CN105199961B - 一种锐顶镰孢菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种锐顶镰孢菌及其应用，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：武汉大学内；保藏日期：2014年12月30日；保藏编号CCTCC NO：M2014678。该菌株具有对苏丹红染料的吸附和降解双重作用，研究发现，当在无机盐培养基上添加5％乳糖时，降解效果最明显，28℃培养7d，降解率达到93.72％，作为开发新的生物菌剂，该菌都具有很好的应用前景。

Description

一种锐顶镰孢菌及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种锐顶镰孢菌及其应用。

背景技术

植物内生真菌是一类重要的微生物资源，在新药开发、植物物种保护及与宿主互作等方面具有重要的商业和科学价值。目前关于细菌对水溶性偶氮类染料的生物降解已经有诸多报道，但针对非水溶性偶氮类染料的生物降解相关研究较少。

苏丹红是一类人工合成的化学染料，为非水溶性偶氮类化合物，被广泛应用于溶解剂、机油、蜡、橡胶、鞋油以及纺织品、化妆品等中的着色剂。苏丹红Ⅰ由于被添加在咸鸭蛋、辣椒油等食品中有潜在的致癌危害，而引起了广泛的社会关注。研究表明苏丹红Ⅰ进入人体后会被肠道微生物的还原酶以及肝脏组织和细胞质内的还原酶代谢成相应的苯胺类物质，这些苯胺类物质具有强烈的致突变性和致癌性，同时苏丹红类染料工业化的应用也会导致土壤和城市水体中偶氮类化合物的积累，并随着食物链浓缩对人和动物造成直接的危害。目前有关水溶性偶氮染料的在厌氧条件下的生物降解已经有了大量报道，在染料废水的脱色和无害化处理中显示出重要的作用，但生物降解非水溶性偶氮类染料的研究较少，因而寻找具有降解苏丹红染料的微生物对于解除由于人体和禽类代谢苏丹红有毒中间代谢产物的积累、明确非水溶性偶氮类染料脱色和降解的新的代谢途径，在有氧条件下降低此类染料的工业应用给环境带来的污染具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种锐顶镰孢菌及其用于降解苏丹红Ⅰ的用途。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种锐顶镰孢菌Fusarium tricinctum B23，该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：武汉大学内；保藏日期：2014年12月30日；保藏编号CCTCC NO：M2014678。

所述的锐顶镰孢菌培养形态为在PDA培养基上28℃培养，气生菌丝茂盛，棉絮状，前期为白色，略带淡紫色，后期菌落部分菌丝变黄，菌落后面呈红褐色环状。

所述的锐顶镰孢菌是分离自七叶一枝花的内生真菌。

本发明还包括以锐顶镰孢菌为活性成分的生物菌剂，该菌剂中根据需要可包含本领域常规的载体和辅料。

本发明还提供了锐顶镰孢菌用于降解苏丹红Ⅰ的用途。降解培养基为：乳糖5g/l，K₂HPO₄1.5g/l，KH₂PO₄0.5g/l，NaCl 0.5g/l，MgSO₄0.06g/l，FeSO₄0.003g/l，(NH4)₂SO₄1g/l，苏丹红Ⅰ浓度为10μg/ml，降解温度为28℃，降解时间为9d。

本发明还包括以锐顶镰孢菌为活性成分的生物菌剂用于降解苏丹红Ⅰ的用途。

本发明的有益效果为提供了一种来自于七叶一枝花的内生真菌锐顶镰孢菌，该菌株具有对苏丹红染料的吸附和降解双重作用，研究发现，当在无机盐培养基上添加5％乳糖时，降解效果最明显，28℃培养7d，降解率达到93.72％。

附图说明

图1是B23对不同浓度苏丹红I的降解结果；

图2是B23在不同浓度苏丹红I条件下的菌丝生长曲线；

图3是B23在不同浓度苏丹红I条件下的降解曲线；

图4是B23降解谱实验结果；

图5是20℃不同PH条件下菌丝的生长曲线；

图6是20℃不同PH条件下菌丝的水解曲线；

图7是24℃不同PH条件下菌丝的生长曲线；

图8是24℃不同PH条件下菌丝的水解曲线；

图9是28℃不同PH条件下菌丝的生长曲线；

图10是28℃不同PH条件下菌丝的水解曲线；

图11是32℃不同PH条件下菌丝的生长曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1锐顶镰孢菌的分离与鉴定

一、分离

剪取健康植物样品的茎用清水洗净后，在75％乙醇中浸1min，然后在3.25％的NaOCl中浸泡5min，再次放入75％乙醇中浸30s，最后用无菌水冲洗5次。样品用无菌吸水纸吸干后备用。将最后一次洗涤水吸取50μL分别涂布在PDA平板上，置于28℃培养箱培养3d，观察是否有菌落出现。将表面消毒后的样本接种到PDA双抗培养基上，倒置于28℃温箱培养15d，待各植物组织切面长出菌丝后挑取边缘部分移至新的PDA固体培养基上，经纯化后得内生真菌。最后接种至PDA试管斜面上28℃培养长好后，放于4℃冰箱中备用。

二、鉴定

1、菌落及菌丝特征：

将分离得到的菌株在PDA培养基上28℃培养，气生菌丝茂盛，棉絮状，前期为白色，略带淡紫色，后期菌落部分菌丝变黄，菌落后面呈红褐色环状。

2、rDNA-ITS测定

①样品准备

将分离的植物内生真菌接种于PDA平板，28℃培养4～5天，在转接于250mL锥形瓶中PDB液体培养基中，28℃，150rpm培养4～7天。用纱布过滤获得菌丝，用吸水纸吸干水分后，取适量菌丝于灭菌的研钵中，加液氮研磨成粉末。取研磨后的粉末20mg装于1.5mL离心管中，-20℃保存备用。

②菌丝基因组DNA的提取

采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取：

1)取适量菌丝于预冷的研钵中用液氮研磨成粉末，取20mg加入1.5mL离心管中。加入200μL Buffer Digestion和2μLβ-巯基乙醇，再加入20μL Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。

2)加入100μL Buffer PF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。

3)室温10000rpm离心5min，将上清转移到新的1.5mL离心管中。

4)加入200μL Buffer BD，充分颠倒混匀。

5)加入200μL的无水乙醇，充分颠倒混匀。

6)将吸附柱放回收集管中，用移液器将将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。

7)将吸附柱放回收集管，加入500μL PW Solution，10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。

8)将吸附柱放回收集管，加入500μL Wash Solution，10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。

9)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rpm室温离心2min，去除残留的WashSolution。

10)取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，加入50μL灭菌双蒸水静置3min，12000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。

11)取5μL DNA样品在1％的琼脂糖凝胶上电泳验证。

12)直接用于扩增或在4℃保存。(较长时间保存放在-20℃)。

③ITS序列的扩增：

以基因组DNA为模板，采用真菌一对通用引物。

正向引物ITS5：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，

反向引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

采用即用PCR扩增试剂盒扩增，PCR反应体系(50μL)：Sterilized H₂O 22μL，2×PCR Master 25μL，DNA模板1μL，上下游引物(10μmol/L)各2μL；PCR反应条件：94℃5min，然后94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸90s，35个循环后72℃延伸10min。目的片段的检测与回收：1.2％琼脂糖凝胶电泳，上样5μL，80V，30min。凝胶成像仪检测扩增目的条带。

④PCR产物纯化

采用DNA纯化回收试剂盒

1)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

2)估计PCR反应液的体积，向其中加入等体积溶液PC,充分混匀。

3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12000离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

4)向吸附柱CB2中加入加入600μL漂洗液PW，12000离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

5)重复操作步骤4

6)将吸附柱CB2放回收集管中，12000离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干。

7)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL灭菌双蒸水，室温静置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液。

⑤PCR产物序列测定

纯化的PCR产物直接进行双向测序，由上海生工生物公司测序完成。其中测序引物为ITS1/ITS4，ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

基于以上特征，将菌株鉴定为锐顶镰孢菌，并命名为Fusarium tricinctum B23。该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：武汉大学内；保藏日期：2014年12月30日；保藏编号CCTCC NO：M2014678。

实施例2顶镰孢菌B23对苏丹红I的降解作用

将B23接种到苏丹红I浓度为50、100、150、200、250ug/ml的染料培养基中，以下为该菌在不同苏丹红浓度条件下的降解结果、菌丝生长状况及降解状况。引进两个参数：降解效率μ和生长速率v；μ＝水解圈直径/生长时间，v＝菌丝直径/生长时间。

如图1所示，为B23在不同浓度苏丹红I培养基上培养10天的降解结果，培养基中白色部分为已降解的部分，红色部分为未降解的部分，随着培养基中苏丹红I的浓度呈梯度增加，水解圈明显减小。图2与图3中的菌体生长曲线和水解曲线都趋近于一条直线。从图2中可以看出，随着苏丹红I浓度的逐渐升高，其生长效率v逐渐降低，且降低的幅度逐渐增大，说明苏丹红I对菌丝的生长存在一定的抑制作用，浓度越高，抑制作用越大。在图3中可以看出当苏丹红I浓度为50～150ug/ml时，三个浓度所对应的水解曲线的降解效率μ几乎相等，这说明菌体在单位时间内的降解效率是相同的，由于培养基中单位面积的苏丹红I含量不同，因此在不同浓度的苏丹红I的培养基中观察到同样大小的水解圈所需要的时间会因染料的浓度的升高相应的更长一些。这一特点也可以从图3中水解圈为10mm所对应的生长时间看出。当苏丹红I浓度达到200ug/ml时，其降解速率μ随着浓度的升高而变小，可以得出苏丹红I浓度过高会对B23的降解过程有较大的抑制作用，因此在高浓度条件下，染料浓度越高，其降解速率越慢。从图2和图3中可以得出，在同一苏丹红I浓度下，菌丝的生长速率v与降解速率μ的比值在理论上为定值，因此可以认为菌丝的生长速率与降解速率成正比。

实施例3顶镰孢菌B23对苏丹红I降解条件

1)最适碳源优化结果

由于B-23在无机盐培养基上生长速度过慢，降解时间过长，降解效率比较低，由此我们希望通过外加不同的碳源来测试是否能够提高B-23降解苏丹红的速率，做了碳源的最适种类确定的单因素实验，结果表面如下表1，降解能力用“+”表示，数量越多，降解能力越好，无现象用“-”表示。

表1：碳源单因素实验记录表

在麦芽糖，乳糖，蔗糖，葡萄糖，淀粉五种碳源后，B23在培养基当中旺盛程度依次是：淀粉>麦芽糖>葡萄糖>蔗糖>乳糖。但是苏丹红降解情况并非如生长状况一致，葡萄糖、淀粉、麦芽糖的存在会导致菌体只生长不降解苏丹红。在第三天原培养基开始出现降解趋势，在第五天开始乳糖培养基开始产生降解趋势而其他四种碳源并未有此种现象。当达到第十天时乳糖三个平板都有非常明显的水解圈，其降解圈的直径达到3cm，而无机盐培养基当中的菌落直径不足1.2cm，外加其他糖的平板并未有一个产生了水解圈。

2)最适乳糖浓度确定

已经确定乳糖为最合适的外加碳源，但是乳糖的加入量的选择并没有进行定量测定，并不知道其最适乳糖浓度是多少，并且乳糖的多少回影响菌体对培养基的适应期的长短，因此测定了乳糖浓度的最适浓度，结果如下表2，降解能力用“+”表示，数量越多，降解能力越好，无现象用“-”表示。

表3：乳糖最适浓度确定记录表

B23号菌在不同浓度下生长状况：5％>1％>2％>3％>4％，B23号菌降解情况如生长状况一样，在5％浓度当中，产生的降解圈最大。但是乳糖浓度为5％在初期会导致菌体生长速度比较慢，适应期时间较长，在第七天以前，其降解能力不如浓度较低的条件，但是在后期的结果当中，乳糖的浓度高储备，使得菌体生长，降解的持久能力较强，因此，苏丹红降解培养基中，乳糖浓度选择5％。

3)最适氮源筛选

由于测定了碳源的单因素实验，但是还是不明确氮源是否对B-23降解苏丹红的能力是否有影响，因此对氮源的种类做了单因素实验，通过实验来观察氮源是否具有影响能力。结果如下表3，降解能力用“+”表示，数量越多，降解能力越好，无现象用“-”表示。

表4：最适氮源选择单因素记录表

B23号菌在五种氮源中生长状况：牛肉膏>(NH₄)₂SO₄>NH₄NO₃>蛋白胨>NaNO₃，B23降解情况与生长情况一致。根据初步结果来看，在培养基中选择牛肉膏作为培养基的氮源是最好的选择，其次是硫酸铵。但是事实上在降解后的照片来看，含有牛肉膏，蛋白胨，与硝酸铵的培养基降解的更彻底一些，而含有NH⁴⁺的氮源发现培养基中间会有红色的残留，并不是很彻底。因此使用牛肉膏作为氮源的主要选择，而NaNO₃作为无机盐培养基的主要氮源降解的最后结果会更好一些，虽然在前面一段时间水解能力会稍弱一些。

实施例4顶镰孢菌B23的降解谱实验

根据实施例2中确定的偶氮染料降解的最适浓度50ug/ml，配制该浓度的苏丹红I、II、III、IV及刚果红和甲基红的降解培养基，并接种B23，每种染料接种三个平行。接种后，放入28℃的恒温培养箱中培养，每天观察并记录菌丝的生长及降解状况，证明这三株菌是否为高效广谱的偶氮染料降解菌。

由图4可知，B23能降解苏丹红I、II，甲基红和刚果红，但不能降解苏丹红III、IV。其降解苏丹红I、甲基红和刚果红达到图片中结果所用时间为14天，降解苏丹红II达到图片中结果所花时间为25天。

实施例5温度和PH对降解的影响

实验以温度为不变的因素，改变培养基的PH，即一个温度对应PH 4、5、6、7、8。实验以对比的形式分三批完成。第一批：20℃与24℃不同PH条件下的降解效果对比；第二批：20℃与28℃不同PH条件下的降解效果对比；第三批：32℃不同PH条件下的降解效果。苏丹红I浓度为50ug/m。

1)20℃与24℃实验结果对比

从图5和图6中可以看到菌丝在第5天时，其生长速度和水解速度都有下降的现象，之后又迅速恢复正常的生长速度和水解速度。但从图中的变化来看，降解速率的变化比菌体生长速率的变化要明显，因此可以得出温度的变化对菌体的降解速度有一定的影响，但对菌体的生长影响不大。从图5的生长结果我们可以得出，在20℃条件下PH为6、7时菌体生长速度较快，其次是PH 5、8。从图6的降解结果可以得出，在20℃条件下，PH为6、7、8时降解效果较好。

从图7中可以看到，前8天在PH6的培养基中菌体的生长速度较快，其余PH条件下的生长速度大致较慢，8天后，在PH为7、8条件下培养的菌体仍以之前的生长速度生长，而PH为4、5的菌体生长速度明显变慢。由于是在培养皿上生长，菌丝的生长范围有局限性，因此图中PH6的菌丝直径在10天后直径没有变化，原因是菌体长满了整个平板。从图8中可以看到，生长在PH6、7、8条件下的菌体直到实验结束，其降解速度一直保持恒定；而PH5的菌体降解速度在第8天后开始出现下降。从最终的生长结果和降解结果来看，24℃，PH6、7、8的条件下，生长及降解状况都比较理想。

综合上述结论，无论是20℃还是24℃，其菌丝生长状况以及降解状况比较理想的PH条件都是PH6、7、8。从第12天菌丝直径及水解圈直径的数据结果来看，24℃比20℃的生长及降解效果好。

2)20℃与28℃实验结果对比

从图9中不同PH条件下菌丝的生长曲线可以看出，生长状况较好的是PH7、8，其次是PH6。在图10中的水解曲线看到，某个时候的水解圈突然变小，这是测量误差的原因，但不影响实验结果的观察。从图中仍然可以看出水解效果较好的PH值为6、7、8。

综上所述，无论是20℃还是28℃，菌丝生长以及水解效果较好的PH值为6、7、8。从两个温度最终的菌丝生长及水解数据来看20℃比28℃的效果好。

3)32℃实验结果

由图11结果可说明，菌体在32℃条件下，无论在哪个PH，其生长速度及水解速度都很缓慢，因此32℃不适合菌体生长及染料降解。

因此，经过一系列的分析和对比，菌体最适生长及降解温度是24℃，最适PH范围为6～8。其次，菌体在20℃～28℃温度范围内也表现出较好的生长及降解效果。但PH6～8为灭菌前溶液的PH值，灭菌后溶液的PH值发生的较大的变化，20℃与24℃实验结果对比中溶液灭菌后PH为：3.44、4.73、5.54、6.43、6.79；0℃与28℃实验结果对比中溶液灭菌后PH为：3.63、4.96、5.67、6.05、6.50；32℃实验结果中溶液灭菌后PH为：4.04、4.96、5.55、6.00、6.50。由此可见，菌体生长及水解的最适PH为5.5～6.5。培养基PH值的变化较大的原因应该与培养基本身是缓冲溶液有关系。最终结论，菌丝生长及降解的最适温度是24℃，最适PH为5.5～6.5，其在20℃～28℃温度范围内也表现出较好的生长及降解效果。

序列表

<110> 涂璇

<120> 一种锐顶镰孢菌及其应用

<130> 2015

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (4)

1.一种锐顶镰孢菌，其特征在于：该菌株已进行保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；地址：武汉大学内；保藏日期：2014年12月30日；保藏编号CCTCC NO：M2014678。

2.根据权利要求1所述的一种锐顶镰孢菌，其特征在于：所述的锐顶镰孢菌是分离自七叶一枝花的内生真菌。

3.权利要求1所述的锐顶镰孢菌用于降解苏丹红Ⅰ的应用。

4.权利要求1所述的锐顶镰孢菌作为制备用于降解苏丹红Ⅰ生物菌剂的应用。