplo 74
Este ejemplo ilustra la síntesis de una librería de conjugados de matriz con ligando de afinidad de esta invención, que se puede identificar sistemáticamente con posterioridad para determinar sus propiedades de unión a proteínas.
Se mezcló una parte de agarosa que tiene grupos amino con 1 parte de tampón de fosfato potásico 1 M, pH 7,0, y se dejó sedimentar por gravedad. La agarosa amínica tamponada se transfirió a una vasija de reacción y se mezcló a 0-5ºC con 0,5 partes de tampón de fosfato potásico 0,5 M, pH 7,0, y con 0,5 partes de acetona. Se añadió una cuarta parte de una disolución que comprende 1 parte de cloruro cianúrico en 10 partes de acetona, y la mezcla se agitó a 0-5ºC durante 1 hora, después de lo cual la mezcla se filtró y se lavó secuencialmente con 10 partes de acetona al 50%, 6 partes de agua, 6 partes de acetona al 50% y 10 partes de agua, para proporcionar la agarosa activada con 2,4-dicloro-s-triazin-6-ilo.
Se añadió una parte de la agarosa activada con 2,4-dicloro-s-triazin-6-ilo a 5 equivalentes molares del compuesto amínico enumerado en la Columna II de la Tabla 4 disuelto en 2 a 3 partes de una disolución que comprende 1 parte de acetona y 1 parte de agua, y se ajustó hasta pH neutro mediante adición de hidróxido sódico. La suspensión se mezcló durante 24 horas a 30ºC. Las agarosas resultantes activadas con monocloro-s-triazin-6-ilo se lavaron secuencialmente con 10 partes de dimetilformamida, 10 partes de una disolución que comprende 3 partes de propan-2-ol y 7 partes de hidróxido sódico 0,2 M, 10 partes de agua, y se dejó sedimentar por gravedad.
Se añadió una parte de la agarosa activada con monocloro-s-triazin-6-ilo a 6 equivalentes molares del compuesto amínico enumerado en la Columna III de la Tabla 4 disuelto en 2 a 3 partes de una disolución que comprende 1 parte de dimetilformamida y 1 parte de agua, y se ajustó hasta pH neutro mediante adición de hidróxido sódico. La suspensión se mezcló durante 72 horas a 85 hasta 95ºC. Los conjugados de matriz con ligando de afinidad resultantes se lavaron secuencialmente con 10 partes de dimetilformamida, 10 partes de una disolución que comprende 3 partes de propan-2-ol y 7 partes de hidróxido sódico 0,2 M, 10 partes de agua, y se dejaron sedimentar por gravedad. Se sintetizó una librería de conjugados de matriz con ligando de afinidad de esta invención, cuyos Ejemplos se identifican en la Columna I de la Tabla 4.
TABLA 4
43
Ejemplo 128
Este ejemplo demuestra el proceso de identificación sistemática mediante el cual se pueden identificar las propiedades de unión a proteínas de los conjugados de matriz con ligando de afinidad descritos en el Ejemplo 74.
Se empaquetaron columnas cromatográficas de 1 ml de volumen total con conjugados de matriz con ligando de afinidad de los Ejemplos 75-127. Las columnas se equilibraron haciendo pasar 10 ml de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0. Se aplicó un ml de una disolución que comprende 1,5 mg de IgG humana por ml de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0, a cada columna cromatográfica, que se lavaron posteriormente con 10 ml de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 8,0, para eliminar la IgG no unida. La IgG unida se eluyó haciendo pasar en cada columna 5 ml de tampón de citrato de sodio 50 mM, pH 3,0. El contenido de IgG del lavado y de las fracciones de la elución se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm frente a un blanco de tampón. El análisis de los resultados reveló que los conjugados de matriz con ligando de afinidad de los Ejemplos 75 a 127 mostraron todos unión a IgG humana. De estos, se logró la elución casi cuantitativa de la IgG unida para los conjugados de matriz con ligando de afinidad de los Ejemplos 92, 99, 101, 102, 103, 111, 113 y 119, que, como consecuencia, se consideran de valor excepcional en la separación, aislamiento o purificación de IgG humana.
Ejemplo 129
Unión selectiva y elución de Factor de Coagulación Recombinante VIIa (rFVIIa) aplicado a la matriz de afinidad según el Ejemplo 181 y procedente de medios de cultivo celular Procedimiento
Se empaquetaron 0,85 ml de volumen sedimentado de la matriz de afinidad, preparada como en el ejemplo 181, en una columna de 5 por 50 mm (Pharmacia HR 5/5), y se equilibró con 20 ml de tampón A.: 20 mM de Tris, 50 mM de NaCl, 5 mM de CaCl_{2}, pH 8,0.
A la columna empaquetada se aplicaron 5 ml de sobrenadante de cultivo celular BHK acondicionado, enriquecido con 1,4 mg de rFVIIa. Después de separar por lavado con 10 ml de tampón A a las proteínas que no se unen, en rFVIIa se eluyó aplicando 5 ml de tampón B: 20 mM de citrato trisódico, 50 mM de Tris pH 8,0.
El caudal durante el procedimiento cromatográfico fue de 0,3 ml/minuto.
El efluente de la columna se hizo pasar a través de un monitor de UV en línea, y se recogió en una fracción de 1 ml, y cada fracción se analizó para determinar el contenido de rFVIIa y la proteína total mediante cromatografía de líquidos de altas prestaciones de fase inversa analítica (RP-HPLC).
Resultados
El resultado del monitor de UV mostró que la mayoría del material absorbente de UV (280 nm) salió durante la aplicación del sobrenadante y del lavado posterior con tampón A. Durante la siguiente elución con tampón B se monitorizó un pico distinto, que correspondió con el tamaño esperado para la cantidad de rFVIIa aplicada.
El análisis de RP-HPLC de las fracciones recogidas mostró que el 90% de la cantidad de rFVIIa aplicada salió en las fracciones durante la elución con tampón B. La pureza de rFVIIa en estas fracciones fue superior a 95%.
Los resultados muestran que se logró la unión selectiva de rFVIIa procedente de medios de cultivo enriquecidos al ligando usado.
Ejemplo 130
Purificación de insulina B-cadena^{1-29}-A-A-K-insulina A-cadena^{1-21} en un conjugado de matriz con ligando de afinidad según el Ejemplo 171
Se suspendieron 255 mg de insulina B-cadena^{1-29}-Ala-Ala-Lys-insulina A- cadena^{1-21} (lote A202558) en 51 ml de H_{2}O. Se añadieron 10 gotas de ácido acético 1 M para solubilizar el precursor. Se añadió citrato potásico 0,2 M, pH 5,5, hasta un volumen total de 510 ml, dando como resultado una disolución de 0,12 mg/ml (mediante análisis de RP-HPLC). El pH medido fue 5,53, la fuerza iónica fue 30,0 mS/cm, y el potencial redox fue 273 mV.
Se aplicaron 400 ml de la disolución anterior a una columna Pharmacia K16 (1,6 x 6 cm) empaquetada con 12 ml del conjugado de matriz anterior, equilibrada en citrato potásico 0,2 M pH 5,5, a 1,8 ml/min, a temperatura ambiente. La columna se lavó en 50 ml de citrato potásico 0,2 M, pH 5,5, y después se eluyó con ácido acético 0,1 M a 1,8 ml/min. Se recogieron 12 fracciones de 5,0 ml.
La columna se limpió con 50 ml de NaOH 0,5 M, y se regeneró con 50 ml de ácido cítrico 0,1 M, 60% v/v de etanol. Las muestras para análisis de RP-HPLC se diluyeron con ácido acético 2 M antes del análisis.
45
De este modo, se obtuvo una recuperación total de 83%.
La pureza del producto se determinó que era 94% mediante análisis de RP-HPLC. Las impurezas restantes estaban relacionadas con la insulina.
Ejemplo 131
Purificación de des-Thr^{830}-insulina en un conjugado de matriz con ligando de afinidad según el Ejemplo 171
Se suspendieron 150 mg de des-Thr^{830}-insulina (INS-J-009) en 50 ml de H_{2}O. Se añadieron 5 gotas de ácido acético 2 M para disolver la suspensión. Se añadió 0,2 M de citrato potásico pH 5,5 hasta un volumen de 500 ml, dando como resultado una concentración de 0,076 mg/ml (mediante análisis de RP-HPLC). El pH medido fue 5,52, la fuerza iónica fue 30,0 mS/cm, y el potencial redox fue 264 mV. Se aplicaron 400 ml de la disolución anterior a una columna Pharmacia K16 (1,6 x 6 cm) empaquetada con 12 ml del conjugado de matriz anterior, equilibrada en citrato potásico 0,2 M, pH 5,5, a 1,8 ml/min a temperatura ambiente. La columna se lavó en 50 ml de citrato potásico 0,2 M, pH 5,5, y después se eluyó con ácido acético 0,1 M, a 1,8 ml/min. Se recogieron 10 fracciones de 5,0 ml.
La columna se limpió con 50 ml de NaOH 0,5 M, y se regeneró con 50 ml de ácido cítrico 0,1 M, 60% v/v de etanol. Las muestras para análisis de RP-HPLC se diluyeron con ácido acético 2 M antes del análisis.
46 
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De este modo se obtuvo una recuperación total de 71%.
Se determinó que la pureza del producto era 91% mediante análisis de RP-HPLC. Las impurezas restantes estaban relacionadas con la insulina.
Ejemplo 132
Purificación de insulina B-cadena^{1-29}-A-A-K-insulina A-cadena^{1-21} en un conjugado de matriz con ligando de afinidad según el Ejemplo 145
Se ajustaron 2 l de caldo centrifugado (lote 628) hasta pH 5,5 con NaOH 5 M, y se filtraron a través de un filtro Leitz Tiefenfilter (Seitz EK), seguido de la filtración a través de un filtro Leitz Tiefenfilter (Seitz EKS). La concentración se midió a 0,006 mg/ml mediante RP-HPLC. La fuerza iónica fue 12,2 mS/cm, y el potencial redox fue 316 mV.
Se aplicaron 1000 ml de la disolución anterior a una columna Pharmacia K16 (1,6 x 6 cm) empaquetada con 12 ml del conjugado de matriz anterior, equilibrada en citrato de potasio 0,2 M, pH 5,5, a 1,8 ml/min a temperatura ambiente. La columna se lavó en 50 ml de citrato potásico 0,2 M, pH 5,5, y después se eluyó con ácido acético 0,1 M a 1,8 ml/min. Se recogieron 11 fracciones de 5,0 ml.
La columna se limpió con 50 ml de NaOH 0,5 M, y se regeneró con 50 ml de ácido cítrico 0,1 M, 60% v/v de etanol. Las muestras para análisis de RP-HPLC se diluyeron con ácido acético 2 M antes del análisis.
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47
De este modo se obtuvo una recuperación total de 63%.
Se determinó que la pureza del producto era 88% mediante análisis de RP-HPLC. Las impurezas restantes estaban relacionadas con insulina.
Ejemplo 133
Purificación de insulina B-cadena^{1-29}-A-A-K-insulina A-cadena^{1-21} en un conjugado de matriz con ligando de afinidad según el Ejemplo 171
Se ajustaron 2 l de caldo centrifugado (lote 628) hasta pH 5,5 con NaOH 5 M, y se filtraron a través de un filtro Leitz Tiefenfilter (Seitz EK), seguido de la filtración a través de un filtro Leitz Tiefenfilter (Seitz EKS). La concentración fue 0,006 mg/ml mediante RP-HPLC. La fuerza iónica fue 12,2 mS/cm, y el potencial redox fue 316 mV.
Se aplicaron 1000 ml de la disolución anterior a una columna Pharmacia K16 (1,6 x 6 cm) empaquetada con 12 ml del conjugado de matriz anterior, equilibrada en citrato de potasio 0,2 M, pH 5,5, a 1,8 ml/min a temperatura ambiente. La columna se lavó en 50 ml de citrato potásico 0,2 M, pH 5,5, y después se eluyó con ácido acético 0,1 M a 1,8 ml/min. Se recogieron 11 fracciones de 5,0 ml.
La columna se limpió con 50 ml de NaOH 0,5 M, y se regeneró con 50 ml de ácido cítrico 0,1 M, 60% v/v de etanol. Las muestras para análisis de RP-HPLC se diluyeron con ácido acético 2 M antes del análisis.
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48
De este modo se obtuvo una recuperación total de 74%.
Se determinó que la pureza del producto era 86% mediante análisis de RP-HPLC. Las impurezas restantes estaban relacionadas con insulina.
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Ejemplo 134
Purificación de EEAEPK-insulina B-cadena(1-29)-A-A-K-insulina A-cadena(1-21) en un conjugado de matriz con ligando de afinidad según el Ejemplo 171
El caldo de levadura centrifugado (lote Y44) se filtró a través de un filtro Leitz Tiefenfilter (Seitz EK), dando como resultado una concentración de 0,35 mg/ml (mediante análisis de RP-HPLC). El pH fue 5,27, la fuerza iónica fue 7,38 mS/cm, y el potencial redox fue 221 mV.
Se aplicaron 120 ml de la disolución anterior a una columna Pharmacia K16 (1,6 x 6 cm) empaquetada con 12 ml del conjugado de matriz anterior, equilibrada en citrato de potasio 0,2 M, pH 5,5, a 1,8 ml/min a temperatura ambiente. La columna se lavó en 50 ml de citrato potásico 0,2 M, pH 5,5, y después se eluyó con ácido acético 0,1 M a 1,8 ml/min. Se recogieron 11 fracciones de 5,0 ml.
La columna se limpió con 50 ml de NaOH 0,5 M, y se regeneró con 50 ml de ácido cítrico 0,1 M, 60% v/v de etanol. Las muestras para análisis de RP-HPLC se diluyeron con ácido acético 2 M antes del análisis.
49
De este modo se obtuvo una recuperación total de 79%. Se determinó que la pureza del producto era 93% mediante análisis de RP-HPLC. Las impurezas restantes estaban relacionadas con insulina.
Ejemplo 135
Purificación de [Asp^{828}]-insulina B-cadena^{1-29}-A-A-K-insulina A-cadena^{1-21} en un conjugado de matriz con ligando de afinidad según el Ejemplo 171
El caldo centrifugado (lote GSG9414) se ajustó hasta pH 5,5 con NaOH 5 M, y se filtró a través de un filtro Leitz Tiefenfilter (Seitz EK), seguido de la filtración a través de un filtro Leitz Tiefenfilter (Seitz EKS). La concentración fue 0,02 mg/ml mediante RP-HPLC. La fuerza iónica fue 17,0 mS/cm, y el potencial redox fue 308 mV.
Se aplicaron 800 ml de la disolución anterior a una columna Pharmacia K16 (1,6 x 6 cm) empaquetada con 12 ml del conjugado de matriz anterior, equilibrada en citrato de potasio 0,2 M, pH 5,5, a 1,8 ml/min a temperatura ambiente. La columna se lavó en 50 ml de citrato potásico 0,2 M, pH 5,5, y después se eluyó con ácido acético 0,1 M a 1,8 ml/min. Se recogieron 12 fracciones de 5,0 ml.
La columna se limpió con 50 ml de NaOH 0,5 M, y se regeneró con 50 ml de ácido cítrico 0,1 M, 60% v/v de etanol. Las muestras para análisis de RP-HPLC se diluyeron con ácido acético 2 M antes del análisis.
50
De este modo se obtuvo una recuperación total de 75%.
Se determinó que la pureza del producto era 84% mediante análisis de RP-HPLC. Las impurezas restantes estaban relacionadas con insulina.
Ejemplo 136
Este ejemplo demuestra adicionalmente el proceso de identificación sistemática mediante el cual se pueden identificar las propiedades de unión a proteínas de los conjugados de matriz con ligando de afinidad de la invención.
Se sintetizó una librería de conjugados de matriz con ligando de afinidad de esta invención según el ejemplo 74, excepto que se sustituyeron los 5 equivalentes en moles del compuesto amínico enumerado en la Columna II de la Tabla 4 por la cantidad correspondiente del compuesto amínico enumerado en la Columna II de la Tabla 5, y se sustituyeron los 5 equivalentes molares del compuesto amínico enumerado en la Columna III de la Tabla 4 por la cantidad correspondiente del compuesto amínico enumerado en la Columna III de la Tabla 5. Se sintetizó una librería de conjugados de matriz con ligando de afinidad de esta invención, cuyos Ejemplos se identifican en la Columna I de la Tabla 5.
Se empaquetaron columnas cromatográficas de 1 ml de volumen total con conjugados de matriz con ligando de afinidad de los Ejemplos 137-180. Las columnas se equilibraron haciendo pasar 10 ml de tampón de cloruro de sodio 0,1 M y acetato de sodio 0,2 M, pH 5,0. Se aplicaron doce ml de caldo fermentado aclarado, que contiene 50 mg/ml de precursor de insulina humana, a cada columna cromatográfica, que se lavaron subsiguientemente con 12 ml de tampón de cloruro de sodio 0,1 M y acetato de sodio 0,2 M, pH 5,0, para eliminar el material no unido. El precursor de insulina humana enlazado se eluyó haciendo pasar en cada columna 3 ml de ácido acético 2 M. El contenido de precursor de insulina humana de las fracciones de mojado, de lavado y de elución se determinó mediante cromatografía de líquidos de altas prestaciones (HPLC) usando una columna de sílice de fase inversa C18 (4 x 250 mm) y un sistema disolvente que comprende tampón A (0,2 M de sulfato de sodio, 40 mM de ácido fosfórico y 10% (v/v) de acetonitrilo, pH 2) y tampón B (50% (v/v) de acetonitrilo) suministrado a un caudal de 1 ml por minuto en proporciones de 55% de tampón A a 45% de tampón B. El tiempo de elución del precursor de insulina humana se determinó por comparación con un patrón de referencia.
El análisis de los resultados reveló que los conjugados de matriz con ligando de afinidad de los Ejemplos 139, 140, 145, 148, 153, 159, 162, 163, 164, 166, 167, 170, 171, 173, se unieron todos al precursor de insulina humana, que se eluyó en las condiciones descritas en este Ejemplo. Como consecuencia, se considera que los conjugados de matriz con ligando de afinidad de los Ejemplos 139, 140, 145, 148, 153, 159, 162, 163, 164, 166, 167, 170, 171, 173, son de valor excepcional en la separación, aislamiento o purificación del precursor de insulina humana.
TABLA 5
51
TABLA 5 (continuación) 
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52 
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Ejemplo 181
Este ejemplo demuestra el procedimiento mediante el cual se pueden sintetizar los conjugados de matriz con ligando de afinidad de esta invención, que son valiosos para la purificación de Factor VII.
Se sintetizó un conjugado de matriz con ligando de afinidad de esta invención según el Ejemplo 74, excepto que los 5 equivalentes molares del compuesto amínico enumerado en la Columna II de la Tabla 4 se sustituyeron por la cantidad correspondiente de 2-aminobencimidazol, y los 5 equivalentes molares del compuesto amínico enumerado en la Columna III de la Tabla IV se sustituyeron por ácido 3-amino-2-naftoico. Este conjugado de matriz con ligando de afinidad se puede usar para la purificación de Factor VIIa según el Ejemplo 129 de esta invención.
Ejemplo 182
Purificación de EEAEPK-insulina B-cadena^{1-29}-A-A-K-insulina A-cadena^{1-21} en un conjugado de matriz con ligando de afinidad según el Ejemplo 171
Se aplicaron 50 ml de precursor de insulina (EEAEPK-insulina B-cadena^{1-29}-A-A-K-insulina A-cadena^{1-21}, a 2,2 mg/ml), purificado mediante intercambio iónico, a una columna Pharmacia K16 (1,6 x 6 cm) empaquetada con 12 ml del conjugado de matriz, equilibrada con citrato potásico 0,2 M, pH 5,5, a 1,8 ml/min a temperatura ambiente. La columna se lavó con 50 ml de citrato potásico 0,1 M, sulfato potásico 0,2 M, pH 5,5, y después se eluyó con ácido acético 0,1 M a 1,8 ml/min. Se recogieron fracciones de 5,0 ml.
La columna se limpió con 50 ml de NaOH 0,5 M, y se regeneró con 50 ml de ácido acético 0,1 M, 60% v/v de etanol. Las muestras para análisis de RP-HPLC se diluyeron con ácido acético 2 M antes del análisis.
53
Se demostró una capacidad de unión dinámica de 9,5 mg/ml de la matriz, con un rendimiento de 88% del precursor.

Claims (73)

1. Conjugados de matriz con ligando de afinidad que comprenden un ligando con la fórmula general (a):
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54
en la que
R_{1} representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo hidroxialquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo ciclohexilo, un grupo amino, un grupo fenilo, grupo naftilo, 1-fenilpirazol, indazol, grupo benzotiazol, grupo benzoxazol, o un grupo bencimidazol, estando cada anillo de benceno, naftaleno, 1-fenilpirazol, indazol, benzotiazol, benzoxazol o bencimidazol opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en grupos alquilo que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, grupos alcoxi que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, grupos aciloxi o acilamino que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos ácido carboxílico, grupos ácido sulfónico, grupos carbamoílo, grupos sulfamoílo, grupos alquilsulfonilo que contienen de 1 a 6 átomos de carbono, y átomos de halógeno;
Y representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo N-R_{2};
Z representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo N-R_{3};
R_{2} y R_{3} representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo hidroxialquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo bencilo o un grupo \beta-feniletilo;
R_{4}, R_{5} y R_{6} representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo alcoxi que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo amino, un grupo aciloxi o acilamino que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, un grupo ácido carboxílico, un grupo ácido sulfónico, un grupo carbamoílo o sulfamoílo, un grupo alquilsulfonilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, o un átomo de halógeno;
uno de los símbolos X representa un átomo de nitrógeno, y el otro símbolo X representa un átomo de nitrógeno o un átomo de carbono que tiene un átomo de cloro o un grupo ciano;
Q representa un anillo de benceno, naftaleno, 1-fenilpirazol, indazol, benzotiazol, benzoxazol, o bencimidazol;
n es un número entero entre 0 y 6;
p es un número entero entre 0 y 20;
y
ligando el cual está unido a una matriz soporte en la posición A, opcionalmente a través de un brazo espaciador interpuesto entre la matriz y el ligando,
con la condición de que la fórmula (a) no comprenda los productos de reacción de los compuestos ácido 4-cloro-2,6-di-(fenilamino)-1,3,5-triazin-3'-sulfónico, ácido 4-cloro-2,6-di(fenilamino)-1,3,5-triazin-3',2''-disulfónico, y ácido 4-cloro-2-(4''-aminofenilamino)-1,3,5-triazin-3',2''-disulfónico con Dextran T 500.
2. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según la reivindicación 1, en los que el brazo espaciador opcional, interpuesto entre el ligando y la matriz, está representado preferiblemente mediante la fórmula general (b)
(b)-T-[-L-V-]_{m}-
en la que T representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo -N-R_{7}; en el que R_{7} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono;
V representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo -COO-, un grupo CONH o un grupo NHCO o un grupo -PO_{3}H-, un grupo NH-arileno-SO_{2}-CH_{2}-CH_{2} o un grupo N-R_{8}; en el que R_{8} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono;
L representa un enlace hidrocarbonado opcionalmente sustituido que contiene de 2 a 20 átomos de carbono; y
m es 0 ó 1.
3. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según la reivindicación 1, que se representan mediante la Fórmula General (I):
55
en la que
R_{1}, Y, Z, R_{2}, R_{3}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, X, Q, n y p son como se definen anteriormente,
T representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo N-R_{7};
V representa un átomo de oxígeno, un átomo de azufre, un grupo -COO-, un grupo CONH o un grupo NHCO o un grupo -PO_{3}H-, un grupo NH-arileno-SO_{2}-CH_{2}-CH_{2} o un grupo N-R_{8};
R_{7} y R_{8} representan cada uno independientemente un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono;
L representa un enlace hidrocarbonado opcionalmente sustituido que contiene de 2 a 20 átomos de carbono;
m es 0 ó 1; y
M representa el resto de una matriz soporte.
4. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que M representa el resto de una matriz soporte que puede ser cualquier compuesto o material, en partículas o no partículas, soluble o insoluble, poroso o no poroso, que se puede usar en combinación con ligandos de afinidad para formar un nuevo conjugado de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y que proporciona un medio conveniente para separar de los solutos a los ligandos de afinidad en una disolución de contacto.
5. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que R_{1} representa un grupo fenilo o naftilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido en el anillo bencénico o naftalénico con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste en grupos hidroxilo o grupos ácido carboxílico.
6. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que R_{2} representa un átomo de hidrógeno.
7. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que R_{3} representa un átomo de hidrógeno.
8. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que R_{4} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo ácido carboxílico, o un grupo amino.
9. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que R_{5} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo ácido carboxílico, o un grupo amino.
10. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que R_{6} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo ácido carboxílico, o un grupo amino.
11. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que R_{7} representa un átomo de hidrógeno.
12. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que T representa un átomo de oxígeno o un grupo NH.
13. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que Y representa N-R_{2}, en el que R_{2} es como se define anteriormente.
14. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que Z representa N-R_{3}, en el que R_{3} es como se define anteriormente.
15. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que ambos X representan un átomo de nitrógeno.
16. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que Q representa un anillo bencénico o naftalénico.
17. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que n representa 0 ó 2.
18. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que p representa 0 ó 2.
19. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que m representa 0 ó 1.
20. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que L representa un grupo etilo, propilo, hidroxipropilo, butilo, pentilo, hexilo, octilo o decilo, y V y m son como se definen anteriormente.
21. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que V representa un átomo de oxígeno o un grupo NH, y L y m son como se definen anteriormente.
22. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que m representa 1, y L y V son como se definen anteriormente.
23. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en los que el resto de una matriz soporte M representa agarosa opcionalmente activada, sílice, celulosa, vidrio, toyopearl, metacrilato de hidroxietilo, poliacrilamida, estirendivinilbenceno, Hyper D, perfluorocarbonos.
24. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según la reivindicación 23, en los que M representa agarosa opcionalmente activada con tresilo, activada con cloruro de sulfonilo, activada con tosilo, activada con vinilsulfona o activada con epoxi.
25. Conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, seleccionados de entre:
i)
56
ii)
57
iii)
58
iv)
59
v)
60
vi)
61
vii)
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62 
\newpage
viii)
63 
\vskip1.000000\baselineskip
en las que M es como se define anteriormente.
26. Procedimiento para la fabricación de los nuevos conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende hacer reaccionar, en cualquier orden, un compuesto halogenoheterocíclico de Fórmula General (II):
64
en la que los símbolos X tienen los significados especificados en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y W representan un átomo de halógeno, con
(i) un compuesto de Fórmula General (III):
(III)R_{1}-(CH_{2})_{p}-Y-H
en la que los símbolos R_{1}, p e Y tienen los significados especificados en cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
(ii) un compuesto de Fórmula General (IV)
65
en la que los símbolos R_{4}, R_{5}, R_{6}, Q, Z y n tienen los significados especificados en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y
(iii) una matriz soporte opcionalmente derivatizada de Fórmula General V
(v)H-T-[-L-V-]_{m}-M
en la que los símbolos L, M, V, T y m tienen los significados especificados en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
27. Procedimiento para la fabricación de los nuevos conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende hacer reaccionar, en cualquier orden, un compuesto halogenoheterocíclico de Fórmula General (II), según la reivindicación 26, con
(i) un compuesto de Fórmula General (III) según la reivindicación 26
(ii) un compuesto de Fórmula General (IV) según la reivindicación 26, y
(iii) con una unidad enlazante de Fórmula General (VI)
(VI)H-T-L-V-H
en la que los símbolos H, L, V y T tienen los significados especificados en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para dar un compuesto de Fórmula General (VII):
66
en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, Q, L, T, V, X, Y, Z, m, n y p tienen los significados especificados en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, seguido de la reacción del compuesto de Fórmula General (VII) con una matriz soporte.
28. Nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (XII):
67
en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, Q, X, Y, Z, n y p tienen los significados especificados en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y Halógeno representa un átomo de flúor, cloro, bromo o yodo; con la condición de que la fórmula (XII) no comprenda los compuestos ácido 4-cloro-2,6-di-(fenilamino)-1,3,5-triazin-3'-sulfónico, ácido 4-cloro-2,6-di(fenilamino)-1,3,5-triazin-3',2''-disulfónico, y ácido 4-cloro-2-(4''-aminofenilamino)-1,3,5-triazin-3',2''-disulfónico.
29. Procedimiento para unir nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (XII) según la reivindicación 28 a una matriz de Fórmula General (V), según la reivindicación 26, haciendo reaccionar los nuevos ligandos de afinidad con la matriz a temperaturas entre -20ºC y 121ºC, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos.
30. Nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (XIII):
68
en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, Q, X, Y, Z, m, n y p tienen los significados especificados en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y j es un número entero entre 2 y 20.
31. Procedimiento para preparar nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (XIII) según la reivindicación 30 haciendo reaccionar un compuesto de la Fórmula General (XII), según la reivindicación 28, con una alquilendiamina de Fórmula General H_{2}N-(CH_{2})_{j}-NH_{2}- a temperaturas entre 0ºC y 100ºC, en presencia de un agente de unión a ácidos.
32. Nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (XIV):
69
en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, Q, X, Y, Z, m, n y p tienen los significados especificados en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, q es 0 ó 1, y j es un número entero entre 2 y 20.
33. Procedimiento para preparar nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (XIV) según la reivindicación 32 haciendo reaccionar un compuesto de la Fórmula General (XII), según la reivindicación 28, con un compuesto aminohidroxílico de Fórmula General H_{2}N-(CH_{2})_{j}-(CO)_{q}-OH a temperaturas entre 0ºC y 100ºC, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos.
34. Nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (VIII):
70
en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, L, Q, T, V, X, Y, Z, m, n y p tienen los significados especificados en cualquiera de las reivindicaciones anteriores; R_{9} representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono; R_{10} representa un grupo carbonilo, un grupo metileno, un grupo -NH-CH_{2}- o un grupo -S-CH_{2}-.
35. Nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (XV):
\vskip1.000000\baselineskip
71
en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, Q, n y p tienen los significados especificados en cualquiera de las reivindicaciones anteriores; con la condición de que la fórmula (XV) no comprenda los compuestos ácido 4-cloro-2,6-di-(fenilamino)-1,3,5-triazin-3'-sulfónico, ácido 4-cloro-2,6-di(fenilamino)-1,3,5-triazin-3',2''-disulfónico, y ácido 4-cloro-2-(4''-aminofenilamino)-1,3,5-triazin-3',2''-disulfónico.
36. Nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (XVI):
72
en la que R_{1}, R_{4}, R_{5}, R_{6}, Q, n y p tienen los significados especificados en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y j es un número entero entre 2 y 20.
37. Ligandos de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones 28, 30, 32, 34, 35 ó 36, en los que R_{1} representa un grupo fenilo o naftilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido en el anillo bencénico o naftalénico con uno o más grupos seleccionados independientemente de grupos hidroxilo o grupos ácido carboxílico.
38. Ligandos de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones 28, 30, 32, 34, 35 ó 36, en los que R_{4} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo ácido carboxílico o un grupo amino.
39. Ligandos de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones 28, 30, 32, 34, 35 ó 36, en los que R_{5} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo ácido carboxílico o un grupo amino.
40. Ligandos de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones 28, 30, 32, 34, 35 ó 36, en los que R_{6} representa un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un grupo ácido carboxílico o un grupo amino.
41. Ligandos de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones 28, 30, 32, 34, 35 ó 36, en los que Q representa un anillo bencénico o naftalénico.
42. Ligandos de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones 28, 30, 32 ó 34, en los que X representa un átomo de nitrógeno.
43. Ligandos de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones 28, 30, 32, 34 ó 35, en los que Y representa un grupo -NH-.
44. Ligandos de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones 28, 30, 32, 34 ó 35, en los que en las que Z representa un grupo -NH-.
45. Ligandos de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones 28, 30, 32, 34, 35 ó 36, en los que n es 0 ó 2.
46. Ligandos de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones 28, 30, 32, 34, 35 ó 36, en los que p es 0 ó 2.
47. Ligandos de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones 30, 32 ó 36, en los que j es 2, 4 ó 6.
48. Ligandos de afinidad según la reivindicación 34, en los que L es un grupo etilo, butilo o hexilo.
49. Ligandos de afinidad según la reivindicación 34, en los que T representa un grupo -NH-.
50. Ligandos de afinidad según la reivindicación 34, en los que V representa un grupo -NH-.
51. Ligandos de afinidad según la reivindicación 34, en los que m es 1.
52. Nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (XI):
73
en la que j es un número entero entre 2 y 20.
53. Ligandos de afinidad según cualquiera las reivindicaciones 28 a 51, seleccionados entre los siguientes:
74
75
76
77
78 
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79 
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80
81
82 
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83
84
85
86
54. Uso de ligandos de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la preparación de conjugados de matriz con ligando de afinidad.
55. Procedimiento para unir los nuevos ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (VII) como se define en la reivindicación 27, (XIII) como se define en la reivindicación 30, (XVI) como se define en la reivindicación 36 y (XI) como se define en la reivindicación 52, a matrices de hidratos de carbono o de polímeros orgánicos haciendo reaccionar a la matriz de hidrato de carbono o de polímero orgánico con un agente activante, seguido de la reacción de la matriz activada con el nuevo ligando de afinidad, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos.
56. Procedimiento para unir los nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (XIV) como se define en la reivindicación 32 a matrices de hidratos de carbono o de polímeros orgánicos mediante condensación con la matriz.
57. Procedimiento para unir los nuevos ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (VII) como se define en la reivindicación 27, (XIII) como se define en la reivindicación 30, (XVI) como se define en la reivindicación 36 y (XI) como se define en la reivindicación 52, a matrices de óxidos metálicos, de vidrio o de sílice, opcionalmente revestidas con un polímero orgánico, haciendo reaccionar con un agente activante a la matriz de óxido metálico, de vidrio o de sílice, opcionalmente revestida, seguido de la reacción de la matriz activada con el nuevo ligando de afinidad, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos.
58. Procedimiento para unir los nuevos ligandos de afinidad de la Fórmula General (XIV) como se define en la reivindicación 32 a matrices de óxidos metálicos, de vidrio o de sílice, opcionalmente revestidas con un polímero orgánico, mediante condensación con la matriz.
59. Procedimiento para unir los nuevos ligandos de afinidad de las Fórmulas Generales (XV) como se define en la reivindicación 35 y (XII) como se define en la reivindicación 28 a una matriz de Fórmula General (V) como se define en la reivindicación 26, haciendo reaccionar los nuevos ligandos de afinidad con la matriz a temperaturas entre -20ºC y 121ºC, opcionalmente en presencia de un agente de unión a ácidos.
60. Conjugados de matriz con ligando de afinidad, preparados según las reivindicaciones 26, 27, 29, 54, 55, 56, 57 y 58.
61. Uso de conjugados de matriz con ligando de afinidad según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la separación, aislamiento, purificación, caracterización, identificación o cuantificación de proteínas.
62. Uso según la reivindicación 61, en el que el material proteinoso es I_{g}G, I_{g}M, I_{g}A, insulinas, Factor VII, u hormona de crecimiento humana, o análogos, derivados y fragmentos de los mismos, y precursores.
63. Procedimiento para la separación o purificación de materiales proteinosos, que comprende llevar a cabo una cromatografía de afinidad usando, como ligando bioespecífico, un ligando de fórmula general (a) como se define anteriormente.
64. Uso según la reivindicación 61, en el que el material proteinoso es inmunoglobulinas, o subclases, fragmentos, precursores o derivados de las mismas, ya sea que deriven de fuentes naturales o recombinantes.
65. Uso según la reivindicación 61, en el que el material proteinoso es inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina A (IgA), o subclases, fragmentos, precursores o derivados de las mismas, ya sea que deriven de fuentes naturales o recombinantes.
66. Uso según la reivindicación 61, en el que el material proteinoso es insulinas o análogos de insulinas, derivados y fragmentos de las mismas, y precursores, ya sea que deriven de fuentes naturales o recombinantes.
67. Uso según la reivindicación 61, en el que el material proteinoso es FVII, o análogos, derivados y fragmentos del mismo, y precursores, ya sea que deriven de fuentes naturales o recombinantes.
68. Uso según la reivindicación 61, en el que los conjugados de matriz con ligando de afinidad comprenden un ligando seleccionado entre los siguientes:
87
88 
\vskip1.000000\baselineskip
89
ligando el cual está unido a una matriz soporte en posición (A), opcionalmente a través de un brazo espaciador representado mediante la fórmula general (b) como se especifica anteriormente.
69. Uso según la reivindicación 68, en el que el ligando es 11a.
70. Uso según la reivindicación 68 ó 69, en el que la matriz soporte es agarosa opcionalmente activada, celulosa, sílice o vidrio.
71. Separación, aislamiento, purificación, caracterización, identificación o cuantificación de inmunoglobulinas mediante cualquier procedimiento por el que dichas inmunoglobulinas se aplican a conjugados de matriz con ligando de afinidad, como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores de conjugados de matriz con ligando de afinidad, a un pH en el intervalo de 5,0 hasta 12,0, y subsiguientemente se eliminan, se eluyen o se desorben reduciendo el pH hasta 4,9 o menos.
72. Separación, aislamiento, purificación, caracterización, identificación o cuantificación de insulinas o análogos de insulina o derivados de las mismas y precursores, mediante cualquier procedimiento por el que las citadas insulinas, derivados de insulina, análogos, y precursores, se aplican a conjugados de matriz con ligando de afinidad, como se define en cualquiera de las reivindicaciones de conjugados de matriz con ligando de afinidad anteriores, a un pH en el intervalo de 4,0 hasta 9,0, y subsiguientemente se eliminan, se eluyen o se desorben reduciendo el pH hasta 3,99 o menos, o elevándolo hasta 9,01 o más.
73. Separación de FVIIa recombinante mediante unión selectiva de FVIIa a la matriz de afinidad de la fórmula
viii)
90
en la que M es agarosa que tiene grupos amino, procedente de medios de cultivo celular, mediante la cual dicho FVIIa se aplica a dicho conjugado de matriz con ligando de afinidad en presencia de 5 mM de Ca^{2+}, y se eluye subsiguientemente.
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