JPH059440B2

JPH059440B2 -

Info

Publication number: JPH059440B2
Application number: JP60105768A
Authority: JP
Inventors: Horaato Ierukaa
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1984-05-17
Filing date: 1985-05-17
Publication date: 1993-02-04
Also published as: EP0165912A3; SE470261B; SE8402662D0; JPS615099A; DE3575872D1; EP0165912B1; SE8402662L; EP0165912A2

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、蛋白質の分離または固定用チオエー
テル吸着剤に関する。

生化学および生物工学の分野において、高分子
および低分子の分離用に、また例えば技術的に応
用可能な酵素並びに病気の診断用抗源および抗体
の固定用に、さまざまな種類の吸着剤が使用され
ている。

本発明の吸着剤は、このカテゴリーの吸着剤に
属するが、いくつかの特徴的な性質を有している
点で従来の吸着剤とは全く異なつている。

すなわち本発明は、共有結合した配位子を有す
るキヤリヤーからなる、蛋白質の分離または固定
用吸着剤において、上記キヤリヤーが親水性ポリ
マーにより完全に、または部分的に浸透または表
面被覆された固相を形成しており、上記配位子が
下記式（）で示される基から成ることを特徴と
する吸着剤、Ｒ−Ｘ−CH₂−CH₂−Ｙ− （）〔式中、ＲはＨ−（CHQ）_o−（CH₂）_n 〔Ｑ＝Ｈ，OHまたはSHn＝０，１または
2m＝０または１〕ヒドロキシアルキル基、メルカプトアルキル
基、またはアリール基であり；ＸはSO₂，Ｓまた
はSeであり；ＹはＳまたはNR₁であり、このR₁
は水素またはアルキル基である。〕を提供するものである。

上記本発明の吸着剤は、好ましくは１〜1000μ
ｍの直径を有し、好ましくは球状の形をした粒子
から成る細かく分割された吸着剤である。

本発明の吸着剤のきわ立つた特徴はその吸着性
にあり、この特性はいわゆる疎水性吸着剤のそれ
と同種のものである。

すなわち、蛋白質の吸着効果は、例えば塩化ア
ルカリ、硫酸アルカリおよび硫酸マグネシウムの
ような塩が水性構造を有しており、かつ高濃度で
存在するとき、増加する。

しかしながら、明らかに、本発明の吸着剤は、
例えば炭素原子数８〜18のアルキル基に基づく吸
着効果を有する疎水性吸着剤よりも他の蛋白質を
好ましく吸着する。

上記式（）中のＲは親水性の基、例えば−
CH₂−CH₂−OHまたは−CH₂−CHOH−CH₂
OHであつてもよい。このことは予期しない意外
な発見であり、本発明の吸着剤の特徴的かつこれ
まで未知の吸着効果は、次の構造式（）と関係
していることを暗示している。

−Ｘ−CH₂−CH₂−Ｙ− （）〔式中、ＸはSO₂，ＳまたはSeであり；ＹはＳ
またはNR₁であり、このR₁は水素まはたアルキ
ル基である。〕構造式（）による吸着効果は、疎水性吸着と
は異なるものである。

この吸着効果は親硫黄性（「硫黄に向つて引き
寄せられる性質」）と呼ぶこともできる。すなわ
ち本発明の吸着剤の吸着は親硫黄性吸着である。

また、式（）中のＲは、非置換アルキル基：
CH₃（CH₂）_oであつてもよい。

この式のｎが大きな整数を有するならば、本発
明の吸着剤は疎水性吸着力と親硫黄性吸着力を有
する化合物になり、この場合疎水性吸着力がｎの
増加と共に優位をしめる傾向にある。

ｎ＝０，ｍ＝１、即ちＲがメチル基の場合、本
発明の吸着剤は実際に親硫黄性吸着のみを有する
化合物になる。

要するに、本発明の吸着剤の、全体的な吸着効
果は、Ｒの化学的性質に応じて変化する。

例えば、Ｒにカルボキシル基が導入されると、
親硫黄性吸着力が弱まり、電荷による吸着性が優
勢となる傾向にある。

さらにまた、上記Ｒはアリール、例えばフエニ
ル基（実施例６）であつもよい。

本発明の吸着剤は、最初チオール基を親水性ポ
リマーに導入し、次にビニル−β−ハロエチルス
ルホン、ビニルスルホキシドまたは硫化ビニルで
アルキル化することにより製造される。

例えば、下記式（）〜（）で示すように、
エポキシド含有キヤリヤー（親水性ポリマー）
にチオール（NaSH）を導入し、その後アルキル
化することにより製造できる。

Ａ（）＋HS−CH₂−CH₂OH→−CHOH−
CH₂−Ｓ−CH₂−CH₂−Ｘ−CH₂−CH₂−Ｓ−
CH₂−CH₂OH （）また、原理的には、本発明の吸着剤を、例えば
次のＢ，ＤおよびＥで示すように、ヒドロキシル
基またはアミノ基含有キヤリヤから直接製造する
ことも可能である。

なお、Ｃはエポキシド含有キヤリヤーから直接
製造した例である。

Ｂ −OH＋CH₂＝CH−Ｘ−CH₂→−Ｏ−
CH₂−CH₂−Ｘ−CH＝CH₂ （）ＣＤＥ −OH＋CH₂＝CH−Ｘ−CH₂−CH₂−Ｓ
−CH₂−CH₂−Ｘ−Ｒ→−Ｏ−CH₂−CH₂−Ｘ
−CH₂−CH₂−Ｓ−CH₂−CH₂−Ｘ−Ｒ（）本発明の吸着剤の１つの具体例は、中心部まで
ずつと浸透可能な蛋白質用親水性ポリマーを構成
する粒子から成る。

他の具体例によれば、粒子の表面のみが蛋白質
を浸透可能であり、このような場合、粒子の核部
は吸着特性のある基を含む必要がない。

第３の具体例は不浸透性核を包囲する多少厚い
層の網目構造を有する親水性ポリマーから成る。
この核は任意に生成することができ、例えば繊
維、ホース、ビーカーまたは他の容器の内面、な
どから成るものである。

高分子を浸透させるために、かつ特徴的な吸着
性を適切に発現させるために、親水性ポリマーは
特有の性質を持つていなければならない。

すなわち、このポリマーは親水性であり、かつ
重合体に対して浸透性がなければならず、また損
傷させることなく蛋白質を吸着するPH範囲におい
て、好ましくはPH４〜８の範囲内において、しか
し望ましくは広い範囲内において耐性がなければ
ならない。

また、親水性ポリマーの化学的性質は吸着特性
にかかわる基を充分に受入れるものでなければな
らない。

親水性ポリマーに関して、本発明はこれらの要
件により次のような親水性ポリマーに限定され
る。

例えばポリビニルアルコール、ポリヒドロキシ
メタン、多糖類および架橋ヘキシトールのような
ポリアルコール並びに架橋ポリアクリルアミドの
ようなポリアミド、さらに架橋ポリアミンおよび
ポリ酸も挙げることができるが、この場合、無機
基の存在により吸着がさらに複雑になることが認
められる。

さらに、親水性ポリマーの一種であるゲルネツ
トは無機ゲルから成り、この無機ゲルには有機ヒ
ドロキシル基含有置換基、例えば置換ケイ酸ゲル
またはのような置換基が結合されている。

本発明の特に有用な吸着剤は架橋寒天である。
本発明の吸着剤は、生体高分子の分別のために利
用することができる。

実施例１反応容器内において、0.6モルのNaOH溶液中
で５％ブタンジオール−ビス−グリシジルエーテ
ルにより粒状の６％アガロースゲルを40℃で２時
間処理した。このゲルを洗浄し、次に0.1％
NaBH₄の存在下で１モルのNa₂CO₃中において
NaSHで処理して、チオール誘導体に変換した。
このゲル、すなわち「チオールアガロース」を蒸
留水で、次に0.1モルのNaHCO₃で洗浄し、その
後反応容器に移して１％ジビニルスルホンで１時
間処理した。ジビニルスルホンで処理したチオー
ルアガロースに、過剰のメルカプトエタノールを
加え、得られた混合物を0.1モルのNaHCO₃中で
２時間反応させた。上記ゲルの蛋白質吸着能力に
ついて以下の試験を行なつた。

上記ゲルを用いて５mlのゲル床を準備し、PH
7.6において0.1モルのHClおよび0.5ミルのK₂SO₄
で洗浄した。ゲル床に導入されたこの緩衝液に対
して、人間の血清を、血清中の蛋白質が50吸光単
位に相当する量（280nmで測定）吸着されるまで
透析した。その後ゲルを50mlの緩衝塩溶液で洗浄
した。その後、最初PH7.6において0.1モルのHCl
で（K₂SO₄を使用せず）、その後40％のエチレン
グリコールで、次に30％のイソプロパノールで、
最後に95％のエタノールで洗浄することにより、
吸着蛋白質を脱着した。

45％の蛋白質がゲルに吸着し、そのうちの25％
を硫酸塩不在の緩衝液で溶出し、残りの部分を他
の溶出液で溶出した。

電気泳動を利用した分析によれば、すべての血
清アルブミンは吸着せずにゲルを通過し、これに
対して免疫グロブリンはゲルに固定され、塩を含
まない緩衝液によつて溶出された。またα₂−マク
ログロブリン及びリポ蛋白が完全に吸着された。

実施例２アガロース粒子の代りにセルロース粉末を使用
したことを除いて実施例１の操作を繰返した。

実施例３エピクロロヒドリンで処理したポリアクリルア
ミド｛市販のユーパーガイト（Eupergite）｝を用
いて実験を行つた。

NaSHでオキシシランゲルをSH−ゲルに変換
し、次にこれをジビニルスルホンで、さらにメル
カプトエタノールで処理した。ポリアクリルアミ
ド誘導体の吸着性能は実施例１のアガロースゲル
よりも幾分低いが、選択性はだいたい同じであつ
た。

実施例４チオールアガロースをジビニルスルホンで活性
化し、次に実施例１で述べたように、２，３−ジ
ヒドキシ−プロパン−１−チオールと結合させ
た。

人間の血清による吸着試験において、実施例１
〜３と同じ選択性を有する蛋白質を43％吸着した
が、エチレングリコールによる脱着はより効果的
であつた（実施例１の６％と比較して10％）。

実施例５２，３−ジメルカプト−１−プロパノールを用
いたことを除いて、実施例４と同じ方法を採用し
た。吸着性能は低かつた（32％）。

実施例６エピクロロヒドリンで活性化したアガロースを
チオールゲルに変換し、さらに0.1モルの
NaHCO₃中においてフエニルビニルスルホンで
処理した。主に親硫黄性吸着により、20％の血清
蛋白をゲル上に吸着し、この場合明らかに、すべ
てのアルブミンが付着することなく床を通過し
た。

実施例７フエニルビニルスルホンをフエニルビニルスル
ホキシドに変えたことを除いて、実施例６で述べ
たように、前記実施例のチオールゲルを変換し
た。吸着性能は対応するスルホン誘導体と比較し
て幾分高かつた（22％）が、選択性は同じてあつ
た。

実施例８実施例１におけるようにチオールアガロースを
ジビニルスルホンで活性化し、次に0.1モルの
NaHCO₃中においてチオグリコール酸で変換し
た。生成物は５％未満の蛋白質を吸着した。エス
テル化後、吸着性能は37％まで増加したが、脱着
時の収率は低く、全収率は約75％であつた。

実施例９実施例８と同様に、ジビニルスルホンで活性化
したチオールアガロースをセレノグリコール酸で
変換した。吸着性能はエステル化の前およびその
後のいずれにおいても低かつた。LiCl溶液中の
NaBH₄で還元することにより、吸着性能は著し
く改善された（48％増加）。しかしながら、付着
した蛋白質を脱着することは非常に困難であつた
（全収率63％）。

実施例 10 ジビニルスルホンで活性化したチオールアガロ
ースを0.1モルのNaHCO₃中で２，2′−ジエチル
アミノエタンチオールと結合させた。得られた生
成物は極端に低い吸着性能（13％）を有してい
た。大部分のリポ蛋白がゲルに固定された。

実施例 11 アルカリ中でアガロースを塩化トシル（塩化ｐ
−トルエンスルホニル）で活性化し、次に１，２
−エタンチオールさらに続いてヨウ化メチルで処
理した。生成物は良好な吸着性能（43％）を有し
ていた。吸着した物質の36％を硫酸不在緩衝液で
脱着した。全収率は定量的に得られた。

Claims

【特許請求の範囲】１共有結合した配位子を有するキヤリヤーから
なる、蛋白質の分離または固定用吸着剤におい
て、上記キヤリヤーが親水性ポリマーにより完全
に、または部分的に浸透または表面被覆された固
相を形成しており、上記配位子が下記式（）で
示される基から成ることを特徴とする吸着剤。Ｒ−Ｘ−CH₂−CH₂−Ｙ− （）〔式中、ＲはＨ−（CHQ）_o−（CH₂）_n 〔Ｑ＝Ｈ，OHまたはSHn＝０，１または
2m＝０または１〕ヒドロキシアルキル基、メルカプトアルキル
基、またはアリール基であり；ＸはSO₂，Ｓまた
はSeであり；ＹはＳまたはNR₁であり、このR₁
は水素またはアルキル基である。〕２固相が好ましくは１mm未満の直径を有する粒
子から形成されていることを特徴とする特許請求
の範囲第１項記載の吸着剤。３親水性ポリマーがポリヒドロキシ重合体から
形成されていることを特徴とする特許請求の範囲
第１項または第２項のいずれかに記載の吸着剤。４ポリヒドロキシ重合体がポリガラクタンであ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第３
項のいずれかに記載の吸着剤。５ポリガラクタンが寒天またはアガロースであ
ることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の
吸着剤。６親水性ポリマーがポリアミドまたはその誘導
体から形成されていることを特徴とする特許請求
の範囲第１項または第２項のいずれかに記載の吸
着剤。７ポリアミドまたはその誘導体が架橋ポリアク
リルアミドであることを特徴とする特許請求の範
囲第６項記載の吸着剤。