KR20050027223A

KR20050027223A - 엔도톡신의 검출 및 제거 방법

Info

Publication number: KR20050027223A
Application number: KR1020047021008A
Authority: KR
Inventors: 쉬츠마이클; 마이어로만; 그라레르트홀거; 밀러스테판
Original assignee: 프로포스 아게
Priority date: 2002-06-24
Filing date: 2003-06-24
Publication date: 2005-03-18
Also published as: WO2004001418A2; WO2004001418A3; US7858299B2; CA2490467A1; JP4659453B2; US20060172281A1; DE50305695D1; RU2004135062A; KR101036456B1; HRP20041088A2; AU2003250270A1; CA2490467C; US7585620B2; AU2003250270B2; HK1074252A1; DE10393326D2; EP1516188B1; PL209568B1; PL375203A1; EP1516188A2

Abstract

본 발명은 시료로부터 엔도톡신의 검출 및 제거에 관한 것이다.

Description

엔도톡신의 검출 및 제거 방법 {METHOD FOR DETECTING AND FOR REMOVING ENDOTOXIN}

본 발명은 시료로부터 엔도톡신의 검출 및 제거 방법에 관한 것이다.

엔도톡신(ET)은 단백질 및 인지질과 함께 그램-음성 박테리아의 외부세포막을 형성하는 리포다당체과를 가리킨다. 엔도톡신은 오직 이 박테리아군에서만 발생하며 외부세포막의 조직, 안정성 및 장벽 기능에 있어서 중요한 역할을 한다. 다수 박테리오파지는 그들의 숙주 박테리아를 찾는 특이방법으로서 엔도톡신이나 일반적인 리포다당체를 사용한다.

모든 엔도톡신 변이체는 지질 A와 공유결합적으로 결합되는 이종다당체로 구성된다(Holst, O., 리포다당체의 코아 영역에서의 화학적 구조. In: 건강과 질병에서의 엔도톡신(Brade, H., Morrison, D.C., Opal, S., Vogel, S. eds.), Marcel Dekker Inc. New York). 지질 A는 외부 박테리아 세포막에 엔도톡신을 고정시킨다. 상기 이종다당체는 코아 올리고당과 O 항원으로 구성되며, 주변용액에서 나타나 박테리아의 혈청학적 특성을 결정한다. 상기 O 항원은 반복되는 올리고당 단위로 구성되며, 이는 특이한 균주의 성분이다(상기 Holst 등의 논문을 참조). 상기 코아 올리고당의 기본 단위체는 2-케토-3-디옥시옥토네이트(KDO) 및 L-글리세로-D-만노헵토스(Hep)이다.

여러 종류의 엔도톡신의 가장 잘 보존되는 부분은 지질 A이다. 내부 코아영역은 지질 A와 유사하게 보존되나, 외부 코아영역은 이미 더 높은 변이를 지닌다. 내부 코아영역, KDO 및 지질 A는 치환물로서의 복수 인산염군을 지니며, 이로 인해 엔도톡신의 음전하를 띠게한다. 또한, 지질 A 및 상기 코아영역의 상기 인산염군은 아라비노스, 에탄올아민 및 인산염에 의해 다양하게 치환될 수 있다. 상기 O 항원의 개별 당류 기본 단위체는 아세틸화, 시알산염화 또는 글리코실화된다. 상기 복수의 반복되는 단위에 따라 상기 O 항원은 변이하게 되는데, 이는 각 박테리아의 엔도톡신 개체군이 특정한 이질성을 가지기 때문이다(Palva E.T., Makela P.H., SDS-PAG(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel) 전기영동법에 의해 분석한 살모넬라 티피무리움에 있어서 리포다당체 이질성. Eur J Biochem. 1980;107(1):137-43; Goldman R.C., Leive L., 대장균 0111 및 살모넬라 티피무리움 LT2로부터의 리포다당체에 있어서 항원측쇄 길이의 이질성. Eur J Biochem. 1980;107(1):145-53).

엔도톡신은 2분자로서 별도의 예방수단없이 거의 모든 수용성 용액에서 발견될 수 있다. 사람과 동물에 있어서의 엔도톡신은 패혈증을 일으켜 면역계통의 강력한 오반응을 야기한다. 따라서, 예를 들어 파마프로틴을 생산하는 경우에 있어서 엔도톡신에의 오염은 정밀하게 검출되어야하고, 이후 완전하게 제거되어야 한다. 엔도톡신은 사람이나 동물에 주입되는(예를 들어, 가축치료 또는 동물실험) 유전적으로 처리된 의약이나 유전자 치료 또는 물질에의 문제를 나타낸다. 그런데, 포유류 세포의 이입실험과 같은 의약 및 연구의 용도에 있어서 엔도톡신에 의한 이입효율의 억제 또는 저하가 관측될 수 있다.

임상연구의 테두리 내에서 단백질을 사용할 수 있기 위하여 유럽 및 미국약전에서는 상기 단백질이 엔도톡신 수준의 특정 경계값(예를 들어, 면역 혈청글로불린 0.91EU/ml. 이는 5EU/kg 체질량 및 시간에 대응한다(투여량 ＝ EU/kg*h, EU ＝ 엔도톡신 단위). 미국식품의약국(FDA)의 최종생성물로서 LAL의 비준 가이드라인) 이하로 되어야 한다. 만일 상기에 함유된 의약이나 단백질이 너무 높은 엔도톡신 수준을 가진다면, 이는 피실험대상의 사멸을 야기할 수 있다. 상기 잘못된 면역방어는 환자에게 과잉반응에 따른 피해를 준다. 이는 조직감염, 혈압저하, 빠른 심장박동, 혈전증, 쇼크 등을 일으킨다. 심지어 피코그램 단위로 오래 동안 엔도톡신에 노출된다면, 면역결핍, 패혈증상 등과 같은 만성 부작용을 일으킬 수 있다. 물질제조의 테두리 내에서는, 특히 "우량제조기준(GMP)"에 따른 공정에 있어서는 최대한의 엔도톡신을 제거하는 시도가 행해지고있다. 그러나, 단백질, 다당체 및 DNA에 있어서의 엔도톡신 제거는 문제이다. 단백질 자체만 하더라도 그 전하상태나 소수성과 같은 고유의 특성으로 인하여 사실상 엔도톡신 제거가 방해받거나 또는 그 제거공정에서 많은 생성물이 소실된다는 큰 문제점이 있다.

현재, 생물학적 용액에 있어서 엔도톡신 검출을 위한 세 가지 방법을 아래와 같이 기술하나, 이 중에서 처음 두 가지 방법만이 FDA에 의해 허가되고 있다.

1. "토끼 발열원 테스트": 살아있는 토끼에 엔도톡신 용액을 주입하여 면역반응을 유발시키는 방법이다. 이러한 엔도톡신-유도 면역응답은 열의 발현으로써 검출된다.

2. "LAL(Limulus Amoebocyte Lysate) 테스트": 현재 가장 많이 사용되고 있으며(Bio Whittacker, Inc., Charles-River, Inc., Associates of Cape Cod, Inc., all USA), 매우 향상된 방법으로 표준화될 수 있다. 이 방법으로, 엔도톡신 접촉 후 투구게(리물루스 폴리페무스)의 혈액응집이 측정된다.

3. 또한, 특별한 세포배양시스템을 사용하는 방법이 있으며(Sterogene Inc., USA), 이는 단핵세포의 활성화를 특정 사이토카인의 발현을 통하여 추적한다.

그런데, 상기 처음 두 가지 방법은 매우 비쌀 뿐더러(참조: 경합적 비교 엔도톡신 검출), 시험동물이나 매우 희귀한 투구게의 혈액을 많이 필요로 하여 적어도 동물보호의 차원에서 모호하다. LAL 테스트는 실제로 소형화 및 자동화될 수 있으나, 해당 성분들의 낮은 안정성으로 인하여 그 적용에 있어서 큰 단점을 지닌다. 일단 LAL 용액이 노출되면, 해당 성분들이 몇 시간 내에 응집되기 때문에 그 즉시 처리되어 사용되어야 한다. 예를 들어, 토끼의 면역시스템은 엔도톡신의 동일한 용량에도 완전히 다르게 반응할 수 있기 때문에, 숙련된 전문가가 모든 테스트 방법에 요구되며 상기 방법은 외부간섭에 민감하다. Sterogene사의 세포배양방법은 모든 배양방법과 마찬가지로 매우 복잡하므로, 표준화에 따르는 문제를 가진다.

사용이 손쉽고 경제적인 엔도톡신 검출방법은 없으며, 현재 사용되는 방법도 많은 단점을 가진다고 할 수 있다. 따라서, 이러한 단점들을 회피하는 방법이 요구된다.

일반적으로 생물학적 용액으로부터의 엔도톡신 제거를 위한 일련의 방법이 있으나, 특히 단백질의 경우에는 적용할만한 표준방법이 없다. 개별적으로 사용되는 방법들은 각 단백질의 특이성과 그에 대응하는 제조공정에 따라 변경된다. 엔도톡신의 제거에는 여러 가능성이 있지만, 이들 방법에는 특정한 장단점이 존재한다.

한외여과법(Unifiltration; Petsch, D. & Anspach, F.B., 2000, J.Biotechnol. 76, 97-119 및 그 참조문헌)은 염, 당질 및 항생물질과 같은 저분자 성분과 물 및 용액으로부터의 엔도톡신 제거에 사용되지만, 고분자 단백질이나 DNA에는 적합하지 않다.

2상추출법(2-Phase Extraction; 예를 들어, 국제특허공개공보 WO 0166718호, Merck)은 수용성 단백질과 DNA를 엔도톡신으로부터 분리하도록 의도되었지만, 정제된 생성물에서 계면활성제의 잔류물을 만들어낸다. 게다가 이 방법은 정제공정의 수회 반복으로 인하여 시간이 많이 소요된다.

음이온 교환제법(DEAE)은 마찬가지로 염기성 단백질과 DNA로부터 엔도톡신을 제거하는데 사용되나(예를 들어, 미국특허 제 5990301호 Qiagen, 국제특허공개공보 WO 9414837호 Enzon), 산성 단백질인 경우에는 낮은 이온강도(＜50mM NaCl)가 요구되고 단백질 공동흡착을 야기한다.

또한, DNA 및 단백질(예를 들어, BSA, 미오글로빈, γ-글로불린, 치토크롬 C)로부터 엔도톡신의 제거를 위한 또 다른 방법은 친화성 흡착인데(예를 들어, 폴리믹신 B, 히스타민, 히스티딘, 폴리라이신; 예를 들어, 영국특허 제 2192633호 Hammersmith Hospital), 이는 폴리믹신 B의 경우에는 독성이 있고, 낮은 이온강도의 경우에는 단백질의 공동흡착을 야기할 수 있다.

또한, 면역 친화성 크로마토그래피가 사용되나, 특정 엔도톡신에 대한 특이성이 코아 올리고당에 대한 값비싼 항체를 통해서만이 달성될 수 있다(미국특허 제 5179018호 Centocor, 국제특허공개공보 WO 0008463호 Bioserv).

또한, 인자 C(LAL 테스트의 성분; 국제특허공개공보 WO 9915676호, National University of Singapore)의 S3델타-펩티드(국제특허공개공보 WO 0127289호, National University of Singapore)가 단백질(예를 들어, BSA, 키모트립시노겐)과 함께 사용되지만, 이 방법은 높은 이온강도의 경우에는 효율이 낮고, 높은 생산비용이 소요된다(곤충세포배양의 생산).

의약산업에의 적용에 있어서, 단백질 용액에 대해 본질적으로 다음 세 가지 방법이 상기 표적 단백질의 특성에 적합함이 발견된다.

· 음이온 교환제 크로마토그래피

· 역상 크로마토그래피: 이 방법은 모든 단백질에 균등하게 적합하지 않다는 단점이 있다- 특히 소수성 단백질의 경우 문제이다. 또한 매우 장시간이 소요된다.

· 렘 톡스(Rem Tox; Millipore Company): 이 방법은 매우 오랜 배양기간뿐만 아니라 비특이성 결합성분이 높다는 단점이 있어 단백질 회수는 종종 부적합하다.

현존하는 방법들에 의해 많은 경우 단백질로부터 엔도톡신을 대략 10EU/ml정도까지 제거될 수 있다. 그러나, 엔도톡신의 잔존농도에는 아직도 독성이 존재한다. 따라서, 그 이상의 제거(＝미세 정제)가 제공되거나 또는 의료적용에서의 단백질의 투여에 따르는 것이 유럽약전(예를 들어, 정맥투여에 있어서 5EU/kg 체질량 및 시간)과 FDA에 의해 필수적인 것으로 규정되어 있다. 그러나, 이러한 미세 정제는 종종 현재 방법들로는 확실하게 실행되지 못할 때가 있다. 현 시장의 방법들은 심각한 단점들을 지니고 있으며, 특정 단백질의 경우에는 종종 적용될 수 없거나 또는 적용된다하더라도 표적 단백질 분량의 상당한 손실을 유발한다.

도 1은 E. coli O111:B4로부터의 엔도톡신의 화학적 구조의 개략도. Hep ＝ L-글리세로-D-만노헵토스; Gal ＝ 갈락토스; Glc ＝ 글루코스; KDO ＝ 2-케토-3-디옥시옥토네이트; NGa ＝ N-아세틸갈락토사민; NGc ＝ N-아세틸글루코사민.

도 2는 설프하이드릴기를 통하여 고정화된 N스트렙S3Cp12를 운반하는 크로마토그래피 컬럼으로 한 테스트의 결과 그래프. (A) 단백질 용액으로부터 엔도톡신의 제거: 소 혈청 알부민(BSA), 탄산 탈수소효소(CA) 및 라이소자임(Lys)이 상기 컬럼에서 1시간동안 배양되고 완충액으로 용출되었다. 상기 컬럼 전후의 엔도톡신 농도를 LAL 테스트로 측정하였고 이로부터 제거비율(%)이 계산되었다. (B) 단백질의 제거: 상기 컬럼 이후의 상기 출발용액과 상기 분획물의 단백질 농도가 280nm에서 흡수측정에 의하여 결정되었고, 이로부터 상기 단백질 회수비율(%)이 결정되었다.

도 3은 "비지향" 고정화된 p12(1) 및 "지향" 고정화된 p12(2)를 지니는 크로마토그래피 컬럼들을 통하여 라이소자임 용액으로부터 엔도톡신을 제거한 결과 그래프. 두 경우 모두 p12S3C가 NHS-활성화 컬럼에 결합되었다. 상기 "비지향" 고정화는 p12S3C의 1차 아미노기를 통하여 달성되었고, 이로부터 NHS군과의 반응에 의해 캐리어 물질과의 공유결합 화합물이 생성되었다. p12S3C의 N-말단 시스테인을 통한 "비지향" 가교는 디아미노 에탄 및 SIA(N-숙신이미딜-요드아세테이트)에 의해 달성되었다. (A) 엔도톡신 제거(%). (B) 단백질 회수(%).

도 4는 스트렙타비딘을 통하여 자기 비드에 결합된 비오티닐화된 p12로 테스트한 결과 그래프(BSA: 소 혈청 알부민, CA: 탄산 탈수소효소, Lys: 라이소자임). (A) 완충액(20mM 헤페스, 150mM NaCl, pH 7.5) 및 단백질 용액으로부터의 엔도톡신 제거는 LAL 테스트에 의하여 결정되었다. (B) 단백질 회수는 흡수측정에 의하여 상기 단백질 용액에 대해 결정되었다. 상기 용액으로부터의 상기 비드의 제거는 자석 분리기에 의하여 달성되었다.

도 5는 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 통하여 아가로스 비드에 고정화된 p12로 엔도톡신을 제거한 결과 그래프. 상기 고정화된 p12의 분리는 원심분리에 의해 달성되었다. 완충액(20mM 트리스, 150mM NaCl, pH 8.0) 및 BSA 용액으로부터의 엔도톡신 제거는 출발용액 및 잔류물의 엔도톡신 농도에 의하여 결정되었다.

도 6은 표면-플라스몬-공진 측정의 결과 그래프. (A) p12 농도( )의 다양한 주입(각각 μg/ml: 100; 25; 6.25; 4; 1.56; 0.4)에 대응하여 측정된 공진곡선. 결합은 소수성 HPA 칩에 고정화된 E. coli D21fl로부터의 엔도톡신에 이루어졌다. p12 및 EDTA(5mM)의 주입은 상기 곡선 상에 막대로 표시된다. 완충액: 20mM 트리스, 150mM NaCl, pH 8.0. (B) p12의 고정화된 엔도톡신에의 결합에 대해 평형 공진값은 p12 주입개시이후 대략 600s로 측정되어 해당 p12 농도에 따라 도시되었다. 연속선은 랑뮤어 흡착 등온식 (RU = (RU_max*[p12])/([p12]+K_d))를 데이터에 적용한 것이다.

도 6c에 있어서 스트렙타비딘 칩들에 고정화된 비오티닐화된 p12에 E. coli가 결합된 것으로서, 내부 코아영역이 완전한 E. coli D21e8( )은 p12에 결합되나, 이와 반대로, 매우 단축된 코아영역을 지니는 E. coli D21f2( )는 p12에 결합되지 않는다. 그 측정은 PBS로 행하였다.

도 7은 여러 E. coli 변이체의 엔도톡신 코아 영역의 개략 구조도.

도 8은 크로마토그래피 컬럼 관통류(Chromatography Column Throughflow)법에 의하여 엔도톡신을 제거한 결과 그래프. E는 평형화 완충액(20mM 헤페스, 150mM NaCl, 0.1mM CaCl₂, pH 7.5), A는 세척 완충액 A(20mM 헤페스, 150mM NaCl, 0.1mM CaCl₂, pH 7.5), B는 용출 완충액 B(20mM 헤페스, 150mM NaCl, 2mM EDTA, pH 7.5), C는 재생 완충액 C(20mM 헤페스, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.005%NaDOC, pH 7.5), S는 상기 출발용액에서의 단백질 및 엔도톡신의 농도를 각각 의미한다. BSA는 소 혈청 알부민을, EU는 엔도톡신 단위를 의미한다. 상기 출발용액(S)의 4ml 주입(I) 후, 15ml 세척 완충액으로 다시 헹구어졌고 상기 관통류가 분획되었다(적용동안 각각 2.5ml, 세척동안 각각 2ml). 그 후, 상기 컬럼은 상기 완충액 B 및 C로 재생되었고 배출물은 마찬가지로 분획물로 수집되었다(각각 2ml). 도면에 명확하게 나타나듯이, 상기 BSA는 상기 주입 후 최초 3 내지 5개 분획물들에서 발견될 수 있었다. 이들 분획물에서의 엔도톡신 농도는 상기 출발용액에서보다 상기 인자 100만큼 낮았다. 그 후, 상기 컬럼에 결합된 엔도톡신은 상기 완충액 B 및 C로 상기 컬럼으로부터 세척되었다.

도 9는 상기 관통류법으로 약간 오염된 완충용액(5EU/ml)으로부터 엔도톡신을 제거한 결과 그래프. p12는 NHS-활성화 세파로스 4 FastFlow(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)에 대해 비지향 고정화되었고(8mg p12/1ml 세파로스), 3개의 컬럼이 각각 2ml 컬럼 부피로 충진되었다. 실험은 3개 컬럼에 동시에 행해졌다. 시료에 적용하기 전에, 각 1ml 평형화 완충액(20mM 헤페스, 150mM NaCl, 0.1mM CaCl₂, pH 7.5)이 수집된 후에 상기 시료(S: 평형화 완충액에서 E. coli O55:B5로부터의 엔도톡신, 4.6EU/ml)가 주입되었고(I), 5ml 및 2ml의 분획물이 수집되었다. 상기 컬럼의 재생은 4ml 재생 완충액(B: 20mM 헤페스, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.005% NaDOC, pH 7.5)을 첨가하여 달성되었다. 상기 엔도톡신 농도는 LAL 테스트(동적 색소생산성 LAL 테스트(Kinetically Chromogenic LAL Test), Charles-River Inc.)에 의해 결정되었다. 상기 엔도톡신 불순물은 세 실험 모두에서 완전히 제거될 수 있었다. 즉, 상기 관통류에서 엔도톡신 농도는 검출한계 이하였다(< 0.005EU/ml).

이로부터 본 발명의 목적은 시료에서 엔도톡신을 검출 가능한 방법을 제공하기 위한 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 엔도톡신이 수용성 용액으로부터 제거될 수 있는 방법을 제공하기 위한 것이다.

이들 목적은 특허청구범위에 기재된 내용에 의하여 달성된다.

여기서 사용되는 용어 "엔도톡신 제거"는 시료물질로부터 엔도톡신의 완전한 제거 또는 부분적 제거를 의미한다.

여기서 사용되는 "엔도톡신"은 그램-음성 박테리아의 외부 세포막의 한 성분인 세균성 리포다당체를 가리킨다.

여기서 사용되는 "박테리오파지 미부 단백질(Bacteriophage Tail Protein)"은 박테리오파지에 발생하여 세포막 성분들을 결합할 수 있는 단백질들을 가리킨다. 보통 이들 단백질은 박테리오파지의 미부에 위치하나, 미부가 없는 박테리오파지의 경우에는 박테리오파지의 두부 또는 박테리아 외피에 위치할 수도 있다. 박테리오파지 미부 단백질에 의해 결합된 세포성분은 특정한 엔도톡신들에서 탐색한다.

여기서 사용되는 "비특이성 고정화" 또는 "비지향 고정화"는 단백질의 기질로의 결합이 단백질 표면 전체에 걸쳐 분포되는 단백질기(1차 아민)를 통하여 달성됨을 의미한다. 각 단백질 분자의 결합에 사용되는 군은 무작위로 선택된다.

여기서 사용되는 "지향 고정화"는 결합이 아미노산기 또는 기타 기(예를 들어, 단백질의 글리코실화)를 통하여 달성되며, 이의 상기 단백질에서의 위치(예를 들어, N- 또는 C-말단)는 알려진 것을 의미한다. 상기 결합을 위해 이들 군을 선택하는 것은 이들 기와 우선적으로 반응하는 적절한 반응 대상/링커를 선택함으로써 달성된다(예를 들어, 설프하이드릴기의 요드아세테이트기로의 결합; 상기 요드아세테이트기는 아미노기보다도 상기 설프하이드릴기와 수천 배나 빨리 반응한다).

본 발명은 엔도톡신의 검출방법에 관한 것으로 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다;

a) 박테리오파지 미부 단백질로 시료를 배양한다.

b) 박테리오파지 미부 단백질에 결합된 엔도톡신을 검출한다.

본 발명은 상기 검출에 있어서 예를 들어 형광발광, 형광편광, 흡수 또는 원편광과 같은 분광법, 예를 들어 전기적 신호와 같은 캐패시턴스 측정법, 또는 간접적인 경합검출법에 의한 방법에 관한 것이다.

가능하다면, 상기 a)단계 이후와 b)단계 이전에 상기 시료로부터 박테리오파지 미부 단백질-엔도톡신 복합체를 분리하는 a')단계가 삽입 부가된다.

또한, 본 발명은 다음과 같은 단계를 포함하여 시료로부터 엔도톡신을 제거하는 방법에 관한 것이다;

a) 비특이적 또는 지향적으로 고정된 캐리어에 고정화된 박테리오파지 미부 단백질과 함께 배양하거나 또는 이에 접촉시키는 단계.

b) 상기 박테리오파지 미부 단백질-엔도톡신 복합체를 상기 시료로부터 분리하는 단계.

적절한 엔도톡신-박테리오파지 미부 단백질 결합을 얻기 위하여 배양 전에 Ca⁺², Mg²⁺와 같은 2가 이온의 이온성분 및/또는 pH값을 조절함이 바람직하다. 또한, 배양 도중이나 그 후에 계면활성제 및/또는 트윈, 트리톤 NaCl, 황산암모늄과 같은 염이나 키토산, 당질, 지질과 같은 기타 물질을 첨가하여 상기 결합된 엔도톡신을 "벗김(demasking)"이 바람직하며, 이는 예를 들어 단백질이나 핵산으로부터 상기 엔도톡신의 분리를 가속화한다.

박테리오파지 미부 단백질은 자연적으로 발생하거나, 분자생물학적 또는 생화학적으로 변형될 수 있다. 박테리오파지 미부 단백질은 여러 이유로 인하여 유전공학 및/또는 생화학적으로 변형될 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 자연적으로 발생한 박테리오파지 미부 단백질뿐만 아니라 이들의 변이체도 사용될 수 있다. 이 때, 상기 변이체는 상기 박테리오파지 미부 단백질이 수정된 아미노산 서열을 가짐을 의미한다. 이들 변이체는 자연적으로 발생한 변이체를 선별하거나, 또는 무작위 변이생성 또는 표적 변이생성에 의하거나, 또는 화학적 변형에 의하여 얻어질 수 있다. 본 발명에 의한 방법에 사용되는 박테리오파지 미부 단백질은 이들의 특이성이나 캐리어 구조에 대한 이들의 결합특성에 따라서 표적 또는 무작위 변이생성에 의해 적응될 수 있다. 이러한 캐리어에의 결합은 예를 들어 공유결합이나 특이 또는 비특이 비오티닐화(Biotinylation)을 통하여 영구적으로 달성될 수 있을 뿐만 아니라, 예를 들어 환원가능한 디설피드 가교 등을 통하여 가역적으로 달성될 수도 있다. 또한, 그 안정성은 변형에 의하여 증가될 수 있다. 분자생물학적 또는 화학적 변이생성에 의하여 아미노산 부가, 결실, 치환 또는 화학적 변형으로 될 수 있는 변이가 도입된다. 테스트 요건에 특이성과 결합친화력을 적응시키기 위한 목적으로 이들 변이를 박테리오파지 미부 단백질의 결합영역에 아미노산 서열의 변화를 일으킬 수 있으며, 그 예로서 검출이나 제거를 향상시키기 위하여 박테리오파지 미부 단백질에의 엔도톡신 결합을 증가시키거나 또는 그것들을 불가역적으로 만든다. 또한, 상기 결합을 향상시키거나 불가역적으로 만들기 위하여 존재할 가능성이 있는 효소 활성도를 무기력하게 하기 위한 목적으로 상기 파지 단백질의 유전공학적 또는 생화학적 변형이 이행될 수 있다. 또한, 용해도라든지 열정 안정성 등과 같이 상기 단백질의 존재하는 물리적 특성을 적응시키기 위하여 상기 파지 단백질의 유전공학적 또는 화학적 변형이 행해질 수 있다.

T4 p12의 3차원 구조를 규명하기 위한 연구에 의하면, 증가된 온도에서는 33 kDa 및 45 kDa의 단백질가수분해 단편이 만들어질 수 있어 N- 및 C-말단(33 kDa) 또는 N-말단(45 kDa)만이 단축된다. 33 kDa 단편과 대조적으로, 45 kDa 단편은 그럼에도 불구하고 박테리아와 결합이 가능하다. 결국, 상기 C-말단은 상기 세포결합에 관여되어버린다.

또한, 상기 변형은 예를 들어 트립토판 형광의 측정과 같은 직접검출이 특히 가능해지도록 이행될 수 있다. 예를 들어, p12는 5개의 트립토판기를 가진다. 상기 천연단백질의 형광스펙트럼에 의하면 이들 기는 매우 잠재적인 용매이다. 다수의 과학적 연구에 따르면, 엔도톡신에서도 발생하듯이 방향족 아미노산은 거의 항상 당기의 결합에 관여된다. 상기 당기의 단백질에의 결합은 트립토판 형광의 소광을 수반하거나, 또는 만약 가능하다면, 이에 덧붙여 상기 형광을 최대로 변화시킨다. 몇몇 연구로부터 천연 p12의 불리한 형광단 분포로 인하여 결합측정용으로 p12의 형광특성을 이용할 수 없다고 예측될 수 있다. p12의 형광특성은 상기 5개의 트립토판기에 의하여 좌우되는데, 이 형광은 측정할 수 없는 방법으로 엔도톡신의 부가에 의해 바뀌어진다. 이들 데이터로부터, 오히려 티로신기가 결합에 트립토판기로서 관여되어도, 이에 의한 신호변경은 높은 트립토판 배경 앞에서는 가시화될 수 없을 것이라고 예상할 수 있다. 단백질가수분해 결과에 기초하면, p12의 C-말단에 있는 6개의 티로신은 상응하여 "가시화"되도록 만들어질 수 있는 엔도톡신 검출키트로 사용가능하다. 5개의 트립토판기를 티로신으로 분자생물학적으로 선택적 교환을 함으로써 상기 분광특성이 첫번째 단계에서 특이하게 바뀌게 되고, 이로써 단일 트립토판기의 형광신호 변경에 의하여 상기 엔도톡신 결합이 측정될 수 있게 된다. 그리고 난 후, C-말단의 6개 티로신 각각을 트립토판기로 교환하면, 상기 측정가능한 신호의 강도가 증가되어 엔도톡신 검출키트의 개발에 유리할 정도의 신호차이를 얻을 수 있게 된다.

사용되는 박테리오파지 미부 단백질은 어떤 엔도톡신이 검출 또는 제거되느냐에 따라 달라진다. 심지어 지금도, 오늘날 알려진 많은 수의 박테리오파지가 상기 기술된 박테리아의 많은 부분에서 입수될 수 있으며, 본 발명에 의한 방법에 사용될 수 있다. 상기 파지와 이에 대응하는 숙주 박테리아는 특히 ATCC(미국), DSMZ(독일), UKNCC(영국), NCCB(네덜란드), MAFF(일본)와 같은 균주센터에서 얻어질 수 있다.

바람직하기로는 본 발명에 의한 방법에 사용되는 박테리오 파지 단백질은 박테리오파지에서 발생하므로, 예를 들어 유전자 치료용 재조합 단백질 또는 핵산의 생산에 사용되는 E. coli 등과 같이 의약이나 생명공학을 고려할 때, 이의 숙주 박테리아는 매우 중요하다. 예를 들어 코아영역이나 지질 A와 같이 엔도톡신의 높은 보존영역을 결합하는 박테리오파지 미부 단백질이 특히 바람직하다. 특히, p12와 p12-유사 박테리오파지 미부 단백질이 바람직하다. 다양한 숙주 박테리아로부터의 엔도톡신 불순물의 조합에 있어서 상기 상응하는 엔도톡신-검출 박테리오파지 미부 단백질의 조합이 사용될 수 있다.

엔도톡신의 시료에서의 검출 또는 시료로부터의 제거는 박테리오파지 미부 단백질에의 엔도톡신 결합을 통하여 달성된다. 상기 결합은 예를 들어, 형광발광, 형광편광, 흡수 또는 원편광 2색성 등을 통한 분광법에 의한 직접측정에 의하여 검출될 수 있다. 또한, 상기 결합은 예를 들어 캐패시턴스 측정과 같은 전기적 신호에 의하여 가시화될 수도 있다. 또한, 상기 박테리오파지 미부 단백질에의 엔도톡신의 결합은 치환실험을 통하여 간접적으로도 검출될 수도 있다.

본 발명에 있어서는 검출을 위하여 만일 시료로부터 박테리오파지 미부 단백질-엔도톡신 복합체의 분리가 요구된다면, 박테리오파지 미부 단백질은 예를 들어 자기입자, 아가로스 입자, 마이크로 플레이트, 필터물질, 관통류세포챔버(Throughflow Cell Chamber; 간접검출) 등과 같은 적절한 캐리어에 결합될 수 있다. 상기 캐리어 구조는 예를 들어 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, PMMA, 셀룰로스 아세테이트, 니트로셀룰로스, 글래스, 실리콘 또는 아가로스 등을 포함할 수 있다. 상기 결합은 예를 들어 흡착이나 공유결합 등으로 달성될 수 있다.

본 발명에 있어서는 제거를 위하여 상기 박테리오파지 미부 단백질이 영구캐리어에 결합된다. 상기 영구캐리어는 크로마토그래피 컬럼용 물질(예를 들어, 세파로스 물질), 여과 매질, 글래스 입자, 자기입자, 원심 또는 침강 물질(예를 들어, 아가로스 입자)로 될 수 있다.

비록 박테리오파지 미부 단백질이 상기 캐리어 물질에 결합된다 하더라도 엔도톡신이 접근하기 쉬운 구조를 가지므로, 여기서는 기능성 결합이 중요하다. 상기 박테리오파지 미부 단백질의 결합은 예를 들어 선택적 비오티닐화 또는 결합을 통하여, 또는 스페이서 또는 링커를 통하여 비특이적으로 달성되거나 또는 바람직하게 지향될 수 있다.

이러한 목적을 위하여, 상기 박테리오파지 미부 단백질은 비오틴과 같은 저분자 물질과 가교되어 이들 저분자 물질을 통하여 일부분이 상기 캐리어에 고정되어있는 스트렙타비딘과 같은 폴리펩티드에 결합될 수 있다. 또한, 비오틴 대신에 소위 스트렙-태그(Strep-tag; Skerra, A. & Schmidt, T. G. M. Biomolecular Engineering 16 (1999), 79-86)가 사용될 수 있으며, 이는 짧은 아미노산 서열로서 스트렙타비딘에 결합한다. 또한, 히스-태그(His-tag)가 사용될 수 있으며, 이는 2가 이온(아연 또는 니켈)이나 그의 특이 항체(Qiagen GmbH, Hilden)를 통하여 캐리어 물질에 결합할 수 있다. 상기 스트렙-태그 및 상기 히스-태그는 DNA 재조합기술을 통하여 상기 재조합적으로 생산된 박테리오파지 단백질에 결합됨이 바람직하다. 상기 결합은 N- 또는 C-말단으로 지향되거나 지향되지 않을 수 있다. 상기 지향 결합은 시스테인과 같이 적절한 반응성 아미노산을 통하여 달성되며, 이는 물론 파지 단백질에서 자주 표면-노출되지 않고 특이적으로 적절한 위치에 삽입된다. 파지 미부 단백질은 세포질 내에서 합성되므로, 디설피드 가교는 고려될 필요가 없다. 결합은 기타 아미노산을 통하여 직접적으로 발생하거나, 또는 "스페이서"나 "가교제"(1가성 또는 2가성)를 통하여 시스테인과 함께 간접적으로 발생할 수도 있다.

시스테인 결합의 경우, 11-말레이미도운데칸산 설포-NHS(11-maleimidoundecanoic acid sulfo-NHS)이나 숙신이미딜-4-[N-말레이미도메틸]-시클로헥산-1-카르복시-[6-아미도]카프론산염(succinimidyl-4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxy-[6-amido]caproate) 등과 같은 중간 스페이서가 있건 없건간에 NH- 및 SH-반응군과의 모든 2가성 가교제가 가능하다. 만일 스페이서가 없다면, 말단 NH군을 가지는 8-12 C-원자-스페이서가 삽입될 수 있다. 상기 시스테인 결합은 예를 들어 EZ-링크-PEO-말레이미드 활성화 비오틴(Pierce)에 의하여 시스테인의 특이 비오티닐화를 통하여 달성됨이 바람직하다.

Ca²⁺ 또는 Mg²⁺와 같은 2가 이온은 p12와 같은 파지 단백질에 엔도톡신을 결합하는데 있어 중요하다. 그런데, 예를 들어 EDTA나 EGTA와 같은 적절한 킬레이트제를 첨가함으로써 이 결합은 끊어질 수 있다. 결합을 위하여 Ca²⁺ 농도는 대략 0.1μM 내지 대략 100mM이 바람직하며, 특히 이보다는 대략 0.1μM 내지 대략 10mM가 더욱 바람직하며, 또한 이보다는 대략 0.1μM 내지 대략 1mM가 더욱 바람직하며, 또한 이보다는 대략 10μM 내지 1mM가 더욱 바람직하다. 만일 2가 이온의 농도가 1mM EDTA를 첨가함에 의하여 100nM보다 낮아진다면, 엔도톡신의 p12에의 결합은 끊어진다. 10mM보다 높은 Mg²⁺농도는 엔도톡신의 p12에의 결합을 더 악화시키고 이는 해리정수의 증가로 감지된다. Mg²⁺의 첨가없이 50nM의 K_d값이 산출되며, 10mM Mg²⁺완충액에서는 K_d값이 1μM로 측정되었다. 아연은 한층 더한 저해효과를 나타낸다. 1mM Zn은 K_d값을 10μM까지 증가시킨다. 2가 또는 기타 이온(예를 들어, Cu²⁺, Al³⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Ca²⁺, Ba²⁺, Mg²⁺, Cd²⁺)의 농도를 결합에 적절한 값으로 조절하는 것은 HEDTA, NTA 또는 2가 이온용 완충액으로 사용될 수 있는 일반적인 킬레이트제/완충액과 같은 물질에 의해 달성될 수 있고, 상기 킬레이트제/완충액으로서는 ADA(N-[2-아세트아미도]-2-이미노디아세트산), 5-AMP(아데노신-5'-모노포스페이트), ADP(아데노신-5'-디포스페이트), ATP(아데노신-5'-트리포스페이트), Bapta(1,2-비스(2-아미노페녹시)에탄-N,N,N',N',-테트라아세트산), 구연산염(구연산), EDTA(에틸렌 디아민 테트라아세트산), EGTA(에틸렌글리콜-비스(β-아미노에틸 에테르) N,N,N',N'-테트라아세트산), HEDTA(N-하이드록시에틸에틸렌디아민트리아세트산), NTA(니트릴로트리아세트산), SO₄(SO₄ 황산염) 등이 있다.

따라서, 본 발명에 의한 방법은 뒤이은 세척단계를 포함할 수 있다. 직접 또는 간접 검출이나 제거가 시료와 박테리오파지 단백질의 분리를 요구하는지에 따라서 세척단계가 포함될 수 있다. Ca²⁺나 기타 금속이온(예를 들어, Mg²⁺)은 상기 결합에 있어 필수적이기 때문에, 엔도톡신의 예를 들어 p12에의 결합은 적절한 세척단계에 의해서도 끊어질 수 있다. 엔도톡신이 상기 박테리오파지 미부 단백질, 즉 예를 들어 p12에 결합된채로 남아있도록 의도되었는지에 따라서 EDTA 없는(free) 완충액으로 세척을 하고, 만일 상기 결합이 끊어지도록 의도되었다면, EDTA 함유 완충액으로 세척을 하는데, 상기 EDTA 농도는 적어도 0.05 내지 10mM 이상이 되고, 특히 2 내지 5mM의 범위가 바람직하다.

상기 분리는 상기 시료를 각각 박테리오파지 미부 단백질과 결합하는 캐리어물질과 배양한 후 달성되며, 그 시간은 대략 5 내지 60분, 또는 30 내지 180분이고, 만일 필요하다면 밤새 배양한다. 또한, 상기 시료는 예를 들어 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출되거나, 또는 여과되거나, 또는 그 대응입자가 원심분리, 침강분리, 또는 자기장을 가하여 자기적으로 분리된다. 여기서 기술하는 배치방법에서의 분리, 즉 각 대응하는 박테리오파지 미부 단백질과 결합하는 시료 및 캐리어물질의 전항온처리로 설명되는 배치방법에서의 분리는 매우 낮은 엔도톡신 농도에서도 민감할 수 있다.

그런데, 크로마토그래피 컬럼을 통한 엔도톡신의 제거는 또한 순수관통류법(Pure Troughflow Method)에 의하여도 달성될 수 있다. 상기 시료는 상기 컬럼에 적용될 수 있고, 상기 컬럼은 박테리오파지 미부 단백질이 결합된 캐리어 물질을 포함한다. 상기 유속은 상기 컬럼의 체적 및 구조에 따라 정해진다. 또한, 심지어 엔도톡신 농도가 낮은 경우라도 충분한 제거를 위하여 가능한 한 오래동안 상기 컬럼과 엔도톡신이 접촉하도록 상기 시료의 체적과 엔도톡신 함량에 따라 정해진다. 이로써 상기 접촉시간은 상기 시료가 상기 컬럼에 적용하여 유출될 때까지 요구되는 시간으로 된다.

상기 분리단계는 예를 들어 상기 영구캐리어에 결합하는 박테리오파지 미부 단백질을 재생하기 위한 제거방법에도 사용될 수 있다. 그 결과, 예를 들어 기질과 같은 영구캐리어는 크로마토그래피 컬럼에서 재활용될 수 있다. 재생은 EDTA를 포함하는 적절한 재생완충액 또는 상응하는 킬레이트제를 이용하여 상기 결합된 엔도톡신을 제거함으로써 달성된다. EDTA의 경우, 농도는 2mM EDTA 이상이 바람직하고, 특히 10mM EDTA 이상이 더욱 바람직하다.

이온성 상호작용은 기본적으로 항상 이온강도에 따른 영향을 받기 때문에, 용액에서의 NaCl이나 KCl과 같은 기타 염의 증가 또는 감소는 상기 박테리오파지 미부 단백질에의 엔도톡신의 결합에 영향을 미칠 수도 있다.

또한, 상기 검출방법에 있어서 상기 결합을 직접적 또는 간접적으로 가시화하기 위하여 상기 단백질은 분자생물학적 또는 생화학적으로 변경되어 측정을 가능케하거나 향상시킬 수 있다. 예를 들어 p12에의 엔도톡신의 결합을 직접적으로 가시화하기 위하여 티로신기를 트립토판과 분자생물학적으로 교환할 수 있다. 이에 의해 신호배경에서의 감소를 위하여 원래 함유되었던 트립토판을 티로신과 교환하는 것이 필수적일 수 있다. 단백질 함유 용액에서의 측정도 가능하게 하기 위하여 트립토판 도입 후 부가적으로 p12가 화학적으로 변형될 수 있다. 이로써 트립토판기는 그 분광특성에 따라 Koshland 시약(2-하이드록시-5-니트로벤질브로마이드)으로 변경될 수 있다. 치환실험의 경우, 표시된 엔도톡신, 예를 들어 형광표시된 엔도톡신(예를 들어, Sigma)은 p12와 같은 엔도톡신에 의하여 치환될 수 있고, 이는 상기 시료에 위치하여 무형광 엔도톡신의 농도가 정해질 수 있다.

본 발명에 의한 방법에 있어서, 엔도톡신은 모든 수용성 용액에서 검출되어 제거될 수 있다. 이들 용액은 단백질, 플라스미드-DNA, 게놈 DNA, RNA, 파지 또는 바이러스 등의 단백질-핵산 복합체, 당질, 백신, 약제, 투석완충액(의약), 염 또는 기타 엔도톡신 결합으로 오염되는 물질을 포함한다.

또한, 본 발명에 있어서는 소위 태그, 예를 들어 스트랩- 또는 히스-태그 등이 바람직하기로는 상기 단백질의 N- 또는 C-말단에 결합되며, 더욱 바람직하기로는 상기 C-말단에 결합된다. 상기 태그는 DNA 재결합기술을 통하여 상기 박테리오파지 미부 단백질과 결합 또는 가교되는 것이 바람직하다. 박테리오파지 단백질 및 태그의 서열을 포함하는 핵산의 제조와 그 발현생성물의 제조는 통상의 기술로 가능하므로 여기서는 별도로 기술하지 아니한다. 또한, 본 발명에 있어서 상기 핵산서열은 상기 스트랩- 또는 히스-태그와 박테리오파지 단백질을 함께 암호화한다. 상기 파지 T4의 상기 p12 단백질은 상기 스트랩- 또는 히스-태그로 변형되는 박테리오파지 단백질인 것이 특히 바람직하지만, 박테리아의 검출 및 결합에 관여하는 기타 모든 박테리오파지 단백질도 마찬가지로 바람직하다.

또한, 본 발명에 있어서 박테리오파지 단백질은 SEQ ID NO: 5, 6, 7과 같은 특이 지향 비오티닐화에 대한 표면 노출 시스테인을 갖는 태그를 지닌다. 태그를 지니는 p12의 일 예는 SEQ ID NO: 8에서 인용된 아미노산 서열이다. 태그를 지니는 p12, 특히 표면 노출 시스테인을 갖는 태그를 지니는 p12가 바람직하며, 특히 SEQ ID NO: 6, 7에 의한 태그를 지니는 p12가 바람직하다. 상기 지향 비오티닐화는 적절한 스페이서 또한 링커에 의해 부가적으로 부여될 수 있다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 5, 6, 7에 의한 서열을 지니는 아미노산에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 5, 6, 7에 의한 아미노선 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명에 있어서는 엔도톡신의 적절한 검출 및 정제방법을 제공하여 여러 적용에 유리하다. 반면에, LPS 코아 올리고당에 대한 항체의 생산은 매우 어렵기 때문에, 항체를 기초로 하는 방법은 매우 비싸다.

이하, 다음의 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하며, 본 발명은 상기 실시예로만 한정되는 것은 아니다. 만일 기재가 없다면, 이는 예를 들어 Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York과 같은 분자생물학적 표준방법이 사용된 것이다.

실시예 1: 글래스 용기, 플라스틱 용기 및 완충액

엔도톡신 제거를 위하여 모든 글래스 용기는 200℃에서 4시간 가열하여 발열인자를 제거(depyrogenate)하였고, 오직 발열인자 없는(free) 플라스틱 물질만(예를 들어, 피펫 팁, 마이크로 플레이트)이 사용되었다. 기타 비내열성 도구 또는 용기는 3% 과산화수소로 처리하거나 또는 1% 디옥시콜산 나트륨으로 세척하였다. 그리고, 이를 엔도톡신 없는 물로 헹구어냈다. 완충액은 엔도톡신이 엄격하게 없는 완충액물질(Sigma)로 제조되고 엔도톡신 없는 물과 혼합하였다. 200℃까지 가열될 수 있는 NaCl과 같은 염은 200℃에서 4시간동안 가열되었다. 크로마토그래피 정제에 사용되는 완충액은 탈기되어 여과되었다.

실시예 2: LAL 테스트에 의한 엔도톡신 검출

엔도톡신 제어테스트가 해당 제조자의 설명서에 따라서 색소생산성(Chromogenic) LAL 테스트(Limulus-Amoebocyte-Lysate Test, Charles-River Endosafe, Charleston, USA)로 행하여졌다. 상기 농도를 결정하기 위하여 0.005 내지 50EU/ml 또는 0.02 내지 50EU/ml 범위의 엔도톡신 기준(Charles-River Endosafe, Charleston, USA)이 사용되었다. 405nm에서 흡수측정은 온도제어 마이크로 플레이트 판독기(Genios, Tecan GmbH)로 행하였다.

실시예 3: p12 검출을 위한 웨스턴-블로트법

비드로 처리한 시료의 잔류물 또는 친화 크로마토그래피의 분획물에서의 p12 검출은 웨스턴 블로트에 의해 행해졌다. 부분적으로 상기 단백질은 NaDOC/TCA 침강(디옥시콜산 나트륨/테트라클로로 아세테이트)에 의하여 미리 농축되었다. 상기 시료는 상기 목적으로 12% SDS 겔에서 전기영동법으로 분리되고 PVDF 막(Immobilon, Millipore)으로 전이되었다. 상기 막은 PBS로 30분간 세척되어 5% 밀크 파우더로 1시간 동안 차단되었으며, 이후 다클론성 항-p12 항체와 함께 배양되었다(1시간, 희석: 1:1000). 2차 항체(산양-항-토끼 IgG)로 배양된 후, 상기 시료는 알칼리성 포스파타아제와 정합되고 BCIP/NBT(5-브로모-4-클로로인도릴포스페이트/니트로블루 테트라졸리움염)로 발생되었다.

실시예 4: 엔도톡신 정제

엔도톡신의 정제는 Galanos, C., Luderitz, O. & Westphal, O. 1969, Europ. J. Biochem. 9, 245-249의 설명에 따라 행해졌다.

실시예 5: 고정화된 요드아세틸기로의 p12의 특이결합

p12의 상기 표면으로의 지향 결합을 달성하기 위하여, SEQ ID NO:5에 대한 스트렙-태그의 위치 3에서의 아미노산 세린이 실시예 12에서와 같이 시스테인으로 치환되었고, 상기 단백질은 바람직하게 유리 설프하이드릴기에 결합하는 요드아세틸기를 통하여 고정화되었다. 이에 따른 p12는 p12S3C라 명명되었다.

1ml 설포링크 결합 겔(Pierce)를 붓고 6ml 1% 소듐 디옥시콜산으로 세척하였으며, 6ml 결합완충액(50mM 트리스, 150mM NaCl, 5mM EDTA, pH 8.5)으로 평형화하였다. 그리고, 1ml p12S3C(＝N-스트렙S3Cp12)를 주입하여(결합완충액 중 1 내지 1.5mg/ml) 상기 컬럼을 15분간 부드럽게 교반하였고, 또한 교반없이 실온에서 30분간 더 배양한 후, 1ml p12S3C를 다시 주입하여 상기 배양과정이 반복되었다. 이러한 p12S3C의 결합을 전부 4회 반복한 후, 상기 컬럼을 6ml 결합완충액으로 세척하였다. 상기 관통류(Throughflow)가 수집되었고 각각의 p12S3C 농도가 280nm에서 흡수측정에 의해 결정되었다. ml겔 당 2.2 내지 2.8mg p12S3C가 결합되었다. 그 다음, 여분의 요드아세틸기가 1ml 시스테인(50mM 트리스, 5mM EDTA, pH 8.5 중 50mM)과 45분간 함께 배양하여 차단되었다. 16ml 1M NaCl과 16ml 20mM 헤페스, 150mM NaCl pH 7.5로 상기 컬럼을 세척하여, 상기 컬럼을 준비하였다.

단백질 용액으로부터 엔도톡신을 제거하기 위한 상기 겔의 용량은 BSA(2 내지 4mg/ml), 탄산 탈수소효소(1 내지 2mg/ml)와 라이소자임(3 내지 4mg/ml)으로 테스트하였다. BSA 및 라이소자임 용액은 E.coli O55:B5(Charles-River Endosafe, Charleston, USA) 또는 E. coli HMS 174 (100 내지 1000EU/ml)가 첨가되었고, 반면에 상기 탄산 탈수소효소는 부가의 엔도톡신과 혼합되지 않았다. 각각의 0.5ml 단백질 용액은 상기 컬럼에 도입되어 실온에서 1시간동안 배양된 다음, 상기 컬럼은 완충액으로 세척되었다. 상기 단백질은 분획물로 수집되어 상기 컬럼 전후에서 상기 엔도톡신 함량이 색소생산성 LAL 테스트(Charles-River Endosafe, Charleston, USA)에 의해 결정되었다. 또한, 상기 단백질 회수는 280nm에서 흡수측정에 의해 결정되었다. 도 2A에 나타내듯이 상기 엔도톡신은 모든 3개의 단백질 용액으로부터 거의 완전하게(93 내지 99%) 제거될 수 있었다. 또한, 상기 단백질은 상기 컬럼으로부터 광범위하게 용출될 수 있었다(80 내지 99%, 도 2B). 마지막으로 상기 컬럼은 5mM EDTA, 20mM 헤페스, 150mM NaCl, pH 7.5로 재생되었다. p12의 분리로 인한 상기 단백질 분획물의 불순물을 제거하기 위하여 상기 컬럼을 거친 후, 상기 분획물을 웨스턴-블로트법에 의하여 p12 테스트를 하였다. p12는 상기 분획물에서 검출되지 않았다.

실시예 6: p12의 NHS-활성화 캐리어물질에의 비특이 결합

N-하이드록시숙신이미드(NHS)는 1차 아미노기에 의해 화합물로부터 치환되므로, 표면에 단백질을 결합하는데 사용된다. 먼저, NHS-활성화 세파로스 컬럼(HiTrap NHS-활성화 HP, 1ml, Amersham-Pharmacia-Biotech)은 6ml 냉빙 1mM 염화수소산으로 세척되었다. 그 다음, 0.2M NaHCO₃, 0.5M NaCl, pH 8.3에서 10 내지 15ml p12S3C(1.0 내지 3.5mg/ml)가 실온에서 상기 컬럼의 한 서클로 펌핑되어 통과되었다(유속 0.8ml/min). 60분 후, 상기 관통류가 분획물로 수집되어 상기 컬럼은 6ml 완충액으로 세척되었다. 이들 분획물로부터 HiTrap-탈염 컬럼(5ml, Amersham-Pharmacia-Biotech)을 통하여 상기 용액을 탈염함으로써 상기 NHS가 분리된 다음, p12 분량이 280nm에서 흡수측정에 의하여 결정되었다. 20 내지 25mg p12S3C는 상기 컬럼에 결합되었다. 상기 결합 후, 상기 컬럼은 상기 제조자의 설명서에 따라 각각의 6ml 차단완충액(0.5M 에탄올아민, 0.5M NaCl, pH 8.3)과 세척완충액(0.1M 아세테이트, 0.5M NaCl, pH 4.0)으로 반복하여 헹구어냈다. 그리고, 상기 컬럼은 6ml 사용가능한 완충액(20mM 헤페스, 150mM NaCl, pH 7.5 또는 20mM 트리스, 150mM NaCl, pH 8.5)으로 평형화하였다.

상기 컬럼을 통한 상기 엔도톡신의 제거는 라이소자임 용액(20mM 헤페스, 150mM NaCl, pH 7.5 또는 20mM 트리스, 150mM NaCl, pH 8.5 중 3 내지 4mg/ml)으로 테스트하였다. 상기 라이소자임 용액에 E. coli HMS 174 (~ 500EU/ml)로부터의 엔도톡신을 가하였다. 0.5ml 단백질 용액이 상기 컬럼으로 도입되어 실온에서 1시간동안 배양된 다음, 상기 컬럼은 완충액으로 세척하였다. 상기 라이소자임은 분획물로 수집되었고 상기 엔도톡신 함량은 상기 컬럼 전후로 색소생산성 LAL 테스트(Charles-River Endosafe, Charleston, USA)에 의해 결정되었다. 또한, 상기 단백질 회수는 280nm에서 흡수측정에 의해 결정되었다. 상기 엔도톡신은 도 3A에 나타내듯이 상기 용액으로부터 85 내지 90%의 범위까지 제거되었고, 상기 라이소자임의 85 내지 90%가 사용가능한 완충액으로 세척함에 의하여 상기 컬럼으로부터 다시 용출될 수 있었다(도 3B). 그 다음, 상기 컬럼은 6ml 5mM EDTA, 20mM 헤페스, 150mM NaCl, pH 7.5와 6ml 1M NaCl로 세척되었다. p12의 분리로 인한 상기 단백질 분획물의 불순물을 제거하기 위하여 상기 컬럼을 거친 후, 상기 분획물을 웨스턴-블로트법에 의하여 p12 테스트를 하였다. p12는 상기 분획물에서 검출되지 않았다.

실시예 7: 스페이서로서 디아미노에탄 및 N-숙신이미딜-요드아세테이트(SIA)를 통한 p12의 NHS-활성화 캐리어물질 컬럼으로의 지향결합

크로마토그래피 캐리어물질에의 지향결합을 달성하기 위하여 2가성 링커가 NHS-활성화 표면에 결합되었는데, 상기 링커로 인하여 p12S3C의 결합이 그의 유리 시스테인 및 상기 2가성 링커의 요드아세틸기를 통하여 가능하게 되었다.

NHS-활성화 세파로스 컬럼(HiTrap NHS-활성화 HP, 1ml Amersham-Pharmacia-Biotech)은 먼저 6ml 냉빙 1mM 염화수소산으로 세척한 후, 1ml 에틸렌 디아민( 0.2M NaHCO₃, 0.5M NaCl, pH 8.3 중 10mg/ml)이 주입되고, 상기 컬럼은 실온에서 30분간 배양되었다. 에탄올아민(0.5M 에탄올아민, 0.5M NaCl, pH 8.3)을 지니는 여분의 NHS군을 차단하고 상기 컬럼을 세척한 후(0.1M 아세테이트, 0.5M NaCl, pH 4.0), 상기 컬럼은 6ml 붕산염 완충액(50mM 붕산염 나트륨, 150mM NaCl, 5mM EDTA, pH 8.3)으로 평형화되었다. 그 다음, 10ml N-숙신이미딜-요드아세테이트(SIA, Pierce, 10ml 붕산염 완충액 중 200μl SIA 모액; SIA 모액: 1ml DMSO 중 1.4mg SIA)는 상기 컬럼 상의 한 서클에서 30분간 헹구어졌다. 그리고, 상기 컬럼은 6ml 붕산염 버퍼로 세척되었고 p12S3C(1mg/ml, 붕산염 완충액 중 50ml)는 상기 컬럼 상에서 1시간동안 헹구어졌다. 상기 사용가능한 완충액(20mM 헤페스, 150mM NaCl, pH 7.5 또는 50mM 트리스, 150mM NaCl, pH 8.5)가 평형화되기 전에, 과잉 요드아세틸기가 1ml 시스테인 용액(붕산염 완충액 중 5mM 시스테인, 실온에서 15분간 배양)으로 중화되었다. 상기 SIA와의 결합반응은 어둠 속에서 행해졌다.

상기 컬럼에서 엔도톡신의 제거는 라이소자임 용액(20mM 헤페스, 150mM NaCl, pH 7.5 또는 20mM 트리스, 150mM NaCl, pH 8.5 중 3 내지 4mg/ml)으로 테스트하였다. 상기 라이소자임 용액은 E. coli HMS 174 (~ 500 EU/ml)로부터의 엔도톡신이 가해졌다. 0.5ml 단백질 용액이 상기 컬럼에 도입되어 실온에서 1시간동안 배양된 후, 상기 컬럼은 완충액으로 세척되었다. 상기 라이소자임은 분획물로 수집되어 상기 엔도톡신 함량이 상기 컬럼 전후로 색소생산성 LAL 테스트(Charles-River Endosafe, Charleston, USA)에 의해 결정되었다. 또한, 상기 단백질 회수는 280nm에서 흡수측정에 의해 결정되었다. 상기 엔도톡신은 도 3A에 나타내듯이 상기 용액으로부터 90%까지 제거되었고, 상기 라이소자임의 75 내지 85%가 사용가능한 완충액으로 세척함에 의하여 상기 컬럼으로부터 다시 용출될 수 있었다(도 3B). 그 다음, 상기 컬럼은 6ml 5mM EDTA, 20mM 헤페스, 150mM NaCl, pH 7.5와 6ml 1M NaCl로 세척되었다. p12의 분리로 인한 상기 단백질 분획물의 불순물을 제거하기 위하여 상기 컬럼을 거친 후, 상기 분획물을 웨스턴-블로트법에 의하여 p12에 대하여 테스트를 하였다. p12는 상기 분획물에서 검출되지 않았다.

실시예 8: 관통류법에 의한 BSA 용액으로부터 엔도톡신의 제거

HiTrap-NHS 활성화 세파로스(Amersham Biosciences, Uppsala Sweden)는 제조자의 설명서에 따라서 비특이적으로 1차 아미노군을 통하여 p12와 결합되었다. 이로써 8mg p12/ml 겔 물질이 공유결합적으로 고정화되었다. 이렇게 획득한 1ml 크로마토그래피 컬럼은 1ml/min의 유속으로 10ml 완충액 A(20mM 헤페스, pH 7.5, 150mM NaCl, 0.1mM CaCl₂)로 평형화되었다. 그리고, 4ml의 BSA용액(11.5mg BSA (Carl Roth GmbH, Germany)/ml 완충액 A)가 가해지고(주입: I), 관통류(E)가 2.5ml 분획물로 수집되었다. 그 다음, 상기 컬럼은 15ml 완충액 A로 세척되었고 상기 컬럼에 결합된 엔도톡신은 7ml 완충액 B(20mM 헤페스, pH 7.5, 150mM NaCl, 2mM EDTA)로 용출되었다. 세척 및 용출 동안, 각 2ml 분획물이 수집되었다. 각각의 실험 후에 상기 컬럼은 20ml 완충액 C(20mM 헤페스, pH 7.5, 150mM NaCl, 2mM EDTA, 0.1% 디옥시콜산 나트륨)으로 재생되었다. 엔도톡신 농도는 색소생산성 LAL(Limulus Amoebocyte Lysate; Charles-River Endosafe, Charleston, USA)에 의해 제조자의 설명서에 따라 결정되었다. 단백질 농도의 결정은 UV 흡수의 측정으로 달성되었다. 엔도톡신 제거효율은 95 내지 99%였고, 상기 단백질 손실은 대략 6 내지 10%였다.

실시예 9: 비특이적으로 결합된 p12에 의한 완충액으로부터의 소량의 엔도톡신 제거

20ml NHS-활성화 세파로스 4 FastFlow(Amersham Biosciences)가 먼저 냉빙 염화수소산으로 세척된 후, 교반되며 실온에서 4시간동안 292mg p12(25mM 시트르산 pH 7.0 중 7mg/ml)과 함께 배양되었다. 그리고, 상기 세파로스는 7 x 80ml 5mM 시트르산 pH 2.0으로 세척되었고, 상기 각 세척 분획물 1ml가 5mM 시트르산 pH 2.0에 대해 투석되었다. 이들 투석물은 280nm에서 흡수측정에 의하여 상기 세척 분획물 중의 과잉 p12의 양을 재기 위하여 사용되었다. 1ml 세파로스 당 8.7mg p12의 전하밀도가 결정되었다. 비반응된 NHS기는 1M 트리스 pH 8.0과 함께 상기 세파로스의 12시간 배양에 의하여 중화되었다. 2ml 부피의 컬럼은 상기 컬럼물질로 충진되어 4℃ 20% 에탄올에서 사용 시까지 보관되었다.

상기 세가지 테스트에 있어서, 각 4ml 엔도톡신 용액(S)이 하나의 컬럼에 가해졌다(도 9). 상기 엔도톡신 용액은 평형화 완충액(20mM 헤페스, 150mM NaCl, 0.1 mM CaCl₂, pH 7.5) 중에서 E. coli O55:B5(Charles-River Endosafe, Charleston, USA)로부터의 엔도톡신을 포함하였다. 상기 용액의 상기 엔도톡신 농도는 4.6EU/ml였다.

상기 컬럼은 먼저 12ml 재생 완충액(20mM 헤페스, 150mM NaCl, 2mM EDTA, pH 7.5)으로 헹구어진 후, 12ml 평형화 완충액으로 헹구어졌다. 그리고, 평형화 완충액은 다시 상기 컬럼에 도입되어 1ml가 분획되었다.

상기 엔도톡신 용액은 상기 컬럼(I)에 가해져 5ml 및 2ml의 분획물이 수집되었다. 그리고, 상기 컬럼은 4ml 재생 완충액(B)으로 재생되었다. 상기 관통류 분획물에 있어서는 엔도톡신이 검출되지 않았다. 즉 상기 엔도톡신 불순물은 상기 세가지 실험 모두 완전히 제거될 수 있었다.

실시예 10: 비오티닐화된 p12의 자기 스트렙타비딘 비드에의 비특이 결합

p12(PBS, 0.05% Tween20에서 3mg/ml)는 설포-NHS-LC-LC-비오틴(Pierce)과 함께 1:10 내지 1:20의 비율로 1시간동안 RT에서 배양된 후, 완충액(예를 들어, PBS 또는 20mM 헤페스, 150mM NaCl, 5mM EDTA, pH 7.5)에 대하여 투석되었다. 이로써 NHS-활성화 비오틴은 p12의 1차 아미노기에 결합한다. 그 다음, 50μl 비오티닐화된 p12(1mg/ml)이 1ml 스트렙타비딘 비드(MagPrep 스트렙타비딘 비드, Merck)에 가해져 실온에서 2시간동안 교반된 후, 과잉 p12는 1.5ml 20mM 트리스, 10mM EDTA, pH 7.5로 4회 세척되어 제거되었다.

상기 엔도톡신 제거는 완충액(20mM 헤페스, 150mM NaCl, pH 7.5) 및 단백질 용액(0.1mg/ml BSA, 0.1mg/ml 라이소자임, 20mM 헤페스 중 0.1mg/ml 탄산 탈수소효소, 150mM NaCl, pH 7.5)으로 테스트되었다. 상기 완충액, 상기 BSA 및 상기 라이소자임 용액에는 5EU/ml(E. coli O55:B5로부터의 엔도톡신, Charles-River Endosafe, Charleston, USA)가 가해졌다. 상기 탄산 탈수소효소 용액은 대략 1EU/ml을 함유하였다. 고정화된 p12와 함께 25μl 자기비드는 200μl 완충액 또는 단백질 용액에 가해져 피펫을 상하로 흔들어 혼합되었고, 실온에서 30분간 배양되었다. 상기 비드는 자석에 의하여 상기 용액으로부터 제거되었고 상기 잔류물은 피펫으로 제거되었다. 그리고, 미처리된 시료 및 비드와 함께 배양된 시료의 엔도톡신 함량을 LAL 테스트로 결정하였고, 상기 단백질 회수는 280nm에서 흡수측정으로 결정되었다. 상기 엔도톡신은 실질적으로 완전히 상기 완충액으로부터 제거될 수 있었고(99.9% 엔도톡신 제거, 도 4A), 상기 엔도톡신은 상기 단백질 용액으로부터 70 내지 92%로 제거되었다(도 4B). 상기 단백질 회수는 57 내지 99%의 범위였다(BSA: 87%, 탄산 탈수소효소: 99%, 라이소자임: 57%; 도 4B).

실시예 11: 비오티닐화된 p12의 고정화된 스트렙타비딘에의 비특이 결합

p12(PBS, 0.05% Tween20 중 3mg/ml)는 설포-NHS-LC-LC-비오틴(Pierce)과 함께 1:10 내지 1:20의 비율로 1시간동안 RT에서 배양된 후, 완충액(예를 들어, PBS 또는 20mM 헤페스, 150mM NaCl, 5mM EDTA, pH 7.5)에 대하여 투석되었다. 이로써 NHS-활성화 비오틴은 p12의 1차 아미노기에 결합한다. 그 다음, 상기 비오티닐화된 p12가 스트렙타비딘(ImmunoPure immobilised streptavidin: 6% 가교된 아가로스 비드)을 지닌 크로마토그래피 물질과 함께 실온에서 1시간동안 배양되었고, 과잉 p12는 PBS로 세척하여 제거되었다.

상기 엔도톡신 제거는 완충액(20mM 트리스, 150mM NaCl, pH 8.0) 및 BSA(20mM 트리스 중 0.5mg/ml, 150mM NaCl, pH 8.0)으로 테스트되었다. 각 1ml 완충액 또는 BSA 용액에는 10EU/ml와 50μl p12 아가로스를 가하여, 실온에서 1시간동안 교반하였다. 그 후, 상기 p12 아가로스는 원심분리되고 그 잔류물에서의 상기 엔도톡신 농도 및 상기 단백질 농도가 측정되었다. 99% 엔도톡신이 상기 완충액으로부터 제거될 수 있었고 86%가 BSA 용액으로부터 제거될 수 있었다(도 5). BSA는 90%까지 회수되었다.

실시예 12: 표면 플라스몬 공진 측정에 의한 p12 엔도톡신 결합을 통한 테스트

외부 세포막의 리포다당체를 통한 p12의 엔도톡신 또는 박테리아에의 결합은 표면 플라스몬 공명측정(Biacore J)에 의하여 측정된다. 해리정수(K_d)를 결정하기 위하여 E. coli O55:B5 (Sigma)로부터의 엔도톡신이 제조자의 설명서에 따라 소수성 HPA 칩에 고정화되었고, p12가 여러 농도로 주입되었다(도 6A). 결합은 상대적인 "반응단위"(RU)로 측정되고 상기 평형화값은 해당 p12 농도에따라 도시되었다(도 6B). 랑뮤어 흡착 등온식 (RU = (RU_max*[p12])/([p12]+K_d))를 상기 데이터에 적용하면, K_d값이 결정된다(표 1). 엔도톡신 없는 완충액이 상기 측정에 사용되었다. 10^-7 내지 10^-9M 범위의 K_d값이 6 내지 10 범위의 pH값으로 결정되었다(표 1). 1mM 또는 5mM EDTA를 주입함에 의하여 상기 결합이 다시 끊어졌고 상기 칩은 재생되었다.

표 1 용액의 pH값에 대한 p12에서의 엔도톡신의 해리정수

pH	K_d
6.00	3.09E-07
7.50	6.85E-08
8.00	5.86E-08
8.50	7.86E-08
9.00	3.29E-08
10.00	1.55E-07

박테리아의 p12에의 결합을 테스트하기 위하여, 비오티닐화된 p12가 스트렙타비딘 칩에 고정화되었고 다양한 E. coli 균주가 주입되었다. 상기 박테리아는 측정을 위하여 PBS에 흡수되었다. 여러 다당체 요소와 함께 리포다당체를 가지는 E. coli 균주가 사용되었다. 상기 다당체 부분은 지질 A와 소위 O항원에 가교되는 "코아" 영역을 포함한다. 상기 O항원은 여러 종류의 박테리아 및 박테리아 균주 사이에서 매우 잘 변이하는 반면에, 그 "코아" 영역은 매우 잘 보존되어있다. 상기 "코아" 영역과 O항원을 가지는 균주(예를 들어, E. coli) 및 완전한 "코아" 영역을 가지는 균주(예를 들어, E. coli D21)는 p12에 의해 결합되는 반면에, 매우 단축된 "코아" 영역을 가지는 균주(예를 들어, E. coli D21f2)는 더 이상 p12에 의해 탐색되지 아니한다(도 6c). 상기 결합은 EDTA(5mM)에 의해 다시 끊어질 수 있었고 상기 칩은 재생될 수 있었다.

실시예 13: 재조합 p12 구조체

1. N-말단 스트렙-태그를 지니는 p12 구조체(N-스트렙-p12): PCR에 의하여 상기 스트렙-태그의 염기서열(미국특허 제 5,506,121호)이 T4p12 유전자의 5'말단에 도입되었다. 이를 위하여, 시발체는 p12 유전자(5' -GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3'), (SEQ ID NO:1)의 5' 말단에 대해 구성되었는데, 상기 시발체는 상기 5' 말단에 상기 스트렙-태그의 염기서열을 포함하고(상기 서열 중 이탤릭체 부분), 상기 우측 해독 그리드에 있는 상기 유전자가 상기 발현 플라스미드에 삽입될 수 있도록 제한 계면(NdeI, 밑줄친 부분)을 가진다. p12 유전자의 3' 말단에 대해 상기 p12 유전자 뒤에 BamH I 제한계면(상기 서열 중 이탤릭체 부분)(5' -ACG CGC AAA GCT TGT CGA CGG ATC CTA TCA TTC TTT TAC CTT AAT TAT GTA GTT-3'), (SEQ ID NO:2)을 도입하는 시발체가 구성되었다. PCR은 40 사이클로 행하여졌다(95℃ 1분, 45℃ 1분, 72℃ 1분). 상기 PCR 배치는 상기 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 및 BamHI로 절단되며, 아가로스 겔을 통한 크기 분획 및 상기 겔로부터의 용출 후에 상기 원하는 단편이 상기 발현 플라스미드 pET21a의 NdeI 및 BamHI 사이트로 삽입되었다. 상기 N-스트렙-p12 유전자의 서열은 DNA 시퀀싱을 통하여 정확도가 조사되었다. 상기 플라스미드 pNS-T4p12p57에 대한 기타 공정은 Burda, M.R. & Miller, S. (Eur J Biochem.1999 265 (2), 771-778)가 T4p12p57에 대하여 기술한대로 행하였다. 그리고, 상기 플라스미드 pNS-T4p12p57는 발현 균주 BL21(DE3)로 형질전환되었다.

2. N-스트렙-p12 (N-스트렙-S3C-p12 및 N-스트렙-S14C-p12)에 있어서 N-말단 시스테인기의 삽입: N-말단 시스테인기의 삽입은 상기 1에서 기재된 바와 같이 행하여졌으며, 5' 말단에 대해 새로운 2개의 시발체가 이를 위하여 구성되었다. 상기 N-스트렙-S3C-p12에 대하여 시발체 5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT TGT TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC AGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3' (SEQ ID NO:3)가 사용되었고, 상기 N-스트렙-S14C-p12에 대하여 시발체 5'-GAA GGA ACT AGT CAT ATG GCT AGC TGG AGC CAC CCG CAG TTC GAA AAA GGC GCC TGT AAT AAT ACA TAT CAA CAC GTT-3' (SEQ ID NO:4)가 사용되었다.

3. N-스트렙-p12 단백질의 정제: 상기 플라스미드 pNS-T4p12p57를 지니는 E. coli 균주 BL21(DE3)은 2l 혼합배지(임피실린 100μg/ml LB배지)에서 37℃에서 0.5 내지 0.7의 OD600까지 되었고, 상기 N-스트렙-p12-단백질의 발현이 1mM IPTG(이소프로필-β-갈락토피라노시드)의 첨가로 유도되었다. 4시간동안 37℃에서 배양된 후, 상기 세포들이 수집되었다. 10l 배지로부터 수집된 세포들은 50ml 인산나트륨, 20mM pH 7.2, 2mM MgSO₄, 0.1M NaCl에서 수용되어 프렌치 가압기 처리(20,000psi)로 3회 파괴한 후, 15,000rpm로 30분간 원심분리(SS34)하였다. 동일한 완충액으로 2회 세척한 후, 상기 N-스트렙-p12 단백질이 상기 펠렛으로부터 추출되었고, 상기 펠렛은 40mM 트리스HCl pH 8.0, 10mM EDTA에서 30분간 교반에 의하여 3회 추출되었으며, 상기 배치는 15,000rpm으로 30분간 원심분리(SS34)되었고 상기 용해된 NS-p12는 4℃에서 잔류물에 보관되었다. 상기 추출은 2회 반복하여 상기 결합된 잔류물은 스트렙Tactin 친화성 컬럼(15ml)에 가하고(IBA GmbH Gottingen), 완충액 "W"(100mM 트리스HCl pH 8, 1mM EDTA, 150mM NaCl)로 평형화되었다. 완충액 "W"의 5배 컬럼 분량으로 세척한 후, 완충액 "W"에서 2.5mM 디시오비오틴과 함께 완충액 "W"의 3배 분량으로 용출이 행해졌다. 완충액 "W"에 대한 복수의 투석과 농축 후에, N-스트렙-T4p12의 농도 및 순도가 SDS-PAGE 및 UV 분광법(Burda et al. 1999)에 의해 결정되었다. 이로써 10리터 배지로부터 대략 100mg N-스트렙-T4p12가 정제되었다.

명칭	태그 서열
Nstrep-p12	MASWSHPQFEKGAS	SEQ ID NO: 5
Nstrep-p12-S3C	MACWSHPQFEKGAS	SEQ ID NO: 6
Nstrep-p12-S14C	MASWSHPQFEKGAC	SEQ ID NO: 7

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 엔도톡신의 적절한 검출 및 정제방법을 제공하여 여러 적용에 유리하다.

SEQUENCE LISTING <110> PROFOS AG <120> Method for detecting and for removing endotxtin <130> PRO-008 PCT/nat. <140> PCT/DE2003/002096 <141> 2003-06-24 <150> DE 102 28 133.5 <151> 2002-06-24 <150> DE 103 07 793.6 <151> 2003-02-24 <160> 8 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 78 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer <400> 1 gaaggaacta gtcatatggc tagctggagc cacccgcagt tcgaaaaagg cgccagtaat 60 aatacatatc aacacgtt 78 <210> 2 <211> 54 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer <400> 2 acgcgcaaag cttgtcgacg gatcctatca ttcttttacc ttaattatgt agtt 54 <210> 3 <211> 78 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer <400> 3 gaaggaacta gtcatatggc ttgttggagc cacccgcagt tcgaaaaagg cgccagtaat 60 aatacatatc aacacgtt 78 <210> 4 <211> 78 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer <400> 4 gaaggaacta gtcatatggc tagctggagc cacccgcagt tcgaaaaagg cgcctgtaat 60 aatacatatc aacacgtt 78 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Tag for targeted Biotinylation <400> 5 Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ser Asn Asn 1 5 10 15 Thr Tyr Gln <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Tag for targeted Biotinylation <400> 6 Met Ala Cys Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ser Asn Asn 1 5 10 15 Thr Tyr Gln <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Tag for targeted Biotinylation <400> 7 Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Cys Asn Asn 1 5 10 15 Thr Tyr Gln <210> 8 <211> 539 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> P12 with a tag for targeted Biotinylation <400> 8 Met Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ser Asn Asn 1 5 10 15 Thr Tyr Gln His Val Ser Asn Glu Ser Arg Tyr Val Lys Phe Asp Pro 20 25 30 Thr Asp Thr Asn Phe Pro Pro Glu Ile Thr Asp Val Gln Ala Ala Ile 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Pro Ala Gly Val Asn Gly Val Pro Asp Ala Ser Ser 50 55 60 Thr Thr Lys Gly Ile Leu Phe Leu Ala Thr Glu Gln Glu Val Ile Asp 65 70 75 80 Gly Thr Asn Asn Thr Lys Ala Val Thr Pro Ala Thr Leu Ala Thr Arg 85 90 95 Leu Ser Tyr Pro Asn Ala Thr Glu Ala Val Tyr Gly Leu Thr Arg Tyr 100 105 110 Ser Thr Asp Asp Glu Ala Ile Ala Gly Val Asn Asn Glu Ser Ser Ile 115 120 125 Thr Pro Ala Lys Phe Thr Val Ala Leu Asn Asn Val Phe Glu Thr Arg 130 135 140 Val Ser Thr Glu Ser Ser Asn Gly Val Ile Lys Ile Ser Ser Leu Pro 145 150 155 160 Gln Ala Leu Ala Gly Ala Asp Asp Thr Thr Ala Met Thr Pro Leu Lys 165 170 175 Thr Gln Gln Leu Ala Val Lys Leu Ile Ala Gln Ile Ala Pro Ser Lys 180 185 190 Asn Ala Ala Thr Glu Ser Glu Gln Gly Val Ile Gln Leu Ala Thr Val 195 200 205 Ala Gln Ala Arg Gln Gly Thr Leu Arg Glu Gly Tyr Ala Ile Ser Pro 210 215 220 Tyr Thr Phe Met Asn Ser Thr Ala Thr Glu Glu Tyr Lys Gly Val Ile 225 230 235 240 Lys Leu Gly Thr Gln Ser Glu Val Asn Ser Asn Asn Ala Ser Val Ala 245 250 255 Val Thr Gly Ala Thr Leu Asn Gly Arg Gly Ser Thr Thr Ser Met Arg 260 265 270 Gly Val Val Lys Leu Thr Thr Thr Ala Gly Ser Gln Ser Gly Gly Asp 275 280 285 Ala Ser Ser Ala Leu Ala Trp Asn Ala Asp Val Ile His Gln Arg Gly 290 295 300 Gly Gln Thr Ile Asn Gly Thr Leu Arg Ile Asn Asn Thr Leu Thr Ile 305 310 315 320 Ala Ser Gly Gly Ala Asn Ile Thr Gly Thr Val Asn Met Thr Gly Gly 325 330 335 Tyr Ile Gln Gly Lys Arg Val Val Thr Gln Asn Glu Ile Asp Arg Thr 340 345 350 Ile Pro Val Gly Ala Ile Met Met Trp Ala Ala Asp Ser Leu Pro Ser 355 360 365 Asp Ala Trp Arg Phe Cys His Gly Gly Thr Val Ser Ala Ser Asp Cys 370 375 380 Pro Leu Tyr Ala Ser Arg Ile Gly Thr Arg Tyr Gly Gly Ser Ser Ser 385 390 395 400 Asn Pro Gly Leu Pro Asp Met Arg Gly Leu Phe Val Arg Gly Ser Gly 405 410 415 Arg Gly Ser His Leu Thr Asn Pro Asn Val Asn Gly Asn Asp Gln Phe 420 425 430 Gly Lys Pro Arg Leu Gly Val Gly Cys Thr Gly Gly Tyr Val Gly Glu 435 440 445 Val Gln Lys Gln Gln Met Ser Tyr His Lys His Ala Gly Gly Phe Gly 450 455 460 Glu Tyr Asp Asp Ser Gly Ala Phe Gly Asn Thr Arg Arg Ser Asn Phe 465 470 475 480 Val Gly Thr Arg Lys Gly Leu Asp Trp Asp Asn Arg Ser Tyr Phe Thr 485 490 495 Asn Asp Gly Tyr Glu Ile Asp Pro Ala Ser Gln Arg Asn Ser Arg Tyr 500 505 510 Thr Leu Asn Arg Pro Glu Leu Ile Gly Asn Glu Thr Arg Pro Trp Asn 515 520 525 Ile Ser Leu Asn Tyr Ile Ile Lys Val Lys Glu 530 535

Claims

엔도톡신을 검출하는 방법에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계들로 구성됨을 특징으로 하는 엔도톡신의 검출방법.

a) 박테리오파지 미부 단백질과 시료를 배양하는 단계,

b) 박테리오파지 미부 단백질에 결합된 엔도톡신을 검출하는 단계.
제 1항에 있어서, 상기 방법은 a)단계 이후와 b)단계 이전에

a') 상기 시료로부터 상기 박테리오파지 미부 단백질-엔도톡신 복합체를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 검출은 분광법에 의하여 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
시료로부터 엔도톡신을 제거하는 방법에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계로 구성됨을 특징으로 하는 엔도톡신 제거방법.

a) 상기 시료를 비특이적으로 또는 지향적으로 영구 캐리어에 고정화된 박테리오파지 미부 단백질과 함께 배양하거나 또는 이에 접촉시키는 단계,

b) 상기 시료로부터 상기 박테리오파지 미부 단백질-엔도톡신 복합체를 분리하는 단계.
제 4항에 있어서, 상기 a) 및 b) 단계는 크로마토그래피 컬럼 관통류법으로 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 영구 캐리어는 여과 매질, 글래스 입자, 자기입자, 원심 물질, 침강 물질 또는 크로마토그래피 컬럼용 충진 물질로 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리오파지 미부 단백질은 결합군들을 통하여 상기 영구 캐리어에 고정화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 결합군은 렉틴, 수용체, 안티칼린으로 되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7항에 있어서, 상기 결합군은 스트렙타비딘 또는 아비딘으로 되고, 상기 박테리오파지 미부 단백질은 비오틴 또는 스트렙-태그와 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리오파지 미부 단백질은 화학적 결합을 통하여 이중결합적으로 상기 영구 캐리어에 고정화되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리오파지 미부 단백질은 스트렙-태그 또는 히스-태그를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항에 있어서, 상기 태그는 SEQ ID NO. 5, 6, 7에 의한 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 상기 파지 T4의 p12 단백질은 박테리오파지 미부 단백질로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양에서의 Ca²⁺농도는 0.1μM 내지 10mM이고, Mg²⁺농도는 0.1μM 내지 10mM인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 엔도톡신은 박테리오파지 미부 단백질과의 결합으로부터 제거되고, 이어서 상기 표적 엔도톡신이 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.