CN114921485B - 病毒样颗粒质控检测品及其制备方法 - Google Patents

病毒样颗粒质控检测品及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114921485B
CN114921485B CN202210478663.9A CN202210478663A CN114921485B CN 114921485 B CN114921485 B CN 114921485B CN 202210478663 A CN202210478663 A CN 202210478663A CN 114921485 B CN114921485 B CN 114921485B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cov
mat
quality control
rna
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210478663.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114921485A (zh
Inventor
齐莉莉
王进波
张正
曾县平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Original Assignee
Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University of Science and Technology ZUST filed Critical Zhejiang University of Science and Technology ZUST
Priority to CN202210478663.9A priority Critical patent/CN114921485B/zh
Publication of CN114921485A publication Critical patent/CN114921485A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114921485B publication Critical patent/CN114921485B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
    • C12N2795/18111—Leviviridae
    • C12N2795/18121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
    • C12N2795/18111—Leviviridae
    • C12N2795/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/18011—Details ssRNA Bacteriophages positive-sense
    • C12N2795/18111—Leviviridae
    • C12N2795/18151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2795/18152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供病毒样颗粒质控检测品及其制备方法，制备方法包括：获取目的基因CoV‑N；在目的基因CoV‑N的3’端下游加装MS2噬菌体的包装位点，获得CoV‑N片段；对pCDFDuet‑1质粒进行双酶切，与MS2噬菌体的Mat‑CP片段以摩尔比1:2~10混合，获得重组质粒pCDF‑Mat‑CP；提取重组质粒pCDF‑Mat‑CP，对重组质粒pCDF‑Mat‑CP进行双酶切，与CoV‑N片段按照摩尔比1：2~10混合，获得重组质粒pCDF‑Mat‑CP‑CoV‑N；分离纯化重组质粒pCDF‑Mat‑CP‑CoV‑N，并诱导表达，获得MS2病毒样颗粒质控检测品。运用实时荧光定量PCR技术进行核酸检测，为现有新型冠状病毒核酸检测试剂盒提供安全、有效的阳性质控物质。

Description

病毒样颗粒质控检测品及其制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及病毒样颗粒质控检测品及其制备方法。
背景技术
运用实时荧光定量PCR（qPCR）技术进行核酸检测，快速、特异的识别病毒，仍然是阻断SARS-CoV-2传播、防控疫情的主要手段。但受样本的采集、运输和保存条件以及检测人员操作水平等因素的影响，核酸检测容易产生“假阴性”与“假阳性”问题。现有技术中为了解决假阳性问题，例如，有的试剂盒含有PCR反应酶及其RNA酶抑制剂， PCR反应液，柯萨奇病毒A16型正向引物序列，柯萨奇病毒A16型反向引物序列，柯萨奇病毒A16型探针序列，阴性质控检测品，阳性质控检测品，并利用实时荧光定量PCR技术，解决了检测实验在一段时间之后出现假阳性结果的技术问题。但是依旧存在核酸检测容易受到干扰的问题。
因此，必须在样品的检测中设置空白、阴性及阳性内参照RNA，以提高核酸检测的准确性。存在的问题是，RNA分子的稳定性差，极易被环境中的RNase降解，长期保存十分困难，容易对检测结果造成不良影响。
发明内容
本发明解决了RNA分子的稳定性差，极易被环境中的RNase降解的技术问题，利用物理、化学或生物学手段包被RNA，避免其直接接触环境中的RNA酶，运用实时荧光定量PCR技术进行核酸检测，实现了提高RNA的稳定性，可为现有的新型冠状病毒核酸检测试剂盒提供安全、有效的阳性质控物质的技术效果。
为解决上述问题，本发明提供一种病毒样颗粒质控检测品的制备方法，包括以下步骤：S10：获取目的基因CoV-N；S20：在目的基因CoV-N的3’端下游加装MS2噬菌体的包装位点ACATGAGGATCACCCATGT，获得CoV-N片段；S30：用限制性内切酶Nco Ⅰ和Hind Ⅲ对pCDFDuet-1质粒进行双酶切，与MS2噬菌体的Mat-CP片段以摩尔比1：2~10混合，获得重组质粒pCDF-Mat-CP；S40：提取重组质粒pCDF-Mat-CP，用Nde I内切酶和Avr II内切酶对重组质粒pCDF-Mat-CP进行双酶切，与CoV-N片段按照摩尔比1：2~10混合，获得重组质粒pCDF-Mat-CP-CoV-N；S50：分离纯化重组质粒pCDF-Mat-CP-CoV-N，并诱导表达，获得MS2病毒样颗粒质控检测品。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明利用MS2噬菌体的包装特性，制备装载SARS-CoV-2 N基因RNA片段的MS2病毒样颗粒（MS2 PLPs），保护RNA分子，降低其被环境中的RNase降解的可能性，提高RNA的储存稳定性，用作SARS-CoV-2检测的内参照。将MS2噬菌体的外壳蛋白、成熟酶的编码序列与SARS-CoV-2 N基因的编码序列克隆重组到pCDFDuet-1载体上，构建pCDF-Mat-CP-CoV-N重组质粒，转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞后，诱导衣壳蛋白、成熟酶以及SARS-CoV-2 N基因的表达，包装成为MS2 PLPs，操作简便有效。采用大肠杆菌双表达质粒，在细胞内拷贝数多，使得外源基因能够大量扩增，同时表达两个外源基因，并且分两步构建重组质粒，能够提升重组质粒的准确度确保序列无误。
在本发明的一个实例中，S30还包括以下步骤：S31：优化并标记Mat-CP片段。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：根据Genbank中MS2噬菌体的衣壳蛋白（CP）和成熟酶（Mat）基因的编码序列，根据大肠杆菌的偏爱密码子对序列进行优化，并插入组氨酸标签（His-tag），能够方便后续纯化。
在本发明的一个实例中，标记Mat-CP片段包括以下步骤：S22：在MS2噬菌体的Mat-CP序列上游添加His-tag。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：在Mat-CP序列上游添加了His-tag，以便后续用镍离子亲和层析柱纯化MS2 PLPs。
在本发明的一个实例中，S22之后包括以下步骤：S23：在His-tag与上下游的CP序列之间分别添加GGGGS编码序列。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：为了提高衣壳蛋白的包装效率，在His-tag与上下游的衣壳蛋白编码序列之间分别添加了一个GGGGS编码序列，以增加肽链的柔性，提高包装效率。
在本发明的一个实例中，GGGGS编码序列数量为1-8个。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：GGGGS序列可以有1-8个拷贝，均能达到增加肽链的柔性，提高包装效率的效果。
在本发明的一个实例中，制备方法还包括以下步骤：S60：纯化MS2病毒样颗粒质控检测品。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：得到的纯化MS2 PLPs样品能够用于后续指标的测定，以及用作SARS-CoV-2检测。
在本发明的一个实例中，Mat-CP片段的碱基序列如SEQID No：1所示。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：在His-tag与上下游的衣壳蛋白编码序列之间分别添加了四个GGGGS编码序列，得到Maturase-CP-G4S-His-G4S-CP序列，能够大大增加肽链的柔性，提高包装效率。
本发明还提供一种病毒样颗粒质控检测品，病毒样颗粒质控检测品采用上述任一种制备方法获得，病毒样颗粒质控检测品用作SARS-CoV-2检测。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：本发明提供的病毒样颗粒质控检测品能够保护RNA分子，降低其被环境中的RNase降解的可能性，提高RNA的储存稳定性，用作SARS-CoV-2检测的内参照。并且，本发明提供的病毒样颗粒质控检测品与实际COVID-19病毒颗粒具有结构一致性，可真实地模拟COVID-19病毒颗粒在体外核酸检测过程，从而实现对COVID-19核酸检测的全方位监控；产品具有成本低廉、稳定性高、便于储存与转运等优势，便于工业级别的大规模生产。
在本发明的一个实例中，病毒样颗粒质控检测品储存于保存液中，保存液由50-100mM硝酸钠或硝酸铵、10-100mM Tris、10-20%蔗糖或甘油、0.5-2%精氨酸、0.01-0.1mMEDTA中的一种或几种组成，保存液的pH为7.4-8.0。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：保存液的离子强度和pH是影响MS2 PLP稳定性的关键性因素,适当的离子强度和pH值能够保护MS2PLPs的外壳蛋白结构完整性。添加一定浓度的精氨酸能够保护外壳蛋白的空间结构，保护MS2衣壳的完整性。一定浓度的EDTA则可以避免酶对外壳蛋白和RNA的降解。
在本发明的一个实例中，保存液由100mM硝酸钠、50mMTris、20%蔗糖、1%精氨酸组成，保存液的pH为7.4。
与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：将MS2病毒样颗粒质控检测品储存于该保存液，其中SARS-CoV-2 RNA的拷贝数仍能达到SARS-CoV-2检测质控检测品的要求，且纯度高。
附图说明
图1为本发明实施例提供的重组表达质粒pCDF-Mat-CP-CoV-N示意图。
图2为本发明实施例提供的重组质粒的核酸电泳图。
图3为本发明实施例提供的重组外壳蛋白和成熟酶的SDS-PAGE结果图。
图4为本发明实施例提供的纯化后MS2 PLPs的透射电镜观察结果图。
图5为本发明实施例提供的MS2 PLPs中核酸的RT-qPCR和qPCR扩增曲线。
图6为本发明实施例提供的RNase处理后各组样品中核酸的RT-qPCR和qPCR扩增曲线。
图7为本发明实施例提供的37 ℃储存的MS2 PLPs样品的扩增曲线。
图8为本发明实施例提供的-20℃储存的MS2 PLPs样品的RNA拷贝数变化示意图。
图9为RNA拷贝数变化示意图一。
图10为RNA拷贝数变化示意图二。
图11为RNA拷贝数变化示意图三。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
【实施例一】
本发明提供一种病毒样颗粒质控检测品的制备方法，包括以下步骤：S10：获取目的基因CoV-N；S20：在目的基因CoV-N的3’端下游加装MS2噬菌体的包装位点ACATGAGGATCACCCATGT，获得CoV-N片段；S30：用限制性内切酶Nco Ⅰ和Hind Ⅲ对pCDFDuet-1质粒进行双酶切，与MS2噬菌体的Mat-CP片段以摩尔比1：2~10混合，获得重组质粒pCDF-Mat-CP；S40：提取重组质粒pCDF-Mat-CP，用Nde I内切酶和Avr II内切酶对重组质粒pCDF-Mat-CP进行双酶切，与CoV-N片段按照摩尔比1：2~10混合，获得重组质粒pCDF-Mat-CP-CoV-N；S50：分离纯化重组质粒pCDF-Mat-CP-CoV-N，并诱导表达，获得MS2病毒样颗粒质控检测品。
具体的，MS2噬菌体属于正义单链RNA病毒，直径约为27 nm，基因组全长3659 bp，主要编码衣壳蛋白（capsid protein, CP）、成熟酶蛋白（maturase protein, Mat）、裂解蛋白（lysis protein）和复制酶蛋白（replicaseprotein）等四种蛋白质。其中，衣壳蛋白主要构成MS2噬菌体外壳，外壳上的成熟酶蛋白主要辅助MS2噬菌体识别宿主并使噬菌体核酸脱壳进入宿主细胞。而在复制酶编码基因的5’端则存在一个由19个碱基组成的RNA茎环结构，是MS2噬菌体的包装位点（称为“pac“位点）。当衣壳蛋白二聚体与包装位点发生特异性相互作用时，复制酶的翻译被抑制，MS2噬菌体的外膜开始自我组装。利用MS2噬菌体的这一包装特性，可将外源RNA序列连接在包装位点上，从而制备包装不同来源RNA的MS2 PLPs。由于MS2 PLPs内部没有完整的噬菌体核酸序列，不具有自主复制能力和侵染活性，也常被称为“假病毒”。
具体的，将新冠病毒N区的一段保守序列作为内参照RNA序列，长度为2115bp，命名为CoV-N。在其3’端下游加装MS2噬菌体的包装位点 ACATGAGGATCACCCATGT，该位点转录成RNA后会形成一个茎环结构，可被外壳蛋白识别并组装成为假病毒。
具体的，作为质控的序列为来自SARS-CoV-2的N基因全长编码区和ORF1ab的编码区序列，总长度为2084bp。
具体的，用限制性内切酶Nco Ⅰ和Hind Ⅲ对pCDFDuet-1质粒双酶切，与切胶回收的Mat-CP片段以摩尔比1:2混合，进行无缝克隆，构建重组质粒pCDF-Mat-CP，转化至E.coliDH5α感受态细胞，用含链霉素的LB平板涂布，37 ℃过夜培养；次日，筛选阳性克隆子进行核酸电泳鉴定和测序验证。
具体的，经测序确认结果无误后，提取重组质粒pCDF-Mat-CP，用Nde I内切酶和Avr II内切酶对其双酶切，与切胶回收的CoV-N片段按照摩尔比1：2混合，进行无缝克隆，构建重组质粒pCDF-Mat-CP-CoV-N，转化至E.coli DH5α感受态细胞，用含链霉素的LB平板涂布，37 ℃过夜培养，次日筛选阳性克隆子进行核酸电泳鉴定和测序验证。参见图1，其为重组表达质粒pCDF-Mat-CP-CoV-N示意图。
参见图2，其为重组质粒的核酸电泳图。pCDF-Mat-CP和pCDF-Mat-CP- CoV-N对应的条带清晰，条带大小分别为5462 bp和7577 bp，与理论值相符。表明重组质粒构建成功，且其中包含了表达MS2 PLPs所需的基因序列，可用于后续的诱导和表达实验。
具体的，挑取上述测序正确的阳性克隆子，37 ℃摇瓶过夜培养，提取重组质粒pCDF-Mat-CP-CoV-N，转化至E.coli BL21（DE3）表达感受态细胞，平板涂布筛选单菌落。按1%的接种量将2 mL菌液接种到200 mL的LB液体培养基中扩大培养，每隔30 min测定菌液吸光度，当菌液的OD600值达到0.4-0.6时，在菌液中分别加入终浓度为0.5 mmol/L、0.8mmol/L和1.0 mmol/L的IPTG溶液，28 ℃下250 rpm振荡孵育16 h，进行诱导。
IPTG诱导结束后，将菌液1500 rpm离心10 min，去上清，在菌体沉淀中加入2倍体积的10 mmol/L PBS清洗，再次离心、去上清，反复清洗3次。加入50 mL PBS和5 μL蛋白酶抑制剂PMSF（10 mmol/L）重悬菌体，超声破碎，1500 rpm离心30 min，转移上清液。取上清液与5×蛋白上样缓冲液混合，100 ℃变性10 min，进行SDS-PAGE蛋白电泳，验证成熟酶蛋白（Mat）和衣壳蛋白（CP）的表达。
参见图3，其为重组外壳蛋白和成熟酶的SDS-PAGE结果。相比于未经IPTG诱导的空白组（见泳道4），经不同浓度IPTG诱导的样品组（见泳道1-3）在44 kDa和29 kDa两处出现条带，这与MS2噬菌体外壳中衣壳蛋白（CP）和成熟酶蛋白（Mat）的分子量大小一致。表明经IPTG诱导后，带有重组质粒pCDF-Mat-CP-CoV-N的细胞能成功表达MS2外壳蛋白和成熟酶，初步表明MS2 PLPs成功制备。
本发明利用MS2噬菌体的包装特性，制备装载SARS-CoV-2 N基因RNA片段的MS2病毒样颗粒（MS2 PLPs），保护RNA分子，降低其被环境中的RNase降解的可能性，提高RNA的储存稳定性，用作SARS-CoV-2检测的内参照。将MS2噬菌体的外壳蛋白、成熟酶的编码序列与SARS-CoV-2 N基因的编码序列克隆重组到pCDFDuet-1载体上，构建pCDF-Mat-CP-CoV-N重组质粒，转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞后，诱导衣壳蛋白、成熟酶以及SARS-CoV-2 N基因的表达，包装成为MS2 PLPs。采用大肠杆菌双表达质粒，在细胞内拷贝数多，使得外源基因能够大量扩增，同时表达两个外源基因，并且分两步构建重组质粒，能够提升重组质粒的准确度确保序列无误。
进一步的，S30还包括以下步骤：S31：优化并标记Mat-CP片段。
具体的，用限制性内切酶Nco Ⅰ和Hind Ⅲ对pCDFDuet-1质粒进行双酶切，与MS2噬菌体的优化并标记的Mat-CP片段以摩尔比1：2~10混合，获得重组质粒pCDF-Mat-CP。
进一步的，标记Mat-CP片段包括以下步骤：S22：在MS2噬菌体的Mat-CP序列上游添加His-tag。
具体的，利用大肠杆菌双表达载体pCDFDuet-1，将MS2的成熟酶、衣壳蛋白和组氨酸标签置于lac启动子下游进行表达；将SARS-CoV-2 N蛋白基因编码区置于T7启动子下游表达；构建获得pCDF-Mat-CP-CoV-N重组质粒。
具体的，根据Genbank中MS2噬菌体的衣壳蛋白（CP）和成熟酶（Mat）基因的编码序列，根据大肠杆菌的偏爱密码子对序列进行优化，并插入组氨酸标签（His-tag），以方便后续纯化。
具体的，在重组载体的lac启动子下游，有1个拷贝的成熟酶和2个拷贝的衣壳蛋白，在两个衣壳蛋白之间添加6个组氨酸编码序列，形成标签His-tag，便于利用镍柱对制备的MS2 PLP进行分离纯化。
进一步的，S22之后包括以下步骤：S23：在His-tag与上下游的CP序列之间分别添加GGGGS编码序列。
具体的，为了提高衣壳蛋白的包装效率，在His-tag与上下游的衣壳蛋白编码序列之间分别添加了一个GGGGS编码序列，以增加肽链的柔性，提高包装效率。
进一步的，GGGGS编码序列数量为1-8个。
进一步的，制备方法还包括以下步骤：S60：纯化MS2病毒样颗粒质控检测品。
具体的，Mat-CP序列上游添加了His-tag，以便用镍离子亲和层析柱纯化MS2PLPs。将超声破碎后的上清液与柱平衡缓冲液（20 mmol/L PBS、10 mmol/L咪唑）等体积混合，上样，流速控制在0.5-1.0 mL/min；收集流出液，再次上样。用洗涤液（20 mmol/L PBS、40 mmol/L咪唑）洗涤至流出液的OD280=0，再用洗脱液（20 mmol/L PBS、250 mmol/L咪唑）洗脱，2 mL/管收集洗脱液。加入DNase Ⅰ（0.05 mg/mL），37 ℃、150 rpm条件下摇床反应30min，以充分去除残留的质粒DNA。得到的纯化MS2 PLPs样品用于后续指标的测定。
进一步的，Mat-CP片段的碱基序列如SEQID No：1所示。
值得说明的是，本实施例选用的Mat-CP和CoV-N基因以及引物、探针均由金斯瑞生物科技股份有限公司合成；pCDFDuet-1质粒由浙大宁波理工学院实验室保存；E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；高保真Taq酶、一步法qPCR试剂盒购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；无缝克隆试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Bacterial RNA kit试剂盒购自广州飞扬生物工程有限公司；His-tag 蛋白纯化填料购自康为世纪生物科技有限公司。
【实施例二】
本发明还提供一种病毒样颗粒质控检测品，病毒样颗粒质控检测品采用上述任一种制备方法获得，病毒样颗粒质控检测品用作SARS-CoV-2检测。
具体的，本发明利用pCDFDuet-1质粒，构建了MS2衣壳蛋白、成熟酶和SARS-CoV-2RNA共表达的重组载体，经诱导、纯化后，得到MS2 PLPs，并对其进行形态观察、RNA纯度鉴定和RNA稳定性评价，以获得可用于新冠病毒核酸检测的有效内参照品。
一、透射电镜（TEM）观察MS2 PLPs的形态
具体的，取纯化的MS2 病毒样颗粒（MS2 PLPs）样品，用1%醋酸双氧铀染色5 min，晾干2 h后，用透射电镜观察样品颗粒的形态。
参见图4，其为纯化后MS2 PLPs的透射电镜观察结果图。用TEM观察纯化后的样品，可清晰看到圆形颗粒，直径约为25~30 nm，与野生的MS2噬菌体大小相近，这进一步表明成功制备了MS2 PLPs，且形态较为完整，符合预期。
二、RT-qPCR法测定MS2 PLPs中RNA拷贝数与纯度
Taq酶只能以DNA为模板进行扩增，而不能直接扩增RNA，因此RNA须逆转录成cDNA方可进行扩增。基于Taq酶的这一特性，可用RT-qPCR法测定样品的RNA拷贝数，并计算RNA纯度。
以假病毒质粒为外部标准品，将质粒浓度稀释到106copies/mL、105copies/mL、104copies/mL、103copies/mL、102copies/mL、101copies/mL，进行qPCR反应测定Ct值，制作“核酸拷贝数-Ct值”标准曲线。本实施例的标准曲线为：
核酸拷贝数（copies/mL）=10(-0.3011×Ct+12.144)×1000
进一步的，将纯化的MS2 PLPs样品稀释1000倍，提取核酸，进行RT-qPCR反应测定Ct值以计算样品的核酸拷贝数（包括RNA和残留的质粒DNA）；同时将样品核酸直接进行qPCR反应测定Ct值以计算样品中残留的质粒DNA拷贝数。在此基础上，分别计算MS2 PLPs样品的RNA拷贝数和RNA纯度，计算公式如下：
RNA纯度（%）=100×（1-2A-B），其中A为RT-qPCR的Ct值，B为直接qPCR的Ct值。
RNA拷贝数（copies/mL）=核酸拷贝数×样品RNA纯度。
具体的，提取纯化后MS2 PLPs样品的核酸，分成两份。一份核酸样品经逆转录后，再进行定量PCR（RT-qPCR），以测定CoV-N的核酸总拷贝数（RNA和微量残留质粒DNA）；另一份核酸样品，直接进行定量PCR反应，以测定MS2PLP中残留质粒DNA的拷贝数。
参见图5，其为MS2 PLPs中核酸的RT-qPCR和qPCR扩增曲线。可以清楚知道，RT-qPCR的样品Ct值为16.18，qPCR的样品Ct值为28.13，代入公式计算得到MS2 PLPs的RNA纯度为99.97%，RNA拷贝数为1.87×1010copies/μL，符合临床检验质控检测品的标准。
三、RNase攻击对MS2 PLPs中RNA稳定性的影响
将稀释1000倍的MS2 PLPs样品作为待测组，另提取样品中的裸露RNA作为对照组。在两组实验管（100 μL）中加入1 μL RNase，37 ℃处理30 min，对各组RNA进行RT-qPCR和qPCR检测，分析RNA拷贝数和纯度的变化。空白组为未经RNase处理的MS2 PLPs样品。
用RNase分别处理MS2 PLPs及裸露RNA，分别进行RT-qPCR和qPCR，以测定RNA拷贝数和纯度。参见图6，其为相应的扩增曲线。可以清楚知道，未经RNase处理的MS2 PLPs样品的RNA拷贝数为6.83×1010copies/μL，RNA纯度为99.9%；经过RNase处理的MS2 PLPs样品，其RNA拷贝数为2.65×108copies/μL，RNA纯度为99.3%；未包裹的裸露RNA样品， RNase处理30min后，其拷贝数为2.24×107copies/μL，RNA纯度为82.8%。以上结果表明，当受到RNase攻击时，MS2 PLPs包裹的RNA样品降解率远低于裸露的RNA样品。这说明MS2噬菌体外壳能够保护RNA，增强其对RNase的抗性，从而提高RNA的储存稳定性。
四、储存温度对MS2 PLPs中RNA稳定性的影响研究
将稀释1000倍的MS2 PLPs样品置于37 ℃储存30 d，提取样品RNA后，进行RT-qPCR和qPCR检测，计算RNA拷贝数和纯度。空白对照组为储存前的MS2 PLPs样品。
参见图7，其为37 ℃储存的MS2 PLPs样品的扩增曲线。可以清楚知道，储存前的空白对照组MS2 PLPs样品的RNA拷贝数为7.85×1010copies/μL，RNA纯度为99.96%；37 ℃储存30 d后，MS2 PLPs样品的RNA拷贝数仍可达3.42×1010copies/μL，纯度为99.93%，仍旧能满足临床检验质控检测品的要求，展现出很好稳定性。
将样品置于-20℃储存共200 d，分别在第15 d、40 d、60 d、90 d、150 d、200 d时取样，提取RNA，进行RT-qPCR和qPCR检测，计算RNA拷贝数和纯度。
参见图8，其为-20℃储存的MS2 PLPs样品的RNA拷贝数变化示意图。可以清楚知道，-20℃下储存200 d后，MS2 PLPs的RNA拷贝数仍然保持在6.13×1010copies/μL，说明在-20℃储存条件下MS2 PLPs中的RNA具有很好的稳定性，这有利于克服核酸检测内参照品不能长久保存的问题。
综上所述，本发明利用MS2噬菌体的包装特性，首先构建pCDF-Mat-CP-CoV-N双表达载体，将其转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞，通过原核表达体系成功诱导表达了包装有CoV-N片段的MS2 PLPs样品。用镍离子亲和层析法纯化MS2 PLPs样品后，可观察到样品呈25-30 nm颗粒状，其中的RNA纯度可达99.97%，RNA拷贝数可达1.87×1010copies/μL，均符合作为核酸检测质控检测品的标准。经检测，该MS2 PLPs样品具有良好的RNase抗性，其MS2外壳能很好地保护内部的RNA不被RNase降解且保持高RNA纯度，稳定性显著优于未组装的裸露RNA；此外，该MS2 PLPs样品还通过了温度稳定性检测，可在37 ℃下至少储存15 d，在-20 ℃下至少储存200 d。最后，该MS2病毒样颗粒已进行了临床测试，所得数据符合作为阳性内参照RNA的要求，有望在未来作为核酸检测质控检测品来辅助检测新冠病毒。并且，本发明提供的质控检测品与实际COVID-19病毒颗粒具有结构一致性，可真实地模拟COVID-19病毒颗粒在体外核酸检测过程，从而实现对COVID-19核酸检测的全方位监控；产品具有成本低廉、稳定性高、便于储存与转运等优势，便于工业级别的大规模生产。
【实施例三】
进一步的，病毒样颗粒质控检测品储存于保存液中，保存液由50-100mM硝酸钠或硝酸铵、10-100mM Tris、10-20%蔗糖或甘油、0.5-2%精氨酸、0.01-0.1mM EDTA中的一种或几种组成，保存液的pH为7.4-8.0。
保存液的离子强度和pH是影响MS2 PLP稳定性的关键性因素,适当的离子强度和pH值能够保护MS2PLPs的外壳蛋白结构完整性。添加一定浓度的精氨酸能够保护外壳蛋白的空间结构，保护MS2衣壳的完整性。一定浓度的EDTA则可以避免酶对外壳蛋白和RNA的降解。
具体的，保存液1含有100mM硝酸钠、100mMTris、0.5%精氨酸、0.1mM EDTA，其pH为7.4。
具体的，保存液2含有100mM硝酸钠、50mMTris、1%精氨酸，其pH为7.4。
具体的，保存液3含有100mM硝酸钠、100mMTris、0.5%精氨酸、0.1mM EDTA，其pH为8.0。
具体的，保存液4含有100mM硝酸钠、50mMTris、1%精氨酸，其pH为8.0。
具体的，设置对照组，将MS2病毒样颗粒质控检测品储存于超纯水。
进一步的，将MS2病毒样颗粒质控检测品分别储存在保存液1、保存液2、保存液3、保存液4以及超纯水中，并在0℃下进行保存，并对其RNA拷贝数每隔一段时间进行检测，检测结果参见表1和图9。
表1
可以清楚知道，利用该保存液1，MS2 PLPs置于0℃保存90天，其中SARS-CoV-2 RNA的拷贝数仍能达到6.84×1010copies/μL，纯度为99.27%，完全能够达到作为SARS-CoV-2检测质控检测品的要求。保存液2、3、4也能够显著提高MS2 PLPs中SARS-CoV-2 RNA的稳定性，其中储存于保存液的MS2病毒样颗粒质控检测品的RNA拷贝数和纯度显著高于超纯水保存组。
【实施例四】
在实施例三的基础上，保存液由100mM硝酸钠、50mMTris、20%蔗糖、1%精氨酸组成，保存液的pH为7.4。
具体的，保存液6含有100mM硝酸钠、50mMTris、20%蔗糖、1%精氨酸，其pH为7.4。
具体的，MS2病毒样颗粒质控检测品储存于PBS。
具体的，MS2病毒样颗粒质控检测品储存于超纯水。
进一步的，将MS2病毒样颗粒质控检测品分别储存在保存液2、保存液6、PBS以及超纯水中，在-20℃下进行保存，并对其RNA拷贝数每隔一段时间进行检测，检测结果参见表2和图10。
表2
可以清楚知道，利用该保存液6，MS2 PLPs置于-20℃保存90天，其中SARS-CoV-2RNA的拷贝数仍能达到7.09×1010copies/μL，纯度为99.27%，完全能够达到作为SARS-CoV-2检测质控检测品的要求。相比于超纯水，保存液2和PBS也能够显著提高MS2 PLPs中SARS-CoV-2 RNA的稳定性，其中储存于保存液的MS2病毒样颗粒质控检测品的RNA拷贝数和纯度高于超纯水保存组。
在另一个实施例中，将MS2病毒样颗粒质控检测品分别储存在保存液2、保存液6以及PBS中，在37℃下进行保存，并对其RNA拷贝数每隔五天进行检测，检测结果参见表3和图11。
表3
可以清楚知道，利用该保存液6，MS2 PLPs置于37℃保存90天，其中SARS-CoV-2RNA的拷贝数仍能达到4.73×1010copies/μL，纯度为99.27%，完全能够达到作为SARS-CoV-2检测质控检测品的要求。相比于PBS，保存液2也能够提高MS2 PLPs中SARS-CoV-2 RNA的稳定性，其中储存于保存液的MS2病毒样颗粒质控检测品的RNA拷贝数和纯度高于PBS保存组。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。
序列表
<110> 浙大宁波理工学院
<120> 病毒样颗粒质控检测品及其制备方法
<130> 2022.03.08
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2098
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggctatcgc tgtaggtagc cggaattcca ttcctaggag gtttgaccta tgcgagcttt 60
tagtaccctt gatagggaga acgagacctt cgtcccctcc gttcgcgttt acgcggacgg 120
tgagactgaa gataactcat tctctttaaa atatcgttcg aactggactc ccggtcgttt 180
taactcgact ggggccaaaa cgaaacagtg gcactacccc tctccgtatt cacggggggc 240
gttaagtgtc acatcgatag atcaaggtgc ctacaagcga agtgggtcat cgtggggtcg 300
cccgtacgag gagaaagccg gtttcggctt ctccctcgac gcacgctcct gctacagcct 360
cttccctgta agccagaact tgacttacat cgaagtgccg cagaacgttg cgaaccgggc 420
gtcgaccgaa gtcctgcaaa aggtcaccca gggtaatttt aaccttggtg ttgctttagc 480
agaggccagg tcgacagcct cacaactcgc gacgcaaacc attgcgctcg tgaaggcgta 540
cactgccgct cgtcgcggta attggcgcca ggcgctccgc taccttgccc taaacgaaga 600
tcgaaagttt cgatcaaaac acgtggccgg caggtggttg gagttgcagt tcggttggtt 660
accactaatg agtgatatcc agggtgccta tgagatgctt acgaaggttc accttcaaga 720
gtttcttcct atgagagccg tacgtcaggt cggtactaac atcaagttaa atggccgtct 780
gtcgtatcca gctgcaaact tccagacaac gtgcaacata tcgcgacgta tcgtgatatg 840
gttttacata aacgatgcac gtttggcatg gttgtcgtct ctaggtatct tgaacccact 900
aggtatagtg tgggaaaagg tgcctttctc attcgttgtc gactggctcc tacctgtagg 960
taacatgctc gagggcctta cggcccccgt gggatgctcc tacatgtcag gaacagttac 1020
tgacgtaata acgggtgagt ccatcataag cgttgacgct ccctacgggt ggactgtgga 1080
gagacagggc actgctaagg cccaaatctc agccatgcat cgaggggtac aatccgtatg 1140
gccaacaact ggcgcgtacg taaagtctcc tttctcgatg gtccatacct tagatgcgtt 1200
agcattaatc aggcaacggc tctctagata gagccctcaa ccggagtttg aagcatggct 1260
tctaacttta ctcagttcgt tctcgtcgac aatggcggaa ctggcgacgt gactgtcgcc 1320
ccaagcaact tcgctaacgg ggtcgctgaa tggatcagct ctaactcgcg ttcacaggct 1380
tacaaagtaa cctgtagcgt tcgtcagagc tctgcgcaga atcgcaaata caccatcaaa 1440
gtcgaggtgc ctaaagtggc aacccagact gttggtggtg tagagcttcc tgtagccgca 1500
tggcgttcgt acttaaatat ggaactaacc attccaattt tcgctacgaa ttccgactgc 1560
gagcttattg ttaaggcaat gcaaggtctc ctaaaagatg gaaacccgat tccctcagca 1620
atcgcagcaa actccggcat ctacgctaac tttactcagt tcgttctcgt cgacaatggc 1680
ggtaccggcg gaggcggttc gcatcaccat caccatcacg gcggaggcgg ttcgggtacc 1740
ggcgacgtga ctgtcgcccc aagcaacttc gctaacgggg tcgctgaatg gatcagctct 1800
aactcgcgtt cacaggctta caaagtaacc tgtagcgttc gtcagagctc tgcgcagaat 1860
cgcaaataca ccatcaaagt cgaggtgcct aaagtggcaa cccagactgt tggtggtgta 1920
gagcttcctg tagccgcatg gcgttcgtac ttaaatatgg aactaaccat tccaattttc 1980
gctacgaatt ccgactgcga gcttattgtt aaggcaatgc aaggtctcct aaaagatgga 2040
aacccgattc cctcagcaat cgcagcaaac tccggcatct actaatagac gccggcca 2098

Claims (3)

1.一种病毒样颗粒质控检测品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将MS2噬菌体的外壳蛋白、成熟酶的编码序列与SARS-CoV-2 N基因的编码序列克隆重组到pCDFDuet-1载体上，构建pCDF-Mat-CP-CoV-N重组质粒，转化至E.coli BL21（DE3）感受态细胞后，诱导衣壳蛋白、成熟酶以及SARS-CoV-2 N基因的表达，包装成为MS2 PLPs；
其中，N基因3’端下游加装MS2噬菌体的包装位点ACATGAGGATCACCCATGT；
所述病毒样颗粒质控检测品储存于保存液中，所述保存液由100mM硝酸钠、50mMTris、20%蔗糖、1%精氨酸组成，所述保存液的pH为7.4。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Mat-CP片段的碱基序列如SEQIDNo：1所示。
3.一种病毒样颗粒质控检测品，其特征在于，所述病毒样颗粒质控检测品采用如权利要求1所述的制备方法获得，所述病毒样颗粒质控检测品用作SARS-CoV-2检测。
CN202210478663.9A 2022-05-05 2022-05-05 病毒样颗粒质控检测品及其制备方法 Active CN114921485B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210478663.9A CN114921485B (zh) 2022-05-05 2022-05-05 病毒样颗粒质控检测品及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210478663.9A CN114921485B (zh) 2022-05-05 2022-05-05 病毒样颗粒质控检测品及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114921485A CN114921485A (zh) 2022-08-19
CN114921485B true CN114921485B (zh) 2023-08-18

Family

ID=82806771

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210478663.9A Active CN114921485B (zh) 2022-05-05 2022-05-05 病毒样颗粒质控检测品及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114921485B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110511926A (zh) * 2019-09-06 2019-11-29 郑州安图生物工程股份有限公司 一种质粒、假病毒的保存液及其用途
CN112029899A (zh) * 2020-04-03 2020-12-04 苏州艾可瑞斯生物科技有限公司 一种新型冠状病毒rna核酸检测质控品及其制备方法
CN112028999A (zh) * 2020-07-21 2020-12-04 河南省生物工程技术研究中心 一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法和用途
CN113265413A (zh) * 2021-06-17 2021-08-17 北京中科生仪科技有限公司 一种假病毒的制备方法
CN113584228A (zh) * 2021-08-05 2021-11-02 北京医院 七种rna病毒核酸检测质控品及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110511926A (zh) * 2019-09-06 2019-11-29 郑州安图生物工程股份有限公司 一种质粒、假病毒的保存液及其用途
CN112029899A (zh) * 2020-04-03 2020-12-04 苏州艾可瑞斯生物科技有限公司 一种新型冠状病毒rna核酸检测质控品及其制备方法
CN112028999A (zh) * 2020-07-21 2020-12-04 河南省生物工程技术研究中心 一种内含新型冠状病毒核酸的病毒样颗粒及其制备方法和用途
CN113265413A (zh) * 2021-06-17 2021-08-17 北京中科生仪科技有限公司 一种假病毒的制备方法
CN113584228A (zh) * 2021-08-05 2021-11-02 北京医院 七种rna病毒核酸检测质控品及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Sien Zhan等.Armored Long RNA Controls or Standards for Branched DNA Assay for Detection of Human Immunodeficiency Virus Type 1.《J Clin Microbiol》.2009,第47卷(第8期),2571-2576. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114921485A (zh) 2022-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5677124A (en) Ribonuclease resistant viral RNA standards
CN102559616B (zh) 一种含诺如病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
AU2015299850A1 (en) Genome editing using Campylobacter jejuni CRISPR/CAS system-derived RGEN
CN111254223A (zh) 一种用于检测非洲猪瘟病毒核酸的反应体系、试剂盒及其应用
CN103923887A (zh) 含戊型肝炎病毒rna片段的假病毒颗粒及其制备方法
CN111607613A (zh) 一种表达细胞免疫疫苗mRNA的质粒载体及其构建方法和应用
CN114921485B (zh) 病毒样颗粒质控检测品及其制备方法
CN111500586A (zh) 特异结合狂犬病毒l蛋白加帽区的核酸适配体及其应用
CN111575307A (zh) 一种内含汉城病毒g2蛋白基因装甲rna标准物质及制备方法
CN111363758A (zh) 新加坡石斑鱼虹彩病毒主要衣壳蛋白多克隆抗体的制备和应用
CN116287139A (zh) 检测金黄色葡萄球菌的方法
CN116064616A (zh) 一种纤维素酶基因、纤维素酶、重组载体及应用
AU2022335499A1 (en) Enzymes with ruvc domains
CN110669117B (zh) 一个草菇乙烯受体蛋白
CN110408582B (zh) 展示猪瘟病毒e2蛋白主要抗原区的霍乱弧菌菌影构建及制备
CN114277048A (zh) 一种内含新型冠状病毒ORF1ab基因、E基因和N基因装甲RNA标准物质及其应用
CN111607612A (zh) 一种表达体液免疫疫苗mRNA的质粒载体及其构建方法和应用
CN106967663B (zh) 一种用于农作物病害防治的重组菌株
CN112391367A (zh) 一种可用于人原代细胞基因编辑的Cas9蛋白的制备方法
CN117051043B (zh) 一种基于环状rna编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌内溶素及其应用
CN111363709A (zh) 一种提高异戊二烯产量的基因工程菌及其构建方法与应用
CN116445546B (zh) 一种质粒载体及通过质粒载体制备的新冠病毒核酸检测标准品和制备方法
Qi et al. One-plasmid double-expression system for preparation of MS2 virus-like particles packaging SARS-CoV-2 RNA
CN116724111A (zh) 一种hiv假病毒颗粒及其制备方法
CN118048322A (zh) 一种鸡传染性支气管炎重组病毒rIBV-Flag及构建方法、应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant