CN104498375B - 一株具有内毒素吸附特性的耶氏酵母及其吸附特性研究方法 - Google Patents

一株具有内毒素吸附特性的耶氏酵母及其吸附特性研究方法 Download PDF

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Abstract

一株具有内毒素吸附特性的耶氏酵母及其吸附特性研究方法，属于酵母菌属的内毒素吸附潜能探究技术领域。本发明公开了一株具有强内毒素吸附特性的食品来源菌株，耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica) SCPW20，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2014528。其鉴定结果为耶氏酵母菌属，且与解脂耶氏酵母标准菌株Yarrowia lipolytica CLIB122的表型相似，拓展了酵母菌属在内毒素去除或治疗领域中的应用潜能。而且，相较于益生菌而言，作为简单真核生物的酵母菌，具有接近高等真核生物研究的优势，该内毒素吸附菌株在吸附特性研究方面具有更广泛的研究价值，拓展了内毒素吸附菌剂的开发应用，更有益于促进内毒素引发的相关疾病研究。

Description

一株具有内毒素吸附特性的耶氏酵母及其吸附特性研究方法
技术领域
本发明涉及一株具有内毒素吸附特性的耶氏酵母及其吸附特性研究方法，其中一株具有强内毒素吸附特性的耶氏酵母菌，是一种具有内毒素去除应用潜能的食品来源菌，而且该吸附特性具有一定的研究价值。属于酵母菌属的内毒素吸附潜能探究技术领域。
背景技术
内毒素（即LPS）是存在于大多数革兰氏阴性菌外膜的主要组成部分，可通过激活宿主细胞内TLR4受体信号转导途径等，促进炎性细胞分泌多种细胞因子，进而引发强烈的免疫反应，造成疾病或者死亡。鉴于携带内毒素的细菌可能从工厂生产线上分离出来，医学临床样本中也普遍存在，如脑脊液，骨髓，血液等，因而是否能有效地清除内毒素或破坏其活性成分，已成为内毒素污染治理或治疗内毒素血症的重要所在，主要涉及内毒素吸附研究等。
内毒素吸附研究主要包括内毒素吸附介质或材料的临床应用探究，以及内毒素吸附菌剂的开发应用等。目前已有研究发现具有内毒素吸附特性的益生菌，如乳酸菌、双歧杆菌等，而且双歧杆菌属制剂已应用于内毒素相关疾病的临床治疗中。一般采用流式细胞术筛选内毒素吸附菌，其具有简单快速的特点，但是其高灵敏度的特点可能会造成假阳性结果，往往需要对内毒素含量进行定量分析以进一步确定。此外，也还少有内毒素吸附菌这一特性的直观观察与探索研究，以及其它类别的内毒素吸附菌属研究报道，而这些可能对内毒素吸附菌剂的开发应用更具指导意义。
发明内容
本发明目的是提供一种能够高效吸附内毒素的耶氏酵母菌，以及该菌株的内毒素吸附特性具有哪些特点以及应用潜能。
本发明要解决的技术问题是寻找一种更直观地观察耶氏酵母菌的内毒素吸附特性的方法，以此探究该特性的应用潜能。
为解决上述技术问题，本发明借鉴免疫细胞体系下的内毒素荧光示踪法，建立酵母菌与荧光素标记内毒素（FITC-LPS）的孵育反应体系，在内毒素含量变化分析的基础上，观察耶氏酵母菌的内毒素吸附现象，并进行内毒素浓度、菌株活性、外力作用等方面影响的探究。
本发明的技术方案：一株具有内毒素吸附特性的酵母菌，其分类命名为耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica) SCPW20，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2014528。
所述的耶氏酵母菌CCTCC NO:M 2014528的内毒素吸附特性的初步鉴定方法，以内毒素特有的KDO基团的含量作为内毒素含量的表征，根据内毒素与耶氏酵母菌孵育体系中的内毒素含量降低比例计算耶氏酵母菌的内毒素吸附率，并以酿酒酵母菌作为低内毒素吸附菌株对照。
所述的耶氏酵母菌CCTCC NO:M 2014528的内毒素吸附现象的直观观察方法，利用荧光素标记内毒素与耶氏酵母菌CCTCC NO:M 2014528进行孵育反应，30℃孵育30 min后，用指甲油封片孵育反应液，在激光共聚焦显微镜下观察到荧光信号明显聚集于耶氏酵母菌细胞周围的现象，而作为阴性对照的酿酒酵母菌实验组则无此现象。
所述的耶氏酵母菌的内毒素吸附现象具有一定的专一性，即一株标准菌株Yarrowia lipolytica CLIB122（Zhao H, et al. Cloning, expression andcharacterization of a new lipase from Yarrowia lipolytica[J]. Biotechnologyletters, 2011, 33(12): 2445-2452.）表现出相似的特性，而且该吸附特性与酵母细胞的活性有一定联系，此外离心作用对该吸附特性的影响不大。
所述的研究表明，耶氏酵母菌的内毒素吸附特性极可能与其表面的某种特殊物质有关，而且菌株活性降低或死亡不会影响体外体系中内毒素的去除效果，因此探究酵母菌的这种内毒素吸附或降解作用，将更具研究价值，而开发酵母菌剂在内毒素血症治疗方面的应用也更具现实意义。
内毒素吸附特性分析方法：
KDO（2-酮基-3-脱氧辛酸）定量检测：KDO基团作为内毒素的特殊结构之一，其含量可以表征内毒素的含量。分别取10 μL 孵育初始和结束后的反应液上清，加入1 mL 0.2 MH2SO4，100℃水浴30 min；待冷却至室温后，12000 rpm离心5 min；转移0.5 mL上相至新的离心管中，加入0.25 mL 0.04 M HIO4（溶于0.125 M H2SO4），混合并室温放置20 min；继续加入0.25 mL 2.6% NaAsO2（溶于0.5 M HCl，w/v），震荡并室温放置至棕红色消失；继续加入0.5 mL 0.6%硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid），震荡混匀后，100℃水浴15 min；趁热继续加入1 mL二甲基亚砜（DMSO），冷却至室温后，548 nm下测定终溶液的吸光值（以同样处理条件下，不含KDO的PBS为空白对照组，进行调零）。由于吸光值的大小与KDO含量成正比，因而吸光值的相对大小可以表征内毒素含量的相对高低。根据同一批实验下，孵育初始与结束后的反应液上清所测得的吸光值变化，可以计算出与内毒素孵育反应后酵母菌的内毒素降低水平。
FITC-LPS示踪观察：收集新鲜的对数前期耶氏酵母细胞培养液（OD600=1.0~2.0），PBS（pH 7.4）清洗菌泥2~3次后，制成PBS菌悬液待用；混合FITC-LPS母液（1 mg/mL，溶于PBS）与耶氏酵母菌悬液，制成耶氏酵母菌浓一定（OD600=3.0~4.0），FITC-LPS浓度不定（20~500 μg/mL）的系列反应液，30℃孵育反应20~30 min后，取8 μL反应液制片，并用指甲油封片；在激光共聚焦显微镜下，采用480 nm激发波长和530 nm检测波长观察荧光信号的分布情况。
本发明的有益效果：本发明提供的内毒素吸附菌株在吸附特性研究方面具有更广泛的研究价值，拓展了内毒素吸附菌剂的开发应用，在治疗内毒素血症方面更具有指导意义。
生物材料样品保藏：本发明涉及的一株具有内毒素吸附特性的酵母菌，其分类命名为耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica) SCPW20，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2014528，保藏日期2014年10月29日。
附图说明
图1 菌株SCPW20、CLIB122和BY4742的内毒素吸附特性分析。采用KDO定量法检测不同菌株与内毒素孵育反应体系中的内毒素含量降低比例。
图2 菌株SCPW20和CLIB122的细胞存活率变化。
具体实施方式
实施例1 内毒素吸附菌株的筛选
挑选从发酵食品中分离出的系列单菌落培养物，液体培养至对数前期，用PBS清洗菌泥2~3次后，制成OD600≈4.0的PBS菌悬液待用。选用Sigma公司E. coli O111:B4来源LPS，制成浓度为2 mg/mL LPS的PBS母液待用。取LPS母液与菌悬液混合，制成LPS初始浓度为1mg/mL，细胞浓度为OD600≈2.0的反应体系，30℃孵育反应30 min后，离心取上清进行KDO定量检测。其中，以仅含菌体反应液上清作为空白对照，计算分析菌株的内毒素降低水平。成功筛选出一株内毒素降低水平高达65%的菌株（图1），并通过初步的菌落形态与显微镜观察鉴定为耶氏酵母菌SCPW20。
实施例2 内毒素吸附特性菌株的18S rDNA鉴定
以待鉴定菌株的基因组为模版，使用常规酵母18S rDNA鉴定引物进行18S rDNA序列的PCR扩增，1% 琼脂糖凝胶电泳检测并回收扩增产物后，由上海生工生物工程公司完成测序工作，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1。将测序结果导入NCBI数据库，进行Blast序列比对分析，得出序列覆盖率最高的酵母菌为解脂耶氏酵母，鉴定为耶氏酵母种属，并命名为Yarrowia lipolytica SCPW20，保藏于中国典型培养物保藏中心。
实施例3 菌株SCPW20的内毒素吸附特性分析
1、KDO定量分析不同酵母菌株的内毒素降低水平差异
另选取一株解脂耶氏酵母标准菌株Yarrowia lipolytica CLIB122，以实验室常用酵母标准菌株Saccharomyces cerevisiae BY4742作为对照，通过KDO定量分析比较三株菌的内毒素降低水平，可以看出两株耶氏酵母菌均表现出较高的内毒素降低水平，酿酒酵母菌的内毒素降低水平则不明显（结果如图1）。
2、荧光示踪法观察不同酵母菌株的内毒素吸附现象
同样选用Sigma公司E. coli O111:B4来源FITC-LPS，制成约1 mg/mL的PBS母液，并进行适当稀释备用。向待考察的新鲜菌悬液中加入一定量FITC-LPS母液，制成FITC-LPS初始浓度为100 μg/mL，细胞浓度约为OD600=4.0的反应体系，孵育反应后制片观察荧光信号分布情况。可以看到两株耶氏酵母细胞膜壁上均表现出明显的荧光信号聚集现象，形成特殊的荧光包被细胞膜壁的结构；而酿酒酵母孵育体系中的荧光信号则分散于细胞周围的液体环境中，没有形成荧光包围结构。推测耶氏酵母细胞表面可能具有特异性吸附LPS的结构组成，且这种特异性吸附增强了耶氏酵母降低内毒素含量的能力。
3、菌株SCPW20的内毒素吸附特性分析
选取含不同浓度FITC-LPS（50 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL）的反应体系，观察菌株SCPW20吸附内毒素的现象是否具有饱和特征。可以看出随着FITC-LPS添加浓度的增加，荧光包被结构的信号强度逐渐增强；且在达到一定浓度后，细胞周围的液体环境中才表现出明显的荧光信号，因而推测菌株SCPW20细胞表面的荧光信号聚集行为是随着FITC-LPS浓度的增加而趋近于饱和的。
此外，当菌株细胞活性丧失或死亡时，孵育反应过程中菌株可作为接纳FITC-LPS的“载体”，细胞整体都呈现出荧光状态；而且离心处理的正常菌株细胞孵育反应液中，仍可观察到明显的荧光包被细胞膜壁的结构，说明耶氏酵母细胞的这种内毒素吸附特性具有一定的生物活性以及结构稳定性。
实施例4 菌株SCPW20和CLIB122的细胞存活率分析
离心分离菌株与内毒素的孵育反应液（LPS初始浓度为1 mg/mL），尽量去除反应液上清中的LPS，并避免菌体损失；重新制成PBS菌悬液后，进行10倍梯度稀释，并从不同梯度稀释样液中，取10 μL涂布或点样于YPD固体平板培养基上，并保证每组数据至少设置三个平行样；30℃培养2~3天，记录比较与LPS的孵育反应对菌株的细胞存活率影响，可以看出菌株SCPW20和CLIB122的细胞存活率变化均不明显（结果如图2）。
虽然本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
<160> SEQ ID NO.1
<170> PatentIn version SCPW20
<210> 1
<211> 401
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18S rDNA序列，用于菌种鉴定
<400> 1
gagctgctca tcagctcata gcgtatatta atgttgttgc agttaaaaag ctcgtagttg 60
aaattgggcg ggctattagt ttaggccgct tcaggaagaa cttcttccag ttactttgaa 120
aaaattagag tgttcaacgc aggtttcgcc tgaatatatt agcatggaat aacataacac 180
gacgagggtc cattttgttg gcttgcaaac ccacgtaatg attaataggg acagtcgggg 240
gcgtcagtat tgtgttgtca gaggtgaaat tcttggattt acacaagact aactactgcg 300
aaggcattcg ccaaggatgt attcattaat caagaacgaa agttagggga tcaaagatga 360
tcagataccg tcgtagtctt aaccgtaaac tatgccgcaa g 401

Claims (1)

1.一株具有内毒素吸附特性的酵母菌在制备内毒素吸附菌剂中的应用，其特征在于所述酵母菌分类命名为耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica) SCPW20，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2014528。
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