FI61811C - Anvaendning av en biologiskt aktiv produkt bestaoende av en i atten oloeslig baerare och ett biologiskt aktivt aemne sa osm adsorptionsmedel foer affinitetskromatografi - Google Patents

Description

rrftr^l m (ii)KUUBLUTUSJULKA|su .-.o-,- u u UTLÄGGNI NGSSKRI FT Ο ι O I ! ¢5¾¾ ci45. Fa tontti aylnn-tty II 10 1932 * Patent meddelat 3 3 B 01 D 15/08 // G 0? G 7/00, (51) Kv.ik. /int.ci. c 12 N 11/08, G 01 N 33/4-8 (21) Pitanttihakcmut — PatununsBkning 70369^ (22) Hakemispilvl — Anittknlnpdag 01.12. (8 (FI) (23) AlkupSlvi— Glltighatsdag 30.01.75 (41) Tullut luikituksi — Bllvlt offentllg 01.12.78

Patentti- ja rekisterihallitut (44) Nlhtiwlktlpanon Ja kuuL|ulktlsun pvm.—

Patent- och registerttyrelten Ansdkan utlagd och utl.skrlftan publicerad 30.06.82 (32)(33)(31) Pyyd««y atuolkaus—Begird prloritet 06.05 · 7^

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) P 21+21789.8 (7:) iH'hringwerke Aktiengesellschaft, Marburg/Lahn, Saksan Liittotasavalta-Forbund srepubliken Tyskland (DE) (73) Rudolf Sc.'hmidtberger, Marburg-Marbach, Heinrich Huemer, Schwalbac’n/

Taunus, Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (YM O.y Kolater Ab (5)1) Biologisesti aktiivisen, veteen liukenemattomasta kantajasta ja biologisesti aktiivisesta aineesta koostuvan tuotteen käyttö adsorptio-aineena affiniteettikromatografiassa - Användning av en biologiskt aktiv produkt bestäende av en i vatten olöslig bärare och ett biologiskt aktivt ämne säsom adsorptionsmedel för affinitetskromatografi (62) Jakamalla erotettu hakemuksesta 751299 (patentti 602l6) -Avdelad fran ansökan 751299 (patent 60216)

Keksinnön kohteena on biologisesti aktiivisen, veteen liukenemattomasta kantajasta ja siihen kemiallisesti sidotusta biologisesti aktiivisesta aineesta koostuvan yhdisteen käyttö adsorptioai-neena affiniteettikromatografiassa, joka veteen lukenematon kantaja on polyhydroksimetyleeni, ja joka biologisesti aktiivinen aine on aminoryhmän tai aminoryhmiä sisältävä aine, kuten entsyymi, antigeeni tai vasta-aine tai muu plasmaproteiini, ja joka biologisesti aktiivinen aine on sidottu kantajaan mahdollisesti polyfunktionaalisen orgaanisen yhdisteen välityksellä.

Viime vuosina biokemiallisten työskentelymenetelmien piirissä yhä enemmän ja enemmän on noussut esiin uusi tekniikka, jonka ensisijaisena tunnusmerkkinä on kantajiin sidottujen, biologisesti ak- 2 6181ϊ tiivisten aineiden affiniteetin hyväksikäyttö selektiivisesti suoritettavissa olevissa reaktioissa.

Käyttämällä hyväksi kantajaan sidotun aineen ja toisen seoksessa olevan aineen spesifistä kompleksinmuodostuskykyä voidaan kysymyksessä oleva aine poistaa seoksesta ja eristää haluttaessa sen jälkeen desorption avulla.

Kantajaan sidottujen entsyymien ansiosta saavutetaan se etu, että aineiden muuttamiset voidaan suorittaa preparatiivisina, jatkuvina prosesseina ja reaktiotuotteet saadaan talteen entsyymittöminä.

Biokemiallisessa, entsymaattisessa analytiikassa reagenssei-na on käytettävissä veteen lukenemattomia entsyymejä, joita voidaan käyttää useaan kertaan. Koska entsyymien ominaisuutena on, että ne omaavat affiniteettia ei ainoastaan substraattien suhteen, vaan myös spesifisten inhibiittoein suhteen, entsyymi-inhibiittorien valmistus on osoittautunut erityisen edulliseksi affiniteettikroma-tografian avulla kantajaan sidottujen entsyymien yhteydessä. Toisaalta inhibiittoein sitoutuminen veteen lukenemattorniin kantajiin mahdollistaa vastaavien entsyymien preparatiivisen valmistuksen.

Antigeenit tai vasta-aineet sitoutuvat niin sanottuina im-munoadsorbentteinä veteen lukenemattomiin kantajiin ja mahdollistavat siten vastaavien vasta-aineiden tai antigeenien eristämisen.

Edellä esitetyn selostuksen mukaisesti biologisesti aktiivisilla aineilla tarkoitetaan in vivo ja in vitro vaikuttavia luonnosta saatavia ja keinotekoisesti valmistettuja aineita, joista avarim-massa mielessä voidaan käyttää nimityksiä entsyymit, antigeenit tai vasta-aineet.

Useimmat tähän asti selostetut kantajaan sidotut biologisesti aktiiviset aineet ovat oleellisesti paremmin säilyviä kuin vastaavat aineet liuoksessa.

Kantaja-aineina, niin sanottuina kantajina, on edullista käyttää vain sellaisia aineita, joiden ominaisuuksiin sisältyy ve-sipitosiin systeemeihin liukenemattomuuden ohella mahdollisimman alhainen epäspesifinen adsorptiokyky. Siksi kantajien ja biologisesti aktiivisen aineen reaktiokumppanin välistä hydrofobista, hyd-rofiilista ja ionista vuorovaikutusta ei saisi esiintyä aineiden kanssa, jotka eivät ole biologisesti aktiivisen aineen reaktiokump-paneita eikä missään tapauksessa saisi muodostua sidoksia sellaisten biologisesti aktiivisten aineiden kantajina tähän saakka käytetyt 3 6 1 8 '1 '1 kantajat ovat mm. sellaisia, jotka sitovat aktiiviaineen fysikaalisen adsorption välityksellä; näitä ovat aktiivihiili ja lasihel-met. Toisen ryhmän kantaja-aineita muodostavat ne aineet, joihin sitoutuu kovalenttisidoksen välityksellä. Näihin viimemainittuihin kuuluvat vinyylipolymeerit., esim. polyakryylihapot, polyakryy 1 ihap-poamidit ja amino-, karboksi- tai sulfonyylisubstituentin sisältävä polystyreeni, edelleen selluloosa ja sen johdannaiset ja lopuksi luonnosta saatavat ja synteettiset polypeptidit ja proteiinit. Kantajien ja biologisesti aktiivisten aineiden välisen tasaisen vuorovaikutuksen vuoksi hiilihydraattien, etenkin selluloosan, dekstraa-nin, tärkkelyksen, agarin tai näiden johdannaisten käyttö kantajina vesipitoisissa systeemeissä on saavuttanut laajimman levinneisyyden, joskin näiden luonnosta saatavien aineiden usien sisältämien karboksyyliryhmien on epäspesifisestä reaktiostaan johtuen todettu vaikuttavan häiritsevästi. Tämän ohella näiden aineiden terminen ja kemiallinen stabilisuus on suhteellisen vähäinen.

Nyt on keksitty, että haitat, joita kantajina käytettävillä hiilihydraateilla affiniteetista riippuvien reaktioiden yhteydessä esiintyy, voidaan torjua, jos kantajina käytetään polyhydroksimety-leeniä.

Keksinnön mukaiselle adsorptioaineelle on tunnusomaista, että veteen lukenematon kantaja on polyhydroksimetyleeni, ja biologisesti aktiivinen aine on aminoryhmän tai aminoryhmiä sisältävä aine, kuten entsyymi, antigeeni tai vasta-aine tai muu pasmaproteiini, ja että biologisesti aktiivinen aine on sidottu kantajaan mahdollisesti poly-funtionaalisen orgaanisen yhdisteen välityksellä.

Polyhydroksimetyleeni on synteettinen polymeeri, jossa on yhtenäinen hiiliketju. Kussakin hiiliatomissa on vetyatomi ja hydr-oksyyliryhmä. Sen valmistusta ja ominaisuuksia on selitetty mm.

N.D. Field, J.R. Schaefgen, J. Polymer Sei., Voi. 58, 533-543 (1962) ja G. Smets, K. Hayashi, J. Polymer Sei., Voi. 29, 257-274 (1958). Sitä voidaan valmistaa emäs- tai happohydrolyysin avulla polyviny-leenikarbonaatista. Polyhydroksimetyleeniä voidaan pitää polyviny-leenikarbonaatin johdannaisena. Biologisesti aktiivisen aineen sitoutuminen polyhydroksimetyleeniin voidaan aikaansaada toisaalta toimenpitein, jotka tunnetulla tavalla liittävät biologisesti aktiivisen aineen kantajan hydroksyyliryhmän kovalenttisidoksin, toisaalta 4 61811 antamalla polyvinyleenikarbonaatin reagoida, niin ikään tunnetulla tavalla polyvinyleenikarbonaatin syklokarbonaattirenkaan aminolyyt-tisen reaktion välityksellä, primaarisen amiinin, esim. heksamety-leenidiamiinin kanssa uretaanisidoksen välityksellä specer'illa tai biologisesti aktiivisella aineella substituoitu polyvinyleenikarbo-naatti, jonka jäljellä olevat syklokarbonaattiryhmät saippuoidaan sen jälkeen hydroksyyliryhmiksi: ---! CH-ClT----- ---- CH-CH | —CH-CH----- ' l ; f j ! + R-NH~ ’ | | OH 0 saippuointi 0 O O O l ' > \ \ ^ I c = o ! C ’ C f i " i " ;

0 n ! NH

' " - J ; n- 1 polyvinyleenikarbonaatti -Γ CH-CiT] —CH-CH ---- | I I > I f I OH OH ; OH o ; ; ;.o l In.— 1 '

— -* NH

R

Tuotteiden käytön kannalta on erityisen edullista, että biologisesti aktiivisten aineiden ei anneta reagoida suoraan polyhydr-oksimetyleenin kanssa, vaan niiden annetaan sitoutua kantajaan kova-lenttisidoksin niin sanotun spacer'in välityksellä.

Spacer-aineet ovat useimmiten hiilivetyrunkoisia ja niiden pitoisuus on 1-2 nm. Kahden reaktiokykyisen pääteryhmän ansiosta spacer voi reagoida sekä kantajan että myös biologisesti aktiivisen aineen kanssa, jolloin kantajan kanssa tapahtuvassa reaktiossa voidaan käyttää sopivissa olosuhteissa sekä polyhydroksimetyleeniä että myös polyvinyleenikarbonaattia.

Biologisesti aktiivisten aineiden liittämiseksi kovalenttisi-doksin kantajaan löytyy useita yleisesti tunnettuja reaktioita: 5 61811

Erityisen yksinkertainen menetelmä perustuu polyhydroksimety-leenin hydroksyyliryhmän aktivointiin syaanihalogenidien avulla, lähinnä bromisyaanilla, ja aminoryhmiä sisältävien biologisesti aktiivisten aineiden reaktioon näiden aktivoitujen ryhmien välityksellä.

Toinen menetelmä perustuu siihen, että polyhydroksimetyl.ee-nin, kuten esim. polysakkaridin annetaan reagoida atsidimenetelmän (Curtius) muunnelmaa käyttäen halogeenikarbonihapon, kuten kloori-erikkahapon, kanssa alkalisessa ympäristössä, vastaava happo esteröi-dään alkoholin kanssa, sen jälkeen esteri muutetaan hydrtasidiksi ja lopuksi näin muodostunut aimonoryhmän sisältävä atsidi liitetään polyhydroksimetyleenimatriisiin.

Biologisesti aktiivinen aine voidaan myös liittää polyhydr-oksimetyleenikantajaan siten, että hydroksyyliryhmät ensin asyloi-daan bromiasetyylibromidilla, minkä jälkeen biologisesti aktiivisen aineen aminoryhmä alkyloidaan.

Vastaavanlaisia reaktioita saadaan tapahtumaan esimerkiksi antamalla kantajan hydroksyyliryhmien reagoida reaktiokykyisten tri-atsiinien kanssa, jolloin osa triatsiinin reaktiokykyisistä ryhmistä reagoi polyhydroksimetyleeniyhdisteen kanssa, osa biologisesti aktiivisen aineen aminoryhmän kanssa.

Diatsotoitavissa olevat aromaattiset amiinit, jotka toisaalta voivat muun reaktiokykyisen ryhmän välityksellä sitoutua kantajan hydroksyyliryhmiin, mahdollistavat toisaalta sidoksen muodostumisen esimerkiksi siihen kykenevien, aktivoitujen proteiinien tyrosiini-tai histidiinitähteiden kanssa.

Aryyliaminoryhmiä sisältävät vinyylisulfonijohdannaiset ja /3-hydroksietyylisulfonien rikkihappopuoliesterit voidaan saada reagoimaan kantajan hydroksyyliryhmien kanssa. Ne mahdollistavat biologisesti aktiivisen aineen sitoutumisen edellä selitetyn diatsotointi-reaktion jälkeen.

Erityisen luja eetterisidos muodostuu annettaessa polyhydr-oksimetyleenin hydroksyylirymien reagoida ioneja muodostamattomien epoksidien kanssa, joissa on vähintään 2 reaktiokykyistä ryhmää, kuten epihalogeenihydriinien tai polyepoksidien, esimerkiksi epikloori-hydriinin tai bisepoksidin kanssa.

Löytyy muitakin menetelmiä kovalenttisidoksen muodostamiseksi polyhydroksimetyleenin hydroksyyliryhmien ja biologisesti aktiivisen aineen aminoryhmien välille, kuten tunnettu reaktio komplekseja muodostavien metalliyhdisteiden, esim. titaaniyhdisteiden välityksellä.

6 6181 1

Mainitun kemiallisen ja termisen stabilisuuden ohella poly-hydroksimetyleenillä on muita erinomaisia ominaisuuksia. Niinpä se voidaan helposti muokata kuitu-, lanka-, kalvo- tai raemuotoon, joten muoto voidaan valita käyttötarkoitukseen sopivaksi. Myös poly-hydroksimetyleenin pinta-ala on helposti säädettävissä.

Vastaavien reaktiomekanismien mukaisesti, joita on selitetty edellä biologisen aineen liittämisen yhteydessä myöskin voidaan liittää kantajaan, jos siinä yhtenä reaktiokykyisenä ryhmänä on aminoryh-mä. Spacerin liittäminen tarjoaa mahdollisuuden liittää biologisesti aktiivinen aine muullakin tavalla, esimerkiksi siinä tapauksessa, että matriisiin sitoutuneessa spacerissa on vapaa karboksyyliryhmä, tämä karboksyyliryhmä on aktivoitavissa esimerkiksi karbodi-imidi -yhdisteillä, joka sitten voi muodostaa aidisidoksen biologisesti ak-tivisen aineen kanssa. Karboksyyliryhmät suovat edelleen mahdollisuuden amidisidosten muodostamiseen Woodward'in esittämien isoksats-olium-suolojen avulla.

Jos matriisiin sidotussa spacerissa on käytettävissä oleva vapaa aminoryhmä, spacerin pidentämiseen aryyliaminoryhmin voidaan käyttää aryyliaminoryhmiä sisältäviä vinyylisulfonijohdannaisia tai /b-hydroksietyylisulfonien rikkihappoestereitä, jotka sen jälkeen diatsotoidaan tunnetuin menetelmin ja sidotaan biologisesti aktiivisen yhdisteen vastaaviin reaktiokykyisiin ryhmiin, esimerkiksi r !_ s i

I OH j 0 OH

σ^ \h- (ch2) 6-nh-ch2-ch2-so2-^~^--nh2

Kantajiin sidotuilla, biologisesti aktiivisilla aineilla on niiden spesifisten adsorptio-ominaisuuksien ansiosta laajaa käyttöä affiniteettikromatografiässä. Kantajiin sidottujen luonnossa esiintyvien tai synteettisten entsyymi-inhibiittorien avulla voidaan valmistaa erittäin puhtaita entsyymituotteita ja kantajiin sidottujen ensyymien on puolestaan todettu soveltuvan huomattavan hyvin erityisesti luonnon entsyymi-inhibiittorien talteenottamiseen raakauut-teista. Kantajiin sidottuja veteen liukenemattomia antigeenejä käytetään asianomaisten vasta-aineiden eristämiseen, jotka saadaan tällä 7 61811 tavalla vapaina muista seerumiosasista ja vapaina muista antigeeneistä. Afiiniteettikromatografisesti voidaan eristää myös saostu-mattomia vasta-aineita samoin kuin aineita, joita ei saada saostumaan , koska niiden konsentraatio seerumissa on vähäinen ja määritys voidaan tehdä myös kvantitatiivisesti.

Keksinnön selventämiseksi seuraavassa esitetyissä esimerkeissä on osoitettu, että polyhydroksimetyleenikantaja soveltuu mitä erilaisimpien biologisesti aktiivisten aineiden sitomiseen, ja että polyhydroksimetyleeni voidaan sopivasti substituoimalla tehdä käytännöllisesti katsoen jokaisen halutun biologisesti aktiivisen aineen sitomiseen soveltuvaksi.

Esimerkin muodossa osoitetaan edelleen, mihin matriisiin sidottuja biologisesti aktiivisia aineita voidaan käyttää.

Esimerkki 1

Polyhydroksimetyleeni-tetanustoksoidi -yhdiste Matriisin valmistus (to -amino-n-heksyyli)-substituoidusta polyhydr-oksimetyleenistä:

Seokseen, jossa on 20 g polyhydroksimetyleeniä suspendoituna 900 ml:aan vettä, lisätään liuos, jossa on 20 g BrCN:a 50 ml:ssa dimetyyliformamidia ja pH pidetään sekoittaen ja sisälämpötilan ollessa 15°C 6 minuutin ajan arvossa 11,5 tiputtamalla hitaasti 2-n natronlipeää. Sen jälkeen suodatetaan heti, pestään hyvin jäävedellä ja puristetaan kaksuksi. Näin aktivoitu, vielä veden kostuttama poly-hydroksimetyleeni lisätään hyvin sekoitettuun, huoneen lämpötilassa pidettyyn, väkevällä HClrlla pH-arvoon 8,5 säädettyyn liuokseen, jossa on 20 g heksametyleenidiamiinia 500 ml:ssa H20:ta, kokonaistilavuus säädetään vettä lisäämällä 1 litraksi, pH-arvo pidetään jatkuvasti välillä 8,5-9,0 ja sekoittamista jatketaan vielä 5 tuntia huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen suodatetaan ja pestään hyvin vedellä. (6)-amino-n-heksyyli)-ryhmin substituoidun polyhydroksimety-leenin kuivatun näytteen typpipitoisuus oli 1,9 %. Lisäämällä primaaristen vapaiden aminoryhmien osoittamiseksi Sanger'in reagenssia saadaan intensiivisen keltaiseksi värjäytyneitä tuotteita.

Tetanus-antigeenin sitominen kantajaan 10 g esimerkin 1 kantajaa suspendoidaan 200 ml:aan 0,5-m natriumfosfaattiliuosta, jonka pH on 10. Suspensiota lämmitetään sekoittaen 50°C:ssa ja lisätään 5 g 1-aminobentseeni-4-/3-hydroksi-etyylisulfonirikkihappopuoliesteriä. Sen jälkeen, kun pH on säädetty 8 61811 arvoon 10 2-NaOH:lla, erää sekoitetaan tunnin ajan 50°C:ssa. Sen jälkeen suodatetaan imusuodattimen läpi ja pestään käyttämällä 2 1 vettä, 2 1 asetonia ja 2 1 0,2-m HCl:a. Polyhydroksimetyleeniin sidottujen aryyliamiiniryhmien diatsotoimiseksi suodatinjäännös suspen-doidaan 200 ml:aan 0,2-m HCl:a, jäähdytetään 2°C:seen ja sekoittaen lisätään 1-m NaN02~liuosta, kunnes KJ-tärkkelyspaperilla on todettavissa, että nitriittiä on hieman ylimäärin. 10 minuutin kuluttua suodatetaan imusuodattimen läpi ja suodatinjäännös pestään 1 litralla 2°C asteista, 0,01-m amidosulfonihapon vesiliuosta ja sen jälkeen 200 ml :11a 0,2-m natriumfosfaattia, jonka pH on 7,5 ja lämpötila 2°C. Kytkentäreaktiota varten diatsoniumryhmiä sisältävä tuote sus-pendoidaan 150 ml:aan liuosta, jossa on 2 g tetanus-toksoidia (1 260 Lf/mg N)0,2-m natriumfosfaatissa, jonka pH on 7,5 ja lämpötila 2°C, ja sekoitetaan 20 tuntia 5°C:ssa. Toksoidin sitoutumattomat osat pestään pois imusuodattimella 1 litralla 1-m NaCl-liuosta.

Polyhydroksimetyleeni-tetanustoksoidi -yhdisteen käyttö

Tetanus-antitoksiinin valmistuksessa 10 g esimerkin 1 tuotetta suspendoidaan 150 mlraan 0,15-m NaCl-liuosta, johon on lisätty 1/15-mol/l natriumfosfaattia, pH 7,2, ja siirretään pylvääseen, jonka läpimitta on 3 cm ja korkeus 10 cm. Pylvääseen pannaan 20 ml tetanus-hevosseerumia, 1 650 KY (kansainvälistä yksikköä) tetanus-antitoksiinia/ml, joka pylväs pestään sen jälkeen 500 ml:11a natriumfosfaattipuskuriliuosta, jonka pH on 7,2. Vasta-aineen eluointi tapahtuu 0,5-m.glysiini/HCl-puskurilla, jonka pH on 2,5. Eluaatissa on 2-m NaOH:lla suoritetun neutraloinnin ja sitä seuranneen sentrifugoinnin jälkeen kaikkiaan 240 mg proteiinia ja 12 300 KY tetanus-antitoksiinia, jonka määritys tapahtuu hiirillä suoritettavan suojakokeen avulla.

Esimerkki 2

Polyhydroksimetyleeni-aminobentsamidiini -yhdiste Matriisin valmistus ( u--karboksi-n-bentyyli)-substituoidusta poly-hydroksimetyleenistä 20 g polyhydroksimetyleeniä lisätään esimerkin 1 mukaisesti BrCN:lla suoritetun aktivoinnin jälkeen vesiliuokseen, jossa on 25 g £ -aminokaronihappoa ja jonka pH on säädetty laimealla natronlipeällä arvoon 8,5 ja kokonaistilavuus 1 litraksi. Seloittamista jatketaan vielä 5 tuntia huoneen lämpötilassa pH:n ollessa 8,5 ja suodatetaan 9 6181'i sekä pestään hyvin vedellä. (61 -karboksi-n-pentyyli) -ryhmin subst.i-tuoidusta polyhydroksimetyleenistä otetun kuivatun näytteen typpipitoisuus oli 0,86 %.

Aminobentsamidiinin sitominen kantajaan 2 g esimerkin 2 mukaisesti valmistettua polyhydroksimetylee-ni-johdannaista suspendoidaan 25 mlraan 0,1 m morfoliinietaanisulfo-nihappoa ja lisätään 1 g 1-etyyli-3-(3-dimetyyliaminopropyyli)-korb-oksi-imidi-hydrokloridia. Lisätään 2-m HCl:a kunnes pH-arvo on 4,8. Erään lisätään sekoittaen 1 g m-aminobentsamidiinia. Suspensiota sekoitetaan pH:ta säätäen tunnin ajan ja adsorbentti siirretään sitten kromatografiapylvääseen, jonka läpimitta on 1 cm. Adsorbentti huuhdotaan 200 ml:11a 0,05-m tris-hydroksimetyyliaminometaani-HCl -puskuria (pH 8,0), johon on lisätty 0,5 m KCl:a (Tris-KCl).

Polyhydroksimetyleeni-aminobentsamidiini -yhdisteen käyttö trombiinin valmistukseen 100 mg naudasta saatua puhdistamatonta trombiinia liuotetaan 5 ml:aan 0,05-m Tris/0,5-m KCl-liuosta, jonka pH on 8,0, ja pannaan edellä esitetyllä tavalla esikäsiteltyyn pylvääseen. Sen jälkeen pylväs huuhdellaan 200 ml :11a Tris-KCl-puskuria. Liukenemattomaksi tehtyyn m-aminobentsamidiiniin sidottu trombiini lohkaistaan tästä 100 ml :11a liuosta, jossa on 0,05-m m-aminobentsamidiinia Tris-KCl-puskurissa.

Proteiinia sisältävät fraktiot yhdistetään ja juosutetaan Tris-KCl-puskurissa Sephadex G-25 -pylvään (valmistaja Pharmacia, Uppsala, Ruotsi; pylvään koko 1 x 30 cm) läpi. Ensimmäisen proteiinia sisältävän pylväseluaatin osan todettiin Chase'n ja Shaw'n Biochem. 8, 1969, s. 2212, mukaisesti suoritetun aktiivisuusmääri-tyksen perusteella sisältävän 78 % lähtöaineen aktiivisuudesta.

Esimerkki 3

Polyhydroksimetyleeni-pepsiini-vaImiste Kantajan valmistaminen (to-amino-n-heksyyli)-substituoidusta polyhydroksimetyleenistä : 8,0 g dimetyyliformamidi/metanoli-seoksesta uudelleen saos-tettua polyvinyleenikarbonaattia (valmistus: ks. N.D. Field, J.P. Schaefgen, J. Polymer Sei., Voi. 58, s. 534 (1962)), suspendoidaan huoneen lämpötilassa liuokseen, jossa on 7,5 g heksametyleenidiamii-nia 180 ml:ssa metanolia ja sekoitetaan 48 tuntia huoneen lämpötilassa, suodatetaan, pestään metanolilla ja pidetään 4 vuorokautta huo- 10 61 81 1 neen lämpötilassa suspendoituna liuokseen, jossa on 10 g natriumme-tylaattia 300 ml:ssa 96-% metanolia, pestään metanolilla ja sen jälkeen hyvin tehokkaasti vedellä, kuusi Ch^-ryhmää sisältävän spacerin välityksellä primaarisin aminoryhmin substituoidun kuivatun poly-hydroksimetyleeniadrorbenttinäytteen typpipitoisuus oli 5,7 %. Pepsiinin sitominen kantajaan 20 g ( -amino-n-heksyyli)-substituoitua polyhydroksimetylee-niä, joka on valmistettu esimerkin 3 mukaisesti, suspendoidaan 400 ml:aan 0,2-m natriumfosfaattia (pH 10). Suspensioon lisätään sekoittaen 40 ml 25-% glutaarialdehydi-liuosta. Kaksi tuntia kestäneen, huoneen lämpötilassa tapahtuneen sekoittamisen jälkeen suodatetaan imusuodattimen läpi ja suodatinjäännös pestään 4 litralla 0,2-m natriumasetaatti-puskuria (pH 4,0). Sen jälkeen reaktiotuote lisätään 500 ml:aan liuosta, jossa on 5 g pepsiiniä, kaikkiaan 500 000 KY, määritetty Anson1in mukaisesti, 0,2-m natriumasetaatissa, (pH 4,0) ja sekoitetaan 15 tuntia 6°C:ssa. Tämän jälkeen saatu tuote pestään imusuodattimella 5 litralla 0,1-m natriumasetaatti/etik-kahappoliuosta (pH 4,0), johon on lisätty 1 mol/1 NaClra.

Polyhydroksimetyleeni-pepsiini -yhdisteen käyttö immunoglobuliinien proteolyyttiseen lohkaisuun Edellä esitetyn esimerkin mukaisesti saatu adsorbenssi suspendoidaan 0,1-m asetaattipuskuriin (pH 4,0) ja tästä suoritetaan Anson'in mukainen aktiivisuusmääritys. Suspensiossa on kaikkiaan 21 000 KY pepsiiniä sidotussa ja tällä kokeella osoitettavissa olevassa muodossa. Ihmisen immunoglobuliini G:n proteolyyttistä lohkai-sua varten pepsiini-adsorbentti suodatetaan erilleen ja jäännös suspendoidaan 2,5-% liuokseen, jossa on 30 g ihmisen immunoglobuliini G:tä (igG) fysiologisessa NaCl-liuoksessa (pH 4,1). Lohkaisuerää se-kotietaan 24 tuntia 37°C:ssa. Kantajaan sidotun pepsiinin erilleen suodattamisen jälkeen suodokseen lisätään 1 250 ml kyllästettyä am-moniumsulfaattiliuosta. Tällöin muodostuva sakka sentitugoidaan erilleen; se sisältää immunoglobiinin (F(ab)2~osan vasta-aine -aktiivi-suuksineen. Suodos heitetään pois.

Esimerkki 4

Polyhydroksimetyleeni-oksamiinihappo -yhdisteen valmistus 10 g polyhydroksimetyleeniä aktivoidaan esimerkissä 1 selostetulla tavalla BrCN:lla ja sen annetaan reagoida 5 g:n kanssa tyr-amiinia, joka on liuotettu 150 mitään 0,1-m natriumvetykarbonaattia, n 6181 1 5°C:ssa 60 minuutin ajan sekoittaen. Sitoutumaton tyramiinin osa suodatetaan erilleen imusuodattimella ja suodatinjäännös pestään 1 litralla 0,1-m natriumfosfaatti-purskuria, jonka pH on 7,0 ja lämpötila 5°C. Suodatinjäännös suspendoidaan 150 ml:aan 5°C: seen jäähdytettyä liuosta, jossa on 1 g diatsotoitua p-aminofenyylioksamiinihappoa ja sekoitetaan 15 tuntia 5°C:ssa. Adsorbentti pestään imusuodattimella 1 litralla 0,05-m natriumasetaattietikkahappopuskuria (pH 5,5), johon on lisätty 2 mmoolia CaCl2:a ja 0,2 mmoolia EDTArta.

Polyhydroksimetyleeni-oksamiinihappoyhdisteen käyttö neuraminidaasin valmistuksessa

Esimerkin 4 mukaisesti saatu adsorbentti suspendoidaan uudelleen mainittuun asetaattipuskuriin ja siirretään kromatografiapy1-vääseen, jonka läpimitta on 2 cm. Tämän pylvään läpi johdetaan 1 litra Vibrio Cholorae-viljelmäsuodosta, jossa on 800 KY neuraminidaa-sia/ml, jonka pH on ensin säädetty 2-m etikkahapolla arvoon 5,5 ja johon on lisätty CaCl2:ta ja EDTA:ta, kunnes näiden pitoisuudet olivat 2 mmol/1 vast. 0,2 mmol/1. Sitoutumattomat proteiinit pestään pois 500 ml :11a asetaattipuskuria.

Kantajaan sitoutuneeseen inhibiittoriin adsorboituneen neuraminidaasin eluointi tapahtuu pesemällä pylväs 0,1-m natriumvetykar-bonaatti-liuoksella ja keräämällä yhteen neuraminidaasia sisältävät fraktiot. Ne sisältävät 86 % käytetystä aktiivisuudesta.

Esimerkki 5 a) polyhydroksimetyleenin reaktio epikloorihydriinin kanssa 50 g polyhydroksimetyleeniä suspendoidaan 1 litraan 2-n

NaOH:a, lisätään 250 ml epikloorihydriiniä ja sekoitetaan 2 tuntia 55-60°C:ssa. Suspension pH-arvo laskee lyhyessä ajassa välille 10-11. Tämä pH-arvo säilytetään vielä tunnin ajan lisäämällä NaOH:a. 2 tunnin reaktioajan jälkeen kiinteä aine suodatetaan erilleen, pestään vedellä, asetonilla ja lopuksi jälleen vedellä.

b) 50 g heksametyleenidiamiinia liuotetaan 1,5 litraan vettä ja lisätään HCl:a, kunnes pH on 10. Liuokseen lisätään kohdan a) mukaisesti aktivoitu polyhydroksimetyleeni ja sekoitetaan 6 tuntia 50-55°C:ssa. Sen jälkeen tuote suodatetaan erilleen ja pestään hek-sametyleenidiamiinittomaksi vedellä.

c) Kohdassa 5b) saatua tuotetta sekoitetaan tunnin ajan 50 g:n kanssa 1-aminobentseeni-4-^-hydroksietyylisulfonirikkihappo-esteriä 55°C:ssa ja pH:n ollessa 10. Sen jälkeen kiinteä aine suo- 12 618 11 datetaan erilleen, pestään vedellä, asetonilla ja uudelleen vedellä.

d) 10 g kohdan 5) mukaisesti saatua tuotetta pestään imusuo-dattimella 200 ml :11a 0,1-n HCl:a ja suspendoidaan sen jälkeen 300 ml:aan 0,5-n HCl:a. Suspensioon lisätään sekoittaen 0-4°C:ssa 0,1-n NaNC^-liuosta, kunnes KJ-tärkkelyspaperilla on todettavissa vähäisen nitriitti-ylimäärän läsnäolo. 10 minuutin kuluttua suodatetaan imu-suodatinta käyttäen ja jäännös pestään jäävedellä ja sen jälkeen 0,15-m natriumfosfaatti-puskurilla (pH 7,5) lämpötilassa 0-4°C.

e) 0,75 g albumiinia liuotetaan 250 mlraan fosfaattipuskuria, jonka pH on 7,5, jäähdytetään 4°C:een ja lisätään kohdassa 5d) valmistettu tuote. Suspensiota sekoitetaan 20 tuntia 4°C:ssa, sen jälkeen suodatetaan ja kiinteä aine pestään 1-m NaClrlla ja fosfaatilla puskuroidulla keittosuolaliuoksella (0,9-% NaCl:n vesiliuos, jossa on 1/15 mol/1 Na2HPC>4-KH2PO4-puskuria, ja jonka pH on 7,2).

Suodoksesta ja pesuvedestä määritetään albumiinipitoisuus radiaali-immunodiffuusiomenetelmällä. 1 g:aan näin valmistettua kantajaa sitoutuu 75 mg albumiinia.

f) 2,4 g IgM:ää liuotetaan 250 ml:aan fosfaattipuskuria, jonka pH on 7,5 ja jäähdytetään 4°C:seen. Lisätään 10 g kohdan 5d) mukaisesti diatsotoitua tuotetta ja suspensiota sekoitetaan 20 tuntia 4°C:ssa. Suodattamisen jälkeen kiinteä aine pestään 1-m NaCl-liuoksella ja PBS-liuoksella.

1 g kohdan 5f) mukaisesti valmistettua kantajaa sitoo 240 mg

IgMrää.

Esimerkki 6 a) 10 g polyhydroksimetyleeniä aktivoidaan epikloorihydriinil-lä, annetaan reagoida heksametyleenidiamiinin kanssa ja jatkokäsitel-lään eismerkissä 5 kohdissa a) ja b) selostetulla tavalla.

b) 10 g näin valmistettua kantajaa sukkinoyloidaan 4 tuntia 10°C:ssa ja pH:n ollessa 6,5 käyttäen 5 g meripihkahappoanhydridiä, joka on suspendoitu 200 ml:aan vettä. pH-arvoa säädellään 2-n NaOH: 11a. Kun kiinteä aine on pesty vedellä, tuotetta sekoitetaan 30 minuuttia pH:ssa 5 ja lämpötilassa 5°C, 2,5 g:n kanssa N-sykloheksyyli-N'-/TN-metyylimorfoliino)-etyyli/-karbodi-imidi-p-tolueeni-sulfo-naatia, suodatetaan erilleen ja pestään nopeasti jäävellä.

c) 1 g IgG:tä liuotetaan 250 ml:aan fosfaatti-puskuria, jonka pH on 7,5 ja sekoitetaan kohdan 5f) mukaisesti valmistetun kantajan kanssa 24 tuntia 4°C:ssa. Tuote pestään suodattamisen jälkeen 1-m keittosuolaliuoksella ja fosfaattipuskuriliuoksella (ks. esimerkki 5) .

6181 1 13 1 g:aan kantajaa sitoutuu (kovalenttisidoksin) 85 mg IgG:tä.

Esimerkki 7 a) 20 g kohdassa 5a) valmistettua tuotetta sekoitetaan 20 g:n kanssa aminokapronihappoa 6 tuntia 50-55°C:ssa ja pll:n ollessa 10. Sen jälkeen suodatetaan ja pestään vedellä.

b) 10 g:aan kohdan 7a) mukaisesti valmistettua tuotetta lisätään 2,5 g N-sykloheksyyli-N'-/_(N-metyylimorfoliino)-etyyli7-kar-bodimidi-p-tolueeni-sulfonaattia ja tähän lisätään viiden minuutin kuluttua pH:n ollessa 5,2 g N-hydroksisukkiini-imidiä. Kun seosta on sekoitettu viisi tuntia 24°C:ssa, kiinteä aine suodatetaan erilleen ja pestään vedellä.

c) 0,5 g albumiinia liuotetaan 200 ml:aan fosfaattipuskuria ja sekoitetaan 24 tuntia 4°C:ssa kohdan 7b) mukaisesti valmistetun aktivoidun kantajan kanssa. Suodattamisen jälkeen tuote pestään 1-m keittosuolaliuoksella ja fosfaattipuskuriliuoksella (ks. esimerkki 5) .

1 g:aan kantajaa sitoutuu (kovalenttisidoksin) 50 mg albumiinia .

Esimerkki 8 10 g PHM:ää aktivoidaan epikloorihydriinillä, annetaan reagoida heksametyleenidiamiinin kanssa ja jatkokäsitellään esimerkin 5 kohdissa a) ja b) selitetyllä tavalla.

a) 10 g näin valmistettua kantajaa suspendoidaan 100 ml:aan vettä ja annetaan reagoida 500 ml:n kanssa 25-% glutaaridialdehydiä. Kiinteä aine suodatetaan erilleen noin tunnin sekoittamisen jälkeen ja pestään vedellä tai liuoksella (ks. esimerkki 5).

b) 0,5 g albumiinia liuotetaan 200 ml:aan fosfaattipuskuria ja sekoitetaan 20 tuntia 4°C:ssa kohdan 8a) mukaisesti valmistetun kantajan kanssa. Suodattamisen jälkeen tuote pestään 1-m keittosuola-liuoksella ja fosfaattipuskuriliuoksella.

Esimerkki 9

Suora reaktio epikloorihydriinillä aktivoidun polyhydroksi-metyleenin kanssa.

a) 10 g polyhydroksimetyleenia aktivoidaan esimerkissä 5a) selostetulla tavalla 50 ml :11a epikloorihydriiniä. Suodattamisen jälkeen tuote pestään nopeasti vedellä, asetonilla, vedellä ja lopuksi fosfaattipuskuriliuoksella (ks. esimerkki 5).

b) 0,5 g albumiinia liuotetaan 200 ml:aan PBS-liuosta (ks. esimerkki 5) ja sekoitetaan 60 tuntia 4°C:ssa kohdan 9a) mukaisesti 14 61811 valmistetun tuotteen kanssa. Suodattamisen jälkeen kantajaan sidottu proteiini pestään 1-m keittosuolaliuoksella ja fosfaattipuskuri-liuoksella .

1 g kantajaa sitoo 45 mg albumiinia.

Esimerkki 10 10 g veteen liukenematonta polyhydroksimetyleeniä sekoittaen pH-arvossa 9,5 (0,15-m Na-bikarbonaatti/NaOH-puskuria) kolme päivää 25°C :ssa 30 g:n kanssa dietyleeniglykolidiglysidyylieetteriä, tuote imusuodatetaan, pestään hyvin ja lisätään 0,5 g:aan ihmisalbumiinia 200 mlrssa 0,15-m fosfaattipuskuria (pH = 8) ja sekoitetaan 60 tuntia 10°C:ssa. Suodattamisen jälkeen pestään kantajaan sidottu proteiini 1-m keittosuolaliuoksella ja fosfaattipuskuriliuoksella. 1 g kantajaa sitoo 35 mg albumiinia.

Esimerkki 11 10 g polyhydroksimetyleeniä saatetaan reagoimaan esimerkissä 10 kuvatulla tavalla 30 g:n kanssa glysidyylitris-(glysidyy1ieette-riä), seos kaadetaan 0,5 g:aan immunoglobuliinia G (IgG) 200 mlrssa 0,15-m fosfaattipuskuria (pH = 7) ja sekoitetaan 60 tuntia 4°C:ssa. Suodattamisen jälkeen pestään tuote 1-m keittosuolaliuoksella ja nat-riumfosfaattipuskuriliuoksella. 1 g kantajaa sitoo 50 mg IgGrtä.