CN100343671C

CN100343671C - 检测和去除内毒素的方法

Info

Publication number: CN100343671C
Application number: CNB038145731A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·许茨; 罗曼·迈耶; 霍尔格·格拉勒特; 斯蒂芬·米勒
Original assignee: Profos AG
Current assignee: Hyglos Invest GmbH
Priority date: 2002-06-24
Filing date: 2003-06-24
Publication date: 2007-10-17
Anticipated expiration: 2023-06-24
Also published as: EP1516188B1; PL375203A1; WO2004001418A3; US20060172281A1; CN1662816A; AU2003250270A1; EP1516188A2; AU2003250270B2; US7858299B2; US7585620B2; HK1074252A1; CA2490467C; IL165390A0; RU2004135062A; KR20050027223A; WO2004001418A2; PL209568B1; IL165390A; DE10393326D2; HRP20041088A2

Abstract

本发明涉及检测内毒素的方法，包括：用噬菌体尾蛋白与样品温育，检测与噬菌体尾蛋白结合的内毒素，其中所述检测通过光谱方法实现。本发明还涉及从样品中去除内毒素的方法，包括：将样品与非特异性或定向固定在永久载体上的噬菌体尾蛋白共同温育或使其接触，从样品中分离噬菌体尾蛋白-内毒素复合物。

Description

检测和去除内毒素的方法

本发明涉及从样品中检测并去除内毒素的方法。

内毒素(ET)是脂多糖家族，其与蛋白质和磷脂一起形成了革兰氏阴性细菌的细胞外壁。内毒素只出现在这组细菌中，并且在其外膜的排布，稳定性和屏障功能中起重要作用。多种噬菌体利用内毒素或总(general)脂多糖来特异性地检测其宿主细菌。

所有内毒素变体都包含与磷脂A共价结合的异源多糖(Holst，O.，1999，Chemical structure of the core region of lipopolysaccharides.In：Ebdotoxin inhealth and disease(Brade，H.，Morrison，D.C.，Opal，S.，Vogel，S.eds.)，MarcelDekker Inc.New York)。脂质A将内毒素固定在细菌外膜。所述异源多糖包含核心寡糖和O抗原，其出现在周围的溶液中并决定细菌的血清学特性。O抗原包含重复的寡糖单元，其组成是菌株特异性的(见上文Holst等所述)。核心寡糖的特征性结构单元(building blocks)是2-酮-3脱氧辛酸(2-keto-3-deoxyoctonate)(KDO)和L-甘油-D-甘露庚糖(Hep)。

不同类型的内毒素最保守的部分是磷脂A。内核心区与脂质A的保守性相似，外核心区已经具有很高的变异。内核心区，KDO和磷脂A本身携带大量磷酸盐基团作为替代物，并因此使得内毒素带负电荷。此外，磷脂A和核心区上的磷酸基团可以用阿拉伯糖，乙醇胺，和磷酸盐不定取代。O抗原的各个糖结构单元是乙酰化的，唾液酸化的或者糖基化的。O抗原除了其重复单元的数量不同以外还有其它变化，因此每种细菌的内毒素群体具有一定的异源性(Palva E.T.，Makela P.H.，Lipopolysaccharide heterogeneityin Salmonella typhimurium analysed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electrophoresis.Eur J Biochem.1980；107(1)：137-43；Goldman R.C.，LeiveL.，Heterogeneity of antigenic-side-chain length in lipopolysaccharide fromEscherichia coli 0111 and Salmonella typhimurium LT2.，Eur J Biochem.1980；107(1)：145-53)。

内毒素是实际上在所有没有相应预防措施的水溶液中均可发现的生化分子。人和动物中的内毒素可导致脓毒症，导致免疫系统产生强烈的错误反应。因此，当制备药物蛋白时，内毒素污染应当被精确检测并应当随后完全去除。内毒素代表了遗传工程制药，基因治疗或被注入人或动物的物质(例如兽医治疗或在动物实验中)的一个问题。然而，不仅在药物中，而且在研究应用(例如动物细胞转染实验)中，可观察到内毒素抑制或降低转染效率。

为能够在临床研究框架中使用蛋白，欧洲和美国药典要求对内毒素水平而言蛋白的水平在特定边界值以下(例如，免疫血清球蛋白0.91EU/ml，相当于5EU/kg体重和小时(剂量＝EU/kg*h)；EU＝内毒素单位；FDA(食品和药品监督局)(Food and Drug Administration)：Guideline on Validation of LALas End Product)。如果药物或蛋白中含有过高的内毒素水平，可导致受试物的死亡。被错误导引的免疫防御系统造成患者过度反应而导致损害。这可导致组织炎症，血压降低，心跳加速(heart racing)，血栓形成，休克等。即使较长时间暴露于皮克级的内毒素也可导致慢性副作用，例如免疫缺陷，脓毒症症状等。在物质生产的框架内，尤其是在具有“药品生产质量管理规范(GMP)”的方法中，试图尽可能去除内毒素。然而，去除蛋白质，多糖和DNA中的内毒素很麻烦。就蛋白质本身而言，由于其内在的性质有大量问题，例如带电状态或疏水性，从而实质上阻止了内毒素去除并可导致去除过程中大量产物丢失。

目前，只描述了三种在生物溶液中检测内毒素的方法，只有前两种得到了FDA的许可。1.“兔热原实验”；在该方法中，将内毒素溶液注入活兔子体内，并由此激发免疫反应。这种内毒素诱导的免疫反应通过出现发热来检测。2.“鲎变形细胞溶解试验(LAL)”-实验，该实验是目前使用最频繁的(Bio Whittacker，Inc.，Charles-River，Inc.，Associates of Cape Cod，Inc.，allUSA)，其可以明显改善的方式被标准化。使用该方法，马蹄蟹(Limuluspolyphemus)的血液凝聚可在内毒素接触后测定。3.还有一种可能是使用特殊细胞培养系统(Sterogene Inc.，USA)，使用该系统可以通过特定细胞因子的出现而显示单核细胞的活化。

但前两种方法非常昂贵(cf.竞争比较内毒素检测)并且，由于需要大量实验动物以及稀有的马蹄蟹的血液，所述方法就动物保护而言至少存在问题。LAL实验实际上也可小型化并自动化，但由于其组分的低稳定性，其在应用中具有大量缺点。一旦LAL溶液被打开，由于其组分将在几小时内发生聚集，必须马上进行处理并用完。所有实验方法都需要熟练技术人员，并且所述方法非常容易受到干扰的影响，这是因为例如兔的免疫系统可对相同剂量的内毒素产生完全不同的反应。Sterogene公司的细胞培养方法同所有细胞培养方法一样，也非常复杂，并有标准化问题。

可完全确认没有容易掌握并且经济的内毒素检测方法，而且目前使用的方法有一系列缺点。因此需要可以避免这些缺点的方法。

通常有一系列方法可将内毒素从生物溶液中完全去除。尤其对蛋白质而言，目前仍没有通常可应用的标准方法。可使各种所用的方法适合各种蛋白质的具体特性，并适应蛋白的相应生产过程。有多种可能来去除内毒素，这些方法的每一种都具有特定的优点和缺点。

超滤(Petsch，D.& Anspach，F.B.，2000，J.Biotechnol.76，97-119以及其中的参考文献)用来从水和含有低分子量组分(例如盐，糖和抗生素)的溶液中完全去除内毒素，但不适合高分子量的蛋白质或者DNA。

2阶段提取(2-phase extraction)(例如WO 0166718，Merck)目的是将水溶性蛋白质和DNA从内毒素中分离，但在纯化的产物中产生清洁剂残余。由于纯化步骤需要多次重复，该方法还非常耗时。

阴离子交换物(DEAE)法也用于从DNA和碱性蛋白中去除内毒素(例如US 5990301，Qiagen；WO 9414837，Enzon)，但其需要低离子强度(＜50mMNaCl)，并且导致酸性蛋白的蛋白共吸收。

从DNA和蛋白质(例如BSA，肌球蛋白，γ-球蛋白，细胞色素C)中完全去除内毒素的方法还有亲合吸收(例如多粘菌素B，组胺，组氨酸，聚赖氨酸)，例如GB 2192633(Hammersmith医院)对多粘菌素B是有毒的，并且在低离子强度的情况下导致蛋白的共吸收。

此外，使用免疫亲合层析，其对具体的内毒素的特异性仅可通过昂贵的针对核心寡糖的抗体(US 5179018，Centocor；WO 0008463，Bioserv)获得。

此外，因子C(LAL实验的组分)的S3δ-肽(WO 0127289)(WO 9915676，both：National University of Singapore)用于蛋白质(例如BSA，糜蛋白酶原)，然而该方法在高离子强度的情况下的效率较低，并且生产费用较高(在昆虫细胞培养物中的生产)。

在制药工业的应用中，发现主要有三种方法适合靶蛋白质的性质；

·阴离子交换层析

·反相层析；其缺点是其并非对所有蛋白都合适-尤其对疏水蛋白质而言存在问题。该方法还非常耗时。

·Rem Tox(Millipore Company)：该方法缺点是除了需要非常长的保温期(incubation period)以外，非特异性结合组分较高且蛋白质回收通常不充分。

使用现有方法可以在许多情况下实现从蛋白质中粗去除内毒素，使其浓度达到10EU/ml。但余下的内毒素浓度总还具有毒性作用。因此，进行进一步的去除(＝精制)，或根据药物应用中蛋白质的剂量，由欧洲药典(例如5EU/kg体重以及静脉内应用的小时数)和FDA中规定为强制性的。然而，现有的方法通常不能令人满意地保证该精制纯化步骤。目前的市场方法在这方面具有明显的缺点，并且对具体蛋白质而言，通常不能使用或者将造成大量丢失靶蛋白。

本发明的目的因而是提供可检测样品中内毒素的方法。此外，本发明的目的是提供可用来从水溶液中去除内毒素的方法。

这些目的通过权利要求中定义的主题实现。

以下图解释了本发明。

图1显示了来自大肠杆菌O111:B4的内毒素的化学结构总体图示。Hep＝L-甘油-D-甘露庚糖；Gal＝半乳糖；Glc＝葡萄糖；KDO＝2-酮-3-脱氧辛酸盐；NGa＝N-乙酰半乳糖胺；NGc＝N-乙酰葡糖胺。

图2显示了利用携带通过巯基固定的NStrepS3Cp12的层析柱进行检测的结果。(A)从蛋白溶液中去除内毒素：牛血清白蛋白(BSA)，碳酸酐酶(CA)和溶菌酶(Lys)在柱上温育1小时，并随后使用缓冲液洗脱。过柱前和过柱后的内毒素浓度用LAL实验测定，并且由此计算去除百分比。(B)蛋白回收：起始溶液的蛋白浓度和过柱后的片段通过在280nm测定吸收而确定，并且由此确定蛋白回收的百分比。

图3显示用“非定向的(undirected)”(1)和“定向的(directed)”(2)固定p12通过层析柱从溶菌酶溶液中去除内毒素。在两种情况下，p12S3C都与NHS活化的柱结合。“非定向的”固定通过p12S3C的伯胺基实现(其通过与NHS基团反应产生带有载体物质的共价化合物)。通过N末端半胱氨酸的“定向”p12S3C交联是通过乙二胺和SIA(N-琥珀酰亚胺-碘乙酸)实现的。(A)内毒素去除百分比。(B)蛋白回收。

图4显示使用生物素化的p12(其通过链霉抗生物素与磁性珠结合)进行检测的结果。(A)从缓冲液(20mM hepes，150mM NaCl，pH 7.5)和蛋白溶液中去除内毒素可通过LAL实验测定。(B)通过吸收测定确定从蛋白溶液中回收的蛋白。从溶液中分离磁性珠通过磁铁分离器进行。BSA：牛血清白蛋白。CA：碳酸酐酶.Lys：溶菌酶。

图5显示了使用通过生物素-链霉抗生物素的相互作用而固定在琼脂糖上的p12进行的内毒素去除的结果。固定的p12的分离通过离心实现。从缓冲液(20mM tris，150mM NaCl，pH 8.0)和BSA溶液中去除内毒素通过起始溶液以及残余物的内毒素浓度确定。

图6显示表面-胞质团-共振测定。(A)根据对不同(分别为μg/ml：100；25；6.25；4；1.56；0.4)的p12浓度(实线)的反应测定的共振曲线。结合在来自大肠杆菌D21f1的内毒素(其固定在疏水HPA芯片上)上实现。p12和EDTA(5mM)的注入用曲线上的柱标记。缓冲液：20mM tris，150mM NaCl，pH 8.0.(B)p12与固定内毒素结合的平衡共振值在开始注入p12后大约600秒测定，并对结合p12的浓度作图。连续曲线显示Langmuir吸收等温线(RU＝RU_max*[p12]/[p12]+K_d))适合所述数据。(C)大肠杆菌和固定在链霉抗生物素芯片上的生物素化的p12的结合。大肠杆菌D21e8(实线)(其内部核心区完整)与p12结合。反之，核心区大大缩短的大肠杆菌D21f2(虚线)不与p12结合。所述测定在PBS中完成。

图7图示了各种大肠杆菌突变体的内毒素核心区结构。

图8图示了通过层析柱通流(through flow)法消减内毒素的结果。E代表平衡缓冲液(20mM hepes，150mM NaCl，0.1mM CaCl₂，pH 7.5)，A代表洗涤缓冲液A(20mM hepes，150mM NaCl，0.1mM CaCl₂，pH 7.5)，B代表洗脱缓冲液B(20mM hepes，150mM NaCl，2mM EDTA，pH 7.5)，C指再生缓冲液C(20mM hepes，150mM NaCl，2mM EDTA，0.005％ NaDOC，pH 7.5)，S指起始溶液中的蛋白和内毒素浓度。BSA指牛血清白蛋白。EU指内毒素单位。注入(I)4ml起始溶液后(S)，用15ml洗涤缓冲液在润洗，并对流出物进行分级(加样时各2.5ml，洗涤时各2ml)。随后，用缓冲液B和C使柱再生，并同样地以级分的形式收集洗出液(分别为2ml)。如图所示，BSA可在注射后最早的3-5个级分中发现。这些级分中内毒素的含量比起始溶液低100倍。与柱结合的内毒素随后用缓冲液B和C从柱上洗涤出来。

图9图示了用通流法从轻微污染的缓冲溶液(5EU/ml)中去除内毒素的结果。固定p12(8mg p12/1ml琼脂糖)，其不针对NHS活化的琼脂糖4FastFlow(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)，并分别用2ml柱体积充满3个柱。所述实验在3个平行的柱上进行。在加样前，分别收集1ml平衡缓冲液(20mM hepes，150mM NaCl，0.1mM CaCl₂，pH 7.5)，然后将样品(S：来自大肠杆菌O55:B5的内毒素，平衡缓冲液中，4.6EU/ml)注入(I)，并收集5ml和2ml的级分。柱的再生通过加入4ml再生缓冲液(B：20mM hepes，150mM NaCl，2mM EDTA，0.005％ NaDOC，pH 7.5)实现。内毒素浓度通过LAL实验的方法测定(动力学发色(kinetically chromogenic)LAL实验，Charles-River Inc.)。内毒素杂质能在所有三个实验中完全去除，即在通流中的内毒素浓度在检测极限以下(＜0.005EU/ml)。

本文术语“内毒素去除”用于完全或部分从样品物质中去除内毒素。

本文术语“内毒素”描述了作为革兰氏阴性细菌的外膜成分的细菌脂多糖。

本文术语“噬菌体尾蛋白”指出现在噬菌体中并可结合细胞膜成分的那些蛋白。通常，这些蛋白位于噬菌体尾中，但也可位于噬菌体头部，或位于没有尾部的噬菌体的正常噬菌体壳上。噬菌体尾蛋白结合的细胞成分尤其是内毒素。

本文术语“非特异性固定”或“非定向固定”指将蛋白偶联到基质是通过分布在整个蛋白表面各处的蛋白基团(初级胺)实现的。用于偶联单独的蛋白分子的基团的选择是随机的。

本文术语“定向固定”指偶联是通过氨基酸基团或其它基团(例如蛋白糖基化)实现的，其中所述基团在蛋白中的位置(例如N端或C端)是已知的。选来用于偶联的这些基团是通过选择与这些基团很好地相互作用的适宜反应配偶体/接头实现的(例如将巯基和碘乙酸基团偶联；碘乙酸与巯基反应的速率比其与氨基基团反应的速率快1000倍)。

本发明涉及检测内毒素的方法，包括以下步骤：

a)将样品与噬菌体尾蛋白一同温育，

b)检测与噬菌体尾蛋白结合的内毒素。

本发明优选涉及一种方法，其中所述检测通过光谱法来实现，例如荧光发射，荧光偏振，吸收或循环二色性，或者通过电容测量的方法，例如电信号来实现，或者间接通过竞争检测法实现。

如必要，在步骤a)后和步骤b)前，可引入额外的步骤a′)，即从样品中分离噬菌体尾蛋白-内毒素复合物。

本发明还涉及从样品中去除内毒素的方法，包括以下步骤：

a)以非特异的方式或定向方式(directed manner)，将样品与固定在固定载体上的噬菌体尾蛋白共温育或使其接触，

b)从所述样品中分离噬菌体尾蛋白-内毒素复合物。

优选，二价离子的离子组合物，例如Ca²⁺，Mg²⁺和/或pH值在温育前进行调整，以获得最佳内毒素-噬菌体尾蛋白结合。此外，在温育期间和以后，通过加入清洁剂和/或盐，例如Tween，triton NaCl或硫酸铵或其它物质，例如壳聚糖，蔗糖或脂类，“暴露(demasking)”结合的内毒素是优选的，其中上述物质能加速内毒素从例如蛋白或核酸的解离。

噬菌体尾蛋白可天然存在或经过分子生物或生物化学修饰。由于多种原因，所述噬菌体尾蛋白可通过遗传改造和/或生化方法进行改造。对于本发明的方法，不仅天然存在的噬菌体尾蛋白可使用，且其变体也可使用。在本发明中，变体指具有改变的氨基酸序列的噬菌体尾蛋白。这些可通过筛选天然存在的变体或者随机诱变或靶诱变，以及化学修饰获得。用于本发明方法的噬菌体尾蛋白可通过在其特异性或其与载体结构的结合性质中进行靶诱变或随机诱变而进行改造。对载体的结合可以是永久的，例如共价结合或者通过特异性或非特异性生物素化，但也可以是可逆的，例如通过可还原的二硫桥。此外，还可通过修饰增加稳定性。通过分子生物或化学诱变，可导入的突变可以是氨基酸添加，缺失，取代或化学修饰。这些突变可导致噬菌体尾蛋白结合区中的氨基酸序列发生变化，目的是使特异性和结合亲合力符合实验要求，例如增加内毒素与噬菌体尾蛋白的结合，或者使它们可逆从而改善检测或去除。此外，可对噬菌体蛋白进行遗传改造或生化修饰以封闭可能存在的酶活性从而改善结合或使其可逆。此外，可对噬菌体蛋白进行遗传改造或化学修饰，从而使蛋白的物理性质，例如溶解性，热稳定性等适应本发明的方法的需要。

解释T4p12的三维结构的工作显示，在增加温度时，可产生33kDa和45kDa的蛋白水解片段，其中N和C末端(33kDa)或仅N末端(45kDa)被缩短。与33kDa的片段相反，45kDa的片段仍能和细菌结合。因此，C末端参与细胞结合。

所述修饰还尤其能够实现直接检测，例如通过测定色氨酸荧光。例如p12具有5个色氨酸基团。天然蛋白的荧光色谱表明，溶剂通常不能接近这些基团。从多项科学研究可知，芳香氨基酸几乎总参与糖基团的结合，内毒素中也如此。糖基团与蛋白质的结合可通过色氨酸荧光的猝灭追踪，或者必要时还可改变荧光最大强度。可从一些工作中推定，天然p12的荧光团的不利分布阻止对p12用于结合测定的荧光性质的开发。p12的荧光性质主要由五个色氨酸基团控制，其荧光通过以不可测定的方式加入内毒素而改变。从这些数据预期，优选酪氨酸基团像色氨酸基团一样参与结合，其信号改变在高色氨酸背景下不能显示。基于蛋白水解结果，p12的C末端的6个酪氨酸是内毒素检测试剂盒而言是可能检测到的，它们可产生相应的“可见性”。将5个色氨酸残基通过选择性分子生物交换为酪氨酸，色谱性质在第一步中特异性改变，使得通过单个色氨酸基团的荧光信号改变可测定内毒素结合。因此，通过分别特异性交换C末端区的6个酪氨酸之一为色氨酸基团，可检测信号的强度明显增强从而获得有吸引力的信号差异来发展内毒素检测试剂盒。

使用的噬菌体尾蛋白依赖与内毒素意图被检测或去除。即使是现在，大量已知噬菌体可用于大部分前述的细菌，并用于本发明的方法。所述噬菌体和相应的宿主细菌可获自以下菌株保藏单位：ATCC(美国)，DSMZ(德国)，UKNCC(英国)，NCCB(荷兰)和MAFF(日本)。

优选，本发明的方法中的噬菌体尾蛋白来自噬菌体，其宿主细菌与医药和生物技术有关，例如用于制备用于基因治疗的重组蛋白或核酸的大肠杆菌。与内毒素高度保守区(例如核心区，或脂质A)结合的噬菌体尾蛋白是尤其优选的。具体优选p12和与p12相似的噬菌体尾蛋白。在来自各种宿主细菌的内毒素杂质组合物中，可使用相应的内毒素检测型噬菌体尾蛋白的组合物。

检验或去除样品中或来自样品的内毒素通过内毒素与噬菌体尾蛋白的结合实现。所述结合可通过例如通过光谱法直接测定，例如通过荧光发射，荧光偏振，吸收，或循环二色性。此外，所述结合可以通过电信号，例如电容测量显示。此外，内毒素与噬菌体尾蛋白的结合可通过置换实验间接测定。

对于根据本发明进行的检测，所述噬菌体尾蛋白(如果需要从样品中分离噬菌体尾蛋白-内毒素复合物)可以和适宜的载体结构偶联，例如磁性颗粒，琼脂糖颗粒，微量滴定板，过滤物质或流通细胞室(间接测定)。所述载体结构可包括例如聚苯乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯，PMMA，醋酸纤维素，硝化纤维，玻璃，硅或琼脂糖。所述偶联可通过例如吸收或共价结合实现。

本发明的去除方法中，所述噬菌体尾蛋白与永久载体偶联。所述永久载体可以是层析柱物质(例如琼脂糖物质)，过滤介质，玻璃颗粒，离心或沉淀物质(例如琼脂糖颗粒)。

功能偶联在此是重要的，即：尽管与载体物质相结合，所述噬菌体尾蛋白仍具有可接近内毒素的结构。噬菌体尾蛋白的偶联可非特异性和优选定向地，通过例如选择性生物素化或偶联或通过间隔物或接头实现。

为此，所述噬菌体尾蛋白可以和低分子物质，例如生物素交联以通过这些的分子物质与多肽如链霉抗生物素结合，所述多肽固定于载体上。除了生物素外，还可使用所谓Strep-标记(Skerra，A.& Schmidt，T.G.M.Biomolecular Engineering 16(1999)，79-86)，其是短氨基酸序列，并与链霉抗生物素结合。此外，可使用His-标记，其通过二价离子(锌或镍)或其特异性抗体(Qiagen GmbH，Hilden)，与载体物质结合。该Strep-标记和His-标记优选通过DNA重组技术与重组产生的噬菌体蛋白结合。所述偶联可以是定向的，例如在N末端或C末端，也可以是非定向的。定向偶联可通过适宜的反应性氨基酸，例如半胱氨酸实现，其显然不经常暴露于噬菌体蛋白表面，并被特异性导入适宜的位置。由于噬菌体尾蛋白在细胞质中合成，不需要考虑二硫桥。优选，偶联可通过其它氨基酸直接或通过“间隔物”或“交联物”(单功能或双功能)间接进行。

对于半胱氨酸偶联，所有具有NH和SH反应性基团的双功能交联物都是可能的(其具有或不具有中间间隔物)，例如11-马来酰亚胺十一烷酸(maleimidoundecanoic acid)硫代-NHS或琥珀酰亚胺-4-[N-马来酰亚胺甲基(maleimidomethyl)]-环己胺-1-羧基-[6-氨基]己酸酯。如果没有间隔物，可插入具有末端NH基团的8-12个C原子的间隔物。优选所述半胱氨酸偶联通过半胱氨酸的特异性生物素化实现，该过程使用例如EZ-link-PEO-马来酰亚胺活化的生物素(Pierce)。

二价离子，例如Ca²⁺或Mg²⁺对内毒素与噬菌体蛋白例如gp12的结合很重要。通过加入适宜的螯合剂，例如EDTA或EGTA，所述结合可以被破坏。为进行结合，Ca²⁺浓度优选在大约0.1μM到大约100mM的范围内，尤其优选在大约0.1μM到大约10mM的范围内，特别优选大约0.1μM到大约1mM的范围，且更尤其优选大约10μM到1mM的范围。如果二价离子的浓度通过加入1mM EDTA降低到100nM以下，随后内毒素与p12的结合被破坏。10mM以上的Mg²⁺浓度使得内毒素与p12的结合更糟，这从解离常数的升高可注意到。不加入Mg²⁺时，产生50nM的K_d值且，在10mM Mg²⁺中时，测定的K_d值为1μM。锌显示更高的抑制效果。1mM Zn将K_d值增加到10μM。调整二价离子或其它离子(e.g.：Cu²⁺，Al³⁺，Zn²⁺，Fe²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Mg²⁺，Cd²⁺)的浓度到结合的最佳范围，可通过例如HEDTA，NTA或常见螯合剂/缓冲液(ADA：N-[2-acet氨基]-2-亚氨基二乙酸(iminodiacetic acid)；5-AMP：腺苷酸-5′-单磷酸；ADP：腺苷酸-5′-二磷酸；ATP：腺苷酸-5′-三磷酸；Bapta：1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N′，N′，-四乙酸；citrate：柠檬酸；EDTA：乙二胺四醋酸；EGTA：乙二醇-双(β-氨乙酸乙醚(aminoethyl ether))N，N，N′，N′-四乙酸；HEDTA：N-羟乙基乙二胺三醋酸(hydroxyethylethylenediaminetriacetic acid)；NTA：三甘胺酸(nitrilotriacetic acid)；SO₄：硫酸盐)实现，其用作二价离子的缓冲物。

因此本发明的方法可进一步包含洗涤步骤。根据直接或间接检测或去除是否需要分离样品和噬菌体尾蛋白，可包含洗涤步骤。由于Ca²⁺或其它金属离子(例如Mg²⁺)对结合很重要，内毒素与例如p12的结合可以通过适宜的洗涤步骤破坏。根据内毒素是否意图保持和噬菌体尾蛋白例如p12的结合，可用不含EDTA的缓冲液洗涤，如意图破坏结合可用含EDTA缓冲液，所述EDTA浓度在至少0.05mM到大于10mM的范围内，优选在2mM-5mM范围内。

所述分离在将样品与载体物质温育大约5-60分钟或大约30-180分钟，或者需要时保温过夜后进行，所述载体与相应的噬菌体尾蛋白偶联。为此，所述样品从例如层析柱上洗脱或者过滤，或通过离心或沉淀除去相应颗粒，或通过使用磁场利用磁性分离。本文所述批次法(batch method)中的分离，例如通过预保温样品和载体物质(与相应的噬菌体尾蛋白偶联)，可尤其对非常低浓度的内毒素敏感。

通过层析柱去除内毒素也可在纯通流法中实现。样品可加于用于此目的的柱上，所述柱含有偶联了噬菌体尾蛋白的载体物质。流率有赖于柱的体积和几何结构。流率可进一步有赖于样品的体积和内毒素含量，以通过尽可能长的柱和内毒素的接触时间(甚至在低内毒素浓度的情况下)而获得有效的去除。由此可见，接触时间是从将样品加样到柱上到其流出所需的时间。

分离步骤可以用于例如去除方法中以使与永久性载体偶联的噬菌体尾蛋白再生。结果，所述永久性载体，例如基质可在层析柱中再循环。再生通过适宜的含EDTA或者相应的螯合剂的再生缓冲液来去除结合的内毒素来实现。对于EDTA，优选大于2mM的浓度，尤其是大于10mM的EDTA。

由于离子相互作用可基本上总是通过离子强度变化实现，溶液中其它盐例如NaCl或KCl的增加或降低，也可实现内毒素与噬菌体尾蛋白的结合。

为使检测法中的结合直接或间接可见，所述蛋白也可通过分子生物学或生物化学方法改变，以进行或改进测定。为使内毒素与例如p12的结合直接可见，用酪氨酸基团交换了色氨酸。因此，减弱信号背景需要以用最初含有的色氨酸交换酪氨酸。为能在含蛋白的溶液中进行测定，色氨酸诱导后，还可对p12进行化学修饰。由此可根据它们的光谱学性质，通过Koshland试剂(2-羟基-5-硝基苄基溴化物(nitrobenzylbromide))改变色氨酸基团。对于置换实验，标记的，例如荧光标记的内毒素(例如Sigma)可用位于样品中的内毒素例如由p12置换，且游离荧光内毒素的浓度可测定。

根据本发明的方法，内毒素可在所有水溶液中检测并从中去除。这些溶液含有：蛋白质，质粒-DNA，基因组DNA，RNA，蛋白质-核酸复合物，例如噬菌体或病毒，糖，疫苗，药物，透析缓冲液(药品)，盐或其它由内毒素结合污染的物质。

本发明另一方面涉及噬菌体蛋白，其中所谓的标记，例如Strep-或His-标记，与所述蛋白偶联，优选与该蛋白的N末端或C末端偶联，尤其优选C末端。优选所述标记与噬菌体蛋白通过DNA重组技术偶联或交联。所述核酸(其包含噬菌体蛋白的序列)，和所述标记的产生，以及表达产物的产生是本领域已知的，并不需要单独说明。本发明另一方面涉及编码具有Strep-or His-标记Strep-or His-标记的噬菌体蛋白的核酸序列。噬菌体T4的p12蛋白是尤其优选的噬菌体蛋白，其由Strep-或His-标记修饰，但所有其它参与检测和细菌结合或与此有关的噬菌体蛋白也同样优选。

本发明的另一方面是具有表面暴露的半胱氨酸的标记(用于特异性定向生物素化)的噬菌体蛋白，所述标记例如根据SEQ ID NO：5，6和7的标记。具有标记的p12的实例是SEQ ID NO：8中所述的氨基酸序列。优选具有标记的p12，尤其优选具有表面暴露的半胱氨酸的标记的p12，尤其是具有SEQID NO：6和7的标记的p12。该定向生物素化可通过适宜的间隔物或接头适宜地形成。此外，本发明涉及具有SEQ ID NO：5，6和7的序列的氨基酸。此外，本发明涉及编码SEQ ID NO：5，6和7的氨基酸序列的核酸。

本发明涉及检测和纯化内毒素的方法，有利于相应应用的进行。此外，LPS核心寡糖抗体的产生非常困难，使得基于抗体的相应方法非常昂贵。

以下实施例揭示了本发明并不应理解为限制性的。如果没有特别指出，使用分子生物标准方法，例如Sambrook等，1989，Molecular cloning：ALaboratory Manual 2^nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York所述。

实施例1玻璃容器，塑料容器和缓冲液

对于内毒素的去除，所有玻璃容器通过在200℃(4h)加热除去病原，并使用专用的无病原体塑料物质(例如吸液管，微量滴定板)。其它不耐热的器具或容器使用3％的过氧化氢处理或者用1％脱氧胆酸钠洗涤。随后，使用不含内毒素的水洗涤它们。缓冲液由大量不含内毒素的缓冲物质制备(Sigma)，并与不含内毒素的水混合。加热盐，(例如NaCl，可加热到200℃)，(200℃，4h)。用于层析纯化的缓冲液被脱气并过滤。

2实施例2通过LAL检测法检测内毒素

内毒素对照实验通过生色LAL实验(Limulus-Amoebocyte-Lysate test，Charles-River Endosafe，Charleston，USA)，根据生产说明进行。为测定浓度，使用浓度范围0.005-50或0.02-50EU/ml的内毒素标准品(Charles-RiverEndosafe，Charleston，USA)。在温度控制的微量滴定板读数仪(Genios，TecanGmbH)上测定405nm的吸收。

3.实施例3p12检测的Western印迹

在用小珠处理的样品残留物或亲合层析级分中检测p12通过Western印迹进行。部分蛋白首先通过NaDOC/TCA沉淀(去氧胆酸钠/四氯乙酸)浓缩。所述样品在12％的SDS凝胶上通过电泳分离，并转移到PVDF膜上(Immobilon，Millipore)。所述膜用PBS洗涤30分钟，由5％奶粉封闭(1小时)，并随后和多克隆抗p12抗体(1小时，稀释度：1∶1000)温育。与偶联于碱性磷酸酶的二级抗体(山羊抗兔IgG)温育后，样品进一步用BCIP/NBT(5-溴-4-氯吲哚磷酸盐(chloroindolylphosphate)/硝基蓝(nitroblue)四唑盐)处理。

实施例4内毒素纯化

内毒素的纯化根据Galanos，C.，Lüderitz，O.& Westphal，O.1969，Europ.J.Biochem.9，245-249的说明进行。

实施例5：p12与固定的碘乙酸基团的特异性偶联

为获得p12与表面的定向结合，位于SEQ ID NO：5的Strep-标记的位置3的氨基酸丝氨酸由半胱氨酸取代(如实施例12所述)，并且通过碘乙酸基团(其优选结合游离sulfydryl基团)将所述蛋白固定。生成的p12称为p12S3C。

倾出1ml Sulfolink偶联凝胶(Pierce)，用6ml 1％去氧胆酸钠洗涤，并用6ml偶联缓冲液平衡(50mM tris，150mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.5)。随后，注入1ml p12S3C(＝N-strepS3Cp12)(1-1.5mg/ml，偶联缓冲液中)，轻轻摇动柱子15分钟，并在室温不摇动下再保温30min，且再次将1mlp12S3C注入，并重复保温步骤。所述p12S3C的偶联共重复4此，且随后用6ml偶联缓冲液洗柱。收集流出物，并通过测定280nm的吸收分别测定各p12S3C浓度。每ml凝胶结合2.2-2.8mg p12S3C。随后，多余的碘乙酸基团通过与1ml半胱氨酸(50mM，50mM tris，5mM EDTA中，pH 8.5)保温(45min)而封闭。用16ml 1M NaCl和16ml 20mM hepes，150mM NaCl pH 7.5洗涤柱后，将柱备用。

该凝胶从蛋白溶液中去除内毒素的能力通过BSA(2-4mg/ml)，碳酸酐酶(1-2mg/ml)和溶菌酶(3-4mg/ml)检测。BSA和溶菌酶溶液掺入来自大肠杆菌O55:B5(Charles-River Endosafe，Charleston，USA)或大肠杆菌HMS 174(100-1000EU/ml)的内毒素，而碳酸酐酶不和额外的内毒素混合。分别将0.5ml蛋白溶液导入柱，在室温温育1小时，并随后用缓冲液洗涤柱。所述蛋白收集在级分中，并通过生色LAL实验(Charles-River Endosafe，Charleston，USA)在上柱前后测定内毒素含量。此外，蛋白回收物还可通过280nm的吸收测定。内毒素能从所有3个蛋白溶液中完全去除(93-99％)，如图2A所示。此外，所述蛋白能从柱上大量洗脱(80-99％，图2B)。最后用5mM EDTA，20mM hepes，150mM NaCl，pH 7.5使柱再生。为在因分离p12而过柱以后去除蛋白级分中的杂质，通过Western印迹技术检测所述级分中的p12。所述级分中不能检测到p12。

实施例6：p12与NHS-活化的载体物质的非特异性偶联：

N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)通过伯胺基团从化合物中置换出来，并由此用于将蛋白偶联在表面。NHS-活化的琼脂糖柱(HiTrap NHS-活化的HP，1ml，Amersham-Pharmacia-Biotech)首先用6ml冰冷的1mM盐酸中。随后，将10-15ml p12S3C(1.0-3.5mg/ml)(0.2M NaHCO₃，0.5M NaCl，pH8.3中)循环(in a circle)在室温加于柱上(流速0.8ml/min)。60分钟后，将流出物收集在级分中，并使用6ml缓冲液洗涤柱。从这些级分中通过HiTrap-脱盐柱(5ml，Amersham-Pharmacia-Biotech)对溶液进行脱盐从而分离NHS，并随后通过测定280nm的吸收测定p12的量。20-25mg的p12S3C与柱结合。所述柱在偶联后根据产品说明分别用6ml封闭缓冲液(0.5M乙醇胺，0.5M NaCl，pH8.3)和洗涤缓冲液(0.1M乙酸，0.5M NaCl，pH 4.0)进行重复润洗。然后，用6ml可用缓冲液(usable buffer)(20mM hepes，150mM NaCl，pH 7.5或20mM tris，150mM NaCl，pH 8.5)平衡柱子。

通过该柱去除内毒素通过溶菌酶溶液(3-4mg/ml，20mM hepes，150mMNaCl，pH 7.5 or 20mM tris，150mM NaCl，pH 8.5中)检测。所述溶菌酶溶液与来自大肠杆菌HMS 174(～500EU/ml)的内毒素混合。0.5ml蛋白溶液加于柱上，在室温保温1小时，并随后用缓冲液洗涤柱子。将溶菌酶收集在级分中，并通过生色LAL实验(Charles-River Endosafe，Charleston，USA)在过柱前后测定内毒素含量。此外，蛋白回收通过测定280nm的吸收确定。内毒素从溶液中去除达85-90％，如图3A所示，且可将85-90％的溶菌酶通过用可用缓冲液进行洗涤而从柱上再洗脱(图3B)。随后用6ml 5mM EDTA，20mM hepes，150mM NaCl，pH 7.5和6ml 1M NaCl洗涤柱。为在因分离p12而过柱以后去除蛋白级分中的杂质，通过Western印迹技术检测所述级分中的p12。所述级分中不能检测到p12。

实施例7：p12与NHS-活化的载体物质柱通过以二氨基乙烷和N-琥珀酰亚胺-碘乙酸(SIA)作为间隔物进行定向偶联

为获得与层析载体物质的定向结合，将双功能接头连接于NHS活化的表面，所述接头通过其游离半胱氨酸以及双功能接头的碘乙酸基团实现p12S3C的偶联。

NHS-活化的琼脂糖柱(HiTrap NHS-活化的HP，1mlAmersham-Pharmacia-Biotech)首先用6ml冰冷的1mM盐酸洗涤，然后将1ml乙二胺(10mg/ml，0.2M NaHCO₃，0.5M NaCl，pH 8.3中)注入，并在室温保温柱子30分钟。用乙醇胺(0.5M乙醇胺，0.5M NaCl，pH 8.3)封闭多余的NHS基团后，洗涤(0.1M乙酸，0.5M NaCl，pH 4.0)柱子，并用6ml硼酸盐缓冲液(50mM硼酸钠，150mM NaCl，5mM EDTA，pH 8.3)平衡柱子。随后，10ml N-琥珀酰亚胺-碘乙酸(SIA，Pierce，200μl SIA母液在10ml硼酸盐缓冲液中；SIA母液：1.4mg SIA在1ml DMSO中)循环洗柱30分钟。该柱随后用6ml硼酸盐缓冲液和p12S3C(1mg/ml，50ml，硼酸盐缓冲液中)洗柱1小时。多余的碘乙酰基团用1ml半胱氨酸溶液(5mM半胱氨酸在硼酸盐缓冲液中于室温保温15分钟)，然后用可用缓冲液(20mM hepes，150mM NaCl，pH7.5 or 50mM tris，150mM NaCl，ph 8.5)平衡柱。用SIA进行的偶联反应在黑暗中完成。

通过该柱去除内毒素用溶菌酶溶液(3-4mg/ml，20mM hepes，150mMNaCl，pH 7.5 or 20mM tris，150mM NaCl，ph 8.5中)检测。所述溶菌酶溶液与来自大肠杆菌HMS 174(～500EU/ml)的内毒素混合。0.5ml蛋白溶液加于柱上，在室温保温1小时，并随后用缓冲液洗涤柱子。将溶菌酶收集在级分中，并在通过生色LAL实验(Charles-River Endosafe，Charleston，USA)在过柱前后测定内毒素含量。此外，蛋白回收通过测定280nm的吸收确定。内毒素从溶液中去除达90％，如图3A所示，且可将75-85％的溶菌酶通过用可用缓冲液进行洗涤而从柱上再洗脱(图3B)。随后用6ml 5mM EDTA，20mMhepes，150mM NaCl，pH 7.5和6ml 1M NaCl洗涤柱。为在因分离p12而过柱以后去除蛋白级分中的杂质，通过Western印迹技术检测所述级分中的p12。所述级分中不能检测到p12。

实施例8：在通流方法中从BSA溶液去除内毒素

HiTrap-NHS活化的琼脂糖(Amersham Biosciences，Uppsala Sweden)根据产品说明通过伯胺基团与p12非特异性偶联。由此共价固定了8mg p12/ml凝胶物质。由此获得的1ml层析柱以1ml/min的流速用10ml缓冲液A(20mM hepes，pH 7.5，150mM NaCl，0.1mM CaCl₂)平衡。随后，将4ml BSA溶液(11.5mg BSA(Carl Roth GmbH，Germany)/ml缓冲液A)加在柱上(injection：I)并将流出物(E)收集在2.5ml的级分中。随后用15ml缓冲液A洗柱，并用7ml缓冲液B(20mM hepes，pH 7.5，150mM NaCl，2mM EDTA)洗脱与柱结合的内毒素。在洗涤和洗脱过程中，分别收集2ml级分。每次实验后，用20ml缓冲液C(20mM hepes，pH 7.5，150mM NaCl，2mM EDTA，0.1％去氧胆酸钠)再生柱。内毒素浓度通过生色鲎变形细胞溶解试验(Chromogenic Limulus Amoebocyte Lysate)(LAL)(Charles-River Endosafe，Charleston，USA)根据产品说明测定。通过测定UV吸收确定蛋白浓度。内毒素去除效率是95-99％且蛋白丢失为大约6-10％。

实施例9：通过非特异偶联的p12从缓冲液中去除小量内毒素

20ml NHS-活化的琼脂糖4 FastFlow(Amersham Biosciences)首先用冰冷的盐酸洗涤，然后和292mg p12(7mg/ml in 25mM citrate pH 7.0)在室温在搅动同时保温4小时。随后，使用7×80ml 5mM柠檬酸pH 2.0洗涤琼脂糖，并用5mM柠檬酸pH 2.0透析1ml的各洗涤级分。通过测定这些透析物在280nm的吸收而定量洗涤级分中多余的p12。测定的流出物密度(charge density)为8.7mg p12每1ml琼脂糖。非反应性NHS基团通过将琼脂糖与1M tris pH 8.0保温12小时中和。体积为2ml的柱用这种柱物质填满，并在4℃储存在20％乙醇中备用。

在3次平行试验中，分别将4ml内毒素溶液(S)加于柱上(见图9)。所述内毒素溶液包含来自大肠杆菌O55:B5(Charles-River Endosafe，Charleston，USA)的内毒素(在平衡缓冲液(20mM hepes，150mM NaCl，0.1mM CaCl₂，pH 7.5中)。该溶液的内毒素浓度是4.6EU/ml。

该柱首先用12ml再生缓冲液(20mM hepes，150mM NaCl，2mM EDTA，pH 7.5)润洗，然后用12ml平衡缓冲液润洗。随后，将平衡缓冲液再次导入柱中，并对1ml进行分级分离。

所述内毒素溶液加于柱(I)并收集5ml和2ml的级分。随后，该柱用4ml再生缓冲液(B)再生。在流出级分中，没有检测到内毒素，即内毒素杂质能够在所有三个实验中完全去除。

实施例10：生物素化p12与磁性链霉抗生物素珠的非特异性偶联

p12(3mg/ml，在PBS，0.05％ Tween20中)和硫代-NHS-LC-LC-生物素(Pierce)，以1∶10-1∶20的比例在RT保温1小时，并随后用缓冲液(例如PBS或20mM hepes，150mM NaCl，5mM EDTA，pH 7.5)透析。NHS-活化的生物素与p12的伯胺基团结合。随后将50μl生物素化的p12(1mg/ml)加入1ml链霉抗生物素珠(MagPrep链霉抗生物素珠，Merck)，在室温搅动2小时，并随后通过用1.5ml 20mM tris，10mM EDTA，pH 7.5洗涤四次去除多余的p12。

所述内毒素去除用缓冲液(20mM hepes，150mM NaCl，pH 7.5)和蛋白溶液(0.1mg/ml BSA，0.1mg/ml溶菌酶，0.1mg/ml碳酸酐酶。20mM hepes，150mM NaCl中，pH 7.5)检测。向所述缓冲液和BSA以及溶菌酶溶液中掺入5EU/ml(内毒素，来自大肠杆菌O55:B5，Charles-River Endosafe，Charleston，USA)。碳酸酐酶溶液含有大约1EU/ml。固定有p12的25μl磁性珠加入200μl缓冲液或蛋白溶液中，通过吸液管抽吸而混合，并在室温保温30分钟。所述珠通过磁铁从溶液中去除，并吸出残余物。未经处理的样品的内毒素含量以及与珠一同保温的样品的内毒素含量随后通过LAL实验测定，且通过测定280nm的吸收确定蛋白回收率。内毒素实际上可从缓冲液中完全去除(99.9％的内毒素被去除，图4A)且内毒素也可从蛋白溶液去除70-92％(图4B)。蛋白回收率为57％-99％(BSA：87％，碳酸酐酶：99％，溶菌酶：57％；图4B)。

实施例11：生物素化的p12与固定的链霉抗生物素的非特异性偶联

p12(3mg/ml，PBS，0.05％ Tween20中)与硫代-NHS-LC-LC-生物素(Pierce)，以1∶10-1∶20的比例在RT保温1小时，并随后用缓冲液(例如PBS或20mM hepes，150mM NaCl，5mM EDTA，pH 7.5)透析。NHS-活化的生物素与p12的伯胺基团结合。随后将生物素化的p12与带有链霉抗生物素(ImmunoPure固定链霉抗生物素：6％交联琼脂糖珠)的层析物质在室温保温1小时，并通过用PBS洗涤去除多余的p12。

所述内毒素去除用缓冲液(20mM hepes，150mM NaCl，pH 7.5)和BSA(0.5mg/ml in 20mM tris，150mM NaCl，pH 8.0)检测。分别向1ml缓冲液或BSA溶液中掺入10EU/ml，并加入50μl p12琼脂糖，并在室温搅动1小时。随后离心去除p12琼脂糖，并测定残余物中的内毒素和蛋白浓度。99％的内毒素可从缓冲液中去除，且86％的内毒素可从BSA溶液中去除(图5)。BSA回收率达90％。

实施例12：利用表面胞质团共振测定p12内毒素结合。

p12与内毒素或与细菌通过细胞外膜的脂多糖的结合通过表面胞质团共振测定(Biacore J)。为测定解离常熟(K_d)，来自大肠杆菌O55:B5(Sigma)的内毒素根据产品说明固定在疏水HPA芯片上，并将p12以各种浓度注入(图6A)。以相对“应答单位”(RU)测定结合，并将平衡值对结合的p12浓度作图(图6B)。将Langmuir吸收等温线(RU＝(RU_max*[p12])/([p12]+K_d))用于这些数据，测定K_d值(表1)。无内毒素缓冲液用于测定。在pH值6-10之间测定的K_d值的范围是10^-7-10^-9M(表1)。所述结合通过注入1mM或5mMEDTA破坏结合，并再生所述芯片。

表1：p12上的内毒素的解离常数依赖溶液pH值

pH	Kd
pH	Kd	6.00	3.09E-07
7.50	6.85E-08	6.00	3.09E-07
7.50	6.85E-08	8.00	5.86E-08
8.50	7.86E-08	8.00	5.86E-08
8.50	7.86E-08	9.00	3.29E-08
10.00	1.55E-07	9.00	3.29E-08

为检测细菌与p12的结合，将生物素化的p12固定在链霉抗生物素芯片，和并注入各种大肠杆菌菌株。所述细菌吸收在PBS中用于测定。使用具有不同多糖成分的脂多糖的大肠杆菌菌株。多糖部分包含与脂质A和所谓的“O”抗原交联的“核心”区。所述“O”抗原在不同类型的细菌和不同菌株之间的差异很大，而“核心”区则高度保守。具有“核心”区和O抗原的菌株(例如大肠杆菌)，和具有完整“核心”区的菌株(例如大肠杆菌D21)与p12结合，而具有极大缩短的“核心”区的菌株(例如大肠杆菌D21f2)不能由p12检测到(图6C)。所述结合可以通过EDTA(5mM)破坏，且所述芯片可再生。

实施例13：重组p12构建体

1.构建具有N末端Strep-标记的p12(N-strep-p12)：通过PCR，将用于Strep-标记(美国专利5,506,121)的核苷酸序列导入T4p12基因的5’末端。为此构建位于p12基因5’末端的引物(5′-GAA GGA ACT AGT CAT ATGGCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AATAAT ACA TAT CAA CAC GTT-3′(SEQ ID NO：1)，其5’末端包含Strep-标记的核苷酸序列(序列中的斜体)，并具有限制性界面(NdeI，序列中加下划线部分)，使得右手阅读格(right-hand reading grid)中的基因可插入表达质粒。对于p12基因的3’末端，构建一种引物其可将BamH I限制性界面(序列中的斜体)导入p12基因之后(5′-ACG CGC AAA GCT TGT CGA CGG ATC CTATCA TTC TTT TAC CTT AAT TAT GTA GTT-3′)，(SEQ ID NO：2)。PCR进行40个循环(1分钟95℃，1分钟45℃和1分钟72℃)。PCR批次(batch)用限制性核内切酶NdeI和BamHI切断，并且需要的片段通过琼脂糖凝胶进行体积分级分离并从所述凝胶洗脱后，被插入表达质粒pET21a的NdeI和BamHI位点。通过DNA测序检测N-strep-p12基因的序列的正确性。对质粒pNS-T4p12p57进一步的处理如Burda，M.R.& Miller，S.(Eur JBiochem.1999 265(2)，771-778)所述的对T4p12p57的处理进行。质粒pNS-T4p12p57随后被转化到表达菌株BL21(DE3)中。

2.将N-末端半胱氨酸基团插入N-strep-p12(N-strep-S3C-p12和N-strep-S14C-p12)：N-末端半胱氨酸基团的插入如1所述进行，并为此构建两种新的5’末端引物、用于N-strep-S3C-p12的引物是5′-GAA GGA ACTAGT CAT ATG GCT TGT TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGCGCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3′(SEQ ID NO：3)，用于N-strep-S14C-p12的引物是5′-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC TGGAGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC TGT AAT AAT ACA TATCAA CAC GTT-3′(SEQ ID NO：4)。

3.纯化N-strep-p12蛋白：在37℃，从2升的摇瓶培养物(LB培养基，添加氨苄西林100μg/ml)中取出OD600达0.5-0.7的具有质粒pNS-T4p12p57的大肠杆菌菌株BL21(DE3)，并通过加入1mM IPTG(异丙基-β-硫代-吡喃半乳糖)诱导N-strep-p12-蛋白的表达。在37℃保温4h后，收集细胞。从10升培养物收集的细胞在50ml磷酸钠，20mM pH 7.2，2mM MgSO4，0.1MNaCl中被吸收，通过French press处理(20,000psi)三次进行破坏，随后在15,000rpm离心30分钟(SS34)。在相同的缓冲液中洗涤2次后，N-strep-p12蛋白从沉淀中提取，通过在40mM trisHCl pH 8.0，10mM EDTA中搅动30分钟提取沉淀，并以15,000rpm(SS34)离心该批次(batch)30分钟，溶解的NS-p12于4℃保存在残余物中。提取重复两次，并将结合的残余物(IBAGmbH Gttingen)加样到StrepTactin亲合柱上(15ml)，用缓冲液“W”(100mM trisHCl pH 8，1mM EDTA，150mM NaCl)平衡。用5倍柱体积的缓冲液“W”，洗涤后，用三倍体积的缓冲液“W”(缓冲液“W”含2.5mM的去硫生物素)进行洗脱。多次用缓冲液“W”透析和浓缩后，N-strep-T4p12的浓度和纯度通过SDS-PAGE和UV光谱(Burda等1999)测定。从10升培养物中，可纯化大约100mg N-strep-T4p12。

名称	标记的序列
名称	标记的序列		Nstrep-p12	MASWSHPQFEKGAS	SEQ ID NO：5
Nstrep-p12-S3C	MACWSHPQFEKGAS	SEQ ID NO：6	Nstrep-p12	MASWSHPQFEKGAS	SEQ ID NO：5
Nstrep-p12-S3C	MACWSHPQFEKGAS	SEQ ID NO：6	Nstrep-p12-S14C	MASWSHPQFEKGAC	SEQ ID NO：7

序列表

<110>普罗福斯股份公司(PROFOS AG)

<120>检测和去除内毒素的方法

<130>PRO-008 PCT/nat.

<140>PCT/DE2003/002096

<141>2003-06-24

<150>DE 102 28 133.5

<151>2002-06-24

<150>DE 103 07 793.6

<151>2003-02-24

<160>8

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

gaaggaacta gtcatatggc tagctggagc cacccgcagt tcgaaaaagg cgccagtaat 60

aatacatatc aacacgtt 78

<210>2

<211>54

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

acgcgcaaag cttgtcgacg gatcctatca ttcttttacc ttaattatgt agtt 54

<210>3

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

gaaggaacta gtcatatggc ttgttggagc cacccgcagt tcgaaaaagg cgccagtaat 60

aatacatatc aacacgtt 78

<210>4

<211>78

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

gaaggaacta gtcatatggc tagctggagc cacccgcagt tcgaaaaagg cgcctgtaat 60

aatacatatc aacacgtt 78

<210>5

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>靶向生物素化的标签

<400>5

Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ser Asn Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Gln

<210>6

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>靶向生物素化的标签

<400>6

Met Ala Cys Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ser Asn Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Gln

<210>7

<211>19

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>靶向生物素化的标签

<400>7

Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Cys Asn Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Gln

<210>8

<211>539

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>携带靶向生物素化的标签的P12

<400>8

Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ser Asn Asn

1 5 10 15

Thr Tyr Gln His Val Ser Asn Glu Ser Arg Tyr Val Lys Phe Asp Pro

20 25 30

Thr Asp Thr Asn Phe Pro Pro Glu Ile Thr Asp Val Gln Ala Ala Ile

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Pro Ala Gly Val Asn Gly Val Pro Asp Ala Ser Ser

50 55 60

Thr Thr Lys Gly Ile Leu Phe Leu Ala Thr Glu Gln Glu Val Ile Asp

65 70 75 80

Gly Thr Asn Asn Thr Lys Ala Val Thr Pro Ala Thr Leu Ala Thr Arg

85 90 95

Leu Ser Tyr Pro Asn Ala Thr Glu Ala Val Tyr Gly Leu Thr Arg Tyr

100 105 110

Ser Thr Asp Asp Glu Ala Ile Ala Gly Val Asn Asn Glu Ser Ser Ile

115 120 125

Thr Pro Ala Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Asn Val Phe Glu Thr Arg

130 135 140

Val Ser Thr Glu Ser Ser Asn Gly Val Ile Lys Ile Ser Ser Leu Pro

145 150 155 160

Gln Ala Leu Ala Gly Ala Asp Asp Thr Thr Ala Met Thr Pro Leu Lys

165 170 175

Thr Gln Gln Leu Ala Val Lys Leu Ile Ala Gln Ile Ala Pro Ser Lys

180 185 190

Asn Ala Ala Thr Glu Ser Glu Gln Gly Val Ile Gln Leu Ala Thr Val

195 200 205

Ala Gln Ala Arg Gln Gly Thr Leu Arg Glu Gly Tyr Ala Ile Ser Pro

210 215 220

Tyr Thr Phe Met Asn Ser Thr Ala Thr Glu Glu Tyr Lys Gly Val Ile

225 230 235 240

Lys Leu Gly Thr Gln Ser Glu Val Asn Ser Asn Asn Ala Ser Val Ala

245 250 255

Val Thr Gly Ala Thr Leu Asn Gly Arg Gly Ser Thr Thr Ser Met Arg

260 265 270

Gly Val Val Lys Leu Thr Thr Thr Ala Gly Ser Gln Ser Gly Gly Asp

275 280 285

Ala Ser Ser Ala Leu Ala Trp Asn Ala Asp Val Ile His Gln Arg Gly

290 295 300

Gly Gln Thr Ile Asn Gly Thr Leu Arg Ile Asn Asn Thr Leu Thr Ile

305 310 315 320

Ala Ser Gly Gly Ala Asn Ile Thr Gly Thr Val Asn Met Thr Gly Gly

325 330 335

Tyr Ile Gln Gly Lys Arg Val Val Thr Gln Asn Glu Ile Asp Arg Thr

340 345 350

Ile Pro Val Gly Ala Ile Met Met Trp Ala Ala Asp Ser Leu Pro Ser

355 360 365

Asp Ala Trp Arg Phe Cys His Gly Gly Thr Val Ser Ala Ser Asp Cys

370 375 380

Pro Leu Tyr Ala Ser Arg Ile Gly Thr Arg Tyr Gly Gly Ser Ser Ser

385 390 395 400

Asn Pro Gly Leu Pro Asp Met Arg Gly Leu Phe Val Arg Gly Ser Gly

405 410 415

Arg Gly Ser His Leu Thr Asn Pro Asn Val Asn Gly Asn Asp Gln Phe

420 425 430

Gly Lys Pro Arg Leu Gly Val Gly Cys Thr Gly Gly Tyr Val Gly Glu

435 440 445

Val Gln Lys Gln Gln Met Ser Tyr His Lys His Ala Gly Gly Phe Gly

450 455 460

Glu Tyr Asp Asp Ser Gly Ala Phe Gly Asn Thr Arg Arg Ser Asn Phe

465 470 475 480

Val Gly Thr Arg Lys Gly Leu Asp Trp Asp Asn Arg Ser Tyr Phe Thr

485 490 495

Asn Asp Gly Tyr Glu Ile Asp Pro Ala Ser Gln Arg Asn Ser Arg Tyr

500 505 510

Thr Leu Asn Arg Pro Glu Leu Ile Gly Asn Glu Thr Arg Pro Trp Asn

515 520 525

Ile Ser Leu Asn Tyr Ile Ile Lys Val Lys Glu

530 535

Claims

1.检测内毒素的方法，包括以下步骤：

a)用能与内毒素结合的噬菌体尾蛋白与样品温育，

b)检测与所述噬菌体尾蛋白结合的内毒素。

2.权利要求1的方法，在a)后和步骤b)前还包含额外的步骤

a′)从样品中分离所述噬菌体尾蛋白-内毒素复合物。

3.权利要求1-2之一的方法，其中所述检测通过光谱方法实现。

4.从样品中去除内毒素的方法，包括以下步骤：

a)将样品与能与内毒素结合的噬菌体尾蛋白共同温育或使二者接触，所述蛋白能够非特异性或定向地固定在永久载体上，其中所述温育中的Ca²⁺浓度为0.1μM-10mM和/或Mg²⁺浓度为0.1μM-10mM，

b)从样品中分离所述噬菌体尾蛋白-内毒素复合物。

5.权利要求4的方法，其中步骤a)和b)在层析柱通流法中实现。

6.权利要求4的方法，其中所述永久载体是过滤介质，玻璃颗粒，磁性颗粒，离心物质，沉淀物质，或用于层析柱的填充物质。

7.权利要求4-6任一项的方法，其中所述噬菌体尾蛋白通过偶联基团固定在永久载体上。

8.权利要求7的方法，所述偶联基团是链霉抗生物素或抗生物素蛋白且所述噬菌体尾蛋白与生物素或Strep-标记偶联。

9.权利要求4-6之一的方法，其中所述噬菌体尾蛋白通过化学键共价固定在永久载体上。

10.权利要求1的方法，其中所述噬菌体尾蛋白具有Strep-标记或His-标记。

11.权利要求4的方法，其中所述噬菌体尾蛋白具有Strep-标记或His-标记。

12.权利要求10的方法，其中所述标记具有SEQ ID NO.5，6或7所示的氨基酸序列。

13.权利要求11的方法，其中所述标记具有SEQ ID NO.5，6或7所示的氨基酸序列。

14.权利要求10至13任一项的方法，其中噬菌体T4的p12蛋白用作噬菌体蛋白。蛋白用作噬菌体蛋白。