CN112028999A

CN112028999A - 一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN112028999A
Application number: CN202010703854.1A
Authority: CN
Inventors: 王云龙; 王国强; 李振勇; 李玉林; 孙新城; 王继创; 王敏; 程蕾; 王运从
Original assignee: HENAN BIOENGINEERING RESEARCH CENTER
Current assignee: HENAN BIOENGINEERING RESEARCH CENTER
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2020-07-21
Publication date: 2020-12-04

Abstract

本发明属于应用分子生物学领域，具体涉及一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法和用途。该内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒含有MS2噬菌体外壳蛋白和包裹在所述外壳蛋白内部的重组基因S序列，所述S序列由依次相连的新型冠状病毒ORF1ab基因片段、人β‑Globin基因片段、新型冠状病毒N基因片段和E基因片段组成；所述S序列具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。该病毒样颗粒可用于新型冠状病毒核酸提取、扩增和检测全程质控，作为试剂盒中的新型冠状病毒的阳性对照和内标质控品推广应用。

Description

一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于应用分子生物学领域，具体涉及一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法和用途。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)引起人发热、乏力、干咳和呼吸困难，严重者并发急性呼吸窘迫综合征的传染病。其传染性强、可感染各年龄段的人，特别是对有基础疾病的老年人可导致较高的发病率和死亡率。

目前，国内外许多研究者建立了各种病原体分子生物学诊断方法，主要包括抗原和核酸的检测。但是，在核酸，尤其是在RNA病原体的实际检测中，带有核酸的阳性质控品(企业参考品)不可或缺。质粒DNA制备的阳性质控品，不能监控提取和反转录步骤；由于环境中Rnase 的存在，裸漏的RNA制备的阳性质控品，稳定性差；完整的病毒难于大量获得，同时存在严重的生物安全性风险。目前由于无生物安全危险、稳定性好、不容易降解的阳性质控物以及内标质控品的缺乏，使得新型冠状病毒的核酸检测很难做到从提取、反转录到扩增的全程监控。

包含MS2噬菌体成熟酶蛋白、外壳蛋白和PAC位点基因的重组载体在原核表达系统中可在体外包装RNA形成假病毒样颗粒作为阳性对照。病毒样颗粒的快速纯化和颗粒溶液中残余核酸的彻底去除是一个关键因素。目前，病毒样颗粒的常用纯化方法主要有：PEG沉淀法、密度梯度离心法、凝胶过滤层析、超滤法等，四种方法得到的装甲RNA病毒颗粒溶液中均有大量大肠杆菌自身和重组质粒DNA的残留，特别是重组质粒DNA的残留。同时，PEG沉淀法得到的病毒样颗粒纯度不高，时间长；凝胶过滤层析在纯化病毒样颗粒时，需要先粗纯，最后再用分子筛，但其上样量小，时间长；密度梯度离心法虽然纯度高，但时间长，不能大量制备，需要超速离心机；超滤法不能去除大分子杂质蛋白，纯度不高，每次纯化量少，损失多。

发明内容

本发明提供一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，以便于实现新型冠状病毒的核酸检测从提取、反转录到扩增的全程监控。

本发明的第二目的在于提供所述内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的纯化方法。该纯化方法可实现所述内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的高效纯化，且制得的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的纯度高，可用作新型冠状病毒的核酸检测的阳性质控品。

本发明的第三目的在于提供所述内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的制备方法。此外，本领域一般采用DNase和Rnase对制备得到的病毒样颗粒中残留的DNA或RNA进行消化去除。发明人在制备所述内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的过程中还发现，在NP40存在的条件下，DNase和RNase不能彻底消化病毒样颗粒溶液中的DNA。发明人通过采用全能核酸酶 Benzonase，可以较彻底消化溶液中DNA，从而解决在NP40存在的条件下，DNase和RNase 不能彻底消化病毒样颗粒溶液中的DNA的技术问题。

本发明的第四目的在于提供所述内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的用途。

本发明还提供了一种试剂盒。

本发明的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒采用如下技术方案：一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，所述病毒样颗粒含有MS2噬菌体外壳蛋白和包裹在所述外壳蛋白内部的重组基因S序列，所述S序列由依次相连的新型冠状病毒ORF1ab基因片段、人β-Globin基因片段、新型冠状病毒N基因片段和E基因片段组成；所述S序列具有如SEQ IDNO.5所示的核苷酸序列。

作为进一步优选的技术方案，所述病毒样颗粒的制备包括下述步骤：(1)构建能够表达所述病毒样颗粒的表达载体，并将所述表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌体；(2)诱导所述重组菌体，使其表达所述病毒样颗粒；(3)收集菌体，并加入裂解液，超声、破碎菌体以获取所述病毒样颗粒；(4)纯化所述病毒样颗粒；(5)采用核酸酶对经步骤(4)纯化所得的含有病毒样颗粒的溶液进行消化，以除去溶液中残留的DNA 和RNA。

作为进一步优选的技术方案，所述裂解液包括NaCL、Tris-HCL、EDTA、甘油和NP40；优选的，所述裂解液包括NaCL 200-300mM、Tris-HCL 15-25mM、EDTA 0.2-1.0mM、甘油 5-15％(体积分数)和NP40 0.01-0.08％(体积分数)，上述各原料的浓度均为终浓度，所述Tris-HCL的pH＝8.0；优选的，所述裂解液包括NaCL 250mM、Tris-HCL 20mM、EDTA 0.5mM、甘油10％和NP40 0.05％。

作为进一步优选的技术方案，所述核酸酶为全能核酸酶Benzonase，所述全能核酸酶 Benzonase在Mg²⁺存在条件下，37℃消化溶液中残留的DNA和RNA；所述全能核酸酶Benzonase消化处理4h即可完全除去溶液中残留的DNA和RNA。由于纯化后的含有病毒样颗粒的样品溶液中还含有NP40等成分，若采用DNase和RNase对溶液中的DNA和RNA 进行消化，消化的效率低，且不能完全去除DNA和RNA。本发明通过采用全能核酸酶 Benzonase，可有效提高消化的速度，且可实现残余DNA和RNA的完全消化。

作为进一步优选的技术方案，所述表达载体按照包括下述步骤的方法构建得到：(1) 以噬菌体MS2 RNA为模板，反转录得到cDNA，利用第一引物对进行扩增，得到包括MS2噬菌体外壳蛋白和PAC位点的第一PCR产物，利用NheⅠ和BamHⅠ对所述第一PCR产物以及携带有MS2噬菌体成熟酶A蛋白基因的重组载体pET28a/A分别双酶切，将PCR酶切产物与质粒酶切产物进行连接，得到第一重组质粒；(2)将所述S序列克隆在质粒pUC57 中，得到pUC57/S质粒；(3)以所述pUC57/S质粒为模板，通过第二引物对扩增得到第二PCR产物，利用BamHⅠ和HindⅢ对所述第二PCR产物以及第一重组质粒分别进行双酶切，并连接酶切产物，得到第二重组质粒；

所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第一引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述第二引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的纯化方法采用如下技术方案：如上述任意一项所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的纯化方法，先向破碎后的、表达所述病毒样颗粒的重组菌体中加入硫酸铵对所述病毒样颗粒进行粗沉；再采用新型凝胶过滤介质 Capto^TM Core 700对粗沉得到的含有病毒样颗粒的样品进行精纯，即得纯化后的病毒样颗粒。 Capto^TM Core 700凝胶过滤层析介质由激活的配基核心和惰性壳层组成。惰性壳层可以排阻大分子(排阻分子量700kDa)，阻止其经壳层上的孔进入核心，穿柱的即为大分子蛋白，较小的杂质蛋白会与微球内在配基结合。与实验室或企业常用的凝胶层析填料相比，高达100倍的样品上样量以及明显更高的流速确保了生产效率显著提高，具有激活的配基核心以及未激活的壳层的核心微球技术可有效的捕获污染物，同时使目标分子流穿，由于穿流层析和稳定的性能，方便的条件优化，可以使用更广泛操作范围。将新型凝胶过滤介质Capto^TM Core 700用于本发明的、硫酸铵粗沉后的病毒样颗粒的进一步纯化，可在保证病毒样颗粒纯度、得率的情况下，实现病毒样颗粒的高效纯化。

作为进一步优选的技术方案，采用硫酸铵粗沉时，硫酸铵的终浓度为10％-50％(饱和度)；采用新型凝胶过滤介质CaptoTM Core 700纯化时，先用5倍柱体积的20mMTris-HCL 平衡凝胶柱后，将含有所述沉淀蛋白的溶液以4ml/min流速上样，收集流出液即得纯化后的病毒样颗粒；优选的，所述硫酸铵的终浓度为30％。

本发明的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的制备方法采用如下技术方案：包括如上述任意一项所述的步骤。

本发明的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的用途采用如下技术方案：如上述任意一项所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的用途，所述病毒样颗粒可用作新型冠状病毒核酸提取、扩增和核酸检测用阳性质控品。

本发明的试剂盒采用如下技术方案：一种试剂盒，所述试剂盒包括如上述任意一项所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒。

本发明的有益效果是：

(1)本发明制备的包含目的核酸的假病毒颗粒稳定性好，过滤后可4℃长期保存，安全无危害，能全程模拟天然病毒特性，尽可能与临床样本保持一致，可作为核酸提取、扩增和检测全程质控。该病毒样颗粒可作为新冠核酸检测试剂盒研发过程中初期体系调整优化的模拟标本来源和企业参考品，也可作为新冠检测试剂盒其中一个组分(阳性对照)。

(2)本发明以MS2噬菌体外壳蛋白编码序列为基础，构建了包含新冠特定序列的表达载体，得到了重组工程菌株BL21(DE3)/pET28a/CP/S，该菌株经过低温诱导，菌体超声破碎后，利用硫酸铵沉淀和Capto^TM Core 700填料凝胶过滤二步法可快速纯化得到10ml

2.5×10⁶copies/μl的假病毒颗粒；纯化的病毒样颗粒经过全能核酸酶Benzonase消化，可去除溶液中残留的大量DNA和RNA，得到高纯度的含目的核酸的假病毒颗粒。

(3)本发明采用全能核酸酶Benzonase对纯化得到的含有病毒样颗粒的样品溶液中残留的DNA和RNA进行消化，不仅可完全除去DNA和RNA，还可有效提高消化的速度。

(4)本发明通过先采用硫酸铵粗沉和再采用新型凝胶过滤介质Capto^TM Core 700对粗沉得到的含有病毒样颗粒的样品进行精纯的方法，可有效提高本发明的病毒样颗粒的纯化速度和收率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明纯化得到的假病毒颗粒的电镜观察图；

图2为本发明纯化得到的假病毒颗粒的动态光散射检测颗粒粒径图；

图3为本发明的病毒样颗粒耐RNase攻击检测的琼脂糖凝胶电泳图；

图4为分别采用不同的核酸酶对纯化得到的病毒样颗粒进行消化后残余核酸检测结果；图 4中的“核酸酶消化后直接扩增”是指用100U DNase和100U Rnase消化处理后的样品；“核酸酶消化后提取核酸反转录后扩增”是指用100U DNase和100U Rnase消化后提取核酸反转录扩增；

图5为本发明的病毒样颗粒加入正常人咽拭子和痰液中模拟检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1 pET28a/MS2/S重组载体构建

1 pET28a/MS2载体制备

以噬菌体MS2 RNA为模板，利用随机引物(N6)和第一引物对进行反转录、扩增，得到包括MS2噬菌体外壳蛋白(CP)和PAC位点的第一PCR产物；反转录和PCR一步法扩增体系为：5μl 10×One-Step Buffer，1μl 50×dNTP Mix，0.5μl Recombinant RNase Inhibitor(40 units/μl)，25μl Thermostabilizing Reagent，10μl GC-Melt，1μl Random(N6)Primer，1 μl 50×Titanium Taq RT Enzyme Mix，1μl第一引物对(45μM each)，1μl MS2RNA，2.5μl RNase-Free H₂O，总体积：50μl。所述反转录和PCR扩增程序为：50℃反转录1h，94℃预变形5m，30个循环：94℃变性30s，65℃退火30s，68℃延伸1min，68℃延伸2 min；扩增结束后，琼脂糖电泳回收第一PCR产物；

利用NheⅠ-HF和BamHⅠ-HF对所述第一PCR产物以及pET28a质粒37℃分别双酶切2h，琼脂糖电泳将PCR酶切产物与质粒酶切产物回收后进行连接，所述连接体系为：PCR酶切产物 5μl(30ng)，pET28a质粒酶切产物4μl(15ng)，10×T4连接Buffer 1.5μl，T4连接酶1μl，补加ddH₂O 3.5μl，总体积：15μl，16℃连接过夜。连接产物转化JM109感受态细胞，涂布平板，菌液PCR鉴定正确的提取质粒，即为第一重组质粒pET28a/MS2；

其中，第一PCR扩增引物对为：

MS2-F(SEQ ID No.1)：CTAGCTAGCCTTCTAACTTTACTC

MS2-R(SEQ ID No.2)：CGCGGATCCTGTTGTCTTCGACATGGGTA

2 pET28a/MS2/S载体制备

由生工生物工程(上海)股份有限公司人工合成包含新型冠状病毒(SARS-Cov-2)ORF1ab 基因、N基因、E基因和人β-Globin基因特定保守序列S，S序列顺序为：ORF1ab基因-人 β-Globin基因-N基因-E基因，S序列克隆在质粒pUC57中。通过第二PCR引物扩增S序列，扩增体系为：5μl 10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺plus)，1μl pUC57/S，1μl第二引物对上、下游引物 (45μM each)，42μl ddH₂O，总体积：50μl。第二PCR扩增程序为：94℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸10min。琼脂糖电泳回收第二PCR产物；

利用HindIII-HF和BamHI-HF对所述第二PCR产物以及第一重组质粒pET28a/MS2质粒 37℃分别双酶切2h，琼脂糖电泳将PCR酶切产物与质粒酶切产物回收后进行连接，所述连接体系为：PCR酶切产物6μl(25ng)，pET28a质粒酶切产物3.5μl(12.5ng)，10× T4连接Buffer 1.5μl，T4连接酶1μl，补加ddH₂O 2μl，总体积：15μl，16℃连接过夜。连接产物转化JM109感受态细胞，涂布平板，菌液PCR鉴定正确的提取质粒，即为第二重组质粒，命名为pET28a/MS2/S；

其中，第二PCR扩增引物对的具体核苷酸序列为：

MS2-F(SEQ ID No.3)：CGGGATCCCCCCTGTGGGTTTTACA

MS2-R(SEQ ID No.4)：CCCAAGCTTATATTGCAGCAGTACGCACACA

全长序列S(SEQ ID No.5)：

CCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAACACAGTCTGTACCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGGCTGTAGTTGTG ATCAACTCCGCGAACCCATGCTTCAGTCAGCTGATGCACAATCGTTTTTAAAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAG AATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTTGTTAACGTGAGTGAGCTGC ACTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGACGCTTGATGTGAACCAGCTTG AGAGCAAAATGTCTGGTAAAGATTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTT TCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATAT

实施例2含新冠病毒核酸的MS2病毒样颗粒的制备

将pET28a/MS2/S重组质粒转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，BL21(DE3)/pET28a/MS2/S 工程菌株复苏37℃培养至OD₆₀₀值大约在0.8后，摇床温度降至16℃，继续培养1h，加入终浓度为0.2mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在16℃条件下，200r/min诱导表达20h。8000r/min离心10min收集培养菌体细胞，弃上清，菌体沉淀用20mM Tris-HCL(pH＝8.0)重悬洗涤后，8000r/min再次离心10min，弃上清，菌体沉淀用裂解液重悬，低温超声破碎后，12000r/min离心10min，收集上清，弃去沉淀。

硫酸铵沉淀粗纯：在冰浴和磁力搅拌条件下，向超声上清中缓慢加入适量饱和硫酸铵，至硫酸铵终浓度为30％，搅拌均匀后冰浴放置20min。12000r/min离心10min，弃去上清，用20mM Tris-HCL(pH＝8.0，含150mM NaCL)重悬沉淀即为粗纯含病毒样颗粒的溶液。

新型凝胶过滤介质Capto^TM Core 700精纯：5倍柱体积的20mM Tris-HCL(pH＝8.0，含 150mM NaCL)平衡凝胶柱后，粗纯含病毒样颗粒的溶液以4ml/min流速直接上样。Capto^TMCore 700的惰性壳层可以排阻大分子(排阻分子量700kDa)，阻止其经壳层上的孔进入核心，而较小的杂质会与微球内激活的配基核心结合，大的病毒样颗粒颗粒直接穿柱被收集，即为精纯的病毒样颗粒溶液。

病毒样颗粒溶液中残余核酸去除：取5ml精纯的病毒样颗粒溶液，加入终浓度为4mM 的Mg²⁺，同时加入100U的全能核酸酶Benzonase，在37℃条件下消化4h。

其中，所述裂解液为：NaCL：250mM；Tris-HCL(pH＝8.0)：20mM；EDTA：0.5mM；甘油：10％；NP40：0.05％，EDTA：0.5mM；

实施例3含新冠核酸MS2病毒样颗粒的物理表征以及特性鉴定

1、病毒样颗粒的物理表征：

实施例2中精纯得到的病毒样颗粒溶液，用20mM Tris-HCL(pH＝8.0，含150mMNaCL)，稀释至浓度为0.5mg/ml左右，0.22μm滤膜过滤，在超净工作台中，在2％磷钨酸负染，自然干燥，在100kV加速电压条件下，通过JEM-1400(日本)透射电子显微镜，观察测量颗粒粒径。同时用布鲁克海文仪器电位及粒度分析仪(美国90Plus PALS)测量颗粒的粒径和分布。

病毒样颗粒经透射电镜观察(如说明书附图图1所示)：颗粒为“外亮内暗”规则的正六边形物质，直径大约为25±3nm左右。该颗粒溶液经动态光散射(DLS)图谱分析(如说明书附图图2所示)：溶液均匀，颗粒内径约为25nm，与透射电镜数据一致。

2、病毒样颗粒的特性鉴定

病毒样颗粒核酸酶消化后残余核酸检测：取核酸酶Benzonase消化后的病毒样颗粒100 ul，用RNAiso Plus裂解提取RNA，步骤为：取100ul上清加入1ml RNAiso Plus裂解液和200ul 氯仿，震荡15s，室温静置3min；12000rpm/m离心5min后，吸取上清，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后，室温静置10min。12000rpm/m离心10min，小心弃去上清，加入1ml75％乙醇(DEPC水配制)，12000rpm/m离心3min，小心弃去上清，放入100℃金属浴烘干，加入20ul DEPC水溶解沉淀，即为提取的RNA。按照PrimeScript^TMRT Master Mix(PerfectReal Time)说明书反转录得到cDNA，体系为：5×PrimeScript RT Master Mix(PerfectReal Time) 3μl，RNA 2μl，ddH₂O 10μl。程序为：37℃15min(反转录反应)85℃5sec(反转录酶的失活反应)。用Probe qPCR Mix荧光探针PCR检测试剂检测反转录cDNA和消化后的病毒样颗粒溶液。体系为：Probe qPCR Mix(2×)12.5μl，PCR Forward Primer(10μM)各 0.5μl，PCR Reverse Primer(10μM)各0.5μl，Probe(10μM)各0.25μl，模板1μl，灭菌 ddH₂O 6.5μl，总体积为25μl。程序为：步骤一1个循环95℃30Sec，步骤二40个循环 95℃10sec 58℃(采集荧光)30sec，注：荧光采集：FAM，ROX，CY5和VIC。荧光检测结果(说明书附图图4)显示：核酸酶消化后病毒样颗粒溶液直接PCR的Ct值为39，说明颗粒溶液中残余核酸消化较为彻底；而核酸酶消化后的样品，经过裂解提取RNA、RT–PCR 检测，Ct值为23，表明形成的病毒样颗粒包封了目的靶序列。

病毒样颗粒耐RNase攻击检测：将全能核酸酶Benzonase消化后得到的病毒样颗粒，分为两组，每组三份，每份100ul。其中一组(三份)直接进行裂解和反转录，另一组(三份)在样品裂解前加入10ul 1mg/L的RNase，37℃条件下放置120min后，再进行裂解和一步法PCR扩增，扩增体系为：5μl 10×One-Step Buffer，1μl 50×dNTP Mix，0.5μlRecombinant RNase Inhibitor(40units/μl)，25μl Thermostabilizing Reagent，10μlGC-Melt， 1μl Random(N6)Primer，1μl 50×Titanium Taq RT Enzyme Mix，1μl检测引物(45μM each)，1μl提取的RNA，2.5μl RNase-Free H₂O，总体积：50μl。扩增程序为：50℃反转录1h，94℃预变形5m，30个循环：94℃变性30s，65℃退火30s，68℃延伸1min， 68℃延伸2min；最后琼脂糖凝胶电泳检测。检测结果(详见说明书附图图3)显示：RNase 处理和不处理病毒样颗粒，经过RNA提取和RT-PCR后均可以扩增出450bp左右目的序列。

其中，病毒样颗粒耐RNase攻击检测中用到引物为：SEQ ID No.6和SEQ ID No.7。

SEQ ID No.6：TGAGTGAGCTGCACTGTGAC

SEQ ID No.7：CCCCTGTGGGTTTTACA

实施例4对比例2现有技术的纯化效果和核酸去除效果

用实施例1中的裂解液超声菌体，用硫酸铵(10％-50％，优选30％)沉淀病毒样颗粒，分别用SepharoseCL-4B凝胶过滤、蔗糖密度梯度离心法和本方法三种不同方法纯化20ml (1mg/ml)30％硫酸铵沉淀后重悬含病毒样颗粒的上清溶液：其中，SepharoseCL-4B柱体积200ml，柱子为26mm×100cm，流速为2ml/min；密度梯度离心蔗糖浓度为60％、40％和20％作为垫层，30％硫酸铵透析后，加入终浓度为10％蔗糖，依次加入超离管， 40000rpm/min超速离心；纯化时间、纯度和最终蛋白得率如表1；纯度上无明显差异，但时间大幅度减少，得率明显高于密度梯度离心。

表1不同方法病毒样颗粒纯化效果

方法	耗时	纯度	蛋白得率
				SepharoseCL-4B凝胶过滤	4小时	90％	30％
蔗糖密度梯度离心法	6小时	90％	15％
				Capto<sup>TM</sup> Core 700介质层析	45分钟	85％	33％

30％硫酸铵和Capto^TM Core 700介质层析纯化得到的病毒样颗粒溶液，各取1ml，分别用100U DNase和100U RNase进行消化以及100U全能核酸酶Benzonase在Mg2+离子浓度 0.5-2mM，优选1mM，37℃条件下，消化4h，按照病毒样颗粒核酸酶消化后残余核酸检测，荧光扩增结果显示(详见说明书附图图4，图4中的“核酸酶消化后直接扩增”是指用100UDNase和100U Rnase消化处理后的样品)：全能核酸酶消化后直接荧光检测，Ct 值为39，经过裂解提取RNA、RT–PCR检测，Ct值为28；而用DNase和RNase消化后，直接荧光检测，Ct值为30，经过裂解提取RNA、RT–PCR检测，Ct值为26。说明全能核酸酶Benzonase几乎可完全消化残余核酸，而DNase和RNase消化后，仍有核酸残留。

表2不同酶的消化效果

不同酶消化	直接荧光检测(Ct值)	提取RNA后反转录检测
			DNase和RNase	30	19
全能核酸酶Benzonase	39	23

实施例5含新冠核酸MS2病毒样颗粒实用性能检测

取正常人咽拭子以及痰液，模拟临床实际标本，将核酸酶消化后的新型冠状病毒核酸病毒样颗粒100ul分别等体积加入咽拭子以及痰液，10000rpm/m离心3min后，吸取上清待用；按照病毒样颗粒核酸酶消化后残余核酸检测中方法提取RNA、RT-PCR进行荧光检测。荧光扩增结果(详见说明书附图图5)可以看出：含目的核酸的病毒样颗粒加入正常人咽拭子以及痰液中扩增曲线均呈S曲线，依据判定标准，E基因(FAM)，ORF1ab基因(ROX)， N基因(CY5)和内标人珠蛋白基因(VIC)均有荧光信号，为核酸阳性；正常人咽拭子以及痰液仅内标人珠蛋白基因(VIC)有荧光信号。这表明制备的含新冠核酸MS2病毒样颗粒可以作为新型冠状病毒核酸检测的质控品。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南省生物工程技术研究中心

<120> 一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法和用途

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctagctagcc ttctaacttt actc 24

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgcggatcct gttgtcttcg acatgggta 29

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgggatcccc cctgtgggtt ttaca 25

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cccaagctta tattgcagca gtacgcacac a 31

<210> 5

<211> 440

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccctgtgggt tttacactta aaaacacagt ctgtaccgtc tgcggtatgt ggaaaggtta 60

tggctgtagt tgtgatcaac tccgcgaacc catgcttcag tcagctgatg cacaatcgtt 120

tttaaagtag gggaacttct cctgctagaa tggctggcaa tggcggtgat gctgctcttg 180

ctttgctgct gcttgacaga tttgttaacg tgagtgagct gcactgtgac aagctgcacg 240

tggatcctga gaacttcagg gtgagtctat gggacgcttg atgtgaacca gcttgagagc 300

aaaatgtctg gtaaagattc ggaagagaca ggtacgttaa tagttaatag cgtacttctt 360

tttcttgctt tcgtggtatt cttgctagtt acactagcca tccttactgc gcttcgattg 420

tgtgcgtact gctgcaatat 440

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgagtgagct gcactgtgac 20

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cccctgtggg ttttaca 17

Claims

1.一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒含有MS2噬菌体外壳蛋白和包裹在所述外壳蛋白内部的重组基因S序列，所述S序列由依次相连的新型冠状病毒ORF1ab基因片段、人β-Globin基因片段、新型冠状病毒N基因片段和E基因片段组成；所述S序列具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒的制备包括下述步骤：(1)构建能够表达所述病毒样颗粒的表达载体，并将所述表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌体；(2)诱导所述重组菌体，使其表达所述病毒样颗粒；(3)收集菌体，并加入裂解液，超声、破碎菌体以获取所述病毒样颗粒；(4)纯化所述病毒样颗粒；(5)采用核酸酶对经步骤(4)纯化所得的含有病毒样颗粒的溶液进行消化，以除去溶液中残留的DNA和RNA。

3.根据权利要求2所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于，所述裂解液包括NaCL、Tris-HCL、EDTA、甘油和NP40；优选的，所述裂解液包括NaCL 200-300mM、Tris-HCL 20mM、EDTA 0.2-1.0mM、甘油5-15％和NP 40 0.01-0.08％，上述各原料的浓度均为终浓度，所述Tris-HCL的pH＝8.0；优选的，所述裂解液包括NaCL 250mM、Tris-HCL 20mM、EDTA0.5mM、甘油10％和NP40 0.05％。

4.根据权利要求2或3所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于，所述核酸酶为全能核酸酶Benzonase，所述全能核酸酶Benzonase在Mg²⁺存在条件下，37℃消化溶液中残留的DNA和RNA；所述全能核酸酶Benzonase消化处理4h即可完全除去溶液中残留的DNA和RNA。

5.根据权利要求2所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒，其特征在于，所述表达载体按照包括下述步骤的方法构建得到：(1)以噬菌体MS2 RNA为模板，反转录得到cDNA，利用第一引物对进行扩增，得到包括MS2噬菌体外壳蛋白和PAC位点的第一PCR产物，利用NheⅠ和BamHⅠ对所述第一PCR产物以及携带有MS2噬菌体成熟酶A蛋白基因的重组载体pET28a/A分别双酶切，将PCR酶切产物与质粒酶切产物进行连接，得到第一重组质粒；(2)将所述S序列克隆在质粒pUC57中，得到pUC57/S质粒；(3)以所述pUC57/S质粒为模板，通过第二引物对扩增得到第二PCR产物，利用BamHⅠ和HindⅢ对所述第二PCR产物以及第一重组质粒分别进行双酶切，并连接酶切产物，得到第二重组质粒；

所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第一引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQID NO.3所示，所述第二引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，先向破碎后的、表达所述病毒样颗粒的重组菌体中加入硫酸铵对所述病毒样颗粒进行粗沉；再采用新型凝胶过滤介质Capto^TM Core 700对粗沉得到的含有病毒样颗粒的样品进行精纯，即得纯化后的病毒样颗粒。

7.根据权利要求6所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的纯化方法，其特征在于，采用硫酸铵粗沉时，硫酸铵的终浓度为10％-50％；采用新型凝胶过滤介质Capto^TMCore700纯化时，先用5倍柱体积的20mM Tris-HCL平衡凝胶柱后，将含有所述沉淀蛋白的溶液以4ml/min流速上样，收集流出液即得纯化后的病毒样颗粒；优选的，所述硫酸铵的终浓度为30％。

8.根据权利要求1-5中任意一项所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的制备方法。

9.根据权利要求1-5中任意一项所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒的用途，其特征在于，所述病毒样颗粒可用作新型冠状病毒核酸提取、扩增和核酸检测用阳性质控品。

10.一种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1-5中任意一项所述的内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒。