CN112742067B - 一种胎牛血清去除内毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种胎牛血清去除内毒素的方法，通过以下方法实现：在磁性琼脂糖微球偶联与内毒素特异性结合的氨基酸片段，所述氨基酸片段与内毒素特异性结合后，通过磁力吸附所述磁性琼脂糖微球，达到去除胎牛血清去除内毒素的目的。本发明的方法比传统胎牛血清加工工艺增加了去内毒素的环节，去除了内毒素的胎牛血清可适用于目前绝大部分细胞培养及更多种类的科学实验研究，减少了科研过程因血清中内毒素问题造成不良或错误的结果。并且去除内毒素使用的特异性吸附的琼脂糖磁性微球，具有制备简单、价格低廉、不残留在血清中且无毒性的优点，节约了胎牛血清去除内毒素的成本。

Description

一种胎牛血清去除内毒素的方法

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种胎牛血清去除内毒素的方法。

背景技术

内毒素也称为脂多糖，是革兰氏阴性菌细胞壁上的一个成分。细菌死亡时会释放内毒素，不同的细菌中内毒素的化学组成有一定的差别，但是都包含脂质A。内毒素分布广泛，且具有毒性，每个大肠杆菌越含有200万个内毒素分子，污染了内毒素的生物制品在使用时会影响实验结果或造成结果失真。内毒素分子化学性质非常稳定，在水溶液聚合成不同分子量的聚合物，且血清中污染的内毒素难以去除。在细胞培养过程中使用的血清中污染了内毒素会对细胞造成不良影响，例如可以改变细胞的外形，降低肝细胞对六碳糖的吸收能力；可活化巨噬细胞使其分泌肿瘤坏死因子，产生不可预测级联效应；可促进或抑制细胞分裂；由于内毒素对不同细胞株产生的影响不同，且与内毒素的来源有关，因此科研人员为了获得稳定可信的实验结果，应使用去除内毒素的胎牛血清培养细胞。

胎牛血清取自剖腹母牛中的胎牛，因胎牛未接触外环境，其血清中抗体和补体含量低，因此广泛用于细胞培养等生物科研实验。目前在胎牛采血过程中容易受到细菌污染，而污染后的细菌在血清中释放内毒素，容易造成胎牛血清中内毒素含量超标。目前控制胎牛血清中内毒素含量的方法主要为提升采血场所洁净度，减少采血过程中细菌污染情况发生；此外张子毅等人采用活性炭吸附的方式来去除血清中的内毒素，降低内毒素含量。通过改进采血场所洁净度虽是从源头上解决细菌内毒素污染的问题，但是不能完全杜绝污染的情况，一旦发生污染，没有有效的内毒素去除方法就会造成本批次血清的浪费，或者造成不同批次间污染程度差别较大；而活性炭对内毒素的吸附属于非特异性吸附，容易造成内毒素较多的残留，且活性炭孔径较多，吸附血清中的蛋白和细胞因子，而这些蛋白和细胞因子大部分都是细胞培养过程中需要的，因此活性炭处理后的血清不利于细胞培养。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明是提供一种胎牛血清去除内毒素的方法，该方法通过内毒素结合蛋白去除内毒素，具有特异性、内毒素去除更加彻底，且不会影响血清的其它成分。

为实现上述目的，本发明采用以下技术手段实现：

一种胎牛血清去除内毒素的方法，通过以下方法实现：在磁性琼脂糖微球偶联与内毒素特异性结合的氨基酸片段，所述氨基酸片段与内毒素特异性结合后，通过磁力吸附所述磁性琼脂糖微球，达到去除胎牛血清去除内毒素的目的。本发明的方法是对初级加工后的血清再经过内毒素特异性吸附磁性琼脂糖微珠处理的操作，处理后的血清具有内毒素含量低、成分稳定、安全、不影响下游实验的优点。并且通过内毒素结合蛋白去除内毒素，具有特异性、内毒素去除更加彻底，且不会影响血清的其它成分；并且磁性琼脂糖微珠成本低廉，容易去除，不会残留在血清中。

作为本发明的优选实施方式，所述与内毒素特异性结合的氨基酸片段的氨基酸序列为脂多糖结合蛋白的氨基酸序列或/和杀菌通透性增加蛋白的氨基酸序列。经发明人的大量试验研究发现，脂多糖结合蛋白(lipopoysacchride binding protein,LBP)属糖蛋白，可促进水溶液中内毒素多聚体解离为单体分子，具有增敏内毒素的作用，可特异性地结合内毒素分子。杀菌通透性增加蛋白(batericidal permeability increasing protein,BPI)是一种能中和内毒素的蛋白质，与内毒素的类脂A具有高度亲和力。BPI及其活性片段均无明显的毒性和免疫原性，在人体及不同动物内毒素血症模型中都能发挥强有力的中和内毒素的作用。

作为本发明的优选实施方式，所述脂多糖结合蛋白的氨基酸序列为其N端1-212个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

作为本发明的优选实施方式，所述杀菌通透性增加蛋白的氨基酸序列为其N端1-199个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

虽然，发明人发现脂多糖结合蛋白与杀菌通透性增加蛋白能够特异性结合内毒素，但是其完整的氨基酸序列过于庞大，不利于实际操作。因此，为了获得更优质的内毒素特异性结合蛋白，发明人对多糖结合蛋白与杀菌通透性增加蛋白的核苷酸序列进行了优化。经发明人的大量试验结果得出，如SEQ ID NO：3～4所述的核苷酸序列序列具有更好的与内毒素的特异性结合力。发明人设计的其他核苷酸序列均没有SEQ ID NO：3～4的特异性结合力。

作为本发明的优选实施方式，所述磁性琼脂糖微球偶联与内毒素特异性结合的氨基酸片段，通过以下方法实现：

(1)通过PCR方式获取脂多糖结合蛋白或杀菌通透性增加蛋白基因的N端序列；

(2)制备含有步骤(1)N端序列的重组质粒，将该质粒转化宿主菌；

(3)培养宿主菌至一定的菌体浓度后，裂解菌体离心收集上清液，获得含有N端序列的蛋白粗提液，将蛋白粗体液经Ni-NTA纯化柱进行纯化；

(4)在琼脂糖磁珠悬浮液中加入步骤(3)获得的纯化后的蛋白溶液，室温混合，加入Blocking Buffer室温反应，磁力架富集磁珠，弃上清液，再加入Storage Buffer，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液，最后加入4mL Storage Buffer，即可获得偶联了与内毒素特异性结合的氨基酸片段的磁性琼脂糖微球。

作为本发明的优选实施方式，编辑所述如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

作为本发明的优选实施方式，编辑所述如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

作为本发明的优选实施方式，所述PCR扩增如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列的引物为SEQ ID NO：5～6所示。

作为本发明的优选实施方式，所述PCR扩增如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的引物为SEQ ID NO：7～8所示。

本发明还提供了一种由上所述的胎牛血清去除内毒素的方法制备的磁性琼脂糖微球。本发明制备的微球可用以清除内毒素，且特异性强，不影响太牛血清中其他营养物质和细胞因子。

本发明的有益效果为：本发明的方法比传统胎牛血清加工工艺增加了去内毒素的环节，去除了内毒素的胎牛血清可适用于目前绝大部分细胞培养及更多种类的科学实验研究，减少了科研过程因血清中内毒素问题造成不良或错误的结果。并且去除内毒素使用的特异性吸附的琼脂糖磁性微球，具有制备简单、价格低廉、不残留在血清中且无毒性的优点，节约了胎牛血清去除内毒素的成本。

附图说明

图1为本发明去除内毒素的过程示意图(1表示偶联了与内毒素特异性结合的氨基酸片段的琼脂糖磁性微球；2表示胎牛血清中的内毒素；3表示内毒素与琼脂糖磁性微球上的氨基酸片段特异性结合；4表示去除了内毒素的胎牛血清上清液；5表示吸附了内毒素的琼脂糖磁性微球通过6所示的磁力被吸附在容器底部)。

具体实施方式

为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例和附图详细说明本发明的技术方案。

实施例1

1、原核表达脂多糖结合蛋白N端：

通过PCR方式获取LBP基因N端序列，其序列如SEQ ID NO：3所示，上游引物：GGAATTCCATATGATGGTGACCTCGACGGGC(SEQ ID NO：5)；下游引物：CCGCTCGAGATAAGGCTGTAGCTCAGAGGTC(SEQ ID NO：6)；pET30a载体与目的基因经过37℃双酶切过夜(NdeI、HindIII)，切胶回收后16℃连接过夜、转化涂板后经测序筛选获得重组目的质粒；重组质粒转化BL21(DE3)菌后经0.5mM IPTG 30℃过夜诱导，诱导后的菌液离心后获得菌体沉淀，菌体沉淀通过渗透冲击法进行裂解：按照1:10的比例将冲击液1(1mM EDTA，50mM磷酸盐缓冲液,20％蔗糖,pH8.0)加入大肠杆菌中打散冲击，冰浴30min后5000g离心5分钟收集菌体，同样按照1:10的比例将冲击液2(50mM磷酸盐缓冲液，pH8.0)加入菌体沉淀中打散冲击，冰浴20分钟后1000g 4℃离心10min，上清液即为蛋白粗提液；将蛋白粗体液经Ni-NTA纯化柱进行纯化。

2、制备脂多糖结合蛋白偶联琼脂糖磁性微球：

取4ml 25％琼脂糖磁珠悬浮液于15mL离心管中，磁分离后弃上清液。加10mL 2～8℃的Washing Buffer A(1mM盐酸)于离心管中，涡旋15s混匀磁珠。磁性分离架内富集磁珠，去除上清液；加2mL上述蛋白溶液(5mg/mL)于离心管中，涡旋30s使其混匀，置于垂直混合仪上，室温混合2～4h；磁性分离架富集磁珠，保存上清。加10mL Blocking Buffer(3M乙醇胺，pH 9.0)于离心管中，涡旋30加10mL Blocking Buffer于离心管中，涡旋30s，将离心管置垂直混合仪中室温反应2h。磁性分离架富集磁珠，弃上清液；加10mL超纯水于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液；加10mL Storage Buffer(PBS缓冲液)于离心管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液。重复该操作2次。最后加入4mL Storage Buffer于离心管中，充分混合4℃保存备用。

3、血清中内毒素的特异性吸附：

将偶联了LBP的琼脂糖磁性微珠旋涡震荡混匀，取1ml磁性微珠，磁分离后去除上清，剩余磁珠加入500ml血清瓶中，置于垂直混合仪上室温混匀2h。混合完毕后内毒素被LBP分子特异性结合，通过磁性分离磁珠，剩余血清上清即为去除了内毒素的血清。

实施例2

将特异性吸附内毒素的LBP序列换成BPI序列如SEQ ID NO：4所示，同样方式构建载体实现蛋白原核表达，上游引物：GGAATTCCATATGATGGCCAGAGGCCCTGAC(SEQ ID NO：7)；下游引物：CCGCTCGAGCTTTCTGGTCATGGACTTTTGGAG(SEQ ID NO：8)；经过原核表达，Ni-NTA柱纯化获取蛋白后，以同样的方式偶联琼脂糖磁性微珠，加入血清中特异性吸附去除内毒素。其他操作步骤与实施例1相同。

对比例1

采用多聚赖氨酸型的内毒素去除填料去除胎牛血清中的内毒素

对比例2

采用多粘菌素B的内毒素去除填料去除胎牛血清中的内毒素

效果验证

1、去除内毒素的效果

对使用实施例1、2与对比例1、2的方法去除了内毒素的胎牛血清进行测，验证本发明方法去除内毒素的效果。其结果如表1所示：

表1：实施例1、2与对比例1、2的方法去除内毒素的实验结果

分组	内毒素含量(EU/ml)	内毒素去除率(％)
			样品处理前	453000
实施例1	353	99.2
			实施例2	236	99.8
对比例1	17214	96.2
			对比例2	22650	95.0

由表1可知，与传统方法相比，本发明的去除去率均大于99％，其去除内毒素效力远远大于传统方法。

2、特异性验证

在稀释血清蛋白溶液中，加入一定量内毒素。对使用实施例1、2与对比例1、2的方法去除了内毒素的胎牛血清进行检测，同时检测蛋白回收率。验证本发明方法去除内毒素的效果。其结果如表1所示：

表2：实施例1、2与对比例1、2的方法去除内毒素后溶液蛋白回收率的实验结果

由表2可知，与传统方法相比，本发明的对溶液本身蛋白影响远小于传统方法。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州博仁安康医疗科技有限公司

<120> 一种胎牛血清去除内毒素的方法

<130> 11.18

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 212

<212> PRT

<213> 合成

<400> 1

Met Val Thr Ser Thr Gly Thr Leu Pro Ser Leu Leu Leu Gly Thr Leu

1 5 10 15

Leu Thr Phe Thr Ser Gly Ala Leu Gly Ala Asn Pro Gly Leu Val Val

20 25 30

Arg Ile Thr Asp Gln Gly Leu Glu Tyr Val Ala Gln Glu Glu Leu Leu

35 40 45

Ala Leu Gln Ser Lys Leu His Lys Val Thr Leu Pro Asp Phe Asn Gly

50 55 60

Asp Val Arg Ile Lys His Phe Gly Ser Val Asp Tyr Arg Phe His Ser

65 70 75 80

Leu Asn Ile Gln Ser Cys Lys Leu Leu Gly Ser Ala Leu Lys Leu Leu

85 90 95

Pro Asn Gln Gly Leu His Phe Ser Ile Ser Asp Ser Phe Ile Gln Val

100 105 110

Thr Gly Asp Trp Lys Val Arg Lys Arg Ile Leu Arg Leu Asp Gly Ser

115 120 125

Phe Asp Val Lys Val Lys Gly Ile Thr Ile Ser Val Asn Leu Leu Leu

130 135 140

Asp Ser Glu Pro Ser Gly Arg Pro Lys Val Ala Val Ser Ser Cys Ser

145 150 155 160

Ser His Ile Arg Asp Val Glu Val His Ile Ser Gly Asp Leu Gly Trp

165 170 175

Leu Leu Asn Leu Phe His Asn Gln Ile Glu Ser Arg Phe Arg Arg Val

180 185 190

Leu Glu Ser Lys Ile Cys Glu Ile Ile Glu Asp Ser Val Thr Ser Glu

195 200 205

Leu Gln Pro Tyr

210

<210> 2

<211> 199

<212> PRT

<213> 合成

<400> 2

Met Ala Arg Gly Pro Asp Thr Ala Arg Arg Trp Ala Thr Leu Val Val

1 5 10 15

Leu Ala Ala Leu Gly Thr Ala Val Thr Thr Thr Asn Pro Gly Ile Val

20 25 30

Ala Arg Ile Thr Gln Lys Gly Leu Asp Tyr Ala Cys Gln Gln Gly Val

35 40 45

Leu Thr Leu Gln Lys Glu Leu Glu Lys Ile Thr Ile Pro Asn Phe Ser

50 55 60

Gly Asn Phe Lys Ile Lys Tyr Leu Gly Lys Gly Gln Tyr Ser Phe Phe

65 70 75 80

Ser Met Val Ile Gln Gly Phe Asn Leu Pro Asn Ser Gln Ile Arg Pro

85 90 95

Leu Pro Asp Lys Gly Leu Asp Leu Ser Ile Arg Asp Ala Ser Ile Lys

100 105 110

Ile Arg Gly Lys Trp Lys Ala Arg Lys Asn Phe Ile Lys Leu Gly Gly

115 120 125

Asn Phe Asp Leu Ser Val Glu Gly Ile Ser Ile Leu Ala Gly Leu Asn

130 135 140

Leu Gly Tyr Asp Pro Ala Ser Gly His Ser Thr Val Thr Cys Ser Ser

145 150 155 160

Cys Ser Ser Gly Ile Asn Thr Val Arg Ile His Ile Ser Gly Ser Ser

165 170 175

Leu Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe Arg Lys Arg Ile Glu Ser Leu Leu

180 185 190

Gln Lys Ser Met Thr Arg Lys

195

<210> 3

<211> 636

<212> DNA

<213> 合成

<400> 3

atggtgacct cgacgggcac cctgccctcc ctcctgctgg gaaccctgct cacgttcacc 60

tccggggccc tgggggccaa tcccggcctg gtcgtcagga tcaccgacca gggcttggag 120

tacgtggccc aagaggagct gttggctctg cagagtaagc tgcacaaagt cacactgccc 180

gacttcaacg gggacgtcag gatcaaacat tttggcagtg tggactatag attccacagc 240

ctgaacattc agagctgtaa gctgcttggc tccgctctga agctcctccc caatcagggc 300

ctgcatttct ctatctccga ctccttcatc caggtcacgg gcgactggaa ggtgcgcaag 360

aggatactga gactagacgg ctcctttgac gtgaaggtca agggcatcac catttcagtc 420

aatcttctct tggacagtga gccctctggg agacccaaag tggctgtctc cagctgcagt 480

agccacatcc gtgatgtgga ggtgcacata tcaggagatt tggggtggct gctgaatctc 540

ttccataacc agatcgagtc caggttccga agggtcttgg agagcaagat ttgcgaaatt 600

attgaggact cggtgacctc tgagctacag ccttat 636

<210> 4

<211> 597

<212> DNA

<213> 合成

<400> 4

atggccagag gccctgacac cgcgcggagg tgggcaaccc tggtggtgct ggccgccctg 60

ggcacggctg tgacgactac caaccctggc attgtggcca ggatcaccca gaagggcctg 120

gactacgcct gccagcaggg agtgcttact ctgcagaagg agttggagaa gataacaatt 180

cccaatttct caggaaactt taagataaag tacctcggga aagggcaata cagcttcttc 240

agcatggtta ttcaaggatt caatcttccc aattcccaga taagaccgtt gccagataag 300

ggccttgatc tctctatcag agatgccagt atcaagatca gaggaaaatg gaaggcacga 360

aagaatttca tcaaactcgg tggcaacttt gacctgagtg tggagggcat ctctattttg 420

gcgggtctga atctgggcta tgatcctgcc tcgggccact ccactgttac ctgctccagc 480

tgcagcagtg gcatcaacac cgtccgcata cacatctctg gcagcagcct ggggtggctg 540

atccaactct tccgcaaacg aatcgagtct ttgctccaaa agtccatgac cagaaag 597

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 合成

<400> 5

ggaattccat atgatggtga cctcgacggg c 31

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 合成

<400> 6

ccgctcgaga taaggctgta gctcagaggt c 31

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 合成

<400> 7

ggaattccat atgatggcca gaggccctga c 31

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 合成

<400> 8

ccgctcgagc tttctggtca tggacttttg gag 33

Claims (7)

1.一种胎牛血清去除内毒素的方法，其特征在于，通过以下方法实现：在磁性琼脂糖微球偶联与内毒素特异性结合的氨基酸片段，所述氨基酸片段与内毒素特异性结合后，通过磁力吸附所述磁性琼脂糖微球，达到去除胎牛血清去除内毒素的目的；

所述氨基酸序列为脂多糖结合蛋白的氨基酸序列或杀菌通透性增加蛋白的氨基酸序列；

所述脂多糖结合蛋白的氨基酸序列为其N端1-212个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示；

所述杀菌通透性增加蛋白的氨基酸序列为其N端1-199个氨基酸，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

2.如权利要求1所述的胎牛血清去除内毒素的方法，其特征在于，所述磁性琼脂糖微球偶联与内毒素特异性结合的氨基酸片段，通过以下方法实现：

(1)通过PCR方式获取脂多糖结合蛋白或杀菌通透性增加蛋白基因的N端核苷酸序列；

(2)制备含有步骤(1)N端序列的重组质粒，将该质粒转化宿主菌；

(3)培养宿主菌至一定的菌体浓度后，裂解菌体离心收集上清液，获得含有N端序列的蛋白粗提液，将蛋白粗体液经Ni-NTA纯化柱进行纯化；

(4)在琼脂糖磁珠悬浮液中加入步骤(3)获得的纯化后的蛋白溶液，室温混合，加入Blocking Buffer室温反应，磁力架富集磁珠，弃上清液，再加入Storage Buffer，充分混合，用磁力架富集磁珠，弃上清液，最后加入4mL Storage Buffer，即可获得偶联了与内毒素特异性结合的氨基酸片段的磁性琼脂糖微球。

3.如权利要求2所述的胎牛血清去除内毒素的方法，其特征在于，所述脂多糖结合蛋白的N端核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.如权利要求2所述的胎牛血清去除内毒素的方法，其特征在于，所述杀菌通透性增加蛋白的N端核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

5.如权利要求3所述的胎牛血清去除内毒素的方法，其特征在于，PCR扩增如SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列的引物为SEQ ID NO：5～6所示。

6.如权利要求4所述的胎牛血清去除内毒素的方法，其特征在于，PCR扩增如SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列的引物为SEQ ID NO：7～8所示。

7.一种由权利要求2所述的胎牛血清去除内毒素的方法制备的磁性琼脂糖微球。

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