JPS6330311A - 変性シリカ及びその製法 - Google Patents

変性シリカ及びその製法

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JPS6330311A
JPS6330311A JP62110392A JP11039287A JPS6330311A JP S6330311 A JPS6330311 A JP S6330311A JP 62110392 A JP62110392 A JP 62110392A JP 11039287 A JP11039287 A JP 11039287A JP S6330311 A JPS6330311 A JP S6330311A
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silica
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mathematical
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メイヤー　ウィルチェック
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Yeda Research and Development Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 化学的に変性されたシリカの新規な誘導体が供される。
一方ではシリカが単一水酸基を有する置換基で置換され
る、１第一（ｐｒｉｍａｒｇ　）ヒドロキシルシリカ”
と称される変性シリカが供され；他方ではクロロホルメ
ート、カルざジイミダゾール、シアノブロマイド、スル
ホニルクロリド等の適当な活性剤でこの第一ヒドロキシ
ルシリカの活性化によシ得られるとのシリカの誘導体が
供される。
この新規な誘導体は有機化学で有益である。これらは高
圧及び低圧アフイニテイクロマトグラフイーにおいて、
タンパク質不動化において特に有益である；これらはＨ
ＰＬＣ等で安定相として有益である。
本発明の他の特徴及びその上の特徴は下記の説、明で明
らかになろう。
非常に種々の材料がキャリアとしてアフイニテイクロマ
トグラフイーに使用されている。最も広く使用されるも
のはシアノブロマイド（ＣＮＢｒ　）で活性化されるア
ガロースビーズである。水溶液中で極めて安定であるけ
れど、その熱安定性及び機械的安定性は種々の目的、例
えばＨＰＡＣ’のために不適当である。このシアノブロ
マイド活性化はアミンのカップリングがＮ−置換イソ尿
素の生成を生じ、これが適当な安定性を欠く不利益を有
する。この不安定性がリガンドの漏出を生じそして若干
の時間の後にこの材料のカラムはイオン交換性を得て、
これが生物特異性を阻害する。
適当な機械的安定性と不変の多孔性を有するシリカは表
面上のシラノール基による特定の基材の不可逆吸着と変
性により支持体として不適当であると思われていた。こ
れによりアフイニテイーク算マドグラフィー及び類似の
用途にキャリアとしてシリカの使用が妨げられていた。
Ｒｅｇｎｉｅｒ及びＮｏｅｌ　、　Ｊ、　ｏｆ　Ｃｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃＳｃｉｅｎｃｅ　１４　（・
１９７６　）　２１６はグリセロールプロぎルシラン結
合相を供する変性シリカを開示した。これらは約１８〜
１９Ａの厚さを有し、グリセロール部分は８０から１５
０μモル／Ｉと異なる。使用される基材嬬調節される多
孔度のガラスであり、そしてその変型はタンパク質の非
特異的吸着と変９：を減少させた。
Ｒｅｇｕｉｅｒ等の変性シリカは各々が水酸基金有する
二つの隣接の炭素を有し、そして活性化は望ましくない
不活性環状カーボネート誘導体の生成を導くようでおる
。この欠陥は本発明により大部分克服される。
本発明によシ単一第一水酸基を有する置換基により置換
されたシリカが供され、そしてこの変性シリカの活性化
誘導体が供される。−高圧アフィニティークロマトグラ
フィー（ＨＰＡＣ）及び低圧アフィニティークロマトグ
ラフィー（ＬＰＡＣ）に使用のため、タンパク質不動化
のため、そして類似の用途のため、前記の変性シリカで
あるキャリアが供される。、また第一ヒドロキシルシリ
カの製造及びその活性化誘導体の調製のための方法が供
される。
第一ヒドロキシルシリカを導く反応頭序は反応機構１に
示される：この機構で２はＲｅｇｕｉｅｒにより得られ
るジオールで６９、これは前記の欠陥を有する。アルデ
ヒドシリカを導く反応段階３はＢｏｒｃｈｅｒｔ　、　
Ｌａｒｓｓｏｎ及びＭｏ５ｂａｃｈ　、　Ｊ、　ｏｆＣ
ｂｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ７２４４　（１９８２）　４
９−５６により行なわれる：所望の生成物を導く反応段
階４は新規でちゃかつ本発明の一部である。結果の生成
物４は安定な共有結合を供する、通常の活性剤、例エバ
クロロホルメート、にトロフェニルクロロホルメート、
Ｎ−ヒドロキシスクシニイミドクロロホルメート）によ
フ、カルざジイミダゾール、１．１．１−トリクロロ−
２−モノクロロエチルスクシニイミドカルボネートによ
って、又はスルホニルクロリドによシ容易に活性化でき
る。
シリカ粒子の高い表面積と小さい粒径、その機械的安定
性及びシリカの他の有益な性質により下記に示すように
非常に多量のリガンドを結合する極めて満足すべき支持
体となる。低圧カラムに大きな粒径のシリカを使用する
ことによシこの新規な生成物が調製スケールで急速アフ
ィニティークロマトグラフィーを可能にする。活性化の
若干の側音反応機構２に示し、これはまたこの結果の活
性化変性シリカヘタンパク質の共有結合を示す。
本発明による活性化変性シリカは低分子量りガントの結
合のため、並びに末端アミノ基含有する巨大分子（生物
学的に活性なもの）、例えば酵素、ＢＳＡ％ポリクロナ
ール及びモノクロナール抗体、抗原等の結合のため極め
て有効である。
本発明の別の変型は置換基部分が −ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−又は−ＮＨ−（ＣＨ２）
ｎ−ＣＯＯ型の好適なスペーサを含み、これがシリカ基
材から結合分子のよシ大きな距離を供する変性シリカを
含む。
下記の例は単に例示の性質のものであり、そして本発明
の１第一ヒドロキシルシリカ”が活性化されそして特に
例示したものと異なる型式の、生物学的に活性かつ他の
分子の結合に使用できることは明らかである。かくして
、本発明は下記の式の化合物及びその製造、並びに前記
に示した目的のためにこれらの使用及び類似の適用に関
する：（式中Ａｔｋは低級アルキルであり、そしてここ
でａ、この化合物は第一ヒドロキシシリカ化合物であシ
、ここでＲは水酸基であシ、又はＲは−（ＣＨ２）ｎμ
ｍの−（ＣＨ２）ｍ−ＣＨ２−ＯＨであシ、ｂ、その誘
導体であシ、ここで Ｒは一〇−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ１−ＯＲ２であシ、Ｒ１は
−ＣＨ２−ｌμｍの−ＣＨ２−１μｍの−ＣＨ，−ＣＨ
２−１−Ｏ−Ｃ−ＣＨ−ＣＨ２−８−（Ｃ）！２）１）
−から選択される基であシ、Ｒ２は水素、−ＣＮ　、　
−Ｇｏ２ＣＨ，−ＣＦ３、から選択され、Ｑは−ＮＨ−
（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ，、−ＨＮ−（ＣＨｚ）ｎ−ＣＯＯ
Ｈ，−ＨＮ−ペゾチド及び−ＨＮ−タンパク質から選択
される基であり、ここでｎ％ｍ及びｐは小さい整数であ
り、ここでｍはまたゼロでもよい） 市販のシリカは機構１に示すようにシランと反応させる
ことによって化学的に変性される。本発明によれば結果
の第一ヒドロキシルシリカは機構２に示されるようにク
ロロホルメート又はカルボジイミダゾールで活性化され
る。このように得られた活性化生成物は低分子量リガン
ド、並びに末端−ＮＨ２基を有するタンパク質のような
生物学的巨大分子のカップリングに対して優れた挙措を
示す。カップルされるタンパク質の中には、酵素（トリ
プシン、キモトリプシン等）　Ｓ　　ＢＳＡ　％抗体（
ポリクロナール及びモノクロナール）等が挙げられる。
見 下記の例は本発明を説明しかつこれを例示するつもシで
ある。非限定方式で解釈されるべきである。
１、　第一ヒドロキシル官能基を導くシリカの化学的変
性。
ａ、γ−グリシドオキシゾロぎルトリメトキシシリカ（
エポキシドシリカ）ニジリカ５！Ｉ（バーチシル、５　
ａｍ　）　ｋ　２０％硝酸、Ｎ２０　ｓ　　Ｏ，５ｒＱ
　ＮａＣ４Ｈ２Ｏ、アセトン及びエーテルで洗浄しそし
て真空下デシケータ−で乾燥した。この洗浄したシリカ
を８時間２００°Ｃで乾燥ピストル中に保つか、又はプ
レート上に分配しそして４０時間１５０’Ｃで真空炉で
乾燥して吸着した水を物理的に除去した。
すべてのガラス容器を使用前１００℃で乾燥させた。乾
燥したシリカ（５，ｌｉ’）ｔｌ−三首反応フラスコに
入れそしてナトリウム乾燥トルエン１００鱈でスラリ化
した。乾燥したＮ２（Ｈ２ＳＯ，上で）の遅い流れを反
応の間中懸濁液に通過させた。γ−グリシドオキシプロ
ビルトリメトキシシラン２戯（９ｍモル）とトリエチル
アミン（水酸化カリウムで乾燥した）７０μｔ　（０，
５Ｉｎモル）ｆ：かきまぜながら加えた。この反応混合
物を還流下夜通しく１５時間）加熱した。このエポキシ
ドシリカをトルエン、アセトン、エーテルでシンター漏
斗上で洗浄しそして真空生乾燥した。得られたエポキシ
基の含量を滴定を介して平均して３２０μモル／Ｉシリ
カまで測定した。エポキシドシリカをＮａ２Ｓ２Ｏ３で
処理しそして遊離したＯＨ−をＨＯ２で滴定した。
ｂ、ジオールシリカ： エボキシドシリカ４．５９ｅＯμｍの１ｍＨＣｔ４００
ｄに注意深く懸濁しそしてがきまぜながら１時間９０℃
に加熱した。
Ｃ，アルデヒドシリカ： ジオールシリカ４．５　！ｉを酢酸／！（２０（１０：
９Ｑ）１ＱＱｄにスラリ化しそしてＮａＩＯ４４ｇを加
えた。反応混合物全室温で２時間かきまぜた。
生成したアルデヒドシリカｋ　Ｎ２０　％　アセトン、
エーテルで洗浄しそして真空下デシケータ−で乾燥した
。
このアルデヒド含量を２．４−ジニトロフェニルヒドラ
ジンと生成したヒドラゾン誘導体として定量分析した。
ｄ、第一ヒドロキシルシリカ： アルデヒドシリカ１ｇを酢酸ナトリウム緩衝液中の０−
３　ｍ　（２２ａｒｎ９）　ＮａＢＨ，２０ｘｔｌに懸
濁させた。この懸濁液（〜ｐＨ：９）ｔ２時間かきまぜ
、その後にとのシリカを水、アセトン及びエーテルで洗
浄しそして真空下デシケータ−で乾燥した。
２．４−ジニトロフェニルヒドラジンとの反応を介して
定量的還元を調節した。アルデヒド基の不存在ｔ１２．
４−ジニトロフェニルヒドラジンでの処理後白色シリカ
を得ることによって示された。
２、　クロロホルメート及びカルボジイミダゾールで第
一ヒドロキシルシリカの活性化： ｅ、及びｆ、　クロロホルメートで第一ヒドロキシルシ
リカの活性化： 第一ヒドロキシルシリカをドライアセトン（ｘ、ｃｏ、
上で）１５ｄに懸濁させそして４℃で水浴で冷却した。
１０ｍ−１ニルのｐ−ニトロフェニルクロロホルメート
又はＮ−ヒドロキシスクシニイミｒクロロホルメートの
添加後、ドライアセトン１０１１Ａ中の１５ｍモルの４
−ジメチルアミノｆ　ＩＪシラン溶液を懸濁液へ滴下で
加えそして３０分間かきまぜｔ続けた。
この活性化シリカをアセトン、ジオキサン中の５％酢酸
、メタノール及びエーテルでシンター漏斗上で洗浄した
。試薬の完全な除去を確保するためにｐ−ニトロフェノ
ール又はに−ヒドロキシスクシニイミドの存在で既知量
（ａｌｉｑｕｏｔ　）　′ｆｒ：０．２Ｎ　ＮａＯＨ１
ｍｌで希釈しそして４００　ｎｍ又は２６０ｎｍで各々
吸光度を読むことによってチェックした。
キャリア上の活性基の測定： 第１ヒドロキシルシリカのｐ−ニトロフェニル誘導体上
の活性基の量を室温で１０分間ＣＬ２　ＮＮａ　ＯＨで
一定貴試料の塩基加水分解によシ測定した。放出された
ｐ−ニトロフェノールを４００ｎｍ％Ｅ：１７０００で
分光測光で分析した。第一ヒドロキシシリカのＮ−ヒド
ロキシスクシニイミド誘導体上に存在する活性基の童’
ｋ　Ｏ，２ＮＮＨ，ＯＨで塩基加水分解（室温で１０分
）の後に分析しそして２６０　ｎｍ％Ｅ：９７００で分
光測光で分析した。
ｇ、１．１−カルざジイミダゾールで第一ヒドロキシル
シリカの活性化ニ ドライジオキサン１０ｄ中のヒドロキシルシリカ０．７
ｇの懸濁液に１．１′−カルボジイミダゾール０．３５
＆（２ｍ−Ｅ−ル）を加え、室温で３０分間徐々に振り
まぜ、そして前記に示したように続けた。
第一ヒドロキシルシリカ（１５０〜）と１．１．１−　
）　！Ｊ　／ロロー２−モノクロロエチルスクシニイミ
ドカーボネート（１，５ｍモル）をドライアセトン５紅
に懸濁させた。この混合物を水浴で冷却しかつかきまぜ
、ドライアセトン５ｍ６にした２ｍモルの４−ジメチル
アミノピリジンを滴下で加えた。
シリカの洗浄を前記のように行なった。
ドライジオキサン５Ｍ中のシリカ１５０ｒＲ９及び１．
１′−力ルざジイミダ・戸−ル１５ｍモルの懸濁液を調
製することによって１．１′−カルボジイミダゾール３
で活性化全行なった。この反応混合物全室温で３０分間
かきまぜた。シリカの洗浄をジオキサン、アセトン及び
エーテルで行なった。
Ｊ、　　）シルクロリド８ニ ドシル化シリカの調製のために、シリカ１５０〜とｐ−
トルエンスルホニルクロリド１．５．：１モル全ドライ
アセトン５１１１に懸濁させた。ぎリジン５ｍモルの添
加後に、連続したかきまぜの下で室温で１時間この反応
を続けた。前記の工程によりこのシリカを洗浄した。
Ｋ、シリカ上の活性基の測定 クロロホルメート及び１．１．１−）シクロロー２−モ
ノクロロエチルスクシニイミドクロロホルメートで活性
化されたシリカ上の活性基のｉｔ、前記フのように塩基
加水分解の後に分光測光で測定した。イミダゾリル−及
びトシル基のｉｔｔ元素分析により測定した。
３、　活性化キャリアヘリガントのカップリングエ、ｐ
−ニトロフェニルクロロホルメー）、Ｎ−ヒドロキシス
クシニイミドクロロホルメート又は１．１′−カルボジ
イミダゾールで活性化されたシリカ１．ｌｉ’をホスフ
ェート緩衝液（ｐ）１ニア、５）１０ｊｌｊに懸濁させ
た、タンパク質又はリジン、又はε−７ミノカゾロン酸
又はジアミノヘキサン又は任意の他のアミノ含有リガン
ド５０■を添加した後に、結果の混合物を４℃で２日間
徐々に振夛まぜた。得られたシリカを次に０−１　ｍ　
ＮａＣ１と水で洗浄した（第■表）。
■、プレパックした活性化カラムヘリガントのカップリ
ング ステンレス鋼カラム（４０Ｘ４．６ｉｎ）へＮ−ヒドロ
キシスクシニイミドクロロホルメート活性化シリカ約０
．５ｇを充填した。Ｈ２Ｏ１０μ中のＢ所２９■の溶ｇ
、をカラムを通して動的再循環工程で７時間ポンプで送
シ込んだ。カップリングの工程中リガンド温液の光学音
波を測定して結合したＢＰＴＩＯ量を決定した。この実
験のためにｐ−二トロフェニルカーボネートの代りにＮ
−ヒドロキシスクシニイミド活性化シリカを使用したが
、その理由は結合したタンパク質の童がＵＶ吸収により
直接追跡できるからである。過剰の活性基を除去するた
めに、０．２　ＮＨ，ＯＨ３０成をカラムに通して６０
分間ポンプで送り込んだ。
４、結合したタンパク質の測定 １１０°Ｃで６　Ｎ　ＨＣｔで一定量試料の加水分解の
後にキャリア上の結合したタンパク質のｔ’にアミノ酸
分析で測定し又は２８０　ｎｍに基づく未結合タンパク
質を測定することによって分析した。そし故に、ｐ−ニ
トロフェニルクロロホルメート活性化樹脂の濾液を透析
して残りの基を除去し又はＮ−ヒドロキシスクシニイミ
ド活性化の場合には最初の未結合洗浄物をＨＣｔ又は酢
酸で希釈した（第■表）。
５、高圧カラムの調製；トリプシン阻害剤の精製ニトリ
プシンが結合したシリカ０．５．９　ｔｌ−３０００ｐ
ｓｉの圧力でステンレス鋼カラム（４−５ｙｔｔｎｓ　
　４　ｃｍ）にスラリパックした。最初に可動相として
ｐＨ７，０で０μｍの１ｍホスフェート緩ｖｉ液＋使用
してこの力？Ａにトリプシン阻害剤を負荷した。この可
動相を０．０２５　Ｎ　Ｈｃｔ　（ｐ）１２．４　）に
変えた後に、０．５紅／分の流速を使用して９．５分以
内にこのトリプシン阻害剤をｌｖ離した。
６、　高圧カラムの調製：　ＢＳＡに対する抗体の精製
：ＢＳＡ　Ｉ　６〜をシリカ０．５ｇに結合しそして２
５００ｐｓｉの圧力でステンレス鋼カラム（４−５ｍ、
　　４Ｉ２）にスラリパックした。試料を負荷するため
に０．０１ｍホスフェート緩衝液、ｐＨ７μｍの’に使
用しそして抗体を溶離するために０．１ｍグリシンＨＣ
１。
ｐＨ２，６’ｉｋ使用して０ＮＰ−ＢＳＡ　（ＢＳＡ　
Ｋ結合したジニトロフェノール）に対する抗体を含有す
る血清５００μｔから純抗体１．２８■を単離すること
ができた。
本　表面変性剤として使用したシランは下記の通シであ
った： ＧＰ８　、３−グリシドオキシゾロビルトリメトキシシ
ラン： ＭＰＳ　、　３−メタクリルオキシゾロリルトリメトキ
シシラン； ＡＰ８　、３−アミノプロぎルトリエトキシシラン。
林活性化基のｆｋｋｐ−ニトロフェニルクロロホルメー
トで活性化により測定した。
琳シリカ表面上でアミン官能基の活性化。
林林　アミノシリカαジアゾ死後に水酸官能基の活性化 第■表 異なる試剤でリクロソルプＳｉ　６０のヒドロオキシエ
チルオキシプロぎルシリカの活性化：活性基と結合した
トリプシンの測定 第１表 ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート及ヒヒトロキシエ
チルオキシプロビルキールゼルデ６０のシリカを使用し
て活性化の程度に関して塩基の影響 塩　基　　　　　　　　　　　活性化基（μモルフ１１
） トリエチルアミン　　　　　　　　　１３０．６ビリジ
ン　　　　　　　　　　　　　２１７．６４−ジメチル
アミノピリジン　　　　２８２．３第■表 異なる活性化シリカを使用して結合したタンパク質の量
： ｐ−ニトロフェニルク ロロホルメート　　　　　　　１５，２　　　４９．Ｉ
Ｎ−ヒドロキシスクシ ニイミドクロロホルメ −）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１５，３　　　　　　　　５３．１１．１′
−カルボジイミ

Claims (14)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の化合物（式中Ａｌｋは低級アルキルであり、 そしてここで、 ａ、この化合物は第一ヒドロキシシリカ化合物であり、
    ここでＲは水酸基であり、又は Ｒは−（ＣＨ＿２）＿ｎ−Ｏ−（ＣＨ＿２）＿ｍ−ＣＨ
    ＿２ＯＨであり、 ｂ、その誘導体であり、ここで Ｒは−Ｏ−（ＣＨ＿２）＿ｍ−Ｒ＾１−ＯＲ＾２であり
    、 Ｒ＾１は−ＣＨ＿２−、−Ｏ−ＣＨ＿２−、−Ｏ−ＣＨ
    ＿２−ＣＨ＿２−、▲数式、化学式、表等があります▼
    から選択される基であり、 Ｒ＾２は水素、 −ＣＮ、−ＳＯ＿２ＣＨ＿２−ＣＦ＿３、▲数式、化学
    式、表等があります▼、▲数式、化学式、表等がありま
    す▼▲数式、化学式、表等があります▼、▲数式、化学
    式、表等があります▼、 から選択され、 ここでＱは基−ＨＮ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＮＨ＿２、−
    ＨＮ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＣＯＯＨ、−ＨＮ−ペプチド
    又は−ＨＮ−タンパク質であり、ここでｎ、ｍ及びｐは
    小さな整数であり、ここでｍはゼロでもよい）。
  2. （２）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａｌｋは低級アルキルを示しそしてここでｎは
    １から５の整数である）の、特許請求の範囲第１項によ
    る化合物。
  3. （３）式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中はＲは▲数式、化学式、表等があります▼▲数式
    、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式、表等
    があります▼、−ＣＮ又は−ＳＯ＿２−ＣＨ＿２−ＣＦ
    ＿３であり、ここでｍとｎは各々１から５の小さな整数
    である）の、特許請求の範囲第１項による化合物。
  4. （４）前記の分子中にタイプ−ＨＮ−（ＣＨ＿２）＿ｎ
    −ＮＨ−又は−ＨＮ−（ＣＨ＿２）＿ｎ−ＣＯ−（式中
    ｎは小さな整数である）のスペーサが供される、特許請
    求の範囲第２項又は第３項による化合物。
  5. （５）３μｍから約２００ｍｍまでの範囲内の孔径の、
    不規則な又は球状の形の粒子の、特許請求の範囲の第１
    項から第４項の何れかによる変性シリカ。
  6. （６）３μｍから２００μｍの粒径の、特許請求の範囲
    第５項による変性シリカ。
  7. （７）実質上後記のかつ例に関連した、特許請求の範囲
    第１項に記載した第一ヒドロキシルシリカ及びその誘導
    体。
  8. （８）特許請求の範囲第１項から第５項の何れかに記載
    した変性した活性化シリカを含む、ＨＰＡＣ、ＬＰＡＣ
    、タンパク質不動化に使用のためのカラム。
  9. （９）式〔２〕： ▲数式、化学式、表等があります▼ の中間体を適当な酸化剤と反応させて中間体〔３〕： ▲数式、化学式、表等があります▼ を供し、これをナトリウムボロハイドライド（ＮａＢＨ
    ＿４）と反応させて所望の化合物▲数式、化学式、表等
    があります▼ （式中ｍとｎは特許請求の範囲第１項に記載した通り）
    を供することを含む、特許請求の範囲第１項に記載した
    第一ヒドロキシルシリカの製法。
  10. （１０）式〔４〕の化合物をクロロホルメートと又は１
    ，１′−カルボジイミダゾールと、トレシルクロリドと
    、１，１，１−トリクロロ−２−モノクロロエチルスク
    シンイミドカーボネートと、又はスルホニルクロリドに
    より又はシアノゲンブロマイドと反応により活性化され
    る、特許請求の範囲第９項による方法。
  11. （１１）クロロホルメートが式： ▲数式、化学式、表等があります▼又は▲数式、化学式
    、表等があります▼ のものである、特許請求の範囲第８項による方法。
  12. （１２）ジイミドが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ のものである、特許請求の範囲第８項による方法。
  13. （１３）実質上後記に記載の、特許請求の範囲第１項に
    記載の活性化変性シリカの製法。
  14. （１４）特許請求の範囲第９項から第１３項の何れかに
    記載の方法によつて得られた、変性シリカ及び変性活性
    化シリカ。
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