JPH0750086B2 - クロマトグラフ充填剤及びこれによる水溶性有機化合物の分離法 - Google Patents

クロマトグラフ充填剤及びこれによる水溶性有機化合物の分離法

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JPH0750086B2
JPH0750086B2 JP1237762A JP23776289A JPH0750086B2 JP H0750086 B2 JPH0750086 B2 JP H0750086B2 JP 1237762 A JP1237762 A JP 1237762A JP 23776289 A JP23776289 A JP 23776289A JP H0750086 B2 JPH0750086 B2 JP H0750086B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、クロマトグラフ充填剤及び水溶性有機化合物
の分離方法に関するもので、主として食品分析や臨床分
析などの分野に利用される。
（従来の技術と発明が解決しようとする課題） 近年食品分析や臨床分析などの分野において、ビタミン
類の簡便，迅速で実用的な一斉分析に関してはいくつか
報告されており、例えば、オクタデシル基をシリカゲル
にグラフトした充填剤（C18）を用いた逆相法（Maeda
ら:J.Assor.Off.Anal.Chem,72,244（1989））;Aminら,P
harm.Ind.,50,1307（1988）によるもの、或いは上記のC
18又はアミノプロピル基をシリカゲルにグラフトした充
填剤（R.B.H.Willsら,J.Chromatogr.Sci.15,262（197
7））によるものなどがその例である。
しかし、これらの方法は分離し得る化合物が限られてい
たり、分離の程度が小さかったり、或いは分析時間が長
かったりしていずれも実用的な充填剤とは言い難い。
更に、従来の方法では移動相として、アセトニトリルや
メタノールなどの有機溶媒を混入させた水溶液を用いた
ものが多く、この方法では分離後の廃液処理に問題があ
るのみでなく、紫外線検知器を用いる場合の波長領域の
選択が自由にできなかった。
更に、輸液などの如く相当量の無機塩を含む検体の分析
の際には混入させた有機溶媒のために塩が析出し、分析
を困難にさせることがしばしば見られた。
（課題を解決するための手段） 本発明者らはかかる状況のもとで、水溶性有機化合物
に、特にビタミン類の一斉分析に対し、分析し得る化合
物の適用範囲が広く、分離の程度が良好で、しかも分析
時間の短い実用的な充填剤及び有機溶媒を含まない移動
相を用いた分離法の開発を目的として鋭意検討した。
その結果、特定のアミン誘導体を無機担体にグラフトし
たクロマトグラフ充填剤がビタミン類等種々の水溶性有
機化合物の分離に優れた効果を有することを見出し、本
発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は 一般式（Ｉ） （式中R1,R2及びR3は同一又は相異なり、炭素数１〜５
のアルキル基，炭素数１〜３のアルコキシル基，ヒドロ
キシル基又はハロゲン原子を表わし、R1,R2及びR3の中
少なくとも１つはアルコキシル基又はハロゲン原子であ
る。R4は直鎖状又は分岐状の低級アルキル基からなる置
換基を有してもよいω−ピペリジノ基，ω−ピペラジノ
基又はω−モルホリノ基を表わす。ｎは２から10までの
整数を表わす。）で示されるアミン誘導体が、ヒドロキ
シル基をその表面に持つ無機担体にグラフトされている
ことを特徴とするクロマトグラフ充填剤であり、更に該
クロマトグラフ充填剤を用いて水溶性有機化合物を分離
するクロマトグラフィー法を提供するものである。
一般式（Ｉ）で表わされるアミン誘導体（以下アミン誘
導体（Ｉ）という）のR1,R2及びR3は同一又は相異なる
ものであって、具体的にはメチル，エチル，プロピル，
ブチル，ペンチル基等炭素数１〜５のアルキル基、メト
キシ，エトキシ，プロポキシ基等炭素数１〜３のアルコ
キシル基，ヒドロキシル基又は弗素，塩素，臭素等のハ
ロゲン原子を表わす。R4は直鎖状又は分岐状の低級アル
キル基からなる置換基を有してもよいω−ピペリジノ
基，ω−ピペラジノ基又はω−モルホリノ基を表わす。
直鎖状又は分岐状の低級アルキル基としては炭素数１〜
４のアルキル基であって、メチル，エチル，プロピル，
イソプロピル，ブチル，イソブチル,sec−ブチル,tert
−ブチル等基が挙げられる。
上記アミン誘導体（Ｉ）の具体例としては、ジメチル
（３−ピペリジノプロピル）メトキシシラン，メチル
（３−ピペリジノプロピル）ジメトキシシラン,3−ピペ
リジノプロピルトリメトキシシラン,3−ピペリジノプロ
ピルトリエトキシシラン，ジメチル（３−ピペラジノプ
ロピル）メトキシシラン，メチル（３−ピペラジノプロ
ピル）ジメトキシシラン,3−ピペラジノプロピルトリメ
トキシシラン,3−ピペラジノプロピルトリエトキシシラ
ン，ジメチル（３−モルホリノプロピル）メトキシシラ
ン，メチル（３−モルホリノプロピル）ジメトキシシラ
ン,3−モルホリノプロピルトリエトキシシラン,3−モル
ホリノプロピルトリエトキシシラン,3−モルホリノデシ
ルトリエトキシシラン,3−（２−メチルピペリジノ）プ
ロピルトリメトキシシラン,3−（３−メチルピペリジ
ノ）プロピルトリメトキシシラン,3−（４−メチルピペ
リジノ）プロピルトリメトキシシラン,3−（２−エチル
ピペリジノ）プロピルトリメトキシシラン,3−（３−エ
チルピペリジノ）プロピルトリメトキシシラン,3−（２
−イソプロピルピペリジノ）プロピルトリメトキシシラ
ン,3−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロピルトリメトキシ
シラン，メチル（３−ピペリジノプロピル）ジクロロシ
ラン,3−ピペリジノプロピルトリクロロシラン，メチル
（３−ピペラジノプロピル）ジクロロシラン,3−ピペラ
ジノプロピルトリクロロシラン，メチル（３−モルホリ
ノプロピル）ジクロロシラン,3−モルホリノプロピルト
リクロロシラン,3−モルホリノデシルトリクロロシラン
などが挙げられる。
本発明のクロマトグラフ充填剤は以下のようにして製造
することができる。
すなわちいわゆるシランカップリング剤といわれるアミ
ン誘導体（Ｉ）を、その表面にヒドロキシル基を持つ無
機担体と共に有機溶媒の存在下又は非存在下で加熱する
ことによって得られる。反応後、必要に応じて、トリメ
チルクロロシラン，トリメチルメトキシシラン及びヘキ
サメチルジシラザンから選ばれた１種又は２種以上を組
合せてエンドキャッピングを行なうこともできる。
本発明に用いるヒドロキシル基を表面に持つ無機担体と
しては、シリカゲル，アルミナゲル，ジルコニアゲル，
ガラスビースなどが挙げられるが、中でもシリカゲルが
好ましい。表面のヒドロキシル基は、アミン誘導体
（Ｉ）と反応することにより、アミン誘導体（Ｉ）を無
機担体にグラフトさせるのに有用である。
上記無機担体の形状は、球状、破砕状などいずれの形で
もよいが、高効率のクロマドグラフ用カラムを得るため
には出来るだけ粒径のそろった微細な粒子が好ましい。
有機溶媒としては、ベンゼン，トルエン，キシレン，ク
ロロベンゼン，ヘキサン，シクロヘキサン，クロロホル
ム，テトラヒドロフラン，ジメチルホルムアミド，ジメ
チルスルホキシドなどを挙げることができる。
反応温度は50〜150℃の範囲が好ましい。反応後は室温
に冷却後濾過し、常法により、トルエン，アセトン，エ
ーテル等の有機溶媒もしくは純水等を用いて洗浄し、80
℃以下の温度で常圧乃至減圧乾燥すると、本発明のクロ
マトグラフ充填剤が得られる。アミン誘導体のグラフト
量としては、無機担体1g当り0.1〜4mmolの量が適当であ
る。
本発明の塩基性基を有する充填剤は、常法に従ってクロ
マトグラフィー用カラムに充填され、液体クロマトグラ
フィーの固定相として使用される。
本固定相を用いる液体クロマトグラフィーにおいて、適
当な溶離条件、特に水溶液を溶離剤として選ぶことによ
り、種々の水溶性有機化合物の分離，分析を高分離能で
かつ短時間で行うことができる。
本発明のクロマトグラフィー法に用いる移動相として
は、水又は水にアセトニトリル，メタノール，エタノー
ルなどを溶解させた水溶液、もしくはこれらに更にリン
酸−リン酸塩，ホウ酸−ホウ酸塩などを溶解させたリン
酸緩衝液，ホウ酸緩衝液などが挙げられ、また、場合に
よっては、上記水溶液に更にイオン対試薬を溶解して用
いることもできるが、中でも本発明のクロマトグラフィ
ー法においては、１〜100mMのイオン対試薬を溶解させ
た0.05〜0.7Mのリン酸緩衝水溶液を用いるのが好まし
い。
イオン対試薬としては、テトラブチルアンモニウムフル
オライド，テトラブチルアンモニウムクロライド，テト
ラブチルアンモニウムブロマイド，テトラブチルアンモ
ニウムヨーダイド，テトラブチルアンモニウムヒドロキ
シド，テトラブチルアンモニウムフルオライド，テトラ
エチルアンモニウムクロライド，テトラエチルアンモニ
ウムブロマイド，テトラエチルアンモニウムヨーダイ
ド，テトラエチルアンモニウムヒドロキシド，テトラメ
チルアンモニウムフルオライド，テトラメチルアンモニ
ウムクロライド，テトラメチルアンモニウムブロマイ
ド，テトラメチルアンモニウムヨーダイド，テトラメチ
ルアンモニウムヒドロキシド，ヘキシルトリメチルアン
モニウムクロライド，ヘキシルトリメチルアンモニウム
ブロマイド，オクチルトリメチルアンモニウムクロライ
ド，オクチルトリメチルアンモニウムブロマイド，デシ
ルトリメチルアンモニウムクロライド，デシルトリメチ
ルアンモニウムブロマイド，セチルトリメチルアンモニ
ウムクロライド，セチルトリメチルアンモニウムブロマ
イド，ペンタンスルホン酸ナトリウム，オクタンスルホ
ン酸ナトリウム，ラウリル硫酸ナトリウム，ドデシル硫
酸ナトリウムなどが挙げられる。
リン酸緩衝水溶液は通常リン酸，リン酸水素ナトリウ
ム，リン酸二水素ナトリウムからなる水溶液が用いら
れ、各成分を変えることにより、液pHを２〜９の範囲内
で任意に調整することができる。
本発明のクロマトグラフィー法で分離可能な水溶性有機
化合物としては、水溶性ビタミン類，アミノ酸，ペプチ
ド，核酸類，糖類などが挙げられる。
上記ビタミン類としては、（塩酸）チアミン，リボフラ
ビン，フラビンアデニンジヌクレオチッド，ニコチン酸
（アミド），葉酸，パントテン酸，リポ酸，（塩酸）ピ
リドキシン，（塩酸）ピリドキサール，（塩酸）ピリド
キサミン，ピリドキシン５′−リン酸，ピリドキサール
５′−リン酸，ピリドキサミン５′−リン酸，シアノコ
バラミン，（酢酸）ヒドロキソコバラミン，メチルコバ
ラミン，アデノシルコバラミン，アクアコバラミン，ビ
オチン，アスコルビン酸，リボフラビンリン酸エステル
などが挙げられる。
上記アミノ酸としては、グリシン，アラニン，バリン，
セリン，トレオニン，システイン，メチオニン，フェニ
ルアラニン，トリプトファン，チロシン，プロリン，シ
スチン，グルタミン酸，アスパラギン酸，アスパラギ
ン，グルタミン，リシン，アルギニン，ヒスチジンなど
が挙げられる。
上記ペプチドとしては、メチオニンエンケファリン，ロ
イシンエンケファリン，キョウトロフィンなどが挙げら
れる。
上記核酸類としては、アデニン，グアニン，シトシン，
ウラシル，チミンなどの核酸塩基、グアノシン，アデノ
シン，シチジン，ウリジン，デオキシグアノシン，デオ
キシアデノシン，デオキシシチジン，チミジンなどのヌ
クレオシド,2′−AMP,3′−AMP,5′−AMP,ADP,ATP,5′
−CMP,CDP,CTP,5′−UMP,UDP,UTP,2′−GMP,3′−GMP,N
ADH,NADPH,CoAなどのヌクレオチッドなどが挙げられ
る。
上記糖類としては、アラビノース，キシロース，リボー
ス，グルコース，マンノース，フルクトース，ガラクト
ースなどの単糖類、マルトース，ラクトース，サッカロ
ース，トレハロースなどの二糖類などが挙げられる。
（発明の効果） 本発明のクロマトグラフ充填剤を用いたクロマトグラフ
ィー法により、広範囲の水溶性有機化合物を高い分離能
で、かつ短時間に分離することが可能である。
また、移動相として、有機溶媒を含まない水溶液を用い
るので、分離後の廃液処理問題がなく、紫外線検知器を
用いる場合波長領域を自由に選択できる等高速高分離能
性で実用性の高い方法ということができる。
（実施例） 以下本発明について実施例により更に詳しく説明する。
実施例１ 300mlのフラスコにトルエン160ml及びシリカゲル（「ダ
イゾーゲルSP−120」ダイソー社製，平均粒径５μ）10.
0gを入れ、28時間加熱還流を行いながら共沸水を除去す
る。
室温に冷却した後３−モルホリノプロピルトリメトキシ
シラン25gを加え、24時間加熱還流を行う。室温に冷却
後濾過し、トルエン，アセトン，エーテルの順で洗浄し
た後減圧乾燥する。
得られたゲルの元素分析値はC:7.89％,H:1.54％,N:1.20
％であり、窒素の元素分析値か求めたグラフト量は0.86
mmol/gであった。
実施例２ 実施例１と同様にして、シリカゲル10.0gと３−モルホ
リノプロピルトリメトキシシラン25gとを24時間加熱還
流を行った後室温に戻し、トリメチルクロロシラン3.68
gとヘキサメチルジシラザン5.43gを混合したものを上記
反応液中に滴下し、滴下終了後５時間加熱還流する。
室温に冷却後濾過し、トルエン，アセトン，エーテルの
順に洗い、次いでアセトンで洗浄後更に純水，アセト
ン，エーテルの順で洗浄した後、80℃で乾燥し、エンド
キャッピングしたゲルを得た。
このゲルの元素分析値はC:8.50％,H:1.65％,N:1.36％で
あった。
実施例３ ３−モルホリノプロピルトリメトキシシランの代りに３
−ピペラジノプロピルトリメトキシシランを用いる以外
は実施例１と同様に反応させ、３−ピペラジノプロピル
基をグラフトしたゲルを得た。
得られたゲルの元素分析値はC:7.92％,H:1.64％,N:2.42
％であり、窒素の元素分析値から求めたグラフト量は0.
86mmol/gであった。
実施例４ ３−モルホリノプロピルトリメトキシシランの代りに３
−ピペリジノプロピルトリメトキシシランを用いる以外
は実施例１と同様に反応させ、３−ピペリジノプロピル
基をグラフトしたゲルを得た。
このゲルの元素分析値はC:8.47％,H:1.68％,N:1.19％で
あり、窒素の元素分析値から求めたグラフト量は0.85mm
ol/gであった。
実施例５ 実施例１で得られた充填剤を内径4.6mm,長さ150mmのス
テンレス製カラムにグリセリン−メタノール（容量比4:
6）溶液を用いてスラリー充填し、以下の条件で分析
し、第１図のクロマトグラムを得た。
温度：室温 移動相:0.1Mリン酸緩衝液（0.1MH3PO4＋0.1MNa2HPO4）
をpH6.0に合わせ、10mMのテトラブチルアンモニウムブ
ロマイドを加えた溶液 流速:1.0ml/分 検出器：紫外線吸収計（波長270μｍ） 分析対象物として次の化合物の混合物を用いた。Ａ）ア
スコルビン酸,B）塩酸ピリドキシン,C）ニコチン酸,D）
フラビンアデニンジヌクレオチッド,E）酢酸ヒドロキソ
コバラミン,F）塩酸チアミン 実施例６ 実施例５のカラムを用い移動相としてpH5.0に調整した
リン酸緩衝液を用いる以外は実施例５と同じ条件で分析
し、第２図のクロマトグラムを得た。
分析対象物として、次の化合物の混合物を用いた。Ｂ）
塩酸ピリドキシン,E）酢酸ヒドロキソコバラミン,F）塩
酸チアミン,G）ニコチン酸アミド,H）リボフラビンリン
酸エステル 実施例７ 実施例５と同様のカラム及び分析条件において、市販の
ビタミン栄養剤の分析を行った結果を第３図に示す。同
図において、ピークB,D,Fは、それぞれピリドキシン，
フラビンアデニンジヌクレオチッド，チアミンに相当す
る。
実施例８ 実施例３及び実施例４で得られた充填剤を内径4.6mm,長
さ150mmのステンレス製カラムにグリセリン−メタノー
ル（容量比4:6）溶液を用いてスラリー充填し、実施例
５と同様の条件で同一の分析対象物を分析して、第４図
のクロマトグラムを得た。
同図において、（イ）は実施例３の、（ロ）は実施例４
の充填剤を夫々用いたクロマトグラムである。
実施例９ 実施例１で得た充填剤を内径6.0mm,長さ150mmのステン
レス製カラムにグリセリン−メタノール（容量比4:6）
溶液を用いてスラリー充填し、以下の条件で分析し、第
５図のクロマトグラムを得た。
温度：室温 移動相:0.5Mリン酸カリウム水溶液に10mMのテトラブチ
ルアンモニウムブロマイドを加えた溶液 流速:2.0ml/分 検出器：紫外線吸収計（波長254μｍ） 分析対象物として、３種のヌクレオチッド化合物:I）
５′−AMP,J）ADP,K）ATPの混合物を用いた。
【図面の簡単な説明】
第1,2,3,4及び５図はそれぞれ本発明のクロマトグラフ
ィー法により実施例5,6,7,8及び９で得られたクロマト
グラムを示す。

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式（Ｉ） （式中R1,R2及びR3は同一又は相異なり、炭素数１〜５
    のアルキル基，炭素数１〜３のアルコキシル基，ヒドロ
    キシル基又はハロゲン原子を表わし、R1,R2及びR3の中
    少なくとも１つはアルコキシル基又はハロゲン原子であ
    る。R4は直鎖状又は分岐状の低級アルキル基からなる置
    換基を有してもよいω−ピペリジノ基，ω−ピペラジノ
    基又はω−モルホリノ基を表わす。ｎは２から10までの
    整数を表わす。）で示されるアミン誘導体が、ヒドロキ
    シル基をその表面に持つ無機担体にグラフトされている
    ことを特徴とするクロマトグラフ充填剤。
  2. 【請求項２】無機担体がシリカゲルである請求項１記載
    のクロマトグラフ充填剤。
  3. 【請求項３】アミン誘導体が、ジメチル（３−ピペリジ
    ノプロピル）メトキシシラン，メチル（３−ピペリジノ
    プロピル）ジメトキシシラン,3−ピペリジノプロピルト
    リメトキシシラン,3−ピペリジノプロピルトリエトキシ
    シラン，ジメチル（３−ピペラジノプロピル）メトキシ
    シラン，メチル（３−ピペラジノプロピル）ジメトキシ
    シラン,3−ピペラジノプロピルトリメトキシシラン,3−
    ピペラジノプロピルトリエトキシシラン，ジメチル（３
    −モルホリノプロピル）メトキシシラン，メチル（３−
    モルホリノプロピル）ジメトキシシラン,3−モルホリノ
    プロピルトリエトキシシラン,3−モルホリノプロピルト
    リエトキシシラン及び３−モルホリノデシルトリエトキ
    シシランの群から選ばれたものである請求項１又は２記
    載のクロマトグラフ充填剤。
  4. 【請求項４】請求項１記載のクロマトグラフ充填剤を用
    いて、水溶性有機化合物を分離することを特徴とするク
    ロマトグラフィー法。
  5. 【請求項５】移動相としてイオン対試薬を含むリン酸緩
    衝水溶液を用いる請求項４記載のクロマトグラフィー
    法。
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